CS230296B1

CS230296B1 - Method of arachnid encephalitis in vitro

Info

Publication number: CS230296B1
Application number: CS38983A
Authority: CS
Inventors: Ivan Slavik
Original assignee: Ivan Slavik
Priority date: 1983-01-20
Filing date: 1983-01-20
Publication date: 1984-08-13

Description

Vynález sa týká biologie, biochémie a imunologie.The invention relates to biology, biochemistry and immunology.

Vynález rieši problém účinnej produkcie virusu kliešfovej encefalitidy v buňkových kulturách. Vyznačuje sa přípravou virusu o vysokom stupni očistenia od kontaminujúcich materiálov pri porovnaní s doteraz najúčinnejším sposobom pomnoženia virusu v mozgoch cicajúcich hlodavcův. Účinná produkcia virusu na jednovrstvách buniek sa dosahuje optimalizáciou podmienok produkcie in vitro. Postup pozostáva z použitia hustých jedncvrstiev buniek inokulovaných nízkou ínulíiplicitou infekcie a infikováním ostatných buniek v jednovrstvé vírusom v nej pomnoženým. Produkovaný virus sa zblera medzi 24. až 72. hodinou po infekcii v krátkých časových intervalech 5 až 12 hodím do minimálneho objemu média neobsahujúceho sérum a pufrovaného puframi umožňujúcimi prácu v nehermeticky uzatvorených nádobách a zabezpečujúcimi minimálně výkyvy pí-Ι kultúry v rámci biologických rytmov buniek aj v priebehu spracovania. Postup súčasne znamená štandardizáciu produkcie virusu kliešťovej encefalitidy in vitro.The invention solves the problem of efficient production of Klimber encephalitis virus in cell cultures. It is characterized by the preparation of a virus with a high degree of purification of contaminating materials compared to the most effective method of virus propagation in the brains of rodent mammals so far. Effective virus production on monolayer cells is achieved by optimizing in vitro production conditions. The procedure consists of using dense layers of cells inoculated with low infection rate and infecting other cells in a monolayer virus propagated therein. The virus produced is collected between 24 and 72 hours after infection at short intervals of 5 to 12 hours in a minimum volume of serum-free medium and buffered with buffers allowing working in non-hermetically sealed containers and ensuring at least pi-Ι culture fluctuations within the biological rhythms of the cells. during processing. At the same time, the procedure involves standardizing in vitro tick tick encephalitis virus production.

Vynález má využitie v humánnej a večerinárnej medicínskej praxi, připravený vírus možno použit ako séroproíylaktický alebo diagnostický antigén.The invention has utility in human and evening medicine practice, and the prepared virus can be used as a seroprophylactic or diagnostic antigen.

Vynález sa týká optimalizácie a štandardizácie produkcie virusu ktiešťóve) encefalitidy (KE) v buňkových kultúrach za' účelom získania vysokého množstva virusu o značné] východiskovej čistotě.The invention relates to the optimization and standardization of the production of tick-borne encephalitis virus (KE) in cell cultures in order to obtain a high amount of virus of considerable initial purity.

Produkcia virusu KE in vitro je podmienkou výroby živých, formolizovaných, alebo subjednotkových (-chemo-) vakcín, připadne antigénov virusu pre diagnostické účely, v laboratórnom, poloprevádzkovom, či príemyselnom rozsahu. Kritériami kvality produkčného postupu by mail byť: — vysoký výřaZok virusu vyhovujúcej až vysokej východiskovej čistoty, — nízké produkčně náklady a — nízký stupeň pracnosti a pracovného rizika.In vitro production of KE virus is a prerequisite for the production of live, formolized, or subunit (-chemo-) vaccines or virus antigens for diagnostic purposes, on a laboratory, pilot scale or industrial scale. The quality criteria for the production process should be: - a high virus yield of satisfactory to high initial purity, - a low production cost, and - a low degree of labor and labor risk.

Z doteraz známých postupov produkcie· virusu KE in vitro, aj v p.iemyselnom rozsahu, spomenutým kritériám najlepšie vyhovuje postup produkcie v rollerových flašiach (F. Heinz, Ch. Kunz, Acta Virol., 21: 301—307, 1977; i b i d, 23: 189—197, 1979).Among the previously known in vitro methods of producing KE virus, even on an industrial scale, the above criteria best meet the roller bottle production method (F. Heinz, Ch. Kunz, Acta Virol., 21: 301-307, 1977; ibid. 23: 189-197, 1979).

