CS231763B1 - Sposob přípravy prostriedku pre viazanie protilátek - Google Patents

Description

2317S3

Vynález sa lýka spůsobu přípravy pro-striedku pre viazanie protilátok, ktorý jeurčený najma pre diagnózu systémovéholupus erythematosus.

Doteraijšie testy pre diagnózu systémové-ho lupus erythematosus vychádzajú z obja-vu tzv. LE-bunkového fenoménu, resp. tes-tu Hargraves Μ. M., Richmond H., MortonR., Pr-oc. Mayo Glin. 23, 25 až 28, 1948; otomto fenoméne sa dokázalo, že v ňom akoefektor účinkujú protilátky proti deoxyribo-inukleoproteínu, povodně· označené ako LE--faktory. Je známy rad testov, ktoré tentofakt zúžitkovali a najviac sa rozšířili aglu-tinačné testy. Vačšinou však tieto testy ne-spíňajú nároky praxe, najma pokia! ide ocitlivost. Aglutinačné testy preferuji! lenurčitú část protilátok a bývajú pozitivně v14 až 86 % sér, podlá koncentrácie proti-látok, ktoré tieto obsahujú Chapman J. C.,Amer. j. med. Technol. 42, 154 až 157, 1978.V testoch, ktoré sú obchodné dostupné sapoužívajú latexové častíce, potiahnuté de-oxyribonukleoproteínom: firemná literatúraHyland, Lederle, Fisher.

Deoxyribonuklooproteín je zložka chro-matínu a na jeho přípravu sa využívá jehonerozpustnost pri fyziologickej iónovej si-le, t. j. pri koncentrácii NaCl 0,15 mol.. dm-3 a relativná rozpustnost alebo dis-pergovatelnosť pri nízkej alebo vyššej ió-novej sile. Nedosjtatok tohoto klasickéhopostupu je tendencia deoxyribonukleopro-teínu vytvárat iréverzibilne nerozpustnýgél, a to už pri relativné nízkej koncentrá-cii, nad 0,8 g . dm-3 deoxyribonukleoproteí-nu, ďalej pri prezrážaní alkoholom alebosofami, a tiež keď sa predčistený materiálnechá dlho stát a homogenizácia nie je dostintenzívna. To sa v súčasnosti obchádza nazáklade poznatku, že chromatín je zlože-ný z menších podjednotiek — nukleozó-mov — a tieto je možné získat na rozdielod predchádzajúcich mechanických postu-pov, působením enzýmov, ako napr. mikro-kokovej nukleázy alebo extrakciou při se-lektívnej koncentrácii niektorých solí NollM., Thomas J. O., Kornberg R., Science 187, 1203, 1975; Fenske a spol., Acta med. biol.germ. 39, 343 až 354, 1980. Tieto postupysú zložité, nákladné a výtažky bývajú ma-lé, menšie ako 25 % východzieho materiá-lu. Takéto přípravky slúžia hlavně pre ba-datelské ciele.

Uvedené nevýhody odstraňuje sposob pří-pravy prostriedku pre viazanie protilátok,tvořeného deoxyribonukleoproteínom, priktorého príprave sa vychádza z tefaciehotýmusu, jadier kuřácích erytrocytov aleboz materiálu s hmotnostným zlomkom jadiernad 0,5, vyčištěného opakovanou extrak-ciou fyziologickým roztokom. Podstata vy-nálezu spočívá v zbotnaní zvyšku a autolý-ze vo vodě alebo roztoku chloridu sodné-ho v koncentrácii do 0,01 mol. dm-3 počas8—48 hodin, pri teplote 0 až 10 °C a v 2až 5-násobnom podrobení vibračnému účin-ku s frekvenciou 10 až 30 kHz pri výkone50 až 1300 W při teplote 0 až 10 °C. Získa-ný materiál sa vysuší mrazovou subllmá-ciou a získá sa stabilný preparát vo forměbielej, páperovitej látky, dobré rozpustnejv roztokoch solí i vo vodě. Použitelnosttakto připraveného prostriedku na viaza-nie protilátok, LE-faktorov, jo možná na zá-klade poznatku, že aj napriek enzýmovej avibračinej degradácii a zníženiu molekulo-vej hmotnosti si zachovává potřebné anti-'génne determinanty. Výhodou tohoto sposobu přípravy je hlav-ně to, že sa dá uskutočniť jednoducho anenákladné. V laboratórtnych podmienkachsa dá připravit také množstvo substancie,aké je potřebné na jej priemyselné využi-tie. K důkazu účinku slúži nasledujúca ta-bulka, udáyajúca výsledky testovania sérchorých s pozitívnym LE-bumkovým testom,'ktorý sa v tomto případe může považovatza referenčný. Analýzy sa vykonali testova-cími súpravami Hyland, Lederle a pomocouprostriedku podfa vynálezu, enzýmovou imu-noanafýzou na detekciu protilátok proti de-oxyribonukleoproteínu triedy IgG (IgG——ainti—DNPj.

