FI92938C - Menetelmä amfoterisiini B-kiteiden muodostamiseksi fermentointiliemessä - Google Patents

Description

92938

Menetelmä amfoterisiini B-kiteiden muodostamiseksi fermen-tointiliemessä

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää amfoteri-5 siini B-kiteiden muodostamiseksi suoraan fermentointialus- tassa, viljelemällä Streptomyces nodosus -kantaa fermen-tointialustassa, johon eristysvaiheessa ei lisätä amfoterisiini B:n liuotinta siihen asti kun vahva sientenvastai-nen aktiivisuus on muodostunut alustaan. Menetelmä on eri-10 koisesti sopeutettu käytettäväksi korkean saannon omaavassa amfoterisiini B-fermentoinnissa.

Tähän asti amfoterisiini B-kiteitä on valmistettu fermentointiliemestä huolellisesti suoritetuilla talteen-ottomenetelmillä, jotka sisältävät kalliit suodatus-, 15 liuosekstraktio- ja kiteytysvaiheet.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti amfoterisiini B-kiteytys indusoidaan suoraan fermentointiliemessä, joka pitää sisällään vesiliukoisen tai veteen liukenemattoman fermentointialustan, sellaisen kuin on kuvattu US-paten-20 tissa nro 2 908 611, joka fermentointialusta sisältää typen lähteen, hiilen/energian lähteen ja vaihtoehtoisesti yhden tai useamman epäorgaanisen suolan prosessin kontrolloimiseksi .

Lisäksi esitetään menetelmä amfoterisiini B-kitei-: 25 den muodostamiseksi suoraan fermentointiliemessä, joka menetelmä sisältää yllä kuvatun kaltaisen fermentointialustan esittämisen, Streptomyces nodosus -kannan kasvattamisen sellaisessa fermentointialustassa ja amfoterisiini B-kiteytyksen sekä mikrobisoluautolyysin indusoinnin. Ki-30 teytys ja autolyysi voidaan suorittaa kuumentamalla liemi riittävässä lämpötilassa, 70 °C - 130 °C:een lämpötilassa, riittävän ajanjakson, 1 minuutista 10 tuntiin, ja mieluummin noin 10 - 45 minuuttiin, amfoterisiini B-kiteiden muodostumisen indusoimiseksi.

35 Kiteytys voidaan myös aloittaa kylvämällä amfoteri siini B-kiteitä fermentointiliemeen fermentoinnin aikana.

2 92938 mieluummin noin 10 - noin 40 tunnin kuluttua fermentoinnin alusta.

Autolyysi voidaan myös suorittaa käyttämällä entsyymeistä, sellaista kuten lysotsyymi tai muuta verratta-5 vissa olevaa entsyymiä, jolla on lyyttinen vaikutus solu-seinään.

Kun käytetään entsyymiä tai kylvämistä, vähempi kuumennuskäsittely voi olla tarpeen.

Menetelmässä käytetty fermentointialusta sisältää 10 typen lähdettä määränä välillä noin 0,1 - 20 % ja mieluummin noin 0,5 - 5 % alustan painon mukaan määritettynä. Esimerkit sopivista typen lähteistä sisältävät kaseiini-hydrolysaatin, puuvillansiemenen tai sen johdannaiset, maissin liotusnesteen, soijapapujauhon tai mitkä tahansa 15 verrattavissa olevat orgaaniset tai epäorgaaniset N-läh-teet tai niiden liukenevat johdannaiset.

Hiilihydraattilähde on läsnä fermentointialustassa määränä välillä noin 0,5 - noin 20 % ja mieluummin noin 0,5 - noin 10 % painosta. Esimerkit sopivista hiilihyd-20 raattilähteistä sisältävät tärkkelyksen, dekstriinin, sokerit kuten maltoosin, laktoosin ja glukoosin, glyserolin ja sen kaltaiset.

Keksinnön menetelmässä käytetty fermentointialusta voi vaihtoehtoisesti sisältää muita tavanomaisia fermen-25 tointialustakomponentteja, kuten yhtä tai useampaa epäor gaanista suolaa, jotka auttavat prosessin kontrollointia. Esimerkit sellaisista epäorgaanisista suoloista sisältävät, mutta eivät ole ainoita, CaC03:n, KH2P04:n, (NH4)2S04:n, MgS04:n, MnS04:n tai Na2HP04:n. Fermentointialusta voi myös 30 sisältää yhtä tai useampaa vaahdonestoainetta, kuten sili-: konivaahdonestoa.

Suositeltava fermentointialustan kokoonpano sisäl tää noin 1 - noin 6 % painosta orgaanista typen lähdettä, mieluummin soijapapujauhoa, noin 2 - 10 % painosta glukoo-35 siä hiilihydraatin lähteenä, vaihtoehtoisesti noin 0,01 % - 0,2 % painosta yhtä tai useampaa epäorgaanista

II

3 92938 suolaa, mieluummin kalsiumkarbonaattia ja kaliumdivetyfos-faattia, ja vaihtoehtoisesti noin 0,05 % - 2 % painosta silikonivaahdonestoa.

