CS233537B1

CS233537B1 - Způsob výroby krmného biologického preparátu na bázi exoproteáz

Info

Publication number: CS233537B1
Application number: CS832356A
Authority: CS
Inventors: Vladimir Lakota; Vladimir Bastl; Drahomir Adl; Frantiska Paleckova
Original assignee: Vladimir Lakota; Vladimir Bastl; Drahomir Adl; Frantiska Paleckova
Priority date: 1983-04-05
Filing date: 1983-04-05
Publication date: 1985-03-14

Abstract

Způsob výroby krmného biologického preparátu na bázi exoproteáz, při nšmž se tekutá živná půda obsahující krmnou mouku, suéené mléko a kvasnice a obohacená zahuštšnou kukuřičnou máčecí vodou a stopovými množstvími solí kovů podporující sporulaci vyšlechtěného mikroorganismu Bacillus subtilis CCM 3622 po fermentaci prováděné za teplot 26 ež 40 °C a za,,neustálého míchání a provzdušnování alespoň polovičním minutovým objemem vzduchu vztaženým na objem tekutá živné půdy upravuje přídavkem 0,1 až 0,3 H> hmot. krystalického CaClg v biologický krmný preparát, který se po případné úpravě pH na hodnotu 6,8 í 0,1 ve vakuové odparce zahustí 8 až 12krát.

Description

Vynález se týká způsobu výroby krmného biologického preparátu ns bázi exoproteáz vyprodukovaných vySlechténým organismem Bscillus subtilis CCM 3622, kterýžto preparát je používán jako přídavek do krmivá hospodářských zvířst.

Biologickou cestou dosud vyrábiné krmné doplňky jsou například stimulétory růstu antibiotického charakteru, jako chlortetracyklin, bacitracin, flavomycin apod. Tyto jaou vyráběny v technické formě usuěením půdy po odstranění nebo po sterilizaci produkčního kmene. Jinou skupinou biosyntetických stimulátorů jsou esenciální aminokyseliny umožňující optimální využití vžech dusíkatých složek krmivá. Jde např. o L-lyzin, L-treonin.

Jejich zpracování je jednoduchá, buň krystalizaci z bohatého filtrátu, nsbo usušením půdy po tepelné sterilizaci mikroorganismů. Po lepěl využití krmivá jsou vSak připravovány stále častěji enzymatické preparáty, zejména technické proteázy, amylázy a lipázy, případně jejich směsi. Některé z těchto preparátů jsou připravovány známou kultivací kmene Bscillus subtilis CCM 3622. Účinek preparátů na bázi tohoto mikroorganismu je založen na obsahu neutrálních a alkalických proteáz, které u zvířat s nedostatečnou účinností vlastních proteáz zvySují využití podaného krmivs a tím přináěejí vlastně jeho úsporu.

Použitím mikroorganismu Bacillus subtilis bylo už dosaženo ve výrobě mikrobiálního syřidla dobrého výtěžku za aplikace aerobních podmínek v tekuté živné půdě obsahující jako základní zdroje živin krmnou pěeničnou mouku, suěené mléko, sladinu a kvasnice nebo kvasní čný extrakt.

Účelem vynálezu je vyprecovat s využitím tohoto poznatku způsob výroby krmného mikrobiálního preparátu, který by využil vedlejších produktů ze zpracovávání krmiv Si jejich přísad a tím přispěl i ke zhospodárnění masové produkce tohoto druhu krmných preparátů.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že při výrobě tohoto krmného biologického preparátu na bázi směsi exoproteáz vyprodukovaných vyšlechtěným mikroorganismem Bacillus subtilis CCM 3622 kultivovaným za aerobních podmínek v živné půdě obsahující jako základní zdroj živin krmnou mouku a sušená mléko pro jejich asimilovatelný dusík a uhlík a suěené kvasnice jako zdroj vitaminů se pevné složky této živné půdy obohatí přídavkem 2 až 4 % hmotnostních zahuštěné kukuřičné máčecí vody o obsahu vlhkosti do 40 %, načež se tato půda doplní deionizovanou vodou nebo pitnou vodou, jekoetí odpovídající normě CSN 830611, v množetví na 100 % obj. a mikroorganismus Bacillus subtilis CCM 3622 ss v táto tekutá živné půdě obohacené o stopové přídavky eolí kovů podporujících jeho eporulaci kultivuje za teploty 26 až 40 °C, přičemž vzdušnění této živné půdy ae provádí alespoň polovičním minutovým objemem vzduchu, vztaženým na objem táto tekuté živné půdy, načež po ukoněení kultivace se do této živné půdy přidává 0,1 až 0,3 % krystalického CaClj, její kyselost se případně upraví ma hodnotu pH 6,8 v rozmezí 1 0,1 a takto vzniklý .biologický preparát 3e za působení podtlaku -85 až -90 kPa 8 až 12krát zahustí.

