CS210673B2 - Manufacturing process of 3-(ls)p-1 - phenylethylamino prropylaminobleomycine - Google Patents
Manufacturing process of 3-(ls)p-1 - phenylethylamino prropylaminobleomycine Download PDFInfo
- Publication number
- CS210673B2 CS210673B2 CS784304A CS430478A CS210673B2 CS 210673 B2 CS210673 B2 CS 210673B2 CS 784304 A CS784304 A CS 784304A CS 430478 A CS430478 A CS 430478A CS 210673 B2 CS210673 B2 CS 210673B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- bleomycin
- phenylethyl
- diaminopropane
- copper
- monosulfate
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 3
- 241001147844 Streptomyces verticillus Species 0.000 claims abstract description 13
- NQONXAAXIFYYMX-JTQLQIEISA-N n'-[(1s)-1-phenylethyl]propane-1,3-diamine Chemical compound NCCCN[C@@H](C)C1=CC=CC=C1 NQONXAAXIFYYMX-JTQLQIEISA-N 0.000 claims abstract description 8
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims abstract description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical group Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 2
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical class N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 abstract description 92
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 abstract description 91
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 abstract description 84
- 208000005069 pulmonary fibrosis Diseases 0.000 abstract description 9
- 230000003327 cancerostatic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 abstract 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical group [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 19
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- -1 amino compound Chemical class 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 14
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 14
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 13
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 9
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 9
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 8
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 7
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 5
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 5
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 5
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PPQNQXQZIWHJRB-UHFFFAOYSA-N Methylcholanthrene Chemical compound C1=CC=C2C3=CC4=CC=C(C)C(CC5)=C4C5=C3C=CC2=C1 PPQNQXQZIWHJRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 206010061924 Pulmonary toxicity Diseases 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 231100000374 pneumotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 3
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 3
- SYTBZMRGLBWNTM-SNVBAGLBSA-N (R)-flurbiprofen Chemical compound FC1=CC([C@H](C(O)=O)C)=CC=C1C1=CC=CC=C1 SYTBZMRGLBWNTM-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010022082 Injection site necrosis Diseases 0.000 description 2
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 2
- 239000007868 Raney catalyst Substances 0.000 description 2
- NPXOKRUENSOPAO-UHFFFAOYSA-N Raney nickel Chemical compound [Al].[Ni] NPXOKRUENSOPAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000564 Raney nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000007665 chronic toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000160 chronic toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 2
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 2
- XHUZQSKFBDDORP-PPHPATTJSA-N n'-[(1s)-1-phenylethyl]propane-1,3-diamine;hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCN[C@@H](C)C1=CC=CC=C1 XHUZQSKFBDDORP-PPHPATTJSA-N 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- AFHFWLNCUQBZAU-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol 2-pyridin-2-ylacetic acid hydrate Chemical compound O.CCCO.OC(=O)CC1=CC=CC=N1 AFHFWLNCUQBZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 231100000456 subacute toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDOYKFSQFYNPKF-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;sodium Chemical compound [Na].[Na].OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O BDOYKFSQFYNPKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GHFWTRIEECHRFD-UHFFFAOYSA-N Cl.Cl.CC(O)=O.CC(O)=O.OS(O)(=O)=O Chemical compound Cl.Cl.CC(O)=O.CC(O)=O.OS(O)(=O)=O GHFWTRIEECHRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N Cu+ Chemical group [Cu+] VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- FWMBCNGLMRSLPH-UHFFFAOYSA-N O.OC=O.CC(O)=O Chemical compound O.OC=O.CC(O)=O FWMBCNGLMRSLPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- BHHGXPLMPWCGHP-UHFFFAOYSA-N Phenethylamine Chemical compound NCCC1=CC=CC=C1 BHHGXPLMPWCGHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SZKGHIVKMXYMDC-UHFFFAOYSA-N S(=O)(=O)(O)O.Cl.Cl Chemical compound S(=O)(=O)(O)O.Cl.Cl SZKGHIVKMXYMDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- ZMZINYUKVRMNTG-UHFFFAOYSA-N acetic acid;formic acid Chemical compound OC=O.CC(O)=O ZMZINYUKVRMNTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000003217 anti-cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N divinylbenzene Substances C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000004508 fractional distillation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 125000003395 phenylethylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 235000021395 porridge Nutrition 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- MFMLMKLBWODGNA-UHFFFAOYSA-N propane-1,3-diamine;hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCN MFMLMKLBWODGNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVSKHRXBFJPNKK-UHFFFAOYSA-N propionitrile Chemical compound CCC#N FVSKHRXBFJPNKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006308 propyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 125000002112 pyrrolidino group Chemical group [*]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000008261 skin carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- PHYFQTYBJUILEZ-IUPFWZBJSA-N triolein Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PHYFQTYBJUILEZ-IUPFWZBJSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu výroby nového opticky aktivního bleomycinu, 3-[ (S)-Γ-feny lethy lamino Jpr opy laminobleomycinu vzorce I
i \ X·/ \ л z^=o
X * ο-χ lf
Χ<χ/^0 o
X ω 0=0-0^ ± 2? 21*
21* \x X/°
X \ / x
O=U4 .
5-δ р-г'-Е v
£ o-o-u,
i xO
X—
XN O
X ,υ-χ. Xм i
0-O-Q 1 X ω-ο o
X
Podstata výroby 3-[ (S)-l‘-fenylethylamino] propylaminobleomycinu způsobem podle vynálezu spočívá v tom, že se kmen mikroorganismu Streptomyces verticllus FERM-P číslo 4108 (ATCC 31 307) nebo mutační kmen mikroorganismu Streptomyces verticilus
FERM-P číslo 4108 (ATCC 31 307) získaný ozářením ultrafialovými paprsky nebo/a paprsky X naočkuje do živného prostředí a kultivuje v přítomnosti N-( (S)-l‘-fenylethylJ-1,3-diaminopropanu vzorce II
210B73
nebo jeho soli při teplotě 23 až 37 °C po dobu 5 až 10 dní za selektivního vzniku 3- [ (S) -l‘-fenylethylamino· ] propylaminobleo- . mycinu, který se pak z kultivační kapaliny izoluje.
N- [(S) -Γ-fenylethy 1 ] -1,3-diaminopropan nebo jeho sůl se přidává do kultivační kapaliny účelně v koncentraci 0.2 až 2 mg/ml prostředí.
Jako· soli N-[ (S)-l‘-fenylethyl]-l,3-diaminopropanu se s výhodou používá hydrochloridu, síranu nebo octanu.
Bleomycin je antineoplasticky účinné anibiotikum objevené Ume-zawou a· spolupracovníky [Umezava a sp.: Journal of Antibiotics, 19A, 200 (1966)·]. Je to bazický, ve vodě rozpustný cukerný peptid, schopný vytvářet chelát s jedním atomem dvojvazné mědi. Lze ho získat kultivací kmene mikroorganismů produkujících bleomycin, příslušejícího k Streptomyces verticillus, v živném prostředí za provzdušňování a míchání a pak izolací produktu z kultivační kapaliny vhodnými způsoby, jako například za použití iontoměničových pryskyřic. Při běžném způsobu kultivace vzniká a bylo izolováno· 16 různých druhů bleomycinu viz například Umezawa a spolupracovníci: Journal of Antibio-tics, 19A, 210 (1966).
