KR820000908B1 - 발효에 의한 세팔로스포린 c의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

발효에 의한 세팔로스포린 C의 제조방법

본 발명은 세팔로스포린 C를 고수율로 제조하는 방법에 관한 것으로 당, 대두분등을 주원료로 한 영양배지에 세팔로스포린 C를 생산할 수 있는 미생물을 배양하고, 그 배양액중에 세팔로스포린을 집적 축적시키고 이를 회수, 단리함에 있어서 메틸올레이트(Methyloleate)를 저지중에 0.5-4%되게 첨가하여 주면, 세팔로스포린 C의 생산이 촉진되어 세팔로스포린 C를 고수율로 제조할 수 있는 방법인 것이다.

그람양성 및 음성세균에 대해 다같이 넓은 스펙트럼을 가진 반합성 세팔로스포린 계열 항생물질들의 전구물질로 사용되는 세팔로스포린 C의 제조방법에는 페니실린으로부터 만들어지는 합성법과 미생물에 의한 발효법이 알려져 있으나 경제성의 관점에서 미생물에 의한 발효법이 알려져 있으나 경제성의 관점에서 아생물에 의한 발효법은 화학적인 합성법에 비해 배지중에 측적되는 세팔로스포린 C의 농도, 즉 생산수율이 중요한 관건이 된다.

일반적으로 발효에서의 생산수율은 미생물의 생산역가와, 발효배지의 구성 및 배양조건등에 의해 좌우되며 특히 발효배지의 조성은 미생물 생육에 필요한 물질 즉, 생육과 생산에 필수적인 여러가지 인자들이 적당히 조합되어야만 최대한의 효과를 얻을 수 있음은 당연한 것으로서, 세팔로스포린 C의 발효에 있어서도 배지의 구성상 탄소원, 질소원 및 미량인자들의 종류 및 농도와 세팔로스포린 C 생산대사과정에서 중요한 중한 물질인 메티오닌, 기타 세팔로스포린의 생산을 촉진하는 물질들이 생산활동에 중요한 요소가 되는 것이다.

본 발명자들은 이러한 조건을 감안하면서, 미생물 변이주에 의한 세팔로스포린 C의 제조방법을 다년간 연구한 결과 탄소원, 질소원, 메티오닌, 기타 미량성분등으로 구성된 배지중에 지방(lipid)계통인 메틸올레이트를 적당량 첨가하여 줌으로써 세팔로스포린을 고수율로 축적 생산할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

이를 더욱 상세하게 설명하면, 지방류는 생물체의 대사에 있어서 에너지원으로서도 중요할뿐 아니라, 생합성물질에 대한 탄소원으로서도 매우 중요한 역할을 하고 있다는 것에 착안한 것이다.

특히 본 발명에서 세팔로스포린 C를 생산하는 미생물의 경우 메틸울레이트의 정확한 대사 기작은 알지못하나, 메틸올레이트가 각종 에너지원으로 중요하게 이용될뿐 아니라, 그동안의 연구결과, 세팔로스포린 C와 같은 항생물질의 생합성에는 그 생산을 더욱 촉진시킬 수 있음을 알았다. 그러나 메틸울레이트의 가수분해물인 울레인산을 첨가했을때, 무첨가보다는 미약의 효과가 있었으나 메틸올레이트만큼은 되지 못하였다(표 1).

이러한 결과는 표 1에서 나타난 바와 같이 메틸올레이트가 세팔로스포린 C의 생성에 중대한 영향을 미치고 있음을 증명하였으며 또 일정농도 첨가까지는 생산과 생육이 향상됨을 알 수 있었다.

[표 1]

(주) 세팔로스포린 생산균주인 세팔로스포리움 스트레인 YC-122를 삼각플라스크 종배지에 식균하여 4일간 진탕배양한 종배양액을 메틸울레이트 농도별(또는 올레이트)로 첨가된 발효배지를 사입한 2.6ℓ 소형발효조에 접종하여 160시간동안 배양하였으며 기본 배지조성, 배양방법등은 실시예 1에 기술된 것과 같이 동일하게 하였음.

이상의 표 1에 나타난 바와 같이 메틸올레이트의 적정농도는 미생물의 종류 및 다른 첨가물의 농도에 따라서도 약간씩은 차이가 있겠으나, 세팔로스포린을 생성하는 여러가지 미생물에 대해서는 공통적으로 세팔로스포린 C의 생성을 더욱 촉진시킨다는 사실을 알았으며 그 결과는 표 2와 같다.

[표 2]

(주) 사용배지, 배양방법등은 실시예 1과 동일함

이와같이 본 발명은 미생물 변이주에 의해 세팔로스포린 C를 제조함에 있어서, 메틸올레이트는 균체의 생육 및 세팔로스포린 C의 생성을 촉진시키는 역할을 하고 있음을 알 수 있으며, 이것은 미생물의 종류에 따라 정의의 차이는 있으나 각각의 미생물 변이주에 공통적으로 생성을 더욱 촉진시켜 주며 적정농도도 미생물에 따라 약간씩 달라짐을 알 수 있다.

