CS230296B1 - Method of arachnid encephalitis in vitro - Google Patents

Description

Vynález sa týká optimalizácie a štandar-dizácie produkcie virusu ktiešťóvej encefa-litidy (KE] v buňkových! kultúrach za' ůče-lom získania vysokého množstva virusu ozmačnej východiskové] čistotě,

Produkcia virusu KE in vitro je podmien-kou výroby živých, formclizovaných, alebosubjednotkových (chemo-) vakcín, připad-ne antigénov virusu p;e diagnostické úče-ly, v laboratórnom, poloprevádzkovom, čipriemyselnom rozsahu, Kritériami kvalityprodukčného postupu by mali byť: — vyso-ký výřaZok virusu vyhovujúcej až vysoké]východiskové] čistoty, — nízké produkčněnáklady a — nízký stupeň pracnosti a pra-covitého rizika. Z doteraz známých postupov produkcie·virusu KE in vitro, a] v priemyselnom roz-sahu, spomenutým kritériám najlepšie vy-hovuje postup produkcie v rollerových fla-šiach (F, Heinz, Ch. Kunz, Acta Virol., 21:301—307, 1977; i b i d, 23: 189—197, 1979).

Na produkciu virusu slúžia uzatvorené ná-doby, pufrovanie médií sa robí HEPES-puf-rom a z pomnoženého virusu sa po jeho o-čistení a opracovaní kationickým detergen-tom připravuje cliemovakeína.

Podstatou vynálezu je optimalizovaniepodmienok produkcie virusu in vitro tak,aby sa zabránilo stratám pomnoženého vi-rusu v důsledku jeho pH-lability a termola-bllity a zároveň sa zohfadnlli potřeby pro-dukujúcich buniek. Vypracovaný postup zá-roveň rieši problém, štandardizácie produk-cie virusu KE in vitro; K experimentálně overeným zásadám pro-dukcie virusu KE in vitro patria: — použi-tie hustých jednovrstiev buniek (nie je mož-né při použití rollerovej techniky); — prá-ca s vodorovné uloženými jednovrstvami bu-niek za účelom minimalizácie objemu nu-trientu potřebného na prekrytie . jedno-vrstiev; — inoknlácia buniek lyofilizovanýmzásobným vírusom o známom a dlhodoboudržatelnom imfekčnom titri; — pufrovanieživných médií puframi o vysokej pufrova-cej kapacitě, zabezpečujúcimi malé výkyvypH, a to iba v mřeme alkalické] oblasti, vrámci biologických rytmov buniek v priebe-hu ich kultivácie, aj v rámci vlastitého spra-covávania buňkových kultúr a umožňujúci-mi kultiváciu buniek v .nepřítomnosti vzdu-chu obohateného 5% CO2; — zber virus ob-sahujúceho média v krátkých, 5- až 12-ho-dinových intervalech; — použitie médií ne-obsahujúcich sérum za účelom prevencieuplatenenia sa v sérach přítomných proteáz;— zníženie produkčnej teploty o 1 °C, te-da na 36 °C,

Použitie nízkej multiplicity infekcie, te-da 0,03—0,05 infekčných jednotiek na buň-ku s následným infikováním ostatných bu-niek v jednovrstvé vírusom v nej pomnože-ným umožňuje lyofilizovať primerane ma-lé objemy zásobného virusu, znamená vne-seme malého množstva cudzorodého mate-riálu v inokule do produkčného systému a zvyšuje stupeň očistenia povrchu buňko-vých jednovrstiev výměnou média v 24. ho-dině po infekcii, Inokulácia buniek štan-dardnou infekčnou dávkou umožňuje zbervirusu ako v širšom časovom rozpátí, tedamedzi 24. až 72. hodinou po infekcii, tak ajv optimálnom období vrcholu virusové] pro-dukcie, teda okolo 40. až 66. hodiny po in-fekcii. Přitom je možné robit časté výmě-ny nutrientu s médiom o zníženom obsahuaminokyselin až o 80 %, bez nebézpečia zní-ženia vírusovoj produkcie či poškodenia pro-dukčných buniek.