Keksinnön menetelmän suositeltavassa suoritusta-5 vassa fermentointituotteen (amfoterisiini B) erotettavien kiteiden muodostamiseksi fermentointiliemessä fermentoin-tialusta voi olla täysin veteen liukeneva. Fermentointi-alustaa käytetään amfoterisiinin fermentoinnissa käyttäen US-patentissa nro 2 908 611 kuvattua menetelmää.

10 Kerättävä liemi kuumennetaan sitten ainakin 70 °C:een lämpötilaan riittäväksi ajaksi, esimerkiksi 10 -45 minuutiksi, aiheuttamaan mikrobisoluautolyysi, joka johtaa amfoterisiini B-kiteiden muodostumiseen. Toisessa suoritustavassa, lysotsyymi tai muu proteolyyttinen ent-15 syymi (kuten proteaasit, glukanaasi, papaiini, trypsiini tai pepsiini) voidaan lisätä fermentointiliemeen, keräyksen aikana, pH alueella 5 - 7,5 ja lämpötilassa noin 20 -noin 80 °C:ssa noin 30 minuutin - noin 5 tunnin välisenä aikana. Sitten lämpötila nostetaan 90 °C:seen tai korkeam-20 maksi 30 minuutin ajaksi kiteiden muodostumisen loppuun suorittamiseksi.

Toisessa kiteytyksen suorittamiseksi suositeltavassa menetelmässä voidaan fermentoriin lisätä fermentoinnin aikana noin 0,01 - noin 0,1 % w/v steriilejä amfoterisiini 25 B-kiteitä (liemen tilavuuden perusteella laskettuna) 10 -40 tunnin kuluttua fermentoinnin alusta, sen jälkeen fer-mentointia jatketaan kuten on kuvattu yllä kuumentamalla (kuten on kuvattu autolyysivaiheessa) tai ilman kuumennusta. Fermentoinnin lopussa amfoterisiini B-mikrokiteet ovat . 30 läsnä fermentointiliemessä, jotka kiteet voidaan erottaa.

Lämmön käyttäminen on edullista kylvämismenetelmän lisäksi.

Amfoterisiinikiteet on helposti erotettavissa liemestä millä tahansa kiinteä/neste-erotusmenetelmällä si-35 sältäen flotaatiotekniikan.

4 92938

Seuraavat esimerkit edustavat esillä olevan keksinnön suositeltavia suoritustapoja.

Esimerkki 1

Amfoterisiini B-kiteet tehtiin kuten on kuvattu 5 alla.

20 litran batch-viljelmä Streptomyces nodosus ATCC 14899 kantaa fermentoitiin amfoterisiini B tuottoa varten käyttäen alla mainittuja ympin valmistus- ja fermentoin-tiolosuhteita.

10 Ympin valmistus A. Ensimmäinen vaihe

Ympin lähde: Streptomyces nodosus ATCC 14899 viljelmän jäädytetty putki.

Alusta: 15 Glukoosi 1 % N-Z Amiini B 1,5 %

Hiivaekstrakti 1 %

NaCl 0,5 %

CaC03 0,1 % 20 pH säädetty 6,8 - 7,0

Tilavuus: 100 ml 500 ml:n pullossa Sterilointi: 30 minuuttia 121 °C:ssa Lämpötila: 25 °C

Inkubointi: 48 tuntia edestakaisin liikkuvassa ra-25 vistelijassa 220 kierrosta minuutissa.

B. Toinen vaihe

Ympin lähde: 10 % ensimmäisestä vaiheesta Alusta: Sama kuin ensimmäisessä vaiheessa Sterilointi: 30 minuuttia 121 °C:ssa 30 Tilavuus: 100 ml 500 ml:n pullossa

Lämpötila: 25°C

Inkubointi: 48 tuntia edestakaisin liikkuvassa ravisteli jassa 220 kierrosta minuutissa.

Il 5 92938

Germinaatio:

Alusta:

Nutrisoy-jauhe 5,0 %

Maissin liotusneste 1,6 % 5 NaCl 0,5 %

Silikonivaahdonesto 0,1 %

Sterilointi: 40 minuuttia 121 °C:ssa Lämpötila: 28 °C

Ravistelu: 0,7 HP/100 US-gallonaa (= 380 1)

10 Ilmastus: 1 WM

Germinaatiosykli: 28 tuntia

Ympin koko: 100 ml toisen vaiheen pullosta. Fermentointiolosuhteet:

Alusta: 15 Glukoosi 7,0 %

Soijapapuöljyjauho 2,5 %

CaC03 0,9 % KH2P04 0,01 %

Silikonivaahdonesto 0,02 % 20 Sterilointi: 45 minuuttia 121 °C:ssa

Lämpötila: 25 °C

Ravistelu: 3,5 HP/100 US-gallonaa (= 380 1)

Ilmastus: 1 WM Fermentointisykli: 136 tuntia * 25 Ympin koko: 14 % germinaatiovaiheesta

Tuloksena syntynyt kerättävä liemi sisälsi 2050 pg/ml amfoterisiini B:tä ja 390 pg/ml amfoterisiini A: ta.