Je rovněž známo, že uvedené bleomyciny mají následující obecný vzorec IJI
ve kterém
R je u jednotlivých druhů bleomycinů různé.
V USA patentovém spisu č. 3 846 400 je rovněž popsáno, že pěstuje-li se kmen mikroorganismů produkujících bleomycin v živném prostředí obsahujícím . aminosloučeninu, vestavuje se zmíněná aminosloučenina do molekuly bleomycinu ve formě postranního řetězce představovaného substituentem R v obecném vzorci III a vzniká nový bleomycin, který se liší od kteréhokoliv známého bleomycinu a který nelze získat obvyklým kultivačním způsobem.
Příklady některých těchto nových bleomycinů jsou uvedeny níže:
Substituent R
H —N—CH2CH2CH2—S—CH5
O
H II —N—CH2CH2CH2—S—CH3
CH3
H + / —N—CH2CH2CH2—S \
CHs
H —N—CH2CH2CH2NH—CH2CH2CH2CH2NH2
NH
H || —N—CH2CH2CH2CH2—NH—C—NH2 —NH— (CHžjs—NHCH3 —NH—(CH2)3NHC4H9
Název bleomycinu demethyl A2
3- (methylmerkapto] p rooylaminnOleemyyin
Ai
Aj
As
B2
3- (mythylamino] p rooylanynnOleoOiyyin
3- [ bbtylamiήoOpooyylamin.cObeomycin
3- (pyrrolidlno)p rooylamУnnOleomyyin
Z uvedených bleomycinů se směsi mědi yrostých bleomycinů Αι,Α2,Α5, B2, demethyl-A2 m některých dalších (v dalším yoyisu vynálezu je· tato· mědi yrostá směs bleomycinů označována jako „bleomycinový komylex“) v současné době v širokém měřítku úsyěšně youžívá v klinické yraxi k léčení rakoviny, zvláště k léčení oyidermálního· karcinomu kůže, karcinomů kůže hlavy a krku, rakoviny krčku děložního, karcinomu ylic, maligního lymfomu a yodobných rakovinných 0nemocnění.
Z hlediska vedlejších účinků má však bleomycin některé nežádocí vlastnosti, nayříklad, že vyvolává fibrosu ylic. Fibrosa ylic je oejnebezyočnějšl·m vedlejším účinkem bleomycinu. Lze snadno odvodit, že kdyby se yodařilo tento vedlejší účinek nějakým zyůsobem yo-tlačit, dalo by se karcinostatické účinnosti bleomycinu v klinické yraxi ještě léye využít.
Z výše uvedených důvodů zabývali se autoři vynálezu několik let yříyravou různých bleomycinů a v testech na zvířatech sledovali jejich karcinostatickou účinnost a toxicitu, hlavně jejich vliv na vyvolávání fibrosy ylic. Výsledkem· jejich studia bylo· nalezení nového bleomycinu, jmenovitě 3-[ (S)-l‘-fenylethylaminoij yroyylaminobleomycinu shora uvedeného vzorce I (v dalším yoyisu je tento nový bleomycin označován symbolem „NK 631“, který zahrnuje jak formu obsahující měď, tak formu yrostou mědi), který lze získávat kultivací kmene mikroorganismů yrodukujících bleomycin v yřítomnosti N-[ [S)-fenylethyl]-l,3-diammoyroyaou _ jako yrekursoru, a který není v karcinostatickém účinku horší než v současné době dostuyný bleomycinový komylex nebo kterýkoliv jiný známý bleomycin, u kterého je však výrazně yotlačen vedlejší účinek zyůsobující fibrosu ylic.
Shora uvedené je yodstatou vynálezu. Účelem vynálezu je zajistit formeotativoí zyůsob výroby nového bleomycinu NK 631. Bližší yodrobnosti vynálezu vyylynou z následujícího yoyisu.
Jednou z nejvýznamnějších biochemických reakcí, ke které dochází yři růstových yrocesech mikroorganismů, je isomerisace, · yři které se různé · oyticky aktivní látky často yřeměňují na ' své motiyody nebo na racemické sloučeniny. Nehledě na to, je rovněž zřejmá možnost, že· u oyticky aktivní aminosloučeniny může dojít k nebio-chemické racemisaci během sterilizace yůdy nebo během kultivace mikroorganismů. Četné výzkumy objasnily, že jedna oyticky aktivní sloučenina se zřetelně liší od druhé ve scho,yoosti yronikání · stěnou mikrobiální buňky nebo buněčnou membránou, a rovněž syecificitou k substrátu a· afinitou k enzymům, které se zúčastňují biochemických a metabolických yochodů.
Bylo yřirozeně očekáváno, že yři blosynté210873 о
do jisté míry selektivním způsobem, a že nelze vyloučit možnost, že aminosloučeňina ze bleomycinu se bude mikrob chovat při přijímání opticky aktivní aminosloučeniny nebo výsledný bleomycin podlehnou racemisaci.
Autoři vynálezu analyzovali níže popsaným způsobem složení bleomycinu, získaného kultivací kmene mikroorganismů produkujících bleomycin v živném prostředí obsahujícím N- [ (R,S) -l‘-fenylethyl ] -1,3-diaminopropan jako prekursor, a nalezli, že zbytek N-[Г-feny lethyl]-l,3-diamoinopropanu vestavěný do molekuly bleomycinu má vždy téměř konstantní poměr R/S roovný 4 : 1. I když není znám důvod, proč vznikající bleomycin není RS-formou, z výše uvedeného experimentálního faktu zřetelně vyplývá, že у biosyntetickém systému mikroorganismů kmene Streptomyces verticillus produkujících bleomycin dochází к zavádění opticky aktivní aminosloučeniny do molekuly bleomycinu se signifikantní selektivitou tak, že se vždy přednostně vestavuje R-forma před S-formou.
Z uvedeného důvodu bylo možné očekávat, že provede-li se kultivace v prostředí obsahujícím N-( (S)-l‘-fenylethyl]-l,3-diaminopropan jako prekursor, bude neobyčejně nesnadné zavést selektivně zmíněnou aminosloučeninu do molekuly bleomycinu a tak získat bleomycin NK 631 ve vysoké optické čistotě a ve vysokém výtěžku.
Přes výše uvedený experimentální fakt autoři vynálezu neočekávaně nalezli, že přidá-li se opticky čistý N-[ (S)-r-fenylethylJ-1,3-diaminopropain do kultivačního systému, nepodléhá racemisaci a je překvapivě vestavován do molekuly bleomycinu v té měř stejném poměru R/S jako v případě, když se do kultivačního prostředí přidá aminosloučenina v čisté formě.
Ačkoliv v současné době nemůže být podáno jednoznačné vysvětlení uvedeného zjevu, je možno připustit hypotézu, že R forma aminosloučeniny působí kompentitivně nebo antagonisticky a výsledkem je, že zavádění
S-formy aminosloučeniny je brzděno a tvorba R-formy bleomycinu probíhá přednostně. Tak byl nalezen způsob přípravy poskytující ve vysokém výtěžku nový bleomycin NK 631, který má velký význam pro léčení rakoviny. Uvedený objev je podstatou předloženého vynálezu. Vynález poprvé umožňuje s úspěchem fermentativně vyrábět opticky aktivní bleomycin.
