CS213099B1 - Způsob kontinuální výroby kyseliny 6-aminopenicilánové - Google Patents

Abstract

Vynález se týká kontinální výroby kyseliny 6-aminopenlcilanové enzymovou hydrolýzou draselné soli benzylpenicilinu, pomocí katalyzátoru na bázi vzájemné chemicky vázaných buněk producenta penicilinacylázy, v systému nejméně dvou průtokových reaktorů, kde je katalyzátor udržován ve vznosu, hodnota pH na 7,6, teplota na 37 °C a koncentrace substrátu v rozmezí kolem 0,2 mol/litr.

Description

Vynález se týká způsobu kontinuální výroby kyseliny 6-aminopenicilanové enzymovou hydrolýzou penicilinu, zejména benzylpenicilinu.

Je znám způsob výroby 6-aminopenicilanové kyseliny (dále jen 6-APK) hydrolýzou penicilinu vázanými buňkami s penicilinacylázovou aktivitou (čs.autorské osvědčení č. 209676), jejichž příprava je rovněž známa (čs.autorské osvědčení č. 203607), Jde o enzymovou hydrolýzu prováděnou bud vsádkovým způsobem, recirkulaci vrstvou vázaných baněk, nebe průtokem roztoku penicilinu dvěma nebo více sloupci vázaných buněk.' Posledně jmenovaná alternativa umožňuje kontinualizaci provozu. Nevýhodou způsobu hydrolýzy penicilinu na sloupci s pevným ložem je pokles hodnoty pH konverzní směsí uvnitř sloupce, který lze sice omezit, například použitím pufru, ale jen omezeně. To vede k nižěí stabilitě vázaných buněk ve srovnání se vsádkovým způsobem. Kromě toho jsou vázané buňky méně využity, Stěpí-li penicilín při nižěím pH. Tyto nevýhody lze zmeněit zvyěováním počtu sloupců v sérii, mezi nimiž je upravováno pH protékající konverzní směsí. Při vsédkovém způsobu je poločas aktivity vázaných buněk 9 týdnů nepřetržitého provozu (asi 1 100 opakovaných konverzí) a využití materiálu je asi 6 litrů 6,5 líního roztoku penicilinu rozštěpeného 1 kg katalyzátoru za 1 hod. K dosažení takové stability a takového využití vázaných buněk na sloupci s pevným ložem je třeba použít okolo 10 eloupců v sérii, což je technicky značně náročné. Například při použití 4 eloupců s pevným ložem katalyzátoru zapojeným v sérii je operační poločas aktivity vázaných buněk maximálně 450 hod.

Při kontinuálním způsobu výroby podle citovaného čs. autorského osvědčení č. 209676 vznikají dalěí komplikace zhorěování průtočnoati sloupců následkem stlačení částic katalyzátoru při delším provozu, což vede k velkým tlakovým ztrátám a ke zvýšení nároků na celé zařízení (tlakové kolony a spoje). Kromě toho vzniká při hydrolýze penicilinu tímto způsobem více degradačních produktů penicilinu i 6-APK.

Bylo zjištěno, že uvedené nevýhody popsaného uspořádání lze odstranit jednoduchým technickým řešením, a to způsobem kontinuální výroby kyseliny 6-aminopenicilanové enzymovou hydrolýzou penicilinu, zejména benzylpenicilinu, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, Že se vodný roztok penicilinu, zejména roztok draselné soli benzylpenicillnu, o koncentraci 0,03 až 0,3 mol/litr, s výhodou 0,18 mol/litr, protékající alespoň dvěma průtokovými reaktory, zapojenými v sérii, uvádí ve vznosu ve styk s katalyzátorem na bázi vzájemně chemicky vázaných buněk producenta penicilinacylázy, za stálého udržování pH na hodnotě 7,0 až 8,0, s výhodou 7,6 a za teploty 20 až 50 °C, s výhodou 37 °C, v každém reaktoru, načež se z reakční směsi, opouštějící poslední reaktor, izoluje kyselina 6-aminopenicilanová, popřípadě regeneruje kyselina fenyloctové.

