PL98610B1 - Sposob jednoczesnego otrzymywania insuliny i pankreaktyny z trzustki swin - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób jednoczes¬ nego otrzymywania insuliny obok pankreatyny ze swiezych albo gleboko mrozonych trzustek swin przez ekstrakcje gruczolów w obecnosci acetonu.

Trzustki zwierzat rzeznych sa podwójnie inte¬ resujace jako surowce farmaceutyczne. Sluza one po pierwsze jako jedyny material wyjsciowy do otrzymywania insuliny, po wtóre zawieraja cenne dla terapeutycznego zastosowania enzymy. I tak trzustki bydlece wazne sa dla otrzymywania tryp- syny i chymotrypsyny obok insuliny, podczas, gdy z trzustki swin mozna otrzymac terapeutycznie wartosciowa mieszanine enzymów pankreatyne o aktywnosci rozszczepiajacej tluszcz, rozpuszcza¬ jacej skrobie i rozszczepiajacej bialko.

Na podstawie tej dwufunkcyjnosci, od czasu sto¬ sowania zawartych w trzustce substancji w me¬ dycynie, farmacji i technice, nie brakowalo prób otrzymania ze wspólnego materialu wyjsciowego obydwóch ukladów substancji czynnej. Taka po¬ dwójna przeróbka napotyka jednak na trudnosci, które polegaja ma tym, ze do otrzymywania insu¬ liny potrzebne sa warunki ekstrakcji, w których enzymy po wiekszej czesci zostaja nieodwracalnie zdezaktywowane. I tak dla calkowitej ekstrakcji insuliny korzystne sa warunki kwasne, przewaznie ponizej pH = 4, w obecnosci rozpuszczalnika orga¬ nicznego, przewaznie 50—€()•/• objetosciowych eta¬ nolu. Amylazy i lipazy trzustki sa jednakze w tych warunkach nietrwale i zostaja w znacznym stop¬ niu zdenaturowane.

Wieksza trwaloscia odznacza sie proteolityczny uklad trypsyna-chymotrypsyna. Dodatkowe otrzy¬ mywanie krystalizowanej trypsyny lub mieszaniny trypsyny d chymotrypsyny z pozostalosci ekstrak¬ cyjnych produkcji insuliny jest znane np. z bry¬ tyjskiego opisu patentowego nr 613 030, opisu pa¬ tentowego RFN nr 875 640, francuskiego opisu pa¬ tentowego nr 999 346, opisów patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2 686 148 i nr 2 751 330 albo z opisu patentowego RFN nr 1013 834.

Jednoczesne otrzymywanie insuliny i pankreaty- ny jest w porównaniu z tym bardziej problema¬ tyczne. Z powodu wyzej przedstawionych trud¬ nosci nie przyjal sie dotychczas zaden ekonomicz¬ nie uzyteczny sposób.

W opisie patentowym RFN nr 745 284 opisano sposób, w którym w celu maksymalne} mozliwej ochrony enzymów zastosowano ekstrakcje insuliny przy alkalicznej wartosci pH. Z opisów patento¬ wych RFN nr 874062 i nr 875 856 znana jest ochra¬ niajaca fermenty kwasna ekstrakcja insuliny. En¬ zymy byly jednak równiez w tych sposobach tak dalece uszkodzone, ze nie mozna otrzymac w opla¬ calnych warunkach produktu, odpowiadajacego aktualnym wymaganiom.

Obok absolutnego zakresu pH, w którym pro¬ wadzono proces, jedna z glównych przyczyn znacz¬ nej dezaktywacji fermentów jest oczywiscie zasto- 98 6103 sowanie kwasów nieorganicznych lub organicznych do nastawiania wartosci pH. To rozpoznanie doty¬ czy równiez sposobu wedlug opisu patentowego KFN DAS nr 2146 275. Tutaj opisano otrzymywa¬ nie insuliny obok pankreatyny. Z odtluszczonych liofilizowanych gruczolów ekstrahuje sie insuline za pomoca wodno-organicznego rozpuszczalnika, korzystnie GO—80% etanolu, po dodaniu soli neu¬ tralnych takich jak chlorek sodu, bez bezposred¬ niego dodatku kwasu Ekstrakcja insuliny ze swie¬ zych albo oziebionych w bardzo niskiej tempera¬ turze trzustek po dodaniu soli takich, jak chlorek sodu albo chlorek amonu, znana jest z opisu pa¬ tentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2 779 706.

