CS214870B2 - Method of simmultaneous gaining of insuline in addition to pancreatine from fresh or deep frozen pig pancreats - Google Patents

Description

[54) Způsob současného získání insulinu vedle pankreatinu z čerstvých nebo z hluboce zmrazených vepřových pankreat

Vynález se týká způsobu současného získání insulinu vedle pankreatinu z čerstvých nebo z hluboce zmrazených vepřových pankreat. Pankreata jatečných zvířat jsou jakožto farmaceutická surovina dvojnásobně zajímavá. Jednak se jich používá jakožto jediného výchozího materiálu pro získání insulinu, jednak obsahují pro terapeutické použití hodnotné enzymy. Tak jsou ho-vězí pankreata důležitá pro získání trypsinu a chymotrypsinu vedle insulinu, zatímco z vepřových pankreat se může získat terapeuticky hodnotná enzymová směs pankreatin s lypolytickým, amylolytickým a protecilytickýím působením.

Na základě této bifunkčnosti nechyběly od dob, kdy se začalo pankreatických obsahových látek používat v medicíně, farmacii a technice, pokusy získat oba systémy účinných látek z téhož výchozího· materiálu. Takové dvojí zpracování však naráží na potíže, které jsou založeny na tom, že je pro získání insulinu zapotřebí extrakčních podmínek, za kterých se enzymy z největší části irreversibilně inaktivují. Tak pro « dokonalou extrakci insulinu jsou výhodné kyselé podmínky, většinou pod hodnotou pH 4, v přítomnosti organického rozpouštědla, Y^ěišlftQU 50 až 80 objemových °/o ethanolu. Amylasy a lipasy pankreasu jsou však za těchto podmínek nestálé á ve velké míře se denaturují.

Větší stálost vykazuje proteolytícký systém trypsin-chymotrypsin. Přídavné získání krystalického· trypsinu, popřípadě směsi trypsinu a chymotrypsinu s extrakčních zbytků výroby insulinu, je známo například z britského patentového spisu číslo 613 030, z patentového .spisu NSR 875 640, z francouzského patentového spisu 999 346, z amerického patentového spisu 2 686 148 a 2 751 330 a z patentového spisu NSR číslo 1 013 834.

Současné získáni insulinu a pankreatinu se naproti tomu jeví více problematickým. Ekonomicky použitelný způsob se pro uvedené obtíže dosud neprosadil. Tak je v německém patentovém spise č. 745 2.84 popsán způsob provádění extrakce insulinu při alkalické hodnotě pH za co možná největší ochrany enzymu. Z německých patentových spisů 874 062 a 875 856 je známa fermenty chránicí kyselá extrakce insulinu. Enzymy jsou však i při těchto postupech tak dalece poškozeny, že nelze získat žádný, současným nárokům vyho-vující produkt za ekonomických podmínek.

Vedle absolutních oborů pH, při kterých se pracuje, je zřejmě hlavní příčinou pro značnou inaktivacl fermentu použiti anorga214870 nických, popřípadě organických kyselin pro nastavení - hodnoty pH. S . tímto -poznatkem počítá také způsob podle německé vyložené přihlášky DAS ' č. 2 - 146 275. Je v ní popsáno získání insulinu vedle pankreatinu z pankreatu sušeného vymrazováním. Z odtučněných, -lyofilizovaných žláz se e-xtrahuje vodně alkoholickým rozpouštědlem, s výhodou 60 až ’ 80 % ' ethanolem, - po přísadě neutrálních solí, jako je chlorid sodný, bez přímé přísady kyseliny insulin. Extrakce insulinu z čerstvých nebo z hluboce zchlazených pankreat po přísadě solí, jako je chlorid sodný nebo chlorid amonný, je známa z amerického patentového spisu č. 2 779 706.

Všechny dosud popsané způsoby mají závažné nedostatky, založené jednak na tom, že jsou výtěžky - insulinu nepatrné, jednak na tom, že se enzymy ' v široké . míře inaktivují, nebo že zahrnují technologicky nákladné a tím . drahé ... výrobní fáze, jako je sušení vymrazováním.

Předmětem vynálezu je způsob současného získání insulinu vedle pankreatinu z čerstvých nebo- z hluboce zmrazených vepřových pankreat extrakcí žláz v přítomnosti acetonu, který je vyznačen tím, že se k extrakci používá . -reakční směsi - alespoň se - 40 procenty acetonu a extrahuje se při hodnotě pH - 5 - až- 7, přičemž se pro nastavení hodnoty pH používá ve vodě rozpustných solí -s kationty, které vytvářejí s- kyselými doprovodnými - látkami insulinu za extrakčních podmínek .nedisooiované sloučeniny, - po· extrakci se popřípadě po -další přísadě acetonu - oddělí pevná látka od extraktu, extrakt se o- sobě známým způsobem· dále zpracovává· - na insulin - a pevná látka se po oddělení z -extrakční směsi neprodleně -pufrem nastaví na hodnotu pH nad 5,6 a -o -sobě známým způsobem -se zpracovává -na pankreatin.