Při provedení způsobu podle vynálezu je možno používat například zařízeni, které sestává z chlazených zásobníků pro výchozí substrát a produkt enzymové konverze, vyhřívaných nádob opatřených míchadly, sloužících jako reaktory, čerpadel, spojovacích trubic a zařízení pro úpravu pH. Vodný roztok draselné soli benzylpenicilinu, respektive konverzní směs, se postupně čerpá systémem čerpadel do jednotlivých reaktorů, kde je míchána suspenze katalyzátoru na bázi vzájemně chemicky vázaných buněk. Ve všech reaktorech se udržuje optimální hodnota pH kontantním přidáváním vodného roztoku alkálie buá pomocí pH-statú nebo kontinuálně. Přítokové rychlost roztoku alkálie se volí tak, aby se konverzní směsi podstatně nezře213 098 áovaly. Všechny průtokové rychlosti jsou řízeny tak, aby se neměnily pracovní objemy reaktorů. Zadržování částic katalyzátoru v reaktorech lze dosáhnout tím, že trubice odsávající konverzní směs z reaktoru je opatřena filtrační plachetkou, která je umístěna těsně nad míchadlem, nebo je konverzní směs odsávána z reaktoru pomocí odkalovací trubice, částice katalyzátoru jsou společně s konverzní směsí nasávány do odkalovací trubice, kde již mohou volně sedimentovat, protože nejsou míchány. Je-li sedimentační rychlost částic katalyzátoru větěí než postupná rychlost čerpané kapaliny vzhůru odkalovací trubicí, potom setrvávají částice v reaktoru. Pro případ jejich úniku může být výtok z posledního reaktoru opatřen filtrem, z něhož mohou být zachycené částice vraceny do reaktorů. Z konverzní směsi vytékající z posledního reaktoru se buď kontinuálně, nebo v určitých časových intervelech izoluje 6-APK a popřípadě regeneruje fenyloctové kyselina tak, že se směs ihned ochladí a míchá s ochlazeným octanem butylnatým ve vohdném objemovém poměru, nejlépe 1 : 3, za současné úpravy pH zředěnou kyselinou sírovou na 4,3, což je hodnota izoelektrického bodu 6-APK. Po dokončené krystalizací se 6-APK odfiltruje, promyje ledovou vodou a vychlazeným acetonem a usuší, přičemž z butylacetátového extraktu lze regenerovat kyselinu fenyloctovou za současné regenerace rozpouštědla.

Přednosr! způsobu výroby podle vynálezu je jeho kontinualizace při vysoké stabilitě katalyzátoru, s operačním poločasem aktivity 1 500 hod. nepřetržitého provozu. Využití katalyzátoru při průtokovém uspořádání konverze roste s počtem v sérii zapojených reaktorů. Maximálního využití určitého množství katalyzátoru, rozděleného do více reaktorů, se dosáhne tehdy, jsou-li jeho hmotnosti ve všech reaktorech stejné. Míru využití vázaných buněk při použiti průtokových míchaných reaktorů v sérii lze odvodit z kinetické rovnice pro průtokový reaktor a ze změřeného průběhu konverze v závislosti na čase při vsádkové konverzi.

Při vsádkovém (diskontinuálním) způsobu kompletně rozštěpí 1 kg vázaných buněk o aktivitě 6 pmol/mg/h asi 6 litrů 6,5%ního roztoku penicilinu. Při použití průtokových reaktorů rozštěpí 1 kg vázaných buněk, rozdělený rovnoměrně do 6 reaktorů 0,3, 2,0, 3,0, 3,3, 3,8 a

4,4 litru 6,5%ního roztoku penicilinu za 1 hodinu.

Způsob podle vynálezu má ve srovnání se způsobem podle čs.autorského osvědčení č.