Na produkciu virusu slúžia uzatvorené nádoby, pufrovamie médií sa robí HEPES-pufrom a z pomnoženého virusu sa po jeho očistení a opracovaní kationickým detergentom připravuje chemovakcína.For virus production, sealed containers are used, media buffers are made with HEPES buffer, and the expanded virus is purified, after treatment and treatment with a cationic detergent, to chemovaccine.

Podstatou vynálezu je optimalizovanie podmienok produkcie virusu in vitro tak, aby sa zabránilo stratům pomnoženého virusu v dósledku jeho pH-lability a termolabllity a zároveň sa zohíadnili potřeby produkujúcich buniek. Vypracovaný postup zároveň rieši problém, štandardizácie produkcie virusu KE in vitro;It is an object of the invention to optimize the conditions of virus production in vitro so as to prevent loss of the propagated virus due to its pH-lability and thermolability, while taking into account the needs of the producing cells. The developed procedure also solves the problem of standardizing KE virus production in vitro;

K experimentálně overeným zásadám produkcie virusu KE in vitro patria: — použitie hustých jednovrstiev buniek (nie je možné pri použití rollerovej techniky); — práca s vodorovné uloženými jednovrstvami buniek za účelom minimallzácie objemu nutrientu potřebného na prekrytie jednovrstiev; — inokulácia buniek lyofilizovaným zásobným vírusom o známom a dlhodobo udržatelnom imfekčnom titri; — pufrovamie živných médií puframi o vysokej pufrovacej kapacitě, zabezpečujúcimi malé výkyvy pH, a to iba v mierne alkalickej oblasti, v rámci biologických rytmov buniek v priebehu ich kultivácie, a j v rámci vlasti lého spracovávania buňkových kultúr a umožňujúcimi kultiváclu buniek v .nepřítomnosti vzduchu obohateného 5% CO₂; — zber virus obsahujúceho média v krátkých, 5- až 12-hodinovýcli intervalech; — použitie médií neobsahujúcich sérum za účelom prevencie uplatenenia sa v sérach přítomných proteáz; — zníženie produkčnej teploty o 1 °C, teda na 36 °C.Experimentally validated principles for the in vitro production of KE virus include: - the use of dense cell monolayers (not possible using roller technique); - working with horizontally stacked cell monolayers to minimize the volume of nutrient needed to cover monolayers; - inoculating the cells with a lyophilized stock virus of known and long-term sustainable infection titre; - buffers of nutrient media with buffers of high buffering capacity, ensuring small pH fluctuations, only in a mildly alkaline area, within the biological rhythms of the cells during their cultivation and in the intrinsic processing of cell cultures and allowing cell culture in the absence of air enriched. % CO ₂ ; Collecting the virus-containing media at short, 5- to 12-hour intervals; - use of serum-free media to prevent the presence of proteases present in sera; - reduction of the production temperature by 1 ° C, ie to 36 ° C.

Použitie nízkej multiplicity infekcle, teda 0,03—0,05 infekčných jednotiek na buňku s následným infikováním ostatných buniek v jednovrstvé vírusom v nej pomnoženým umožňuje lyofilizovať primerane malé objemy zásobného virusu, znamená vneseme malého množstva cudzorodého materiálu v inokule do produkčného systému a zvyšuje stupeň očistenia povrchu buňkových jednovrstiev výměnou média v 24. hodině po infekcli. Inokulácia buniek štandardnou infekčnou dávkou umožňuje zber virusu ako v širšom časovom rozpátí, teda medzi 24. až 72. hodinou po infekcli, tak aj v optimálnom období vrcholu virusové) produkcie, teda okolo 40. až 66. hodiny po infekcii. Přitom je možné robit časté výměny nutrientu s médiom o zníženom obsahu aminokyselin až o 80 %, bez nebézpečia zníženia virusové] produkcie či poškodenia produkčných buniek.Using a low multiplicity of infectious, i.e., 0.03-0.05 infectious units per cell, followed by infecting other cells in the monolayer virus multiplied therein allows lyophilization of adequately small volumes of the stock virus, introducing a small amount of foreign material in the inoculum into the production system and increasing the degree cleansing the surface of cell monolayers by medium exchange at 24 hours after infection. Inoculation of cells with a standard infectious dose allows harvesting of the virus both over a wider time span, i.e. between 24 to 72 hours after infection and at the optimum peak of viral production, i.e. around 40 to 66 hours after infection. Frequent nutrient exchanges can be made with media with reduced amino acid content of up to 80%, without the risk of reducing viral production or damaging producer cells.