Při tomto· způsobu se odstraní nedostatky dosud známých způsobů. S překvapením se zjistllo·, že je možná extrakce insulinu z čerstvých nebo -s hlubokým - chlazením konservovaných pankreat velmi šetrným způsobem, jestliže se do rozmělněných žláz, suspendovaných ve směsi vody a acetonu, přidá roztok soli, jejíž kationty jsou schopné reagovat s -obsahovými -látkami žláz takovým způsobem, že se z reakční směsi uvolňují -vodíkové - ionty, které posunují hodnotu pH. Především přicházejí pro uvolňování -vodíkových iontů v úvahu mastné kyseliny, které -vytvářejí -s kovovými ionty nedisociované sloučeniny. Jakožto kovové ionty přicházejí v úvahu takové ionty, které jsou fyziologicky nezávadné, protože většinou nelze vyloučit, aby - zbytky těchto solí nezůstávaly v pankreatinu.

Naproti tomu přicházejí méně -v úvahu takové kovové ionty, obzvláště takové ionty těžkých kovů, které mají nepříznivý vliv na konečné produkty se zřetelem na hormonální, popřípadě fermentovou aktivitu. S výhodou se používá ve vodě rozpustných vápena tých solí, může - se však také - použít - solí hoře Sňatých, - - zinečnatých, - hlinitých, železitých, solí kobaltu, niklu, cínu a manganu. Potřebné množství přidávaných solí -se stanoví měřením hodnoty pH. Vápenatých -solí, zvláště chloridu vápenatého, se používá -s výhodou, jednak pro- jejich dobrou rozpustnost, jednak -pro jejich fysiologickou nezávadnost. Výhodným vedlejším působením vápenatých -iontů je jeých známá vlastnost stabilizovat enzymy.

Například lze přísadou asi 0,7 % chloridu vápenatého do rozmělněných - žláz, suspendovaných ve -směsi acetonu - a vody, dosáhnout posunutí hodnoty pH směsi na hodnotu 5 až 6, s výhodou 5,4 až 5,6; to jsou podmínky, za kterých citlivé enzymy pankreasu utrpí -sotva znatelné poškození. Tento efekt lze zesílit popřípadě přísadou vhodné soli, jestliže chemická reakce této soli se solí vápenatou ovlivňuje uvolňování vodíkového -iontu. Pro tento- - účel jsou vhodné kyselé soli víceisytných kyselin, jestliže odpovídající vápenaté - soli, které -se přitom vytvoří, za dosavadních podmínek slabě disociují nebo vůbec nedisočiují. Například se pro tento - účel hodí natriumdihydrogenfosfát nebo dinatriumhydrogenfosfát.

Přísady jiných neutrálních -solí, jako chloridu sodného- nebo chloridu amonného - a jiných solí, kterých -se popřípadě používá pro extrakci insulinu za jiných podmínek, neruší tyto -reakce a mohou se rovněž přidávat.

Způsob podle vynálezu se může například provádět takto: Čerstvá nebo hlubokým chlazením konservovaná vepřová - pankreata se rozmělní a suspendují se ve směsi například z 24 objemových % a 76 objemových % acetonu, do které se popřípadě přidaly uvedené neutrální soli, jakož také již uvedené soli vícesytných kyselin. Pro extrakci a následné oddělení - nerozpuštěných podílů žláz je výhodné -udržovat koncentraci acetonu v kapalné fázi -na 40 až 80 objemových °/o, aby se na jedné straně umožnilo - rozpouštění insulinu ze tkáně žláz- a na druhé straně aby se zabránilo aktivaci zymogenu - autolytickými pochody v násadové směsi.

Objem extrakční kapaliny je dán praktickou úvahou, která je založena na dostatečném rozpuštění účinné látky a na příznivé technické manipulaci se -suspenzí. Obzvláště výhodné je provedení způsobu, při kterém je obsah pevné látky -v suspenzi asi 10 až 20 %. Do této - směsi se pak s - výhodou teprve nyní přidává vápenatá sůl, nejlépe ve formě vodného roztoku. Suspenze, upravená na požadovanou hodnotu pH, s výhodou na hodnotu mezi 5 a 7, nejvýhodnějl -však na hodnotu 5,4 až 5,6 se míchá. Pokud -se pracuje v - běžných míchacích nádobách, je -dostatečnou extrakční . - dobou 0,5 až 1,5 hodin. Pak se pevné látky oddělí, -s výhodou odstředěním. Pevná -látka se může způsobem podle vynálezu několikrát extrahovat, počet extrakcí se však má v zájmu dobré kvality pankreatinu udržovat podle možnosti nízký.