Výhody a pokrok tohoto řeěení lze spatřovat v tom, že při daném složení živná půdy se její obohacení vitaminy a některými stopovými prvky důležitými pro fermentaci provádí zahuštěnou kukuřičnou máčecí vodou, která je produktem zbylým po přípravě kukuřice ke krmným účelům. Tato zahuštěná kukuřičná máčecí voda se podílí na zvýšená produkci blomasy vznikající kultivací použitého mikroorganismu. Deionizovaná voda má svou přednost v tom, že nemůže nepříznivě ovlivňovat složení živná půdy jako pitná voda, která podle místních poměrů často takové látky obsahuje. Proto v případě použití pitná vody v tekutá živná půdě je nutný její předběžný rozbor, který rozhodne o její vhodnosti či nevhodnosti.

Bližěí podrobnosti způsobu podle vynálezu jsou patrny z popisu příkladu jeho provedení, který má přirozeně povahu pouze ilustrativní, nikoliv omezovači.

Způsob výroby krmného biologického preparátu podle vynálezu vychází přirozeně z vypěstované kultury vyšlechtěného mikroorganismu Bacillus subtilis CCM 3622 vyrostlé na maso3 peptonovém agaru s 2 % hmot. laktózy, 0,000 6 % hmot. MnClg, 0,008 % hmot. CaClg a 0,007 % hmot. MgClg. Uvedená laktóza působí jako zdroj asimilovatelného uhlíku a uvedená stopová poměrová množství solí kovů podporují sporulaci tohoto mikroorganismu. Kultivace tohoto mikroorganismu nejlépe probíhá při teplotě 37 °C a trvá tři až čtyři dni. Takto vypěstovaná kultura se musí uchovávat v chladničce při teplotě +5 °C, aby se dala používat pro očkování živné půdy, do které se její spory za pomoci očkovací kličky přenášejí k dalšímu množení, např. v Erlenmayerových baňkách.

Pro laboratorní přípravu krmného biologického preparátu se pro Erlenmayerovy baňky o objemu 750 ml připraví půda tohoto složení:

krmná mouka	4 % hmot.
sušené odtučněné mléko	1,5% hmot.
sušené kvasnice	0,6 % hmot.
MgClg	0,007 % hmot.
MnClg	0,000 6 % hmot
CaClg	0,008 % hmot.

A

Tato živná půda se obohatí 3 % hmot. zahuětěné kukuřičné máčecí vody s obsahem vlhkosti do 40 % hmot. a v uvedené baňce smí zaujímat asi 10 % jejího objemu, tj. v daném případě cca 80 ml. Hodnota pH takto obohacené půdy se neupravuje, nebol po následující sterilizaci má hodnotu pH 6,0. živná půda se sterilizuje při 120 °C po dobu 30 minut.

Sušené mléko je vhodnější sterilizovat zvlášl jako 10% až 20% hmot. roztok při stejné teplotě po dobu 20 minut a přidávat je až do sterilní živné půdy tak, aby obseh mléka v živné půdě byl 1,5 % hmot. a celkový objem této půdy byl při použití Erlenmayerových baněk uvedeného objemu nanejvýš 80 ml.

Kultivace v těchto Erlenmayerových baňkách se provádí po přidání pitné vody, případně deionizované vody na rotační třepačce o 270 ot/min a s výchylkou 25 mm. Vzorky pro kontrolu produkce exoproteáz se odebírají ve 48. a 72. hodině kultivace. Maximální produkce exoproteáz se dostavuje obvykle ve 48. hodině, a to asi 9 000 SRN (syřivá aktivita).

Tento příklad tedy ilustruje laboratorní přípravu prepetáru podle vynálezu. Pro kultivace ve větších objemech se připravuje vegetativní inokulum 16 až 18hodinovou kultivací na třepačce v Erlenmayerových baňkách o objemu 750 ml s 80 ml živné půdy uvedeného složení, která se naočkuje stejným způsobem, jaký už byl popsán. Tímto vegetativním inokulem v poměrném množství 0,5 % lze očkovat přímo živnou půdu ve fermentačním tanku sloužícím k průmyslové výrobě biologického krmného preparátu stejně tak jako kultury vyprodukované předešlým laboratorním postupem.