Wszystkie opisane dotychczas sposoby maja po¬ wazne wady, czesciowo wskutek tego, ze wydaj¬ nosc insuliny jest zbyt mala, czesciowo dlatego, ze enzymy zostaja w znacznym stopniu zdezaktywo- wane albo ze wlaczone sa posrednio wymagajace technologicznyich nakladów i tym samym kosztow¬ ne etapy procesu takie, jak suszenie z zamraza¬ niem.

Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze do ektrakcji stosuje sie mieszanine reakcyjna, zawie¬ rajaca co najmniej 40% acetonu, przy czym w srodku ekstrakcyjnym rozpuszczona jest sól rozpusz¬ czalna, której kationy z kwasnymi substancjami, towarzyszacymi insulinie, w warunkach ekstrakcji tworza niezdysocjowane zwiazki, przez co otrzy¬ muje sie wartosc pH okolo 5—7 i ewentualnie dodaje sie dodatkowo rozpuszczalne kwasne sole wielozasadowych kwasów i po ekstrakcji, ewen¬ tualnie po dalszym dodaniu acetonu, oddziela sie substancje stala od ekstraktu, ektrakt przerabia sie w znany sposób na insuline i substancje stala po oddzieleniu z rnieszaniny ekstrakcyjnej nie¬ zwlocznie nastawia sie za pomoca mieszaniny bu¬ forowej na wartosc pH powyzej 5,6 i w znany spo¬ sób przerabia na pankreatyne.

. Ekstrakcje insuliny przeprowadza sie korzystnie przy zawartosci acetonu 50—$0% w mieszaninie ekstrakcyjnej i oddzielanie substancji stalych z ekstraktu przy zawartosci acetonu 60—70%.

Sposób wedlug wynalazku pozwala uniknac wad znanych dotychczas sposobów. Nieoczekiwanie stwierdzono, ze ekstrakcje insuliny ze swiezych albo konserwowanych przez oziebianie w bardzo niskiej temperaturze trzustek mozna przeprowa¬ dzic w ochraniajacy enzymy sposób, jesli do roz¬ drobnionych gruczolów, które sa przeprowadzone w zawiesine w mieszaninie wody i acetonu, dodaje sie roztwór soli, której kationy sa w stanie reago¬ wac z substancjami, zawartymi w gruczolach, w taki sposób, ze zostaja uwolnione jony wodoru z mieszaniny reakcyjnej, które powoduja przesu¬ niecie wartosci pH. W pierwszym rzedzie do uwol¬ nienia jonów wodoru nadaja sie kwasy tluszczowe, które z jonami metalu tworza zwiazki niezdysocjo¬ wane. Jako jony metalu nadaja sie w szczególnosci takie, które nie budza zastrzezen pod wzgledem fizjologiczn^ln, poniewaz przewaznie nie da sie uniknac, aby Tesztki tych soli nie pozostaly w w pankreatynie.

Mniej korzystne sa natomiast takie jony metali, 610 4 w szczególnosci takie jony metali ciezkich, które pogarszaja produkty koncowe pod wzgladem ich aktywnosci hormonalnej i enzymatycznej. Korzyst¬ nie stosuje sie rozpuszczalne w wodzie sole wap- niowe, jednakze mozna równiez stosowac sole magnezu, cynku, glinu, zelaza, kobaltu, niklu, cyny i manganu. Potrzebna ilosc dodawanej soli okresla sie przez pomiar wartosci pH.

Korzystnie stosuje sie sole wapnia, w szczegól- io nosci chlorek wapnia, raz z powodu ich dobrej rozpuszczalnosci, po wtóre z powodu ich nieszkod¬ liwosci fizjologicznej. Korzystny efekt uboczny stanowi znana wlasciwosc jonów wapnia, polega¬ jaca na stabilizowaniu enzymów.