Kerättävän liemen mikroskooppinen tutkimus ei pal-30 jastanut mitään kiteitä. Lientä kuumennettiin 60 °C:ssa 15 :·. minuuttia. Mikroskooppisella tarkastelulla liemen havait tiin sisältävän runsaasti amfoterisiini B-kiteitä, jotka oli helposti erotettavissa kerätystä liemestä flotaatiolla tai muulla halvalla erotustekniikalla.

92938 6

Esimerkki 2

Amfoterisiinijauheen talteenotto fermentointilie- mestä

Esimerkin fermentointipuoli oli samanlainen esimer-5 kin 1 vastaavalle, paitsi että fermentointialusta suodatettiin käyttämättömien soijapapujäännösten poistamiseksi käyttäen Sparkler-suodatinta, joka oli vuorattu puuvillakankaalla. Saatu suodos steriloitiin sitten uudestaan ja käytettiin fermentointialustana. Tuloksena saatu kerättävä 10 liemi sisälsi 960 pg/ml amfoterisiini B:tä 112 tunnin fer-mentoinnin jälkeen. Fermentointilientä käsiteltiin sitten useita minuutteja 120 °C:ssa amfoterisiinikiteiden muodostuksen indusoimiseksi. Huoneen lämpöön jäähdyttämisen jälkeen amfoterisiinikiteet erotettiin sitten sentrifugoimal-15 la ja kuivattiin 15 mmHgissa (=2 kPa) 25 °C:ssa 3 tuntia. Sellaisten talteenotettujen kiteiden havaittiin sisältävän 70 pg amfoterisiini B:tä/mg kiteitä kokonaissaannon ollessa 95 %.

Esimerkki 3 20 Entsymaattinen käsittely ja kuumennus

Esimerkin 2 menetelmän jälkeen, kun fermentointilientä oli käsitelty useita minuutteja 120 °C:ssa amfoterisiini B:n kiteytymisen indusoimiseksi, liemi jäähdytettiin ja pidettiin 35 °C:ssa ja pH noin 7,0:ssa; sitten liemeen 25 lisättiin lysotsyymiä ja annettiin reagoida 2 tuntia my-seelisolujen osittaiseksi hajottamiseksi. Lysotsyymiä lisättiin konsentraationa 4000* yksikköä/ml lientä. Amfoterisiini B-kiteet erotettiin sitten liemestä sentrifugoi-malla ja asetonikuivattiin. Sellaisen jauheen havaittiin . 30 sisältävän vieläpä korkeamman amfoterisiini B-sisällön kuin esimerkin 2 tuote.

* Yksi yksikkö on määritelty entsyymiaktiivisuudeksi, joka tuottaa 0,001 A450 per minuutti pH 6,24:ssä 26 °C:ssa.

n 7 92938

Esimerkki 4

Kylväminen

Seurattiin esimerkin 2 menetelmää, paitsi että lisättiin 0,1 g amfoterisiini B-kiteitä/1 40 tuntia fermen-5 toinnin aloituksen jälkeen.

Kuumennusvaiheen lopussa (fermentoinnin jälkeen) otettiin talteen amfoterisiini B-kiteet.

Esimerkki 5

Amfoterisiini B-kiteiden muodostaminen veteenliuke-10 nevassa fermentointialustassa Tämän esimerkin fermentointipuoli oli samanlainen kuin esimerkissä 1, paitsi että 2,5 %:nen soijapapuöljy fermentointialustassa korvattiin 1,25 %:lla spray-kuiva-tulla maissin liotusnesteen veteenliukenevalla muodolla 15 (toimittanut Roquette Corporation).

Liemi kuumennettiin noin 75 °C:seen 15 minuutiksi. Lämpökäsittelyn jälkeen liemi sisälsi amfoterisiini B-ki-teitä ja osittain hajonnutta myseeliä. Amfoterisiini B-kiteet erotettiin sitten nesteestä sentrifugoimalla ja ne 20 kuivattiin 15 mmHg:ssa (=2 kPa) 25 °C:ssa 3 tuntia. Amfo-terisiinin kokonaissaanto oli 95 %.

Claims (3)

92938

1. Menetelmä amfoterisiini B-kiteiden muodostamiseksi suoraan fermentointialustassa, viljelemällä Strepto- 5 myces nodosus -kantaa fermentointialustassa siihen asti kun vahva sientenvastainen aktiivisuus on muodostunut alustaan, tunnettu siitä, että eristysvaiheessa ei lisätä amfoterisiini B:n liuotinta ja, että kasvatuksen jälkeen alusta kuumennetaan 70 °C - 130 °C:n lämpötilaan 1 10 minuutin - 10 tunnin ajaksi amfoterisiini B-kiteiden muodostamiseksi ja amfoterisiini B-kiteet otetaan talteen suurina määrinä alustasta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että amfoterisiini B:tä sisältävä 15 alusta kuumennetaan noin 10 - 45 minuutin ajaksi amfoterisiini B-kiteiden muodostuksen aiheuttamiseksi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että amfoterisiini B:tä sisältävä fermentointiliemi kuumennetaan noin 121 °C:seen noin 20 20 minuutiksi amfoterisiini B-kiteiden muodostuksen li. 92938