CS242635B1 - Sposob přípravy fermentačnej pody pre biosyntézu oefaloaporínu C - Google Patents

Description

(54) SpSsob přípravy fermentačnej p8dy pre biosyntézu oefaloaporínu C

Vynález popisuje aerobnú fermentác.iu s kmenom Acremonium chrysogenum na pdde vhodné naštiepenej,pred eterilizáciou.Požadovaný vhodný poměr rozpuštěného uhlíka a dusíka sa dosiahne tým, že k fermentačnej p8de před eterilizáciou sa přidá 2-8% hmot. odpadného myoélia Acremonium chrysogenum vztiahnuté na 100% řermentačnej p8dy, izolovaného z predchádzajúcej ukončené j fermentácie^cefalosporínu C pomoeou produkčného kmena Acremonium chrysogenum. Toto mycélium obsahuje proteolyticke a amylolytické eňzýmy a súčasne vlastně organické zdroje uhlíka a dusíka z bunkovej hmoty a zo zbytkov zachytenej nespotrebovanej fermentačnej pády. Po přídavku takéhoto odpadného myoélia k fermentačnej p8de sa po 60 minútovom miešaní pri 50°C zintenzívnia hydrolytické pochody, čím sa v p8de zvýši rogpustný dusík a zníži polymeračný stupen sacharidov. V konečnom dosledku to vedie k zvýšeniu výtažnosti výroby cefalosporínu C.

242 635

1242 635

Předložený vynález popisuje spósob přípravy fermentačnej pódy pře biosyntézu cefalosporínu C /CFS-C/ fermentáciou pomocou kmeňa Acremonium chrysogenum.

Cefalosporín C sa vyrába submerznou aerobnou fermentáciou s použitím vhodnéj kultúry, v praxi váčšinou s kmeňmi Acremonium chrysogenum a vhodných sterilných živných pód, Vhodným asimilovatelným zdrojom uhlíka móžu byť rózne monosacharidy, disacharidy a polysacharidy v koncentračnom rozmedzí 2-10%hmot., pričom ako význačné substráty aj tuky a ich hydrolyzáty, ktoré súčasne plnia aj funkciu odpeňovačov. Ako zdroje organického dusíka sa používajú arašídová, sojová, kostná, rybia múčka, kukuřičný extrakt, extrakt z bavlníkových semien, rózne hydrolyzáty kvasničných buniek a iné. Podl’a enzýmového metabolizmu síry u produkčných kmeňov je možné ako zdroj síry použiť buď anorganické síry ako /NH^/gSQ^ alebo organické zlúčeniny, z ktorých sa najlepšie osvědčil DL-metionín.

Tieto pódy sú chráněné US patentom č. 3 816 257 z 11.5.1974, ďalej US patentom 3 082 155 z 19.10.1963 resp. NSR patentom Č.

239 j21 z 22.2.1973 a čs. AO č. 198 425 z jO.8.1932.

Pretože je známe, že vhodným pomerom rozpuštěného uhlíka a dusíka móže sa regulovat tvorba cefalosporínu a jeho vedlejších produktov, fermentačné pódy sa niekedy před sterilizáciou hydrolytickým postupom naštiepujú na požadovanú úroveň. K tomu sa používajú enzymové přípravky katalyzujúce takúto hydrolýzu resp. drastickéjšie chemické cesty pomocou kyselin alebo zásad.

Námi navrhovaný spósob přípravy fermentačnej pódy pre bioΪ syntézu cefalosporínu sa vyznačuje tým, že využívá odpadně mycélium Acremonium chrysogenum izolované z predchádzajúcej výroby ako substrát majúci proteolytické a amylolytické enzymy a súčasne vlastně organické zdroje uhlíka a dusíka z bunečnej hmoty a zo zbytkov zachytenej fermentačnej pódy. Napr. při přídavku 2,5% hmot. mokrého filtračného koláča s obsahom 30% hmot. sušiny po

242 635 výrobě cefalosporínu C k hotovej fermentačnej póde sa pri 5Cj)*C a 60 minútovom miešaní zvýšil rozpustný aminodusík o 3^% a u polysacharidov došlo k poklaau polymeračného etupňa o 3tj%· V konečnom dósledku to viedlo k zvýšeniu produkčněj aktivity cefalosporínu o 19)%. Calšou výhodou takéhoto spósobu přípravy je to, že sa čiastočne znižujú odpady, likvidácia ktorých je doeť pracná.