Například, ak sme robili produkciu virusu na primárných kuřácích embryonálnych buňkách v jednovrstvé o ploché 2250 cm²obsahujúcej asi 1,3 x 10⁹ buniek a zbierali sme v nevýhodné dlhých 24-hodinových intervalech, po očistění virusu v ultracentrifúge sa dařilo detegovať okolo 1,1 mg vírusovej hmoty. Přitom sa v priebehu 1. dňa kultivácie dařilo detegovať 4 %, v priebehu 2. dňa 70 % a v priebehu 3. dňa 26 % produkovanej vírusovej hmoty. Pri voíbe kratších zberových intervalov je důvodné předpokládat vyššie výtažky virusu, nakoíko poločas stálosti virusu pri produkčneý teplote je krátký — okolo 3 hodin. Přibližné za túto dobu ubudne polovica biologické) aktivity virusu KE, na ktorú změnu bezprostředné navazuje fyzická dezintegrácia virusových častíc.For example, if we were producing virus on primary smokers embryonic cells in monolayer with a flat 2250 cm ² containing about 1.3 x 10 ⁹ cells and harvested at unfavorable long 24-hour intervals, after cleaning the virus in the ultracentrifuge, about 1, 1 mg of viral mass. In the course of the first day of cultivation, 4% was detected, in the second day 70% and in the third day 26% of the viral mass produced. When selecting shorter collection intervals, it is reasonable to assume higher virus yields, since the half-life of the virus at production temperature is short - about 3 hours. In about this time, half of the biological activity of the KE virus, which is immediately altered by the physical disintegration of the virus particles, decreases.

V nasledujúcom texte sa používajú v odborných textech běžné skratky: KE — kliešťová encefalitida, KEB — kuracie embryonálně buňky; BHK—21 — stabilná buňková línia íadvín novoredeného škrečka; PS — stabilná buňková línia prasačích íadvín; BEM — bazálne Eaglovo médium,; TBS — fyziologický roztok pufrovaný 7 mM Tris-HC1 pufrom; PBS — fosfátovým pufrom pufrovaný fyziologický roztok.Common abbreviations are used in the following texts: KE - tick-borne encephalitis, KEB - chicken embryonic cells; BHK-21 - stable hamster adrenal cell line; PS - a stable porcine gland cell line; BEM - basal Eagle's medium ,; TBS - saline buffered with 7 mM Tris-HCl buffer; PBS - phosphate buffered saline.

PřikladlEXAMPLE

Do skleněných alebo jednorázových nádob s rovným dnom (napr. Petrlho misky, Rouxové flaše opatřené buničinovou zátkou a pod.) o íubovoínej kultivačnej ploché sa zasejú KEB v BEM, Parkerovom médiu 199, alebo Eaglovom médiu s obsahom 10 % inaktivovaného teíacieho séra a pufrovanom 7 mM Tris-HCl pufrom pH 7,7 pri 24 °C v dávke cca 6,5 x 10⁵ buniek na 1 cm². Buňky sa súmerne rozvrstvia po celej ploché dna kultivačnej nádoby v takom objeme média, aby výška vrstvy média nad buňkami bola 1 mm. Buňky sa kultívujú 16—20 hodin pri 37 °C. Aby sa zabránilo podchladeniu a následnému odlučovaniu hustých jednovrstiev od dna kultivačných nádob, v ďalšom sa pracuje s roztokml predhriatymi ,na 30—36 °C.Plain KEB in BEM, Parker medium 199, or Eagle medium containing 10% inactivated calf serum and buffered 7 are placed in flat or disposable flat-bottomed containers (eg, Petrl dishes, Roux flasks with cellulose stoppers, etc.) of any culture flat. mM Tris-HCl buffer pH 7.7 at 24 ° C at a dose of about 6.5 x 10 ⁵ cells per cm ² . Cells are symmetrically stratified across the flat bottom of the culture vessel in a volume of media such that the height of the media layer above the cells is 1 mm. Cells are cultured for 16-20 hours at 37 ° C. To prevent supercooling and subsequent separation of the dense monolayers from the bottom of the culture vessels, the solution is preheated to 30-36 ° C.