N-[ (S)-1‘-Fenylethylj-1,3-diaminopropan, používaný jako prekursor při způsobu podle vynálezu, je novou sloučeniou, která byla poprvé syntetizována autory tohoto vynálezu. Lze ho připravit následujícím způsobem:
К fenylethylaminu, ochlazenému předem na 0 °C, se přidá přibližně ekvivalentní množství akrylonitrilu a směs se pak zahřívá 10 až 24 hodin na 85 až 100 °C. Po skončení reakce se přebytečný akrylonitril oddestiluje za sníženého tlaku a zbývající surový produkt se předestiluje rovněž za sníženého tlaku. Získaný 3-[ (S)-r-fenylethylaminojpropionitril se zredukuje obvyklým způsobem, na příklad vodíkem v přítomnosti Raneyova niklu, a získá se žádaný N-((S)-l‘-fenylethyl]-1,3-diaminopropan (v dalším popisu je pro tuto látku používán název „aminosloučenina ).
Fyzikálně-chemické vlastnosti zmíněné aminosloučeniny jsou uvedeny v tabulce 1.
Tabulka 1
Fyzikálně-chemické vlastnosti
N-[ (S)-l’-fenylethyl]-l,3-diaminopropanu
Volná báze Dihydrochlorid
1) Vzhled
2) Teplota tání
3) Teplota varu
4) Ultrafialové absorpční maximum (nm) j Molární extinkční koeficient ε (při 256 nm)
6) Specifická rotace ['«jo25 bezbarvá kapalina (při teplotě místnosti) až 103 °C (při 0,27 kPa)
241, 247, 252, 257, 263, 267 (methanol) bílé jehličkovité krystalky
223,5 až 224 °C
250, 256, 259, 266 (destilovaná voda)
206 (v destilované vodě) —56,38 0 (neředěno, 1-1) —20,6 0 (c = l, destilovaná voda)
Volná báze Díhydrochlorid
7) Tenkovrstevná chromatografie (RP) n-propanol — pyridin — — kyselina octová — voda (14 :10:3:12, V/V) Avicell-SF @
8} ' Vysokovoltová elektroforesa (R1U) kyselina mravenčí — — kyselina octová — — 'voda (25 : 75 : 900, V/V)
Avicell-SF (§)
800 V, 10 minut Rm alaninu položeno rovno 1,0
9) Infračervené absorpční spektrum (cm'1,
KBr tableta)
10) Sumární vzorec (molekulová hmotnost)
0,73
1,52
700, 760, 820, 910, 1025,
1080, 1130, 1200, 1305, 1350,
1370, 1450, 1495, 1605, 2850, 2940, 3300, 3375
C11H18N2 (178,28)
0,73
1,52
690, 740, 820, 910, 980,
1020, 1065, 1075, 1150, 1205,
1385, 1460, 1500, 1515, 1590, 2500, 2850, 3000, 3500
C11H20№C12 (251,20)
Při praktickém provádění způsobu podle vynálezu se ke kultivaci mikroorganismů s výhodou používá živného prostředí obsahujícího hlavně cukry a organické dusíkaté látky, jako· například prosnou kaši, glukózu, škrob, sójovou moučku, kukuřičný výluh a podobné, a kromě toho obsahujícího· malá množství anorganických látek, jako· fosforečnanu draselného, síranu mědnatého, síranu zinečnatého, kuchyňské 'soli, dusičnanů a podobných (tento typ živné půdy je popsán například v USA patent, čís. 3 681 491 a 3 846 400').
N-[ ' (S) -Γ-Feny lethyl] -1,3-diaminopropan, používaný · jako· prekursor, lze k živné půdě přidat buď před zahájením kultivace, nebo po částech během . kultivace, anebo· ho přidávat kombinovaně oběma způsoby. Přidávaná aminosloučenina se obvykle napřed zneutralizuje kyselinou chlorovodíkovou a používá se ve formě hydrochloridu. Je však možné přidávat do živného prostředí 'volnou aminosloučeninu. V posléze uvedeném případě se upraví pH prostředí jako celku a pak se zahájí kultivace.
Koncentrace N-[ (S )-r-fenylet'hyl]-l,3-diaminopropanu v živném prostředí se pohybuje obvykle v rozmezí od 0,2 do· 2 mg/ml, výhodně je · · 1 mg/ml. Po vysterilizování se živná půda naočkuje mikroorganismy pro- ·: dukujícími bleomycin, příslušejícími ke kme- : nu Streptomyces vertícillus, například mikroorganismy kmene Streptomyces verticillus NK 68-144, uloženým v japonském výzkumném ústavu pro fermentaci (Fermen tation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japonsko)· pod označením FERM-P číslo 4108, a 'v americké sbírce · typových kultur (Americal Type Culture Collection) pod · označením ATCC 31307, nebo se naočkuje násadovou kulturou mikroorganismů · produkujících bleomycin, patřících k dalším odrůdám kmene Streptomyces vertícillus, 'a mikroorganismy se pak kultivují při 23 až 37 °C, za provzdušňování a míchání, obvykle po dobu 5 až 10. dnů.
Kultivace se skončí, když se dosáhne maxima antimikrobiální mohutnosti v živném prostředí (sledováno biologickým testem za použití Mycobacteria 607 jako testovaného mikroorganismu). Po skončení kultivace se kultivační kapalina zfiltruje a filtrát se nechá protékat přes sloupec anexové pryskyřice nesoucí vhodné reaktivní skupiny, jako karboxylové skupiny. Žádaný produkt se při tom naadsorbuje na pryskyřici a pak se eluuje vodnou kyselinou chlorovodíkovou.
Eluát se zneutralizuje, rozpuštěný surový bleomycin se naadsorbuje na aktivní uhlí, produkt se eluuje směsí acetonu s kyselinou·· chlorovodíkovou, eluát se zahustí a pak lyofilizuje. Surový produkt se vyjme do methanolu, roztok se chromatografuje na. kysličníku hlinitém za použití methanolu jako· elučního činidla, eluát se zahustí a · lyofllizuje. Získaný produkt se chromatografuje na sloupci Sephadexu (g) G-25 (obchodní znač ka pro gelový filtrační materiál, složený z mikroskopických kuliček zesilovaného dextranu, vyráběný a prodávaný firmou Pharmacia Fine Chemicals lne., Švédsko], a pak se znovu chromatografuje na sloupci CM
Sephadexu®
C-25 (obchodní značka pro katexový typ Sephadexu, který se skládá z mikroskopických kuliček karboxymethylovaného polysacharidu dextranu, a který vyrábí a prodává firma Pharmacia Fine Chemicals, lne., Švédsko), za použití vodného roztoku chloridu amonného jako elučního činidla. Získá se eluát obsahující žádaný bleomycin NK 631 ve formě obsahující měď. Podíl obsahující zmíněný bleomycin se nalije na sloupec iontoměničové pryskyřice značky Diaion (§) HP 40, sloupec s naadsorbovaným produktem se promyje postupně vodným roztokem dvojsodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (v dalším popisu je pro tuto sůl používána zkratka „EDTA. .Na2“), vodným roztokem síranu sodného a vodou, a posléze se produkt eluuje směsí acetonu s vodou. Eluát se zahustí a lyofilizuje; získá se monosulfát bleomycinu NK 831 (formy prosté mědi) ve formě světle žlutobíle zbarveného amorfního prášku.
