CS242391B1 - Způsob izolace cystatinů, přirozených inhibitorů cysteinových proteináz, z roztoku získaných z přírodních materiálů pomocí imobilizovaných cysteinových proteináz - Google Patents

Abstract

Způsob spočívá v isolaci cystatinu z roztoku pomocí cysteinové proteinázy imobilizované polymerací glutaralčlehydem na polymerní nosič na bázi polyetylentsreftalátu vsádkovým uspořádáním při pH roztoku 5 až 8, s výhodou při pH 6,5» po následném oddělení pevné fáze s cystatinem a jejím opětném suspendováním do vodné fáze se cystatin uvolní z vazby s imobilizovanou cysteinovou proteinázou do vodného roztoku při pH menším než 3,5 nebo vyšším než 10,0.

Description

Způsob izolace cystatinů, přirozených inhibitorů cysteinových proteináz, z roztoku získaných z přírodních materiálů pomocí imobilizovaných cysteinových proteináz

Způsob spočívá v isolaci cystatinu z roztoku pomocí cysteinové proteinázy imobilizované polymerací glutaralčlehydem na polymerní nosič na bázi polyetylentsreftalátu vsádkovým uspořádáním při pH roztoku 5 až 8, s výhodou při pH 6,5» po následném oddělení pevné fáze s cystatinem a jejím opětném suspendováním do vodné fáze se cystatin uvolní z vazby s imobilizovanou cysteinovou proteinázou do vodného roztoku při pH menším než 3,5 nebo vyšším než 10,0.

242 391

- 1 242 391

Vynález se týká izolace cystatinů, přirozených inhibitorů cysteinových proteináz, z roztoků připravených z vajec, vaječného bílku, extraktů tkání a tělních tekutin živočichů, čerstvých, sušených nebo zmražených, pomocí cysteinových imobilisovaných proteináz.

λpřičemž

Postupy dosud použité pro izolace cystatinů^ cystatiny jsou přirozené inhibitory cysteinových proteináz bílkovinné povahy, o relativní molekulové hmotnosti 10 až 15 kD, stabilních v roztocích o pH 2 až 12, stabilních ve vodných roztocích při teplotách nad 80 G, schopných vazby na aktivní jakož i na inaktivováné deriváty cysteinových proteináz, využívají aktivních nebo inaktivovaných cysteinových proteináz imobilizovaných na polymerních nosičích na bázi modifikovaných agarosových gelů, například na gel Sepharosa 4B aktivovaný bromkyanem, který dodává firma Pharmacia Švédsko, nebo Reacti-gel firmy Pierce z USA, v provedení kolonové afinitní chromatografie. Tyto gely se vyznačují nízkou mechanickou odolností, neumožňují tlakovou filtraci ani intenzivní míchání rotujícími míchadly, bez poškození nosiče.

Podstata vynálezu spočívá v isolaci cystatinů pomocí cysteinových proteináz imobilizovaných polymeraci glutaraldehydem na polyetylentereftalét. Vzniklá suspenze imobilizované proteinázy na rigidních částicích pevné fáze lze filtrovat a míchat běžnými technickými prostředky, čehož se s výhodou využije pro izolaci cystatinů.

Suspenze imobilizované cysteinové proteinázy se připraví vaz bou z roztoku na polyetylentereftalát podle postupu čs. patentu č. 195 568.

242 391

Pro izolaci cystatinů se suspenze imobilizované cystěinové proteinázy smíchá s roztokem obsahujícím aktivní cystatin. Ve vzniklé suspenzi se upraví pH roztoku v rozmezí 5 až 8.

Po dosažení postačující vazby cystatinů na pevnou fázi se tato oddělí ze suspenze filtrací nebo sedimentací, volně nebo v odstředivce a promyje se od nespecificky sorbovaných složek výchozího roztoku cystatinů. Pro dosažení vhodného promytí se osvědčila destilovaná voda v nejméně šesti dávkách v množství 200 násobku suché hmotnosti nosiče, při proraývání odstřelováním, dekantací nebo filtrací.

Po promytí se cystatin z pevné fáze eluuje roztokem o pH menším než 5,5 nebo větším než 10,0 a oddělí se filtrací přes papírový filtr nebo sedimentací v odstředivce, či dekantací. Počet možných použití pevné fáze závisí na kvalitě promytí před elucí a podmínkách eluce.

Podle poměru, v němž je objem eluátu k objemu výchozího roztoku cystatinů, lze dosáhnout různého stupně nakoncentrování cystatinu v eluátu proti výchozímu roztoku, za současného odstranění většiny balastních složek z roztoku cystatinů. Po zahuštění roztoku cystatinů mrazovou sublimací a gelové filtraci na vhodném nosiči lze získat použitím cysteinových proteináz zmobilizovaných na polyetylentereftalát, preparáty cystatinů, které vykazují homogenitu na elektroforéze v 15% gelu polyakrylamidu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného v uspořádání podle Laemmliho. /U.K. Laemmli: Nátuře, /London/, 227» str. 680 A97O//.