Například, ak sme robili produkciu viru-su na primárných kuřácích embryonálnychbuňkách v jednovrstvé o ploché 2250 cm2obsahujúcej asi 1,3 x 109 buniek a zbiera-li sme v nevýhodné dlhých 24-hodinovýchintervalech, po očistění virusu v ultracen-trifúge sa dařilo detegovať okolo 1,1 mg ví-rusovej hmoty. Přitom sa v priebehu 1. dňakultivácie dařilo detegovať 4 %, v priebe-hu 2. dňa 70 % a v priebehu 3. dňa 26 %produkovanej vírusovej hmoty. Pri voibekratších zberových intervalov je důvodnépředpokládat vyššie výtažky virusu, nakoí-ko poločas stálosti virusu pri produkčneýteplote je krátký — okolo 3 hodin. Přibliž-né za tuto dobu ubudne polovica biologic-ké) aktivity virusu KE, na ktorú změnu bez-prostředné navazuje fyzická dezintegráciavirusových častíc. V nasledujúcom texte sa používajú v od-borných textech běžné skratky: KE — klieš-tová encefalitida, KEB — kuracie embryo-nálně buňky; BHK—21 — stabilná buňkoválínia 1'advín novorodeného škrečka; PS —stabilná buňková línia prasačích l'advín;BEM — bazálne Eaglovo médium,; TBS —fyziologický roztok pufrovaný 7 mM Tris--HC1 pufrom; PBS — fosfátovým pufrompufrovaný fyziologický roztok. Přikladl

Do skleněných alebo jednorázových ná-dob s rovným dnom (napr. Petriho misky,Rouxové flaše opatřené buničinovou zátkoua pod.) o 1'ubovolnej kultivačnej ploché sazasejú KEB v BEM, Parkerovom médiu 199,alebo Eaglovom médiu s obsahom 10 % in-aktivovaitého telacieho séra a pufrovanom7 mM Tris-HCl pufrom pH 7,7 pri 24 °C vdávke cca 6,5 x 105 buniek na 1 cm2. Buň-ky sa súmerne rozvrstvia po celej plochédna kultivačnej nádoby v takom objememédia, aby výška vrstvy média nad buňka-mi bola 1 m,m„ Buňky sa kultívujú 16—20hodin pri 37 °C. Aby sa zabránilo podchla-deniu a následnému odlučovaniu hustýchjednovrstiev od dna kultivačných nádob, vďalšom sa pracuje s roztokmi predhriatymi,na 30—36 °C. Zásobný virus KE sa skladuje pri —18 °Cv lyofilizovanom stave v ampulkách zata-vených za vákua. Použitý genetický homo- 230298 génny a na genetické markéry analyzovanýklon P—-III E kmeňa I-Iypr virusu kliešťovejencefalitidy (Mayer, V., Acta Virol., 6: 309——316, 1962) sme připravili vo formě 20 %(v/oj suspenzie z mozgov agonických ci-cajúcich krýs v TBS pH 8,0, opracovali v ko-nečne-j koncentrácii 0,5 % (v/o) síranomprotamínu po dobu 30 minut