Mozna np. przez dodanie okolo 0,7% chlorku wapnia do przeprowadzonych w zawiesine w mie¬ szaninie acetonu i wody rozdrobnionych gruczo¬ lów uzyskac przesuniecie wartosci pH mieszaniny do pH = 5—6, korzystnie 5,4—5,6 a wiec takie wa- irunki, w których wrazliwe enzymy trzustki do¬ znaja ledwo wykrywalnego pogorszenia. Ten efekt mozna ewentualnie wzmocnic przez dodanie od¬ powiedniej soli, gdy reakcja chemiczna tej soli z sola wapniowa powoduje uwolnienie jonów wo- doru. Nadaja sie do tego celu kwasne sole wielo¬ zasadowych kwasów, jesli odpowiednie sole wap¬ nia, które zostaja przy tym utworzone, dysocjuja slabo albo wcale w panujacych przedtem warun¬ kach. Nadaja sie do tego celu np. dwuwodorofos- foran solu albo wodorofosforan dwusodowy.

Dodatki innych soli neutralnych takich, jak chlo¬ rek sodu albo chlorek amonu itp., jakie stosuje sie niekiedy do ektrakcji insuliny w innych warun¬ kach, nie przeszkadzaja w tych reakcjach i mozna je ewentualnie dodawac.

Mozna np. przeprowadzic proces wedlug wyna¬ lazku w nastepujacy sposób: Swieze albo zakon¬ serwowane przez oziebianie w bardzo niskiej tem¬ peraturze trzustki swin rozdrabnia sie i przepro¬ wadza w zawiesine w mieszaninie, skladajacej sie np. z 24% objetosciowych wody i 70% objetoscio¬ wych acetonu, do której ewentualnie 'dodano wy¬ mienione sole neutralne, jak równiez wyzej wy¬ mienione sole wielozasadowych kwasów. 45 Dla ekstrakcji i nastepnego oddzielenia nieroz¬ puszczalnych skladników gruczolów korzystne jest utrzymywanie stezenia acetonu w fazie cieklej miedzy 40 i 80% objetosciowych, aby z jednej strony umozliwic rozpuszczenie insuliny z tkanki gruczolów i aby z drugiej strony uniknac aktywo¬ wania profermentów przez procesy autolityczne w mieszaninie wsadowej.

Objetosc cieczy ekstrakcyjnej ustala sie na pod¬ stawie rozwazan praktycznych, które sa oparte na 55 wystarczajacym rozpuszczeniu substancji czynnej i na korzystnej technicznej przydatnosci zawiesiny do manipulacji.

Szczególnie korzystny jest sposób postepowania, w którym zawartosc substancji stalej w zawiesinie 60 wynosi okolo 10—20%. Do tej mieszaniny korzyst¬ niej dodaje sie dopiero teraz sól wapnia, najlepiej w postaci roztworu wodnego. Zawiesine, doprowa¬ dzona do zadanej wartosci pH, która korzystniej wynosi 5—7, zwlaszcza jednak 5,4—5,6, poddaje sie 65 mieszaniu. Wystarczajacy czas ekstrakcji wynosi,98610 jesli stosuje sie znane mieszalniki, w przyblizeniu 0,5—1,5 godziny. Nastepnie oddziela sie substan¬ cje stale, korzystnie przez odwirowanie. Substan¬ cje stala mozna równiez sposobem wedlug wyna¬ lazku ekstrahowac kilkakrotnie, liczba ekstrakcji 5 powinna jednak byc utrzymana mozliwie niewiel¬ ka w interesie dobrej jakosci pankreatyny.

Klarowne ekstrakty ewentualnie laczy sie i przez dodanie roztworów alkalicznych nastawia na war¬ tosc pH = 7—8, korzystnie 7,3—7,7. Do tego celu 10 stosuje sie korzystnie slaba wode amoniakalna, lug sodowy albo wodny roztwór soli hydrolizujacej z alkaliczna reakcja jak np. wodorofosforan dwu- sodowy. Flokulujaca tutaj ewentualnie frakcje obojetnej proteiny mozna oddzielic przez odwiro- 15 wanie. Klarowny ekstrakt zakwasza sie ponownie, uwalnia pod zmniejszonym cisnieniem od acetonu, odtluszcza, koncentrat straca za pomoca soli ku¬ chennej i otrzymany placek soli poddaje sie w znany sposób dalszej przeróbce na insuline. 20 Substancja stala, otrzymana-' po oddzieleniu eks¬ traktu zawierajacego insuline, stanowi material wyjsciowy dla pankreatymy. Dla ochrony aktyw¬ nosci enezymatycznych doprowadza sie ja nie¬ zwlocznie przez dodanie roztworu soli buforowej 25 albo mieszaniny soli buforowych do wartosci pH = = 6—7 i nastepnie w znany sposób przerabia sie na pankreatyne.