Monosulfát bleomycinu NK 631 (formy prosté mědi) získaný způsobem podle vynálezu se za účelem indikace a stanovení optické Čistoty hydrolyzuje silnou kyselinou, hydrolysát se rozdělí vysokovoltovou papírovou elektroforézon a dvojrozměrnou papírovou chromatografii a látky se detegují ninhydrinem; tím se prokáže přítomnost N- (l‘-feny lethyl) -1,3-diaminopropanu.
Hydrolýzou uvolněný amin se izoluje a přečistí, změří se jeho specifická rotace a absorbance v ultrafialovém světle, a z naměřených hodnot se zjistí optická čistota bleomycinu NK 631. Konkrétně se při stanovování optické čistoty postupuje následujícím způsobem:
Asi 50 mg monosulfátu bleomycinu NK 631 (formy prosté mědi) se zahřvá s 6 N kyselinou chlorovodíkovou 16 hodin к varu pod zpětným chladičem (na teplotu 110 až 115 stupňů Celsia). Hydrolýzou vzniklý N-[(ŠJ-l‘-fenylethyl)-l,3-diaminopropan se ze směsi rozkladných produktů izoluje, přečistí a pak se stanoví jeho optická rotace (při λ = = 365 nm) při teplotě 25 °C, za použití polarimetru značky Perkin-Elmer 141. Poté se stanoví jeho absorbance při λ = 256 nm a registruje se celá křivka v ultrafialové oblasti. Křivka v oblasti 280 až 310 nm se extrapoluje na λ = 256 nm, a tato hodnota se použije jako základní čára při 256 nm.
Hodnotu x optické čistoty lze vyjádřit následujícími rovnicemi:
S X ~ S + R (1), x = 0,5 + 5,735 X (2), ve kterých
S = levotočivá optická rotace, R = pravotočivá optická rotace, a = pozorovaná optická rotace a OD = pozorovaná absorbance.
Monosulfát bleomycinu NK (forma prostá mědi) připravený způsobem podle vynálezu poskytne po' kyselé hydrolýze N-[ (S)-l‘-fenylethyl]-l,3-diaminopropan, u něhož se v typickém případě nalezne specifická rotace [о)]зб525 = —64,18° (c = 0,38, voda). Optická čistota tohoto monosulfátu bleomycinu NK 631 (formy prosté mědi), vypočtená podle shora uvedených rovnic, je 98,5 %.
V tabulce 2 a 3 jsou uvedeny základní fyzikální a chemické vlastnosti bleomycinu NK 631.
Struktura bleomycinu NK 631 znázorněná vzorcem I byla potvrzena tím způsobem, že monosulfát bleomycinu NK 631 (forma prostá mědi) byl rozpuštěn v těžké vodě a změřeno jeho 13C-NMR spektrum metodou potlačení protonového šumu, za použití dioxanu jako vnitřního standardu.
Byly znaznamenány následující signály:
19,4, 26,3, 37,0, 43,5, 58,9, 128,3 (dva signály), 130,0 (dva), 130,2 a 136,3 ppm, které lze přisoudit jedenácti 15C atomům přítomným ve zbytku aminosloučeniny v postranním řetězci molekuly bleomycinu NK 631, jmenovitě 3-[ (3)-l‘-fenylethylamino]propylaminovém zbytku. Všechny ostatní pozorované signály uhlíkových atomů odpovídaly charakteristickým signálům zbývající bleomycinové molekuly, tak jak jsou popsány v literatuře [viz Naganawa a spolupracovníci: Journal of Antibiotics, svazek 30, str. 388 (1977)].
Tabulka 2
Fyzikální a chemické vlastnosti bleomycinu
NK 631 (formy obsahující měď)
Dihydrochlorid Monosulfát
1. Vzhled
2. Rozpustnost
3. Teplota tání (rozkladu) °C
4. Specifická rotace [ja]^25 (destilovaná voda, c = 1,0)
5. T-enkovrstevná chromatografie (Rf) (viz poznámku 1)
6. Elektroforéza (Rm) (Rm alaninu položeno· rovno1 1,0;
(viz poznámku 2) modře zbarvený amorfní prášek rozpustný ve vodě, methanolu, kyselině octové, dimethylsulfoxidu a dimethylformamidu; málo rozpustný · v dioxanu; nerozpustný v . ethanolu, acetonu, etheru . a benzenu,
205 až 207 — 95,6°
a) 0,72
b) 0,75
0,80 modře zbarvený amorfní prášek stejná jako u dihydro-chloridu
205 až 207 — 93,7 °
a) 0,72
b) 0,75
0,80
Poznámka 1:
a) na adsorbentu značky Silica gel G ® (obchodní značka pro silikagel určený pro tenkovrstevnou chromatografií, vyráběný firmou Merck ínc., USA), v soustavě methanol —10% octan amonný — 10% vodný amoniak (10: 9:1, V/V).
b) na adsorbentu značky Avicel SF (§) (obchodní značka pro adsorbent určený pro tenkovrstevnou chromatografií, tvořený krys talinicko-u celulózou, vyráběný firmou FMC Corporation, USA), v soustavě n-propanol — pyridin — kyselina octová — voda (15 : 10' : :3:12).
Poznámka 2:
na adsorbentu značky Avicdl SF (§) v soustavě kyselina mravenčí — kyselina octová — voda (25:75:900, V/V), 800 V, 15 minut.
д ω
Sh cd 40
Tabulka 3
Fyzikální a chemické vlastnosti bleomycinu NK 631 (formy prosté mědi)
Dihydrochlorid Monosulfát Diacetát ω
X) o 4—·
>ω > CO
4tí ω >ω 'со
Рч '3
4-1 ř-l o β cd oo cn >N cd
'cd
ST
4-1 ω
Φ £ N >
OJ >N Cd co
| ъ | CD O ID O | > | |
| OJ I | CO CD | cn | |
| CO | > | ||
| 1 | cd 40 | rH |
СП
| & | CD O | |
| OJ | co a | cn |
| 1 | Ctí 40 | o* |
| 0 | co o | |
| гЧ | Ю O | |
| oí | cod | cn |
| 1 | се л | co |
cd
co* 'cd й
N
O
Рй
W
V příloze jsou na obr. 1 a 2 znázorněny ultrafialové absorpční křivky, a na obr. 3 a 4 infračervené absorpční křivky bleomycinu NK 631 vzorce 1. Obr. 1 znázorňuje ultrafialovou absorpční křivku dihydrochloridu
3- [ ( S) - rlfenylethylamino] propplaminobleomycinu vzorce I (formy obsahující měď), obr. 2 znázorňuje ultrafialovou absorpční křivku odpovídajícího moypsulfátu (formy prosté mědi); obr. 3 znázorňuje infračervenou absorpční křivku dihydrochloridu 3- [ (S) -l‘-feiiylethylamino ] prppyiaminobinomycinu (formy obsahující měď), měřenou v tabletě bromidu draselného, a obr. 4 znázorňuje infračervenou absorpční křivku odpovídajícího monosulfátu (formy prosté mědi), měřenou stejným způsobem.
Vynikající biologická účinnost bleomycinu NK 631 podle vynálezu vyplývá z níže uvedených výsledků experimentálního hodnocení.