Uvedené příklady len objasňujú princip vynálezu, ale jeho platnost nijako neobmedzujú.

Příklad č.l

Náhrada 0,5^ hmot. pevných zložiek fermentačnej pódy e O,sj% hmot. odpadného mycélia v pdde pre biosyntézu cefalosporínu C fermentáciou pomocou kmeňa Acremonium chrysogenum. Ako fermentačná póda^ sa použila póda o zložení : kukuřičný škrob 4,J3)% hmot., arašídová muka 5,85f% hmot., odpadně mycélium 0,5)% hmot., glukóza 1,^% hmot., sacharóza 0,48)% hmot., CaCO^ 0,97(% hmot., metyloleát 2,^% hmot., DL-metionín 1,65)% hmot., pH po sterilizácii 7,1. idda bola po zmiešaní všetkých zložiek udržiavaná 60 minút pri teplote 3o(*C, pričom hmotnostný úbytok vzniknutý odpařováním pódy bol kompenzovaný prídavkom vody.

Táto póda bola porovnávaná v laboratórnom fermentačnom pokuse s pódou kontrolnou označenou ako produkčná póda XIII nasledujúceho zloženia : kukuřičný škrob 4,5|% hmot., arašídová múka 6)% hmot., glukóza 1,23)½ hmot., sacharóza 0,5)% hmot., CaCO-j ])% hmot., metytoleát 2,s)% hmot., DL-metionín 1,^% hmot.

Obidve pódy bolí -sterilizované pri .12oj*C 30 minút v autokláve a naočkované 1θ)% obj. inokula Acremonium chrysogenum CCM-F-644 připraveného 43 až 72 h kultiváciou produkčného kmeňa na inokulačnej póde označenej ako inokulačná póda V., ktorej zloženie je : sacharóza 1,5^ hmot., octan amonný 0,3^% hmot., DL-metionín 0,1^ hmot,, kukuřičný výluh Ο,βφ hmot., metyloleát Ο,φ hmot. a následnou 48-72 h kultiváciou na produkčněj póde XIII.

Fermentácia sa robila na rotačnom trepacom stroji pri 3 Hz · výstredníku 40 mm při 27,3*0 v 500 ml varných bankách s náplňou 40 ml fermentačnej pódy. Éermentácia trvala 168 h. ro skončení fer mentácie bola aktivita v pokusných a kontrolných bankách stanovená spektrofotometrickou modifikovanou metodou Claridge v třech paralelných bankách. Hodnoty holi spriemerované a hodnota priemeru bola vyjádřená v Ί voči kontrole.

Výsledky :

kontrola pokusná póda

500 ug/ml 8 5j0 ^ug/ml

-3Príklad δ.2

Náhrada hmot. pevných zložiek fermentačnej pódy s hmot. odpadného mycélia v póde pre biosyntézu cefalosporínu C fermentáciou pomocou kmeňa Acremoniua chrysogenum. Zloženie pokusnej pódy : kukuřičný škrob 4,lj# hmot., arašídová múka 5,lj# hmot., odpadně mycelium ^# hmot., glukóza l,15j# hmot., sacharóza 0,4^# hmot., CaCC^ 0,9^# hmot., metyloleát 2,^f% hmot., DL-metionín 1,^# hmot. Podmienky príprjavy pokusnej pddy, přípravy inokula, fermentácie a vyhodnocovanie pokusu ako v příklade č.l.

Výsledky kontrola 8 500 ^ug/ml pokusná póda 8 680 yug/ml,

Příklad fenot

Náhrada 2j%- pevných zložiek fermentačnej pódy s 2%/odpádného mycélia v póde pre biosyntézu cefalosporínu C fermentáciou pomocou kmeňa Acremonium chrysogenum. Zloženie pokusnej pódy ako v příklade č.2, ale po zmiešaní všetkých zložiek bola pokusná póda krátkodobo vyhriata na 90/’C a potom miešaná 30 minút za postupného ochladzovania pri teplote okolia 20^*C. Podmienky přípravy inokula, fermentácie a vyhodnocovanie pokusu ako v příklade č.l.

Výsledky : kontrola 8 500 jo^/niL pokusná pódy 8 620 yug/ml.

Příklad č.4.