pri 4 °C, cen-trifugovali pri 1500 g 15 minut a superna-tant sme rozplnili po 0,4 ml do ampuliek.Lyofilizovali sme 6 hodin nad kysličníkomfosforečným. V jednej ampulke sa nachádza-lo okolo 108 LD.50, ktoré množstvo infekč-ných jednotiek dostačovalo na inokuláciubuniek přichycených na ploché 2200—3000cm2. Zásobný roztok síranu protamínu (5%,v/o) sa kontroluje a upravuje na pH 8—8,5.Rovnako možno lyofilizovať virus pomno-žený v buňkových kultúrach po opracovanímédia 0,025 % protamínu. Zásobný virus sa resuspenduje v PBS pH7,2-7,4 a aplikuje sa v objeme prekrýva-júcom jednovr-stvu buniek do výšky 0,7 mm.Po 90 minutách pri 25 36 °C, za občas- nej agitácie produkčných nádob sa inoku-lum odstraní, buňky možno premyť raz činiekolko rázy polovičným obj&mom pred-hriateho PBS, a nakoniec sa prevretvia dovýšky 0,7 mm živným médiom bez obsahuséra. Pufrovanie médií je rovnaké ako prizasievaní buniek. Buňkové jednovrstvý sakultivujú pri 36 °C, médium z prvých 24hodím kultivácie sa vylieva. Možno opako-vat premytie povrchu jednovrstiev PBS, při-padne odstrániť ešte aj živné médium v 36.hodině po infekcii. Tým sa dosiahne vysokýstupeň očistemia povrchu jednovrstiev odzvyškov připadne na ich povrch adsorbova-ných materiálov zo séra, inokula a nevitál-nych buniek. V tomto časovom úseku, tedana začiatku zberu virus obsahujúceho mé-dia, je možné začat pracovat s médiami ozníženom obsahu aminokyselin až o 80 %,výšku vrstvy média nad jodnovrstvami vo-lit medzi 0,7 až 0,5 mm a zbery média ro-bit v krátkých 5- až 12-hodinových inter-valoch. V případe opakovaného preplacho-vania buniek pomocou PBS je vhodné při-dat do produkčných médií minimálně množ-stvo kyslého uhličitanu sodného nevedúce kzásadným změnám pH v nehermeticky uza-vretých produkčných nádobách. Pri vyso-kých nárokoch na sterilitu produktu je mož-né použit prachotěsně uzatvoritelné a steri-lizované podnosy, v ktorých sa produkčněnádoby vkladajú do termostatu. Ak sa po-čítá s opracováním virus obsahujúcich mé-dií 0,25 % síranoím protamínu a následnoupurifikáciou virusového produktu, je mož-né produkčně nádoby volné ukladať na ek-vílibrizované rovné podnosy z tvrdého ma-teriálu (napr. perforované sklo hrůbky 6——10 mm) v termostate opatrenom těsněnímproti prieniku prachu a udržiavanom v pa-tričnej čistotě.