Biologická účinnost bleomycinu NK 631 byla srovnávána s účinností komerčníhobleomycinového komplexu a s účinností monosulfátu 3-[ (RSpr-fenylethylamino] propylaminoblepmycinu (formy prosté mědi] (v dalším je pro- tuto látku používáno· označení „RS-forma“) v následujících čtyřech testech:
1] účinek na vyvolávání fibrosy plic j antineoplastická účinnost
3) aytimikrpbiáiyí účinnost
4) toxicita
Ke srovnání použitá RS forma antibiotika byla získána fermeytačyím způsobem popsaným v USA patentu č. 3 846 400.
1. Toxicita vůči plícím u myši (vyvolání fibrosy)
K testování byly použity dvanáctičetné skupiny myších samců kmene ICR ve stáří 15 týdnů. Testované látky byly podávány v ko-nstantní dávce 5 mg/kg ve formě intrareritpneá^ích injekcí jednou denně po dobu 10 po sobě následujících dnů. Po skončení aplikace látek byly myši chovány a pozorovány 5 týdnů. Pak byla zvířata usmrcena a pitvou zjištěn rozsah fibrosy plic.
Výskyt a stupeň vyvolané fibrosy plic u skupiny myší, které byl podáván mpnpsulfát bleomycinu NK 631 (forma prostá mědi) byl porovnán s výskytem a stupněm fibrosy plic u skupin myší, kterým byla podávána RS forma antibiotika a blnomyciyový komplex. Nalezené výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.
Tabulka 4
| Počet myší s fibrosou plic (%) | Výskyt Relativní hodnota | Stupeň onemocnění | ||
| Celkové zhodnocení stupně fibrosy plic: celkový počet vzorků (viz poznámka) | Relativní hodnota | |||
| mpypsuieát bleomycinu NK 631 (forma prostá mědi) | 4/12 (0,33) | 0,36 .. | 6/36 - (0,17) - | 0,25 · |
| RS forma | 7/12 (0,58) | 0,63 | 12//36.(0,33) -. . | . 0,49 |
| blnpmyciyový | 11/12 (0,92) | 1,0 | 24/36 (0,67) | 1,0. |
komplex
Poznámka:
Stupnice používaná k hodnocení stupně ' fibrosy plic:
bod — žádná fibrosa bod — hromadění exudátu v plícních sklípcích a fibrose podobné změny v alveorálních přepážkách body — fibrosa na několika místech body — roztroušená fibrosa bodů — fibrosa na více než dvou třetinách - celé plochy
Jak vyplývá z tabulky 4, monosulfát bleomycinu NK 631 (forma prostá mědi) snižuje ve srovnání s RS formou antibiotika výskyt a rozsah fibrosy plic asi na polovinu, a ve srovnání s bleomycinovým komplexem výskyt fibrosy asi na polovinu a její rozsah na čtvrtinu. Nalezené výsledky zřetelně prokazují výhodnost monosulfátu bleomycinu NK 631 pro klinické použití.
2. Antineoplastická účinnost
2—1. Účinek in vitro na kultury HeLa . S3 buněk
Pro každý shora uvedený bleomycin byla stanovena hodnota. ID50 inhibice množení HeLa S3. buněk po 72 hodinách kultivace v přítomnosti testovaného bleomycinu. Pro. bleomycinový komplex byla nalezena ID5'0 = = 1,70 ^g/ml a pro bleomycin NK 631 IDso = = 0,82 /zg/ml. Z uvedených hodnot vyplývá, že bleomycin NK 631 ihibuje množení HeLa S3 buněk dvakrát silněji než bleomycinový komplex. Pro RS formu antibiotika bylo· na lezeno LD50==O,8O jzg/ml, z čehož vyplývá, že inhibiční činek tohoto bleomycinu je srovnatelný s inhibičním účinkem monosulfátu bleomycinu NK 631 (formy prosté mědi).
2—2. Karciniost-atiCiký účinek na myších Ehrlichův karcinom (solidní nádor)
Myším samcům kmene ICR, starým 6 týdnů, bylo transplantováno podkožně do· tříselné oblasti po 2X10-8 buněk. Po 24 hodinách po· transplantaci byl každé myši aplikován testovaný preparát stejným· způsobem jak bylo popsáno výše v testu 1. Patnáctý den po subkutánní transplantaci byly myším nádory vyjmuty a zváženy, a hmotnosti srovnány s hmotnostmi tumorů, které se vyvinuly u kontrolní skupiny myší, které nebyly ošetřeny, a bylo· zjištěno· procento inhibice.
Jak vyplývá z tabulky 5, je karcinostatická účinnost monosulfátu bleomycinu NK 631 (formy prosté mědi) srovnatelné s účinností RS formy antibiotika a asi 1,4 krát vyšší než účinnost bleomycinového komplexu.
Tabulka 5
Dávka Stupeň . inhibice (v %)
| (mg/kg X10) | Monosulfát NK 631 (forma prostá mědi) | RS-forma antibiotika | Bleomycinový komplex |
| 2,7 | 84 | 78 | 67 |
| 0,9 | 68 | 60 | 55 |
| 0,3 | 39 | 51 | 49 |
| 0,1 | 24 | 51 | 24 |
| 0,03 | 19 | 13 | 21 |
| 0 | 0 | 0* | 0 |
| ID50 | |||
| (mg/kg/den) | 0,35 | 0,31 | 0,49 |
2—3. Karcinostatická účinnost vůči ascitickému hepatomu u krys (ascitický typ)
Krysám kmene Donryu bylo do břišní dutiny transplantováno po 1X10-6 AH 66 buněk. Za 24 hodin po transplantaci byl intraperitoneálně aplikován testovaný preparát a v jeho· podávání bylo pokračováno jednou denně po dobu deseti po· sobě následujících dnů. Během 30· dnů po transplantaci byla sledována tělesná hmotnost krys a počet přežívajících zvířat. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6.
Tabulka 6
Relativní hodnoty průměrného přežití (po-čet dnů)
| Dávka (mg/kg X10) | Monosulfát NK 631 (forma prostá mědi) | RS-forma antibiotika | Bleomycinový komplex |
| 3,12 | 296 | 298 | 241 |
| 1,56 | 269 | 257 | 257 |
| 0,78 | 216 | 196 | 145 |
| 0,39 | 163 | 149 | 116 |
| 0,19 | 116 | 121 | 110 |
| 0 | 10O | 100 | 100 |
Jak vyplývá z tabulky 6, je účinnost monosulfátu bleomycinu NK 631 (formy prosté médi) vůči АН 63 ascitickému hepatomu srovnatelná s účinností RS formy antibiotika a je ve všech dávkách vyšší než účinnost bleomyc nového komplexu.
2—4. Antikarcinogenní účinek vůči epidermálnímu karcinonu kůže vyvolanému 20-methylcholanthrenem u myši
Roztok 20-methylcholanthrenu (v dalším je tato látka označována jako 20-Mc) v acetonu byl dvak/át týdně, po dobu 18 týdnů, lokálně aplikován na oholený hřbet samců myší kmene ddy, starých 10 týdnů. Za šest týdnů cd začátku aplikace 20-MC byl intraperitoneálně aplikován testovaný preparát v dávce 62,5 iUg/myš a v jeho podávání bylo pokračováno dvakrát týdně po dobu 15 týdnů. Za jeden týden po skončení podávání testovaného preparátu byla pathologicky vyšetřena oblast kůže, na kterou byl aplikován 20-MC a sledován výskyt karcinogenesy.