Tabulka

Test Počet analyzovaných vzoriek Pozitívnych vzoriek počet % Hyland Lederle 76 36 47,4 IgG—anti—DNP 94 76 80,9 podlá vynálezu 157 138 87,9

Tieto výsledky dokazujú, že prostriedokpodlá vynálezu je najúčinnejší v porovna-ní s referenčným testom, v zmysle zhody vpozitivitě oboch testov. Příprava deoxyribonukleoproteínu známý-mi postupmi vedle k malým výťažkom pro- duktu, ktorý je limitované rozpustný. Běž-ný postup spočívá v homogenizácii tkani-va, alebo izolovaných jadier v štandardnomsolinom roztoku 0,15 mol. dm-3 NaCl, čo saopakuje dotiaf, kým sa už neextrahuje sig-nifikantně množstvo proteinu. Nerozpustný

Claims (2)

1. zvyšok isa potom rýchlo homogenizuje v ti-síiC-násobnom přebytku slabého solného roz-toku, 0,015 mol. dim-3 NaCl a menej a cen-trifuguje pri vysokom zrýchlsaí 15 000 . ga viac. Typicky sa z 10 g íeíacieho týmusuvyťaží 0,20' až 0,50 g deoxyribonukleopro-teínu. Postup pódia vynálezu je jednoduchý apřitom účinnější. Poskytuje vačšie množst-vo isubstancie, s výhodnějšími vlastnosťami.Postup přípravy vynálezu jo ďalej objasně-ný ma príkladoch, ktoré ale jeho rozsah anineobmedzujú ani nevyčerpávajú. Přikladl 10 g telacieho týmusu, ktorý bol predbež-ne dokladné extrahovaný štandardným sol-ným, roztokom, obsahujúcim 0,15 mol. dm-3NaCl, sa dispergoval pomocou kuchyňské-ho mixéru v 250 ml 0,01 mol. dm-3 NaCl agél sa nechal stát v chlade pri 5 °C 10 až18 hod., kým nemabotnal. Gél sa potom dis-pergoval pomocou injekčnej striekačky strubičkou 0 2,0 až 2,5 mm a podrobil so-nikovaniu pri výkone 100 W a frekvencii20 kHz. Teplota nesmie vystúpiť na 10 ’C.Po scentrifugovaní pri 15 000 g počas 1 hod,a 5 °C sa sediment podrobil rovnakému so-nikovaniu opakované, až sa v sedimente ne-nachádzaia deoxyribonukleová kyselina. Ex-trakty sa zlyofilizovali a vyťazilo sa takspolu 1,7 g preparátu. Tento sa dobré roz-pusta vo vodě alebo v solných roztokoch.Roztoky majú charakteristické spektrum vultrafialové] oblasti, kde vykazujú Amax =— 257 nm a Amin = 237 inm. Poměr absor-bancií pri 260 a 280 nm je 1,3 až 1,5 v šty-roch frakiciách a hmotnostný poměr pro-teín/DNA bol 1,0 až 1,6. Na přípravu je výhodné použit tkanivábohaté na obsah deoxyribonukleoproteínua vedla týmusov sú osobitne výhodné ajjadrá z kuřácích erytrocytov, ktoré sa da-jú 1'ahko připravit v čistom stave. Příklad