Ve fermentačním tanku, zaplněném s výhodou jen do poloviny svého objemu tekutou živnou půdou výěe uvedeného složení, je mikroorganismus Bacillus subtilis CCM 3622 kultivován při teplotě 37 °C za míchání živné půdy asi 500 ot/min a za současného provzdušňování alespoň polovičním minutovým objemem vzduchu ve vztahu k objemu tekuté živné půdy, načež po uplynutí 18, 24, 30, 36, případně 42 hodin kultivace se kontroluje produkce exoproteáz.

Jejich maximální produkce 8 000 až 9 000 SRN se dostavuje v době mezi 30. a 36. hodinou kultivace. Dosažením maxima je kultivace prakticky ukončena a fermentační tekutina se pak zpracuje na koncentrát přidáním 0,2 % hmot. krystalického CaClg, její kyselost se případně upraví na pH 6,8 ± 0,1 a nakonec se 8 až 12-krát zahustí. Tím vznikne biologický krmný preparát vhodný jako přídavek do krmivá hospodářských zvířet. Jeho účinek je uveden v následujícím.

Složení krmné smčsi A 1:

rybí moučka masokostní moučka krevní úsuáky krmné kvasnice extrahovaný sojový Škrob odtučnéné mléko pšenice ječmen kukuřice krmná sůl

MKP 3

DB Pí mletý vápenec

1,25 % hmot 1,00 % hmot
0,80	%	hmot
5,50	%	hmot
8,20	%	hmot
0,50	%	hmot
35,00	%	hmot
35,00	%	hmot
10,00	%	hmot,
0,30	%	hmot
0,50	%	hmot
0,20	%	hmot,
0,50	%	hmot

Složení doplňku biofaktorů DB P 1:

Vitamin A	1 000 000 mj,
Vitamin D₂	200 000 mj,
Vitamin B, ₂	6 mg,
Vitamin B₂	1 200 mg
Niacin	1 500 mg
Lysinchlorid	80 000 mg
Krmná mouka pSeničná ad	1 kg

Složení minerální krmné přísady MKP 3:

mletý vápenec minerální doplnčk MD 3 Ca₂HPO₄ pyrofosforečnen sodný celkový obsah vápníku v celkový obsah foaforu v

MKP 3 MKP 3 až 78 % hmot. 2 % hmot.

až 25 * hmot. 0 až 7 % hmot. 34,8 % hmot,

4,2 % hmot.

Složení doplňku MD 3:

síran železnatý	300	000	mg
síran mšďnatý	100	000
kysličník zinečnatý	30	000	mg
uhličitan manganatý	50	000	mg
síran kobaltnatý	15	000	mg
jodid draselný	5	000	mg
sádra	50	000	mg
pšeničná mouka krmné	ad 1	kg

Pokusná smčs obsahovala 1 % preparátu dle vynálezu, kontrolou byla pouze smčs A 1, V pokusech s 40 až 90 dní starými prasaty byl denní přírůstek o 15 % hmot. vySSí ve srovnání s kontrolou. Denní spotřeba krmivá byla u pokusné skupiny o 13,5 % nižší proti kontrole bez preparátu dle vynálezu.

Claims

Způsob výroby krmného biologického preparátu ηβ bázi exoproteóz vyprodukovaných vyšlechtěným mikroorganismem Bacillus subtilis CCM 3622 za aerobních podmínek v živné půdě obsahující jako základní zdroj živin krmnou mouku, sušené mléko, jako zdroj asimilovatelného dusíku a uhlíku, a sušené kvasnice jako zdroj vitaminů, vyznačený tím, že k těmto složkám živné půdy se přidávají 2 až 4 % hmot. zahuštěné kukuřičné máčecí vody o obsahu vlhkosti do 40 % hmot., načež se po přídavku deionizované vody nebo pitné vody

A odpovídající ČSN 83 06 11 v množství do 100 % obj. kultura mikroorganismu Bacillus subtilis CCM 3622 na této tekuté živné půdě obohacené o stopové přídavky solí kovů podporujících jeho sporulaci, kultivuje za teploty 26 až 40 °C, přičemž vzdušnění této živné půdy se provádí alespoň polovičním minutovým objemem vzduchu, vztaženým na objem této tekuté živné půdy, načež po ukončení kultivace se do této živné půdy přidává 0,1 až 0,3 % hmot. krystalického chloridu vápenatého, její kyselost se případně upraví na hodnotu pH 6,8 i 0,1 a takto vzniklý biologický krmný preparát se za působení podtlaku -85 až -90 kPa zahustí 8 až 12krát.