Použití polymerního nosiče, polyetylentereftalátu, s navázanými cystěžňovými proteinázami pro izolaci cystatinů jež je předmětem tohoto vynálezu představuje proto nový přístup k řešení otázky izolace cystatinů a jeho hlavní výhody tkví ve vysoké mechanické pevnosti částic s zmobilizovanou proteinázou, což zajišťuje dobrou filtrovatelnost a umožňuje, intenzivní míchání suspenze, ve snadném oddělování pevné fáze sedimentací, možnosti recyklování jež snižuje nevýhodu vsádkového procesu ve srovnání s ko242 391 lonovým uspořádáním, tedy nižší výtěžnost, dále ve vyšší rychlosti provedení afinitního kroku, která se projeví především při zpracování velkých objemů roztoka o nízké koncentraci cystatinů, v dovozní nenáročnosti a nízké cené polymerního nosiče pro imobilizaci proteináz. Nevýhodou předmětu tohoto vynálezu je nutnost používat pro zajištění dobré čistoty výsledného preparátu cystatinů větších objemů promývacích roztoků, jejichž cena je ovšem nízká a dostupnost dobrá.

Podstatnou předností předmětu tohoto vynálezu je možnost použití proteinázy imobilizované na polyetylentereftalát pro izolaci cystatinů i z roztoků, které nejsou prosty koloidních částic, které jsou pro kolonovou afinitní nepoužitelné, stejně jako roztoky s vysokou viskozitou /například 3x koncentrovaný bílek/.

Výtěžnost kolonových chromátogra.fií cystatinů na afinitních nosičích udávají autoři v rozmezí 20 až 40 %. Při použití předmětu tohoto vynálezu se výtěžnost pohybuje v konkrétním případě vaječného bílku, kde je znám přibližný obsah cystatinů v intaktním materiálu kolem 10 % v prvním cyklu, lze ji však zvýšit recyklováním, nehledě na to, že bílek ze slepičích vajec je levnou surovinou, přístupnou ve velkých množstvích vznikající jako odpad při výrobě majonézy.

Příklad 1

Suspenze obsahující 1,25 g polyetylentereftalátu ve 25 ml fyziologického roztoku byla po přídavku 12,5 ml 25% roztoku glutaraldehydu a promíchání umístěna do termostatu a polymer aktivován při 37 °C po dobu 14 hodin. Polymer byl oddělen filtrací na Buchnerově nálevce přes papírový filtr a přenesen bez promytí do roztoku papainu obsahujícího 300 mg papainu ve 30 ml 0,1 M fosfátového tlumicího roztoku obsahujícího 0,002 M kyselinu etylendiamin tetráoctovou /dále EDTA/, o pH 6,3· Po kapkách bylo k suspenzi přidáno, za stálého míchání magnetickým michadlem, 3,3 ml 1% roztoku glutaraldehydu. Po třech hodinách míchání suspense při 22 °C byl polymer s navázaným papainem oddělen filtrací na Buchnerově nálevce přes papírový filtr a promyt postupně 2 dm? destilované vody, na filtru. Takto připravený imobilizovaný papain, byl

- 4 242 391 skladován v 1# roztoku NaCl okyseleném přídavkem HC1 na pH 3,0 při 4 °c několik měsíců bez ztráty vazebné kapacity.

Extrakt obsahující cystatin byl připraven z hovězích ledvin. 800 g zmrazených hovězích ledvin bylo rozmraženo, mechanicky zbaveno tukové tkáně a rozemleto na masovém mlýnku, poté smícháno se

I 600 ml destilované vody a homogenizováno v mixeru běžného kuchyňského typu po dobu 5ti minut. Po deseti minutách stání byly hrubé zbytky tkáně odstraněny z homogenátu odstředěním 6 000 x g po dobu 10 minut a supernatant byl dále odstředěn při 25 000 x g po dobu 30 minut, přídavkem 5M NaOH bylo pH v supernatantu ustaveno na 11,0 a roztok byl ponechán stát po. dobu 2 hodin. Všechny operace byly provedeny při 4 °C.

Po 2 hodinách stání při pH 11,0 bylo pH roztoku upraveno přídavkem 11 M HC1 na 7,5 a vzniklá sraženina byla odstředěna při 6 000 x g po dobu 10 minut. Poté bylo pH roztoku upraveno na 2,8

II M HG1 a roztok byl v průběhu 20 minut zahřát na vodní lázni na teplotu 90 °C. Po deseti minutách stání při této teplotě byl roztok rychle ochlazen pod tekoucí vodou na 25 °C a přídavkem 5 M NaOH bylo pH upraveno na 5,4· Vzniklá sraženina byla odstředěna při 6 000 x g, 10 minut.