Pomnožený virus obsahujúce médium sa ihned' po zbere schladí a až do spracovania sa skladuje pri 4 °C. Množstvo pomnožené-ho virusu sa stanoví menej presne titrácioujeho infekčnej alebo hemaglutinačnej akti-vity, alebo presnejšie po čiasíočnej purifi-ká-cii v ultracentrifúge, ktoroukofvek vhod-nou metodou na stanovenie proteinu.

Ak sa jedná o živú očkovaciu látku osla-beného virusu pre veterinárně účely, zo-zbieraný virus možno okamžité- lyofilizovaťa stanovit jeho biologické aktivity až v lyo-filizáte. Z pomnoženého virusu možno při-pravit formolizovanú alebo (formolizovanú)subjednotkovú vakcínu po jeho očistění akoncentrácii v ultracentrifúge. Pre přípra-vu virusu KE určeného pre humánně použi-tia sa na inokuláciu buňkových jednovrstievpoužije v buňkách produkovaný virus -a buň-kový substrát sa připravuje z primeranekontrolovaných kuřácích embryí. Příklad 2

Stabilně buňkové linie [BHK—21, PS, apod.) sa zasejú v množstve 40—60 000 bu-niek na 1 cm2 a ponechajú sa pri 37 °C dovytvorenia jednovrstvý. Výška vhodného mé-dia s obsahom séra sa voli do 1,3 mm. Buň-kové jednovrstvý sa infikujú ako predošle,avšak nároky na pufrovanie médií sú vačšie,nakolko stabilně linie bunie-k vykazujú vpriebehu kultivácie výraznejšie metabolic-ké účinky na posuny pH živných médií. Pre-to sa volí buď vyššia koncontrácia Tris-HClpufru pH 7,7 pri 24 °C (10—15 mM), alebosa použije pufor o vyššej pufrovacej kapa-citě (napr. HEPES pufor v 10 roM koncen-trácii a pufrovaný kyslým uhličitanom sod-ným na pH 7,6 pri 24 sc). Stabilně linie bu-niek můžu byť náročnejšie na kvalitu živ-ných médií, preto sa použitie médií so zní-ženým obsahom aminokyselin volí opatrnépo predchádzajúcom preskúšaní konkrétné-ho typu média. Výška vrstvy zberového mé-dia nie je nižšia ako 0,7 mm nad jednovrst-v-ami buniek. Optimálny časový interval zbe-ru sa má taktiež predom preskúšať s kon-krétným médiom a konkrétným klonom sta-bilných buňkových linií. Inak je postup práčrovnaký ako v případe primárných KEB.

Opísaný postup produkcie virusu KE invitro má oproti všetkým postupom pomnože-nia virusu v hermeticky uzatvorených nádo-bách alebo v systémoch pracujúcich podtlakom (rollerové, suspenzné kultúry, per-fúzny systém) výhodu vo vysokom stupnibezpečnosti práce a praktickej nemožnostiprodukčnej havárie s možným onemocněnímobsluhujúceho personálu. Stupeň čistoty avýtažku pomnoženého virusu možno 1'ahkovolit podlá konečného účelu jeho použitia.Produkčně náklady postupu sú minimálně.

Sposob produkcie virusu KE na jednovrst-vách buniek može nájsť uplatnenie všadetam, kde sa má připravit živý či usmrtenýantigénny materiál virusu pre humánně ale-bo veterinárně séroprofylaktické a diagnos-tické účely.

Claims (5)

1. 23029S PREDMET

   1. Spósob produkcie virusu kliešťovej en-cefalitidy in vitro na jednovrstvách primár-ných kuřácích embryonálnych buniek ale-bo stabilných buňkových linií vyznačujúci satým, že sa husté jednovrstvý buniek inoku-lujú nízkou multiplicitou 0,03 až 0,05 infekč-ných jednotiek na buňku, ostatně buňky vjednovrstvé sa infikujú vírusom v nej po-množeným v priebehu kultivácie 22 až 30hodin pri 36 °C, v živnom médiu neobsahu-júcom sérum a pufrovanom v rozmedzí pH7,3 až 7,7 pufrom zabezpečujúcim nízké vý-kyvy pH počas kultivácie aj spracovania kul-tur, že sa médium odstraní a pokračuje sas vlastnou produkciou s čerstvým bezséro-vým médiom, pričom sa virus obsahujúcemédium zbiera v 5- až 12-hodinových inter-valoch v časovom období medzi 24. až 72.hodinou po infekcii a jednovrstvý buniek sakultivujú pri 36 QC s minimálnym objemom VYNALEZU živného média, umožňovaným vodorovnýmuložením buňkových jednovrstiev.
2. 2. Spósob produkcie virusu podl'a bodu 1vyznačujúci sa tým, že sa móže výhodnépracovat s nehermeticky uzatváranými kul-tivaonými nádobami.
3. 3. Sposob produkcie virusu pódia bodu1 vyznačujúci sa tým, že od 24. až 36. hodi-ny po infekcii možno produkujúce buňky kul-tivovat v médiách so zníženým obsahom ami-nokyselin až o 80 °/o.
4. 4. Sposob produkcie virusu pódia bodu1 vyznačujúci sa tým, že zber virus obsahu-júceho média možno optimálně robit na vr-chole produkcie virusu, teda u kuřácíchembryonálnych buniek okolo 40. až 66. ho-diny po infekcii.
5. 5. Spósob produkcie virusu pódia bodu1 vyznačujúci sa tým, že je možné výhodnépoužitie geneticky homogénnych a analy-zovaných klonov kmeňa Hypr. Severografia, n. p., závod 7, Most Cena 2,40 Kčs