Zásobný virus KE sa skladuje pri —18 °C v lyofilizovanom stave v ampulkách zatavených za vákua. Použitý genetický homo230298 génny a na genetické markéry analyzovaný klon P—-III E kmeňa I-Iypr virusu kliešťovej encefalitidy (Mayer, V., Acta Virol., 6: 309— —316, 1962) sme připravili vo formě 20 % (v/o) suspenzie z mozgov agonických cicajúcich krys v TBS pH 8,0, opracovali v konečne-j koncentrácii 0,5 % (v/o) síranom protamínu po dobu 30 minút pri 4 °C, centrifugovali pri 1500 g 15 minút a supernatant sme rozplnili po 0,4 ml do ampuliek. Lyofilizovali sme 6 hodin nad kysličníkom fosforečným. V jednej ampulke sa nachádzalo okolo 10⁸ LD.50, ktoré množstvo infekčných jednotiek dostačovalo na inokuláciu buniek prichytených na ploché 2200—3000 cm². Zásobný roztok síranu protamínu (5%, v/o) sa kontroluje a upravuje na pH 8—8,5. Rovnako možno lyofilizovať virus pomnožený v buňkových kultúrach po opracovaní média 0,025 % protamínu.Stock virus KE is stored at -18 ° C in a lyophilized state in vacuum sealed ampoules. The genetic homo230298 gene and genetic marker analyzed clone P-III of E strain I-Iypr of tick-borne encephalitis virus (Mayer, V., Acta Virol., 6: 309—316, 1962) was prepared in the form of 20% (v / v). o) suspensions from brains of agonistic mammal rats in TBS pH 8.0, treated with 0.5% (v / o) protamine sulfate for 30 minutes at 4 ° C, centrifuged at 1500 g for 15 minutes and the supernatant was dispense 0.4 ml into ampoules. We lyophilized for 6 hours over phosphorus pentoxide. There were about 10 ⁸ LD.50 in one vial, sufficient infectious units to inoculate cells attached to a flat 2200-3000 cm ² . The protamine sulphate stock solution (5%, v / o) is checked and adjusted to pH 8-8.5. Alternatively, the virus multiplied in cell cultures can be lyophilized after treatment with 0.025% protamine medium.

Zásobný virus sa resuspenduje v PBS pH 7,2-7,4 a aplikuje sa v objeme prekrývajúcom jednovrstvu buniek do výšky 0,7 mm. Po 90 minútach pri 25 36 °C, za občasnej agitácie produkčných nádob sa inokulum odstraní, buňky možno premyt raz či niekolko rázy polovičným obj&mom predhriateho PBS, a nakoniec sa prevretvia do výšky 0,7 mm živným médiom bez obsahu séra. Pufrovanie médií je rovnaké ako pri zasievaní buniek. Buňkové jednovrstvý sa kultivujú pri 36 °C, médium z prvých 24 hodím kultivácie sa vylieva. Možno opakoval premytie povrchu jednovrstiev PBS, připadne odstranit' ešte aj živné médium v 36. hodině po infekcii. Tým sa dosiahne vysoký stupeň očistemia povrchu jednovrstiev od zvyškov připadne na ich povrch adsorbovaných materiálov zo séra, inokula a nevitálnych buniek. V tomto časovom úseku, teda na začiatku zberu virus obsahujúceho média, je možné začal pracoval s médiami o zníženom obsahu aminokyselin až o 80 %, výšku vrstvy média nad je-dnovrstvami volit medzi 0,7 až 0,5 mm a zbery média robit v krátkých 5- až 12-hodinových intervaloch. V případe opakovaného preplachovania buniek pomocou PBS je vhodné přidat do produkčných médií minimálně množstvo kyslého uhličitanu sodného nevedúce k zásadným změnám pH v nehermeticky uzavretých produkčných nádobách. Pri vysokých nárokoch na sterilitu produktu je možné použil prachotěsně uzatvoritelné a sterilizované podnosy, v ktorých sa produkčně nádoby vkladajú do termostatu. Ak sa počítá s opracováním virus obsahujúcich médií 0,25 % síranom protamínu a následnou purifikáciou virusového produktu, je možné produkčně nádoby volné ukladať na ekvílibrizované rovné podnosy z tvrdého materiálu (napr. perforované sklo hrůbky 6— —10 mm) v termostate opatrenom těsněním proti prieniku prachu a udržiavanom v patričnej čistotě.The stock virus is resuspended in PBS pH 7.2-7.4 and applied in a volume overlaid with a cell monolayer up to a height of 0.7 mm. After 90 minutes at 25 36 ° C, with occasional agitation of the production flasks, the inoculum is removed, the cells can be washed once or several times with half volume pre-warmed with PBS, and finally rolled to a height of 0.7 mm with serum-free nutrient medium. The buffering of the media is the same as for the sowing of cells. Cell monolayers are cultured at 36 ° C, the medium from the first 24 hours of culture is discarded. It is possible to repeat the washing of the monolayer surface with PBS, optionally removing the nutrient medium at 36 hours post infection. This achieves a high degree of purification of the monolayer surface from residues or adsorbed serum, inoculum and non-vital cell materials on their surface. In this time period, ie at the beginning of the collection of virus containing media, it is possible to work with media with reduced content of amino acids by up to 80%, the height of the layer of media above the monolayers to choose between 0.7 to 0.5 mm and short 5- to 12-hour intervals. In the case of repeated cell flushing with PBS, it is advisable to add at least an amount of sodium bicarbonate to the production media not resulting in substantial pH changes in the non-hermetically sealed production containers. Dust-sealable and sterilized trays in which the production containers are placed in a thermostat can be used for high product sterility requirements. If processing of virus-containing media with 0.25% protamine sulphate is envisaged and the virus product is subsequently purified, the production containers can be freely stored on equilibrated, flat trays of hard material (eg perforated glass of 6-10 mm thickness) in a thermostate sealed against dust penetration and maintained in proper cleanliness.