Jak vyplývá z tabulky 7, inhibují monosulfát bleomycinu NK 631 (forma prostá mědi) a RS forma antibiotika o něco málo intensivněji karcinogenesu vyvolanou 20-MC, než bleomycinový komplex.
| Tabulka 7 | Stupeň Inhibice (v %) | ||
| Úmrtnost | Stupeň karcinogenese (v °/o) | ||
| Monosulfát NK 631 (forma prostá mědi) | 1/12 | 5/11 (45,4) | 47,8 |
| RS forma | 1/12 | 5/11 (45,4) | 47,8 |
| bleomycinový komplex | 2/12 | 5/10 (50,0) | 42,5 |
| kontrola | 1/24 | 20/23 (86,9) | 0 |
Ze všech shora uvedených testů vyplývá, že monosulfát bleomycinu NK 631 (forma prostá mědi) má ve srovnání s komerčně dostupným bleomycinovým komplexem zřetelně vyšší antineoplastickou účinnost.
3. Antimikrobiální účinnost nismům Mycobacterium 607 a Bacillus subtllls PCI byla zjišťována diskovou metodou za použití bleomycinu Аг jako standardu (účinnost 1000 j/mg). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8.
Antimikrobiální účinnost vůči mikroorgaTabulka 8
Mycobacterium 607
Bacillus subtilis PCI
| Monosulfát NK 631 (forma prostá mědi) | 7848 | 1550 |
| RS forma | ||
| antibiotika | 7535 | 1400 |
| Bleomycinový | ||
| komplex | 1234 | 886 |
Jak vyplývá z tabulky 8, vykazují monjsulfát bleomycinu NK 631 (forma prostá mědi) a RS forma antibiotika mnohem vyšší antimikrobiální účinnost než bleomycinový komplex.
4. Toxicita
4—1. Akutní toxicita u krysy (LDso) při intraperitoneálním podávání
Jak vyplývá z tabulky 9, jsou hodnoty LDso u krysy nalezené pro monosulfát bleomycinu NK 631 (formy prosté mědi) přibližně stejné jako hodnoty nalezené u bleomycinového komplexu a RS formy antibiotika.
210'673
Tabulka 9
| LDso (mg/kg) | Meze spolehlivosti (5% hladina významnosti) |
Monosulfát NK 631 (forma prostá mědi) 155,0
133,6 až 179,8 krysa
RS forma.
antibiotika 150,6
129,0 až 170,6 bleomycinový komplex 168,0
130,0 až 217,0
4-^2. Subakutní a chronická toxicita u krys a psů
Subakutní a chronická toxicita monosulfátu bleomycinu NK 631 (formy prosté mědi) u krys a psů je srovnatelná s analogickými toxicitami bleomycinového komplexu. Je však třeba rovněž poznamenat, že monosulfát bleomycinu NK 631 (forma prostá mědi) nevyvolává u psů nekrosu v místě vpichu, zatím· co bleomycinový komplex způsobuje nekrosu v místě vpichu u všech psů ve skupině, které byla podávána vysoká dávka látky (1,2 mg/kg, 90 krát), i když zmíněná výška dávky byla u obou druhů bleomycinu stejná. Bleomycin NK 631 vykazuje rovněž nižší toxicitu vůči plícím než bleomycinový komplejx.
Z výše uvedených výsledků vyplývá, ; že toxicita monosulfátu bleomycinu NK 631 (formy prosté mědi) jest srovnatelná s toxicitou bleomycinového komplexu, s výjimkou toxicity vůči plícím a vyvolávání nekrosy, které jsou u bleomycinu NK 631 podstatně nižší.
5. Souhrn
Ze shora uvedených výsledků ' testů lze učinit závěr, že bleomycin. NK 631 jest nová sloučenina, která má následující přednosti:
a) extrémně nízkou toxicitu vůči plícím,
b) antimikrobiální a antineoplastickou účinnost vyšší než komerčně dostupný bleomycinový komplex,
c) obecnou toxicitu srovnatelnou s toxicitou komerčně dostupného bleomycinového. komplexu a
d) nižší lokální toxicitu v místě vpichu injekce než komerčně dostupný bleomycinový komplex.
Z uvedených důvodů lze očekávat, že nový bleomycin NK 631 bude výhodný při kliňlCkém použití.
Způsob podle· vynálezu je podrobněji objasněn v následujících příkladech provedení, které však rozsah vynálezu žádným způsobem neomezují.
Příklady provedení
Příklad 1
Jeden litr živné půdy (pH 7,0) obsahující 2 % glukózy, 0,75· % peptonu, 0,75 % masového· extraktu a 0,3 %o chloridu sodného, se vnese do pětilitrové Erlenmeyerovy baňky, půda se vysterillzuje, naočkuje mikroorganismy druhu Streptomyces verticillus NK-68-144 (FERM-P číslo· 4108, ATCC číslo· 31 387) a mikroorganismy se kultivují při 28 °C po dobu 48 hodin za míchání a třepání; získá se násadní. kultivační kapalina.
Současně se k živné půdě, obsahující 7,17 procenta prosné kaše, 0,5 % glukózy, 3,5 % sójové moučky, 0,75 °/o kukuřičného· výluhu, 0,3 % chloridu . sodného, 0,1 % hydrogenfosforečnanu draselného, 0,05 % síranu zinečnatého, 0,01 °/o síranu měďnatého, 0,2 ·%' dusičnanu sodného a 0,03 Ό/ο · povrchově aktivní látky značky Pronal ST-1 (§) (neionogenní povrchově aktivní činidlo· a odpěňovadlo, vyráběné firmou Toho· Kakagu) přidá hydrochlorid N- [ · (S) -Γ-fenylethyl ] -1,3-diaminopropanu v množství 1 mg/ml půdy a pH směsi se upraví na 6,5.
Dvacet litrů uvedené živné půdy se vnese do fermentačního kotlíku o· objemu 39 litrů a vysterilizuje se. Živná půda se naočkuje shora uvedeným způsobem připravenou násadní kultivační kapalinou v množství 10 °/o. Kultivace se provádí za provzdušňování a míchání rychlostí 400 otáček za minutu po dobu 7 dnů při 28 °C. Po dokončení fermentace se kultivační kapalina, po· přidání 5 % infusoriové hlinky, zfiltruje filtrem značky (•obchodní název pro křemeli- @ Daikalite nový filtrační prostředek vyráběný a prodávaný firmou Toa Kasei Co., Japonsko) a získá se 10· litrů filtrátu o antimikrobiální mohutnosti 326 j/ml (3,26 g-mohutnosti).