2. 2 . Asi 150 ml kuracej krvi sa premylo 4 rá-zy fyziologickým roztokom a podrobilo lý-že v 0,01 rool.dim-3 CaCl2. Jadrá sa zachy-tili scentrifugovaním lyzátu pri nízkých ob-rátkách a premyli sa štandardným sofnýmroztokom až do zjavného odstránenia he- moglobinu. Jadrá sa narušili dvojnásobnýmzmrazením a rozmražením a podrobili sazbotnaniu v 100 ml vody počas 18 hod. Natosa dispergovali a podrobili sonlkovaniu pri100 W a 20 kHz pri tepláte do 10 °C vždy 1min, načo sa stočili pri 15 000 g 1 hod. a 5stupňov Celsia a zvyšok sa opat podrobilsonikovaniu, Po 5 sonikáciách sa prakticky.všetok nukleoproteín jadíer previedol doroztoku a po mrazovej sublimácii sa získa-lo 1,35 g 'bielej páperoviíej látky. Rozpúšťalsa dobré vo vodě i v solných roztokoch scharakteristickým, spektrom v ultrafialové]oblasti. Poměr absorbancií pri 260 a 280 nmbol 1,05 až 1,4 a hmotnostný poměr pro-tein,/DNA 1,0 až 1,7. V priebehu niekofkých dní sa dá připra-vit týmto postupom také množstvo substan-cie, ktoré vystačí pre priemyslové zhoto-venie testovacích súprav na screening sy-stémového lupus erytíhematosus. Prosíriedokje dlhcdobe 'skladovatelný v chladničke priteplote pod 10 °C. Preparáty skladované 2roky sa dali použit v teste. Před přípravoutestovacích skúmaviek alebo mikrodosieksa prosíriedok rozpustí vo vodě a jeho kon-centráci-a sa nastaví výhodné tak, že v sol-nom roztoku 0,15 mol. dm“3 NaCl a 0,015mol. dm-3 trinátriumcitrát dává absorban-ciu pri 260 nm 0,5. Skúmavky, mikrodosky,všeobecná pevná fáza, sú výhodné z poly-styrénu a naplnia sa roztokom prostriedkutak, aby sa získala dostatočná aktívna plo-cha. Pláštenle, aktivovanie pevnej fázy prebeh-ne za 15 až 18 hod. pri 5 °C, načo sa roz-tok odsaje a pevná fáza sa opakované pre-myje vodou. Testovanie sér sa uskuteční na-plněním vhodné riedeného séra, ktoré sapo inkubácii odstraní a pevná fáza sa opatdokladné propláchne. Viazané protilátky sahapokon odhalia inkubáciou, pomocou ainti-globulínového konjugátu, označeného vý-hodné enzýmom, ktorého farebný produktje úměrný koncentrácii viazaného konjugá-tu a tým aj protilátky. Rozsah reaktivity tes-tovaného' séra sa može výhodné porovnats reaktivitami pozitívneho a negativného re-ferenčného séra. Využitie prostriedku v en-zýmoimunologickom teste umožňuje speci-fický a citlivý screeining chorých so systé-movým lupus erythematosus, s možnoisťoukvantitativného určemia protilátek v roz-nych imunoglobulínových triedach. PREDMET Sposob přípravy prostriedku pre viazanieprotilátek tvořeného dooxyribonukleopro-teínom, pri ktorého přípravě sa vychádza ztelacieho týmusu, jadier kuřácích erytrocy-itov alebo z materiálu s hmotnostným zlom-komi jadier ina 0,5, vyčištěného opakovanouextrakciou fyziologickým roztokom, vyzna-čujúci sa tým, že sa predčistený zvyšok po- vynAlezu drobí zbotnaniu a autolýze vo vodě aleboroztoku chloridu 'sodného v koncentrácii do0,01 mol. dm-3 počas 8 až 48 hodin, při tep-lotě 0 až 10 °C a vibračnom účinku s frek-venciou 10 až 30 kHz pri výkone 50 až 100W pri teplote 0 až 10 °C, ktorý sa opakuje2- až 5krát.