Pomnožený virus obsahujúce médium sa ihned po zbere schladí a až do spracovania sa skladuje pri 4 °C. Množstvo pomnoženého virusu sa stanoví menej presne titráciou jeho infekčnej alebo hemaglutinačnej aktivity, alebo presnejšie po čiasíočnej purifikácii v ultracentrifúge, ktoroukofvek vhodnou metodou na stanovenie proteinu.The multiplied virus containing medium is cooled immediately after harvesting and stored at 4 ° C until processing. The amount of propagated virus is determined less accurately by titrating its infectious or haemagglutinating activity, or more precisely after a partial purification in the ultracentrifuge, by any suitable method for protein determination.

Ak sa jedná o živú očkovaciu látku oslabeného virusu pre veterinárně účely, zozbieraný virus možno okamžité- lyofilizovať a stanovit jeho biologické aktivity až v lyofilizáte. Z pomnoženého virusu možno připravit formolizovanú alebo (formolizovanú) subjednotkovú vakcínu po jeho očistění a koncentrácii v ultracentrifúge. Pre přípravu virusu KE určeného pre humánně použitia sa na inokuláciu buňkových jednovrstiev použije v buňkách produkovaný virus -a buňkový substrát sa připravuje z primerane kontrolovaných kuřácích embryí.If it is a live vaccine of an attenuated virus for veterinary purposes, the harvested virus may be immediately lyophilised and its biological activities determined only in the lyophilisate. Formolized or (formolized) subunit vaccine may be prepared from the multiplied virus after purification and concentration in the ultracentrifuge. For the production of KE virus intended for human use, the virus-produced cells are used to inoculate cell monolayers and the cell substrate is prepared from adequately controlled smoking embryos.

