CS210222B1 - Spósob výroby kyseliny digalakturónovej enzýmovou hydrolýzou - Google Patents

Abstract

Vynález sa týká spósobu přípravy kyseliny digalakturónovej enzýmovou hydrolýzou. Podstata vynálezu spočívá v tom, že se na kyselinorozpustnú polygalakturónovú kyselinu pósobí enzýmom endo-D-galakturonanázou pri teplote 30 až 40 °C a pH 4»2 až 5, pričom kyselina digalakturónová sa oddělí chromatograficky na koloně a efluent sa odpaří alebo vysuší mrazovou sublimáciou. Význam vynálezu spočívá v použití kyseliny digalakturónovej na testovanie róznych enzymatických preparátov používaných v konzervárskom, kožiarskom a textilnom priemysle.

Description

Vynález sa týká spĎeobu přípravy kyaeliny digalakturonovej enzýmovou hydrolýzou.

Kyaelina digalakturonová aa doteraz priemyeelne navyrába. Bola připravené v niekol'-kých laboratoriách ceatou chemickéj hydrolýzy (Hátanaka C., Ozawa J. J. Agr. Chem. Soc.JapanVol. 40 etr. 98 (1966); Rexová-Benková L., Chem. zvěsti 24 (1970), atr. 59; van Hon-denhoven F., Wittp. D., Visser J. Carbohyd, Res. 34, atr. 233 (1974)). Všetky popíaané po-stupy sú viacatupňové a značné sa odlišujú heterogenitou získaného produktu. Spoločným ry-aom týchto poatupov je, že vedú k malým výťažkom kyseliny digalakturonovej popři vysokomvýtažku vyěších oligogalakturo'nových kyselin. Získanie kyseliny digalakturonovej v čistomstave zo zmesi oligogalakturonových kyselin má mnohé nevýhody ako je pracnost, časová ná-ročnost a viacatupňové izolácie,

Tieto nedostatky odstraňuje spdsob výroby kyseliny digalakturonovej enzýmovou hydro-lýzou, ktorého podstata spočívá v tom, že sa na kyselinorozpustnú polygalakturonovú kyse-linu pĎsobí enzýmom endo-D-galakturonanázou pri teplote 30 až 40 °C a pH 4,2 až 5, pričomkyselina digalakturonová sa oddělí chromatograficky na kolo'ne a efluent sa odpaří alebo vy-suší mrazovou sublimáciou. Výhodou tohto postupu je, že endo-D-galakturonáza sa nemusí izolovat v čistom stave.

Na enzýmovú hydrolýzu sa mdže použit endo-D-galakturonanáza z komerčných preparátov pekto-lytických enzýmov (Pectinase, Rohament, Pectinex Ultra, Pekticín, Leozym a i.) bežne použí-vaných v konzervárenskom priemysle. Jedinou požiadavkou na použitý enzýmový preparát jenízký obsah exo-D-galakturonanázy. fialšou velkou přednostou uvedeného apčsobu je, že hyd-rolýza prebieha formou jednostupňovej reakcie a pře priebeh reakcie nie je potřebný eialšísubstrát alebo koenzým.

Kyselina digalakturonová je látka dfiležitá z hlediska teoretického štúdia enzýmova pektínových látok a pre charakterizáciu v priemysle používaných pektolytických enzýmov. Příklad 1

Pri príprave substrátu (kyselinorozpustnej polygalakturónovej kyseliny) pre hydrolý-zu sa postupovalo podlá upraveného postupu Mc Creadi Seegmiller: Archiv of Biochim. andBiophys. 50, 440, 1954. 50 g pektínu sa za stálého miešania přidává do 2 1 1N kyselinysirovej. Po rozpuštění sa suspenzia zahrieva pri 100 °0 60 minút. Suspenzia sa chladía v kyselině nerozpustný podiel sa oddělí filtráciou. Supernatant sa zráža 2 litrami etyl-alkoholu a nechá stát 24 hodin. Vyzrážaná kyselinorozpustná polygalakturonová kyselina saoddělí centrifugováním při 10 000 g. Supernatant sa zráža štyrmi litrami 96 % etylalkoho-lu a postup sa opakuje ako v prvom případe. Obidva podiely vyzrážanej kyselinorozpustnejpolygalakturónovej kyseliny sa spoja, dvakrát premyjú 70 % etylalkoholom a nakoniec 1 krátacetónom. Preparát sa volné vysuší pri laboratornej teplote alebo sa rozpustí v destilova-nej vodě a vysuší mrazovou sublimáciou. Příklad 2 500 mg kyselinorozpustnej polygalakturonovej kyseliny o priemernom polymerizačnomstupni 10, připravenéj podlá příkladu 1, sa postupné za miešania rozpustí v 70 ml octano-

Claims (1)

1. 2 vého tlmivého roztoku (pH = 5). 10 mg enzýmového preparátu (Pektinase) sa rozpustí v 30 mloctanového tlmivého roztoku. Po přefiltrovaní roztoku enzýmu sa obidva roztoky spoja. Enzýmová hydroláza prebieha pri 40 °C za miešania alebo trepania 4 až 6 hodin. Priebeh enzýmo-vej hydrolýzy sa kontroluje chromatograficky. Ak v reakčnom médiu sú přítomné len kyselinadigalakturónová a kyselina D-galaktopyranuronová reakcia sa ukončí 20 minútovým varom. Boztok po ochladení sa přefiltruje a supernatant sa vysuší mrazovou sublimáciou. Potom sa nakolonu naplněná molekulovým sitom (Sephadex G-10) dispergovaným vo vodě nanesie 180 mg lyofilizátu a efluent s kyselinou digalakturonovou sa odpaří, alebo vysuší mrazovou sublimá-ciou. Výťažok kyseliny digalakturonovej je až 90 %. Příklad 3 Postupovalo sa ako v příklade 2 s tým rozdielom, že sa enzýmový preparát (Pektofoedi-tín) rozpustil v acetonovom tlmivom roztoku o pH = 4,4 a enzýmová hydrolýza prebiehala priteplote 30 °C počas 3 až 5 hodin. Výťažok kyseliny digalakturonovej bol až 70 %. Příklad 4 * . Kvalitativně stanovenie kyseliny digalakturonovej sa uskutočnilo chromatografiou natenkých vrstvách silikagélu na platniach (Silufol) v systéme n-butanol-kyselina mravčia--voda (2:3:1) a detekciou anilínftalátom. Kyselina digalakturonová sa identifikovala nazáklade hodnoty log /Rf/ 1-Rf/, ktorá je lineárně závislá od stupňa polymerizácie oligoga-lakturonových kyselin. Ako referenčná vzorka sa použila kyselina D-galaktopyranuronová.Druhým kritériom čistoty bol poměr obsahu karboxylových skupin k obsahu redukujúcich sku-pin stanovených podl’a Bittera a spo. (Bitter T., Muir Η. M. Annal. Biochem. 41, 330, 1962) Význam vynálezu spočívá v použití kyseliny digalakturonovej na testovanie rdznych en-zymatických preparátov používaných v konzervárskom, kožiarskom a textilnom priemysle. PŘED MET VYNÁLEZU Spdsob výroby kyseliny digalakturonovej enzýmovou hydrolýzou vyznačujúci sa tým, žesa na kyselinorozpustnú polygalakturónovú kyselinu pdsobí enzýmom endo-D-galakturonanázoupri teplote 30 až 40 °C a pH 4,2 až 5, pričom kyselina digalakturonová sa oddělí chromato-graficky na koloně a efluent sa odpaří alebo vysuší mrazovou sublimáciou.