따라서, 본 발명은 세팔로스포린 C와 생산능력이 있는 세팔로스포리움속 에머리셀롭시스(Emericellopsis) 속등을 탄소원, 질소원, 메티오닌, 기타 생육 및 생육 필수인자를 포함한 영양배지에 배양하여 세팔로스포린 C를 생산함에 있어서 배지중에 메틸올레이트를 0.5-4.0%되게 첨가하는 것을 특징으로 하여, 세팔로스포린 C의 축적을 더욱 촉진시켜 생성물을 고수율로 생산할 수 있는 제조방법이다.

특히 본 발명에서는 세팔로스포린 C를 직접 발효배지에 축적시킬 수 있는 미생물이면 모두 사용될 수 있으며 대표적인 예로서는 세팔로스포리움 스트레인 YC 122, 세팔로스포리움 SP. ATCC 14553 세팔로스포리움 폴리알레룸 ATCC 20360, 세팔로스포리움 SP. ATCC 20339등이 효과적이다.

또한 본 발명의 발효배지중 탄소원으로는 포도당, 설탕, 당밀, 과당 덱스트린(Dextrin), 전분가수분해물등 자화 가능한 모든 당질이면 사용될 수 있으며, 질소원으로는 요소, 황산암모니움, 질산암모니움, 암모니아등이 양호하며, 이밖에 육분(meat meal), 땅콩분, 효모즙, 맥아즙, 카제인 가수분해물, 콘스팁리커(corn Steep liquor)펩톤등이 효과적이며 무기물로는 염화칼슘, 염화마그네슘, 인산제일, 제이칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 탄산칼슘, 망간, 아연, 철, 구리등을 미생물의 생육과 생산이 저해받지 않는 범위내에서 첨가하는 것이 효과적이며, 또한 메티오닌을 첨가하면 더욱 효과적이다.

또한 배양방법에 있어서는 미생물의 종류에 따라 약간씩의 차이는 있으나, 일반적으로 통기교반 배양하면서 온도는 연속적으로 조절하는 것이 효과적이며, pH는 배양초기에만 가성소다, 수산화칼륨, 암모니아수등으로 조절하는 것이 유리하며, 배양중에는 탄산칼슘의 첨가량에 의해 pH 5.0이상이 되도록 유지하는 것이 좋다.

이와 같은 본 발명을 실시예에 의하여 좀더 상세하게 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

사용균주 : 세팔로스포리움 스트레인 YC 122

종배지 : 콘스팁리커분(Corn Steep liquor Powder 수분 18%) 19%, 포도당 2%, 설탕 1.5%, 염화나트륨 0.2%, 육즙 1%, 효모엑키스 1%, 탄산칼슘 0.5%, pH 7.5

발효배지 : 대두분 2%, 콘스팁리커분 2.5%, 당밀 3%, 과당 2%, 육즙 1%, 황산암모니움, 1%, 소포제(autifoam S-57) 0.1%, 탄산칼슘 0.5%, 염화마그네슘 0.1%, 인산제일, 제이칼륨 각 0.2%, 황산철 0.002%, 황산아연 0.001%, 황산망간 0.0004%, 메티오닌 0.1%, pH 7.0의 기본배지에 메틸올레이트를 농도별로 첨가하였다.

배양방법 : 상기 조성의 종배지 50ml을 5000ml 삼각플라스크에 넣어 120℃에서 20분간 가압살균한 다음, YC 122균주의 1백금이를 식균하여 27℃에서 4일간 배양한다. 종배지 1.2ℓ를 2.6ℓ 소형발효조에 사입하여 120℃에서 30분간 가압살균한 후 삼각플라스크의 1차 종배양액 50ml를 접종하여 27℃에서 4일간 900rpm, 1.Ovvm의 조건으로 통기교반 배양하여 2차 종배양액으로 사용하며 메틸올레이트를 각 농도별로 첨가하여 조제된 각 발효배지 12ℓ씩을 각각 30ℓ 발효조에 사입하여 120℃에서 30분간 가압살균한 후 2차 종배양액을 10% 용량으로 각각 접종하여 27℃의 온도에서 350rpm, 1.Ovvm의 조건으로 통기 교반하면서 160시간동안 배양하였다.

이때 배양중의 Packed Cell Volume은 배양액 10ml 3000rpm에서 15분간 원심 분리하여 측정하였으며, 세팔로스포린 C는 고속액체 크로마토그라피법으로 정량하였다.

[실시예 2]

본 실시예의 배지조성, 배양방법, 세팔로스포린 C 정량법등은 실시예 1과 동일하며 발효배지의 메틸올레이트 농도만 3.0%되게 첨가하였으며 배양중 pH가 5.0까지 하락하였다가 배양말기에 pH가 8.0으로 상승하면 배양을 완료한 것으로 그 결과는 표 4와 같다.

[표 4]

Claims (1)

1. 본문에서 상술한 바와 같은 세팔로스포리움속에 속하는 세팔로스포린 C 생성균주를, 탄소원, 질소원 및 기타 영양물질을 함유한 배지에 배양하여 세팔로스포린 C를 생산함에 있어서 메틸올레이트를 배지중에 0.5-4.0%되게 첨가함을 특징으로 한 발효에 의한 세팔로스포린 C의 제조방법.