Příklad 2Example 2

Stabilně buňkové linie (BHK—21, PS, a pod.) sa zasejú v množstve 40—60 000 buniek na 1 cm² a ponechajú sa pri 37 °C do vytvorenia jednovrstvý. Výška vhodného média s obsahom séra sa voli do 1,3 mm. Buňkové jednovrstvý sa infikujú ako predošle, avšak nároky na pufrovanie médií sú vačšie, nakolko stabilně linie bunie-k vykazujú v priebehu kultivácie výraznejšie metabolické účinky na posuny pH živných médií. Preto sa volí buď vyššia koncentrácia Tris-HCl pufru pH 7,7 pri 24 °C (10—15 mM), alebo sa použije pufor o vyššej pufrovacej kapacitě (napr. HEPES pufor v 10 mM koncentrácii a pufrovaný kyslým uhličitanom sodným na pH 7,6 pri 24 sc). Stabilně linie buniek možu byť náročnejšie na kvalitu živných médií, preto sa použitie médií so zníženým obsahom aminokyselin volí opatrné po prednhádzajúcom preskúšaní konkrétného typu média. Výška vrstvy zberového média nie je nižšia ako 0,7 mm nad jednovrstvami buniek. Optimálny časový interval zberu sa má taktiež predom preskúšať s konkrétným médiom a konkrétným klonom stabilných buňkových linií. Inak je postup práč rovnaký ako v případe primárných KEB.Stable cell lines (BHK-21, PS, etc.) are seeded at 40-60,000 cells per cm ² and left at 37 ° C to form a monolayer. The height of a suitable serum-containing medium is chosen up to 1.3 mm. Cell monolayers are infected as before, but the media buffering requirements are greater as stable cell lines exhibit more pronounced metabolic effects on pH shifts of nutrient media during culture. Therefore, either a higher concentration of Tris-HCl buffer pH 7.7 at 24 ° C (10-15 mM) is chosen, or a buffer with a higher buffer capacity (e.g., HEPES buffer at 10 mM concentration and buffered with sodium bicarbonate to pH 7) is used. , 6 at 24 sc). Stable cell lines may be more demanding in the quality of nutrient media, therefore, the use of media with reduced amino acid content should be chosen with caution following prior examination of a particular type of media. The height of the collection medium layer is not less than 0.7 mm above the cell monolayers. The optimal harvest time interval should also be tested in advance with a particular medium and a particular clone of stable cell lines. Otherwise the procedure is the same as in the case of primary KEB.

Opísaný postup produkcie virusu KE in vitro má oproti všetkým postupom pomnoženia virusu v hermeticky uzatvorených nádobách alebo v systémoch pracujúcich pod tlakom (rollerové, suspenzné kultúry, perfúzny systém) výhodu vo vysokom stupni bezpečnosti práce a praktickej nemožnosti produkčnej havárie s možným onemocněním obsluhujúceho personálu. Stupeň čistoty a výtažku pomnoženého virusu možno 1'ahko volit podlá konečného účelu jeho použitia. Produkčně náklady postupu sú minimálně.The described in vitro KE virus production process has the advantage of a high degree of occupational safety and the practical impossibility of a production accident with possible disease to operating personnel over all virus propagation procedures in hermetically sealed containers or pressurized systems (roller, suspension cultures, perfusion system). The degree of purity and yield of the propagated virus can be easily selected according to the end use purpose. The production cost of the procedure is minimal.

Sposob produkcie virusu KE na jednovrstvých buniek može nájsť uplatnenie všade tam, kde sa má připravit živý či usmrtený antigénny materiál virusu pre humánně alebo veterinárně séroprofylaktické a diagnostické účely.The method of producing KE virus on monolayer cells can be used wherever live or killed antigenic material of the virus is to be prepared for human or veterinary seroprophylactic and diagnostic purposes.

Claims

Method for the production of tick-borne encephalitis virus in vitro on monolayers of primary smokers of embryonic cells or stable cell lines, characterized in that dense monolayer cells are inoculated with a low muitiplicity of 0.03 to 0.05 infectious units per cell, otherwise monolayer cells are infected with virus propagated therein during cultivation for 22 to 30 hours at 36 ° C, in a serum-free nutrient medium buffered between pH 7.3 and 7.7 with a buffer ensuring low pH fluctuations during both cultivation and processing of cultures that the medium is removed and continued s own production of fresh serum-free medium, wherein the virus-containing medium is collected in a 5 to 12-hour intervals in the time period between 24 and 72 hours after the infection of a monolayer of cells was kuitivujú at 36 ^Q C in a minimum volume of

BACKGROUND OF THE INVENTION to the nutrient medium provided by the horizontal deposition of cell monolayers.

2. Virus production method according to claim 1, characterized in that it is advantageous to work with non-hermetically sealed culture containers.

3. The method of producing virus according to claim 1, wherein from 24 to 36 hours after infection, the producing cells can be cultured in media with reduced amino acid content by up to 80%.

4. The method of producing virus according to claim 1, wherein harvesting the virus containing media can be optimally done at the peak of virus production, i.e., in smoking embryonic cells, about 40 to 66 hours after infection.

5. Virus production method according to claim 1, characterized in that it is advantageous to use genetically homogeneous and analyzed clones of the Hypr strain.