209676 tyto výhody:

a) penicilín lze hydrolyzovat na 6-APK kontinuálně, přičemž stabilita enzymové aktivity vázaných buněk je stejná jako při vsádkovém (diskontinuálním) způsobu. Při použití větěího počtu reaktorů zapojených v sérii lze dosáhnout přibližně stejného využití kata lyzátoru jako u diskontinuálního způsobu;

b) množství degradačních produktů je nižší než při průtokovém způsobu konverze na sloupcích s pevným ložem;

c) operační stabilita vázaných buněk je vyšší než při použití sloupců s pevným ložem, realizace výroby je technicky méně náročná a navíc odpadají náklady spojené s používáním pufrů potřebnýeh při konverzi na sloupcích, takže se zjednodušuje i izolace 6-AKP;

d) způsob podle vynálezu a jeho provedení má ve srovnání se způsoby používajícími různé imobillzovanó maleriály pro enzymovou hydřOlýžU penicilinu na 6-APK výhodu především v zajištění vysoké stability katalyzátoru a z toho vyplývající možnosti dlouhodobého

213 099 kontinuálního provozu, což zvyšuje ekonomickou efektivnost výroby.

Pro kontinální výrobu G-APK podle vynálezu byly použity chemicky navzájem vázané buňky s penicilinacylázovou aktivitou, získané podle čs.autorského osvědčení č. 203607. a č. 209265.

BližSí podrobnosti způsobu podle vynálezu vyplývají z příkladů provedení, které tento způsob pouze ilustrují, ale nijak neomezují na létky, zařízení, postup nebo podmínky v nich uvedené.

Příklad 1

Dvě 150 ml kádinky byly umístěny ve vodní lázni vyhřívané na 37 °C. V každé kádince bylo 20 g biokatalyzátoru na bázi navzájem chemicky vázaných buněk, s těmito charakteristikami: sedimentační rychlost ve vodě 0,4 cm/sek, velikost částic 0,2 až 0,8 ma (průměr 0,5 mm), sušina 35 % hmot., specifická aktivita 5,5 umol /6-APK/h/mg vlhké hmoty (42 °C, pH 7,6). Suspenze, jejichž objem v každé kádince byl 75 ml, byly míchány intenžltou 200 ot/min. Před spuStěním průtokového provozu byla směs biokatalyzátoru a 6,5%ního roztoku draselné soli benzylpenicilinu ponechána reagovat vaádkově 30 minut v první kádince a 60 minut ve druhé, za úpravy pH čpavkovou vodou na hodnotu 7,6, dokud koncentrace penicilinu v kádinkách neklesla asi na 12 % hmot., respektive 0 % hmot. výchozího množství, což odpovídá stacionárnímu stavu při průtokovém provozu. Teprve po dosažení tohoto stavu byl spuštěn průtokový provoz. Ze zásobníku byl čerpán 6,5%ní roztok draselné soli benzylpenicilinu do první kádinky rychlostí 50 ml/h,a částečně zkonvertovaný roztok K°druhé kádinky rychlostí rychlostí 51 ml/h e zcela zkonvertovaný roztok z druhé kádinky ven rychlostí 52 ml/h. V obou kádinkách bylo pH udržováno na hodnotě 7,6 přítokem 15,5%ní čpavkové vody do první kádinky a l,8%ního roztoku do druhé kádinky rychlostí 1 ml/h. Systém byl v provozu nepřetržitě 240 hodin. Po celou tuto dobu bylo v první kádince přítomno 12 % zbytkového penicilinu a ve druhé kádince nic. Průměrné množství degradačnlch produktů vznikajících při konverzi bylo 3,5 % hmot., průměrná účinnost konverze tedy činila 96,5 % teorie.