Filtrát se spojí s promývací vodou a roztok se nechá protéci sloupcem připraveným z 630· ml Amberlitu (§) IRC-50 · (H-forma), přičemž se žádaný produkt na sloupci na210673 adsorbuje. Sloupec se promyje vodou a produkt se eluuje &0 litry 0,5 N kyseliny chlorovodíkové. Eluát se zneutralizuje, nerozpustný podíl se odfiltruje a filtrát se nechá protéci sloupcem- připraveným z 50 ml aktivního· uhlí. Sloupec se promyje vodou a produkt se eluuje 750 ml směsi 0,02 N kyseliny chlorovodíkové s acetonem (1:1). Eluát se zneutrahzuje Do-wexem ® Dohodni název anexové pryskyřice složené z kopolymeru epichlorhydrínu s amoniakem, vyráběné a prodávané firmou Dow Chemical Co., USA), kapalina se zahustí a zahuštěný roztok se lyofilizuje. Získaný produkt se rozpustí v trojnásobku vody, roztok se přikape do 9 objemů methanolu a vyloučené nerozpustné podíly se odfiltrují. Methanolický roztok se nechá protéci sloupcem připraveným z 25 ml kysličníku hlinitého a produkt se eluuje 90·% methanolem·. Eluát se zneutralizuje, zahustí a pak lyofilizuje. Odparek se rozpustí v 10 ml vody, produkt se naadsorbuje na sloupci připraveném ze 100 ml G-25 a pak se etouje vodou;©) Sephadexu jímají se modře zbarvené frakce.
Modře zbarvené frakce se spojí, roztok se nechá protéci sloupcem připraveným ze 100 mililitrů CM-Ssphadexu (g) C-25 a produkt se eluuje vodným roztokem chloridu amonnho, jehož koncentrace stoupá od 0,05 do 1 M. Ke spojeným frakcím obsahujícím bleomycin NK 631 se přidá 1 g EDTA-Naz. pH roztoku se upraví 12 N kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu 0,5 a pak se roztok zneutralizuje 5· N roztokem hydroxidu sodného. Produkt se naadsorbuje na sloupci připraveném z 50 mi Diainonu © HP-40 (obchodní název pro· absorpční pryskyřici tvořenou styren· — divinylbenzenovým kopolymerem, vyráběnou a prodávanou firmou Mitsubishi Chemical Co·., Japonsko).
Sloupec se promyje 5% roztokem EDTA. .Naa (dvojnásobkem objemu sloupce), pak 5% vodným· roztokem síranu sodného (1,5 násobkem objemu slouce), vodou a produkt se eluuje· 50'% vodným acetonem (trojnásobkem objemu sloupce), Eluát se zahustí a zahuštěný roztok se zlyofilizuje. Získá se 100 mg konečného· produktu, monosulfátu bleomycinu NK 631 (formy prosté mědi) o mohutnosti 8,30· mg. Výtěžek tohoto produktu je 25,4 %„ počítáno' na obsah ve zfiltrované kultivační kapalině. Analýzou za použití metody s CM-Sephadexem ® byl nale zen obsah 98,7 % bleomycinu NK 631. Jeho · optická čistota · byla 98,5 %, stanoveno· metodou· uvedenou v popisu vynálezu.
Získaný produkt má následující spektrální a antimikrobiální charakteristiky:
Ultrafialové absorpční spektrum:
% maximum, při 290 nm, E = 106 v 0,1 cm
N kyselině chlorovodíkové
Antimikrobiální mohutnost: 8077 j/mg.
Příklad 2
Do· fermentačního· tanku o· · objemu 200 litrů se vnese 120· litrů živné půdy mající stejné složení jako· půda popsaná v příkladu 1, k roztoku se přidá 120 g N-[ (S)-T-fenylethyl]-l,3-diaminopropanu, pH se upraví na hodnotu 6,5 a směs se vysterilizuje. Poté se živné prostředí naočkuje, v množství 10 ·%, násadní kultivační kapalinou mikroorganismů druhu Streptomyces verticillus NK 68-14.4 (FERM-P číslo 4108, ATCC 31 307 J připravenou stejným postupem a za stejných podmínek jak bylo popsáno v příkladu· 1. Mikroorganismy se kultivují za provzdušňo·vání a za míchání rychlostí 350 otáček za minutu po dobu 7 dnů při 28 °C.
Po skončení kultivace se filtrát (107 litrů, antimikrobiální mohutnost 671 j/ml, 72 gmohutnosti) zpracuje stejným způsobem jako v příkladu 1. Po· -extrakci a uvedeném způsobu čištění se získá 4,7 g monosulfátu bleomycinu NK 631 (formy · prosté mědi) (38,9 g-mobutnostij. Výtěžek je 47 %, počítáno na obsah bleomycinu ve zfiltrované fermentační kapalině. Analýzou za použití metody s CM-Sephactexem © byl-o· nalezeno, že· získaný produkt obsahuje 99,6 % bleomycinu NK 631. Získaný bleomycin NK 631 má optickou čistotu 99,1 %, stanoveno· shora popsanou metodou.
Produkt má následující spektrální a antimikrobiální charakteristiky:
Ultrafialové absorpční maximum při 290 %
nm, E = 107, v ·0,1 N kyselině chloro1 cm vodíkové.
Antiinikrobiální mohutnost: 8027 j/mg.
Příklad 3
Syntéza N-[ (S j-r-fenylethyl]-l,3-diamlnopropanu
K 50 g (SJ-l-fenylethylaminu, ochlazeném na 0 °C, se· zamíchání přidá 33 g akrylonitrilu. Na baňku s reakční směsí se nasadí zpětný chladič opatřený chlorkalcio-vým uzávěrem a směs se za míchání zahřívá 18 hodin na 93 °C.
Po skončení reakce se přebytek akrylonitrilu oddestiluje za sníženého tlaku a zbývající surový produkt se podrobí frakcionované destilaci rovněž za sníženého tlaku;
jímá se frakce vroucí pří 142 až 145 °C při 0,933 kPa. Získá se 53,5 g 3-[ (S)-l’-fenylethy lamino ] propionitrilu.
Získaný nitril se vnese do hydrogenačního autoklávu, ipřidá se 5 g Raneyova niklu W-7 a 50 ml ethanolu obsahujícího 15 % amoniaku a směs se hydrogenuje, za míchání rychlostí 1000 otáček za minutu, při teplotě 50 až 58 °C, vodíkem pod parciálním tlakem 10 až 4 MPa po dobu 1,5 hodiny. Po skončení hydrogenace se kapalná reakční směs předestiluje za sníženého tlaku a jímá se frakce vroucí při 95 až 103 °C při 0,266 kPa. Získá se 48,3 g N-( (S)-l’-fenylethyl]-l,3-diaminopropanu (výtěžek 66 % teorie, počítáno na výchozí (Sj-l-fenylethylamin).
Příklad 4
Do živné půdy obsahující stejné složky jaké byly použity v příkladu 1 se přidá hydrochlorid N-[ (S)-l‘-fenylethyl]-l,3-diaminopropanu v množství 0,2 mg/ml půdy a pH půdy se upraví na 6,5. Dvacet litrů kultivace se vnese do kultivační nádoby o objemu 30 litrů a vysterilizuje se, načež se naočkuje v množství 10% násadní kultivační kapalinou Streptomyces verticillus NK 71-125 (který je mutačním kmenem získaným ze Streptomyces verticillus FERM-P číslo 4108, ATCC 31 307 ozářením ultrafialovými paprsky), připravenou za stejných podmínek jako v příkladu 1. Kultivace se provádí po· dobu 5 dnů při 37 °C za současného provzdušňování a míchání rychlostí 360 otáček za minutu. Po ukončení kultivace je antimikrobiální mohutnost NK 631 v kultivační půdě 376 j/ml.