150 ml takto získaného vyčeřeného extraktu bylo smícháno se smspenzí obsahující 1 g papainu zmobilizovaného na polyetylentereftalótu v 50 ml 0,1 M fosfátového tlumivého roztoku.obsahujícího 0,002 M EDTA a 0,002 M L-cysteinhydrochloriď o pH 6,3· Suspenze byla intenzívně míchána magnetickým míchadlem po dobu 30 minut při teplotě 25 °G a poté byla pevná fáze oddělena filtrací přes papírový filtr na Buchnerově nálevce, promytá 1 dm^ destilované vody a suspendována ve 150 ml destilované vody. V suspenzi bylo přídavkem 11 M HC1 upraveno pH na 2,8 a po 10 minutách míchání při 25 °C byla pevná fáze oddělena filtrací. Roztok obsahující uvolněný cystatin byl zahuštěn mrazovou sublimací.

Příklad 2

Postupem jako v příkladu 1 byly připraveny 4 g imobilizováného papainu /hmotnost nosiče s navázaným enzymem/. Z 30 kusů čerstvých slepicích vajec B /Pražské drůbežářské závody n.p., závod Libuš/ bylo odděleno 900 ml bílku a rozmixováno s 900 ml 0,25 M NaCl v kuchyňském mixeru. Vzniklý roztok měl pH 8,7· Přídavkem

- 5 242 391

5M mravenčanu sodného o pH 5,0 bylo pH v roztoku bílku upraveno na 6,2 a vzniklé sraženina ovomucínu byla odstředěna při 6 000 x g po dobu 10 minut»

Supernatant byl smíchán se suspenzí obsahující 4 g polyetylentereftalátu s navázaným paparnem ve 100 ml 0,1 M fosfátového tlumivého roztoku s 0,002 M EDTA o pH 6,5> který neobsahoval L-cystein hydrochlorid. Suspenze byla míchána přes noc magnetickým míchadlem. Pevná fáze byla oddělena odstředováním při 1 000 x g a promyta 6x11 destilované vody odstředováním při 1 000 x g po dobu 1 minuty.

Sediment byl přenesen do 200 ml destilované vody a cystatin byl uvolněn okyselením suspenze 11M HCl na pH 1,8. Po*deseti minutách míchání magnetickým míchadlem při 25 °C byl roztok obsahující uvolnění cystatin oddělen od pevné fáze filtrací přes skládaný papírový filtr a zahuštěn mrazovou sublimací.

Kromě eluce proběhly všechny operace při 4 °C.

Příklad 3

Vaječný bílek jež byl jednou použit a oddělen od pevná fáze před promýváním v příkladu 2 byl opětovně smíchán se suspenzí imobilizovaného papainu oddělenou po eluci v příkladu 2 a za podmínek stejných jako v příkladu 2 byla provedena vazba cysratinu zbyléno v roztoku bílku na zmobilizovaný papain a eluce navázaného cystatinu. Výtěžek cystatinu v eluátu byl o 21 % nižší než v příkladu 2.

Příklad 4

27,5 g sušeného slepičího vaječného bíl&u /pražské drůbežářské závody/ bylo rozmícháno a 80 ml destilované vody. Vzniklá pěna byla odstraněna odstředěním, 1 000 x g 10 minut nebo stáním po dobu 1 hodiny. Odstranění ovomucínu, vazba cystatinu a promyti suspenze zmobilizovaného papainu s navázaným cysteinem bylo provedeno jako v příkladu 2. V suspenzi bylo přídavkem 5 M NaOH ustaveno pH 11,5 a po míchání při 25 °C po dobu 10 minut byla pevná fáze oddělena odstředěním při 1 000 x g po dobu 1 minuty a v supernatantu upraveno pH na 7,0 přídavkem HCl. Supernatant obsahující uvolněný Cystatin byl zahuštěn mrazovou sublimací.

242 391

Eluáty cystatinu obsahovaly 5 až 10 mg aktivního cystatinu, v případě postupů uvedených v příkladech 2, 5, 4 S 0,7 a 2,0 mg cystatinu v případě postupu podle příkladu 1. Množství cystatinů byla stanovena pomocí titrace .roztokem kathepsinu H, o známém obsahu proteinézy, za použiti 4-nitroanilidu L-fenylalaninu jako substrátu.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob izolace cystatinů, přirozených inhibitorů cysteinových proteináz, z roztoků získaných z přírodních materiálů pomocí imobilizovaných cysteinových proteináz, vyznačující se tím, že se cystatin z roztoku váže na cysteinové proteinázy imobilisované polymerací glutaraldehydem na polymerní nosič na bázi polyetylentereftalátu vsádkovým uspořádáním při pH roztoku5 až 8,s výhodou při pH 6,5, po následném oddělení pevné fáze s cystatinem a jejím opětném suspendování do vodné fáze se cystatin uvolní z vazby s imobilisovanou cysteinovou proteinázou do vodného roztoku při pH menším než 3,5 nebo vyšším než 10,0.