Příklad 2

Do dvou 201itrových fermentačních tanků bylo umístěno 7,5 litrů suspenze obsahující 2 kg biokatalyzátoru jako v příkladu 1. Suspenze byly zahřívány na 37 °C a míchány 180 ot/min Provoz byl zahájen jako v příkladu 1. Třemi čerpadly byl čerpán vodný roztok draselné soli benzylpenicilinu ze zásobníku do prvního reaktoru rychlostí 5,0 litrú/h, z prvního do druhého reaktoru rychlostí 5,1 litrů/h a z druhého reaktoru do zásobníku konverzní směsi rychlostí 5,2 litrů/h. Zásobníky roztoku draselné soli benzylpeniclinu i konverzní směsi byly chlezeny na teplětu 5 °C. V obou tancích bylo pH udržováno na hodnotě 7,6 přídavkem čpavkové vody o hmotnostní koncentraci 1,8 % do druhého tanku rychlosti 100 ml/h. Na výtoku z druhého tanku byly vyplavené částice katalyzátoru zachycovány ns filtru a uniklý materiál, asi 40 g denně, byl vracen do tanků, které byly v provozu 120 h. Po celou dobu provozu bylo v prvním tanku přítomno 12 % zbytkového penicilinu a v druhém tanku nic. Z konverzní směsi v zásobníku byla vždy po 12 h izolována 6-APK popsaným postupem. Výtěžek 6-APK činil průměrně 80 % teorie, bez zpracování matečných louhů. Fenyloctová kyselina byla regenerována obvyklým způsobem.

213 099

Příklad 3

Tři 50 ml baňky, sloužící jako reaktory, opatřené uzávěrem s otvory pro přívod roztoku draselné soli benzy lpěni dinu a Čpavkové vody a pro odtok konverzní směsi, byly umístěny v suěárně při 37 °C. V každé baňce bylo 25 ml suspenze obsahující 6 g biokatalyzátoru jako v příkladu 1. Před zahájením provozu ee nechala směs biokatalyzátoru a 6,5%ního roztoku draselné soli benzylpenicilinu reagovat vsádkově za úpravy pH na hodnotu 7,6 v prvním reaktoru 17 minut, 33 v druhém a 60 v třetím, aby v jednotlivých reaktorech bylo dosaženo 26,10 a 0 % zbytkového penicilinu, což odpovídá stacionárnímu stavu za podmínek průtokového provozu. Teprve potom byly reaktory těsně uzavřeny a byl spuštěn průtokový provoz. Do prvního reaktoru byl čerpán roztok draselné soli benzylpenicilinu rychlostí 50 ml/h, z posledního reaktoru vytékala konverzní směs, v důsledku přítoku čpavkové vody do reaktorů, rychlostí 53 ml/h. Konverzní směsi byly odsávány z reaktorů stejně jako v příkladu 1.

Do reaktoru přitékal roztok čpavkové vody rychlostí 1 ml/h, ve hmotnostní koncentraci 12,8 % do prvního reaktoru, 2,8 % do druhého a 1,8 % do třetího reaktoru. Reaktory byly v provozu 48 hodin. Po celou dobu provozu bylo množství zbytkového penicilinu v prvním, druhém, respektive třetím reaktoru 26, 10, respektive 0 %, což znamená, že bylo dosaženo 74, 90 a 100%ní konverze penicilinu na 6-APK.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob kontinuální výroby kyseliny 6-aminopenieilanové enzymovou hydrolýzou penicilinu, zejména benzylpenicilinu, vyznačující se tím, že se vodný roztok penicilinu, zejména roztok draselné soli benzylpenicilinu, o koncentraci 0,03 až 0,3 mol/litr, s výhodou 0,18 mol/litr, protékající alespoň dvěma průtokovými reaktory, zapojenými v sérii, uvádí ve vznosu ve styk s katalyzátorem na bázi vzájemně chemicky vázaných buněk producenta penicilinacylázy, za stálého udržování pH na hodnotě 7,0 až 8,0, s výhodou 7,6 a za teploty 20 až 50 °C, s výhodou 37 °C, v každém reaktoru, načež se z reakční směsi, opouštějící poslední reaktor, izoluje kyselina 6-aminopenicilanová, popřípadě regeneruje kyselina fenyloctová.