Vyčeřené extrakty se popřípadě spojí a přísadou alkalických roztoků se hodnota pH upraví na 7 až 8, s výhodou na 7,3 až 7,7. К tomuto· účelu se s výhodou používá slabé amoniakální vody, sodného· louhu nebo vodného ro-ztoku soli hydrolyzují-cí s alkalickou reakcí, jako je například dinatriumhydrogenfosfát. Přitom popřípadě vyvločkovaná inertní proteinová frakce se může oddělit odstředěním. Reakce čirého extraktu se •opět nastaví na kyselou, ve vakuu se odstraní aceton, koncentrát se vysráží chloridem sodným a získaný solný kc-láč se o sobě známým způsobem dále zpracuje na insulin.

Po oddělení extraktu obsahujícího insulin představuje zbylá pevná látka výchozí materiál pro- pankreatin. Ke chránění aktivity fermentu se neprodleně přísadou roztoku pufrové soli nebo směsi pufrových solí upraví hodnota pH na 6 až 7 a pak se o sobě známým způsobem dále zpracovává na pankreatin: dvakrát opakovanou extrakcí vysokoprocentním acetonem se zbaví tuku, odvodní se a pak se usuší. Způsob tohoto dalšího· zpracování je popsán v následujícím příkladu 1.

Příklad 1 kg hluboce zmrazeného vepřového pankreasu se rozemele na masovém strojku a suspenduje se při teplotě 15 °C v předložené směsi ze 130 1 acetonu a 50 1 vody. Přidáním vodného· roztoku chloridu vápenatého (100 g chloridu vápenatého v 150 ml vody) se h-odnota pH nastaví na 5,6. Míchá se po dobu 30 minut při teplotě 15 °C, smíchá se se 45 1 acetonu a pevná látka se oddělí odstředěním. Čirá fáze obsahuje insulin a pevná hmota se zpracu je na pankreatin.

Pevná látka se natěstuje 40 1 vodného roztoku dinatriumhydrogenfosfátu, který o-bsa-

Claims (3)

1. PŘEDMĚT

   1. Způsob současného získání insulinu vedle pankreatinu z čerstvých nebo· z hluboce zmrazených vepřových pankreat extrakcí žláz v přítomnosti acetonu, vyznačený tím, že se к extrakci po-užívá reakční směsi alespoň se 40 % acetonu a extrahuje se při hodnotě pH 5 až 7, přičemž se pro· nastavení hodnoty pH používá ve vodě rozpustných solí s kationty, které vytvářejí s kyselými doprovodnými látkami insulinu za extrakčních podmínek nedisociované sloučeniny, po extrakci se popřípadě po· další přísadě acetonu oddělí pevná látka od extraktu, extrakt se o sobě známým způsobenu dále zpracovává na insulin a pevná látka se pc* oddělení huje tolik fosfátu, aby se nastavila hodnota pH na 6,0 až 6,5, a vakuovou destilací při teplotě produktu 25 °C se uvede na obsah acetonu 15°. Hustý tekutý destila-ční zbytek se nyní podle kvality žláz udržuje až po· dobu tří hodin na teplotě 25 °C, pak se rozmíchá s 250 1 acetonu a zahřeje se na teplotu 30 °C.

   Pevná látka a čirá fáze se oddělí odstředěním. Pevná látka se znovu extrahuje při teplotě 25 °C 150 1 acetonu, který obsahuje 10 1 vody, oddělí se odstředěním а к udržení aktivity fermentu se suší ve vakuu při teplotě 25 až 30 °C.

   Výtěžek je 9 kg pankreatinu s touto fermentační aktivitou:

   90 amylasových jednotek podle Willstáttera,

   75 lipasových jednotek podle Willstáttera,

   160 proteasových jednotek podle Willstáttera.

   Insulinový extrakt, získaný odstředěním, se odpařuje ve vakuu až do odstranění acetonu. Přitom vypadlý tuk se oddělí. Z vodného· destilačního zbytku se ro-zpuštěný insulin izoluje vysrážením kuchyňskou solí a následnou krystalizací.

   Výtěžek je 3 g insulinu s 25 I. J./mg, to je 75 000 I. J. insulinu.

   Příklad 2

   Směs předložená к extrakci insulinu se skládá ze 120 1 acetonu a 50 1 vody, ve které je rozpuštěn 1 kg chloridu amonného a 0,5 kilogramů prim, natriumhydrogenfosfátu.

   Jinak jsou sl-ožení násady, pracovní podmínky a výtěžky stejné jako při způsobu popsaném v příkladu 1.

   ynálezu z extrakční směsi neprodleně pufrem nastaví na hodnotu pH nad 5,6 a o sobě známým způsobem se dále zpracovává na pankreatin.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se do extrakční směsi přidávají rozpustné kyselé soli vícesytných kyselin а к nastavení hodnoty pH se používá ve vodě rozpustných solí, jejichž kationty vytvářejí s anionty přidávaných kyselých solí za extrakčních podmínek nedisociované soli.
3. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se extrakce insulinu provádí při obsahu acetonu 50 až 6-0 % v extrakční směsi a oddělování pevné látky z extraktu při obsahu acetonu 60 až 70 %.