Náhrada 2% hmot. pevných zložiek fermentačnej pódy s 2% hmot. odpadného nycélia v póde pre biosyntézu cefalosporínu C.

Zloženie pokusnej pódy : kukuřičný škrob 4,1% hmot., arašídová múka 5,1# hmot., odpadně mycélium 2% hmot., glukóza 1,15# hmot., sacharóza 0,45# hmot., CaCO^ 0,95# hmot., řepkový olej nerafinovaný 1„5# hmot., sojový olej 0,07# hmot., DL-metionín 1,5# hmot. Táto póda bola porovnávaná β pódou kontrolnou označenou ako produkčně póda XIII modifikovaná nasledujúceho zloženia : kukuřičný škrob 4,5# hmot., arašídová múka 6# hmot., glukóza 1,25# hmot., sacharóza 0,5# hmot., CaCO^ 1# hmot., řepkový olej nerafinovaný 1,7# hmot., sojový olej 0,8# hmot., DL-metionín 1,7# hmot.

Obidve pódy boli očkované 10# obj. inokula Acremonium chrysogenum CCM-F-644 připraveného 48-72 h kultiváciou produkčného kmeňa na inokulačnej póde o zložení : sacharóza 1,5# hmot., octan amónny 0,5# hmot., DL-metionín 0,1# hmot., kukuřičný výluh 0,88 % hmot., řepkový olej nerafinovaný 0,8# hmot., a následnou 48-72 h kultiváciou na póde o zložení : kukuřičný škrob 4,5# hmot., ara-41

242 635 áidová múka 6%-hmot., glukóza 1,25% hmot., sacharóza 0,5% hmot., CaCOj 1% hmot., řepkový olej nerafinovaný 2,5% hmot., DL-metionín 1,7% hmot.

Ostatně podmienky přípravy půdy, inokulačného materiálu, fermentácie a vyhodnotenie pokusu ako ▼ příklade č.l.

Výsledky : kontrola 8 000 ug/ml pokusná pddy 8 040 ug/ml.

Příklad δ.5

Náhrada 3% hmot. pevných zložiek s 3% hmot. odpádného mycélia v pdde pre bioeyntézu cefalosporínu C.

Zloženie pokusnéj pddy : kukuřičný výluh 8% hmot., kukuřičný škrob 2,9% hmot., dextrín 5,5% hmot·, glukóza 0,46% hmot., sacharóza 1,38% hmot., CaC0₃ 1% hmot., /NH₄/₂S0₄ 1,29% hmot., MgS0₄ 0,27% hmot., KH₂P0₄ 0,45% hmot., sojový olej 2,3% obj.

Táto pdda bola porovnávaná s pddou kontrolnou označenou ako produkčně pdda Ila nasledujúceho zloženia : kukuřičný výluh 8,7% hmot., kukuřičný škrob 3,2% hmot., dextrín 6% hmot·, glukóza 0,5% hmot., sacharóza 1,5% hmot., MgS0₄ 0,3% hmot., KH₂P0₄ 0,5% hmot·, sojový olej 2,5% obj.

Obidve pddy boli očkované 10% obj. inokula Acremonium chrysogenum CCM-F-750 připraveného 72 h kultiváéiou produkčného kmeňa na inokulačnej pdde o zložení: sacharóza 2% hmot., octan amonný 0,5% hmot., DL-metionín 0,1% hmot., kukuřičný výluh 0,88% hmot., metyloleát 0,3% hmot.

Ostatně podmienky přípravy pddy, inokulačného materiálu, fermentácie a vyhodnotenia pokusu ako v příklade č.l.

Výsledky : kontrola 9050 ug/ml pokusná pdda 9140 ug/ml.

Claims (1)

1. PREDMET 7 f N Á L E Z U

   242 635

   Spósob přípravy fermentačnej pódy pre biosyntézu cefalosporínu C fermentáciou pomocou kmeňa Acremonium chrysogenum vyznačujúci. sa tým, že ako doplňkový, zdroj živin, proteolytických a amylolytických enzýmov sa používá odpadně mycélium Acremonium chrysogenum o obsahu sušiny 30% hmot. získané po filtrécii fermentačnej pódy z ukončenej predchádzajúcej fermentácie cefalosporínu C, v množstve 2-^% hmot. vztiahnuté na 10Q% fermentačnej pódy.