Příklad 5
Do živné půdy obsahující stejné složky ja ké byly použity v příkladu 1 se přidá hydrochlorid N-[ (SJ-T-fenylethyl j-l,3-diaminopropanu v množství 2 mg/ml půdy a pH půdy se upraví na 6,5. Dvacet litrů kultivace se vnese do kultivační nádoby o obsahu 30 litrů a vysterilizuje se, načež se naočkuje v množství 10 % násadní kultivační kapalinou Streptomyces verticillus NK 71-054 (což je mutační kmen získaný z mikroorganismu Streptomyces verticullus FERM-P číslo 4108, ATTC 31 307 dvojnásobným ozářením ultrafialovými paprsky a jedním ozářením X-paprsky) připravenou ze stejných podmínek jako v příkladu 1. Kultivace se provádí za současného provzdušňování a míchání rychlostí 400 otáček za minutu při teplotě 23 °C. Po ukončení kultivace je antimikrobiální mohutnost NK 631 v kultivačním prostředí 571 j/mg.
Příklad 6
Do živné půdy obsahující stejné složky, jaké byly použity v příkladu 1, se přidá hydrochlorid N-[ (S)-l’-fenylethyl]-l,3-diaminopropanu v množství 0,5 mg/ml a pH půdy se upraví na hodnotu 6,5. Dvacet litrů kultivace se vnese do· kultivační nádoby o objemu litrů a vysterilizuje se, načež se naočkuje v množství 10% násadní kapalinou Streptomyces verticillus NK 71-058 (což je mutační kmen získaný z mikroorganismu Streptomyces verticillus FERM-P číslo 4108, ATCC
307 dvojnásobným ozářením ultrafialovými paprsky a dvojnásobným ozářením paprsky X) připravenou za stejných podmínek jako v příkladu 1. Kultivace se provádí 7 dnů při teplotě 30 °C a za současného míchání rychlostí 400 otáček za minutu. Po ukončení kultivace je antimikrobiální mohutnost NK 631 v kultivačním prostředí 820 j/ml.
Claims (3)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZU1. Způsob výroby 3-[ (S)-l’-fenylethyl]propylaminobleomycinu, vyznačující se tím, že se kmen mikroorganismu Streptomyces verticillus FERM-P číslo 4108 (ATCC 31 307) nebo mutační kmen, získaný z mikroorganismu Streptomyces verticullus FERM-P číslo 4108 (ATCC 31307) ozářením ultrafialovými paprsky a/nebo X paprsky naočkuje do živného prostředí a kultivuje v přítomnosti N-[ (S)-l’-fenylethylj-l,3-diaminopropanu vzorce IIÍS J nebo jeho soli při teplotě 23 až 37 °C po dobu 5 až 10 dní za selektivního vzniku 3- [: (S) -ť-fenylethylamino] propy laminobleomycinu, který se pak z kultivační kapaliny izoluje.
- 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se N-[ (S)-r-fenylethyl]-l,3-diaminopropan nebo jeho- sůl přidává do kultivační kapaliny v koncentraci 0,2 až 2 mg/ml prostředí.
- 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako soli N-[ (S)-T-fenylethyl]-l,3-diaminopropanu používá hydrochloridu, síranu nebo o-ctanu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9899777A JPS5441387A (en) | 1977-08-18 | 1977-08-18 | Preparation of 3-(s)-1'phenylethylamino-proplyamino-bleomycin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS210673B2 true CS210673B2 (en) | 1982-01-29 |
Family
ID=14234606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS784304A CS210673B2 (en) | 1977-08-18 | 1978-06-29 | Manufacturing process of 3-(ls)p-1 - phenylethylamino prropylaminobleomycine |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5441387A (cs) |
| CS (1) | CS210673B2 (cs) |
| DK (1) | DK148808C (cs) |
| ES (1) | ES471297A1 (cs) |
| HU (1) | HU179556B (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54124692U (cs) * | 1978-02-20 | 1979-08-31 | ||
| JPS62129961U (cs) * | 1986-02-13 | 1987-08-17 | ||
| JPS62129960U (cs) * | 1986-02-13 | 1987-08-17 | ||
| CN107434821A (zh) * | 2016-05-25 | 2017-12-05 | 国科戎安生物科技（北京）有限公司 | 一种111铟‑博来霉素衍生物的螯合物及应用 |
| CN107434822A (zh) * | 2016-05-25 | 2017-12-05 | 国科戎安生物科技（北京）有限公司 | 博来霉素衍生物及制备方法和应用 |
-
1977
- 1977-08-18 JP JP9899777A patent/JPS5441387A/ja active Granted
-
1978
- 1978-06-14 DK DK267478A patent/DK148808C/da not_active IP Right Cessation
- 1978-06-29 CS CS784304A patent/CS210673B2/cs unknown
- 1978-06-30 ES ES471297A patent/ES471297A1/es not_active Expired
- 1978-07-03 HU HU78NI217A patent/HU179556B/hu not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK267478A (da) | 1979-02-19 |
| JPS5441387A (en) | 1979-04-02 |
| DK148808B (da) | 1985-10-07 |
| JPS5739752B2 (cs) | 1982-08-23 |
| HU179556B (en) | 1982-11-29 |
| ES471297A1 (es) | 1979-01-16 |
| DK148808C (da) | 1986-04-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4827036A (en) | Pseudo-aminosugars, their production and use | |
| EP0182315A2 (en) | Novel antibiotic NK84-0218 pharmaceutical compositions containing it and process for the production of the same | |
| DK141761B (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotika aclacinomycin A og/eller B eller salte eller deoxyribonucleinsyrekomplekser deraf. | |
| US4007167A (en) | Antibiotic BM123 and production thereof | |
| JPS6310953B2 (cs) | ||
| US4187299A (en) | Fortimicin E | |
| CS210673B2 (en) | Manufacturing process of 3-(ls)p-1 - phenylethylamino prropylaminobleomycine | |
| US4992425A (en) | Antibiotics BU-3608D and BU-3608E | |
| PT96943B (pt) | Processo para a preparacao de analogos de rebecamicina e de composicoes farmac euticas que os contem | |
| US4018972A (en) | Antibacterial agents cis-BM123γ1 and cis-BM123γ2 | |
| US4595698A (en) | Physiologically active substance, arphamenine and production thereof | |
| KR840001258B1 (ko) | 신항생물질 mf 266 물질의 제조방법 | |
| CA2012013C (en) | Antitumor antibiotic bmy-41339 | |
| US5326754A (en) | Antitumor antibiotic BMY-41219 | |
| CA1113950A (en) | Isofortimicin | |
| US5096817A (en) | Process for producing antibiotics BU-3608 D and BU-3608 E | |
| US5086045A (en) | Antitumor antibiotic | |
| JPS61145145A (ja) | アントラサイクリン誘導体およびそれらの微生物学的製法 | |
| IE44567B1 (en) | Antibiotic bm123 and production thereof | |
| JPS59148795A (ja) | アントラサイクリン化合物、その製造法およびその用途 | |
| KR830002817B1 (ko) | 생물학적으로 활성인 fr-900156물질의 제조방법 | |
| JPH0149357B2 (cs) | ||
| CA1085391A (en) | Antibacterial agents | |
| JPH01216927A (ja) | 抗腫瘍剤 | |
| KR820001204B1 (ko) | 항생물질 c-15003 p-3의 제조법 |