Przyklad I. 50 kg zamrozonych w bardzo niskiej temperaturze trzustek swin rozdrabnia sie 3Q za .pomoca maszynki do mielenia miesa i przepro¬ wadza w zawiesine w przygotowanej mieszaninie 120 litrów acetonu i 50 litrów wody w temperatu¬ rze 15°C. Przez dodanie wodnego roztworu chlor¬ ku wapnia (100 g chlorku wapnia w 150 ml wody) oe nastawia sie wartosc pH = 5,6. Miesza sie w ciagu minut w temperaturze 15°C, zadaje 45 litrami acetonu i oddziela nastepnie substancje stala przez odwirowanie. Klarowna faza zawiera insuline, sub¬ stancje stala przerabia sie na pankreatyne. Sub¬ stancje stala zarabia sie na paste z 40 litrami wod¬ nego roztworu NaaHPO*, który zawiera tyle fosfo¬ ranu, ze ustala sie wartosc pH = 6,0—6,5, i przez destylacje pod zmniejszonym cisnieniem przy tem¬ peraturze produktu 25°C doprowadza do zawar¬ tosci acetonu 15°. Gestoplynna pozostalosc po des¬ tylacji utrzymuje sie teraz zaleznie od jakosci gruczolów w ciagu do 3 godzin w temperaturze °C, potem miesza sie z 250 litrami ocetonu 40 i ogrzewa do temperatury 30°C. Substancje stala i faze klarowna rozdziela sie przez odwirowanie.

Substancje stala ekstrahuje sie ponownie w tem¬ peraturze 25°C za pomoca 150 litrów acetonu, któ¬ ry zawiera 10 litrów wody, oddziela przez odwiro¬ wanie i w celu utrzymania aktywnosci enzyma¬ tycznych suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 25—30°C. Wydajnosc: 9 kg pan¬ kreatyny.

Ekstrakt insulinowy, otrzymany z odwirowania, zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem az do uwolnienia do acetonu. Wydajnosc: 3 g insuliny o 25 I.E./mg = 75.000 I.E. insuliny.

Przyklad II. Mieszanina, zastosowana dq ektrakcji insuliny, sklada sie ze 120 litrów acetonu i 50 litrów wody, w których rozpuszczone sa 1 kg chlorku amonu i 0,5 kg pierwszorzedowego wodo- rofosforanu sodu. Pozostale* ilosci i warunki wsa¬ dowe oraz wydajnosci, jak w przykladzie I.

Claims (2)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób jednoczesnego otrzymywania insuliny obok pankreatyny ze swiezych albo zamrozonych w bardzo niskiej temperaturze trzustek swin przez ekstrakcje gruczolów w obecnosci acetonu, zna¬ mienny tym, ze do ekstrakcji stosuje sie miesza¬ nine reakcyjna, zawierajaca co najmniej 40°/o ace¬ tonu, przy czym w srodku ekstrakcyjnym rozpusz¬ czona jest sól rozpuszczalna, której kationy z kwasnymi substancjami, towarzyszacymi insuli¬ nie, w warunkach ekstrakcji tworza niezdysocjo- wane zwiazki, przez co otrzymuje sie wartosc pH okolo 5—7 i ewentualnie dodaje sie dodatkowo rozpuszczalne kwasne sole wielozasadowych kwa¬ sów i po ekstrakcji, ewentualnie po dalszym doda¬ niu acetonu, oddziela sie substancje stala od eks¬ traktu, ekstrakt przerabia sie w znany sposób na. insuline i substancje stala po oddzieleniu z mie¬ szaniny ekstrakcyjnej niezwlocznie nastawia sie za pomoca mieszaniny buforowej ma wartosc pH powyzej 5,6 i w znany sposób przerabia na pan¬ kreatyne.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ekstrakcje insuliny przeprowadza sie przy, zawar¬ tosci acetonu 50—60% w mieszaninie ekstrakcyjnej i oddzielanie substancji stalych z ekstraktu przy zawartosci acetonu 60—70%.