CS209481B2

CS209481B2 - Method of preparation of the fibres containing the antimatters,antigenes and antiserums

Info

Publication number: CS209481B2
Application number: CS755353A
Authority: CS
Inventors: Onofrio Lostia; Francesco Bartoli
Original assignee: Snam Progetti
Priority date: 1974-07-31
Filing date: 1975-07-31
Publication date: 1981-12-31
Also published as: DK347875A; LU73121A1; AU502914B2; NO147676C; JPS5144627A; BE831991A; SE7508702L; IT1008202B; DK145346C; YU196375A; NO752690L; AU8356675A; DD120665A5; US4031201A; CA1060342A; NL177839C; IL47845A; DE2534317B2; NL7509169A; DE2534317A1

Description

(54) Způsob přípravy vláken obsahujících antilátky, antigeny nebo antiséra

Vynález se týká způsobu přípravy vláken obsahujících antilátky, antigeny nebo antiséra, při kterém se používá zvlákňovací roztok a polymer, který nezpůsobuje inaktivaci uvedených látek.

Je známo, že výrazem „antilátka“ se rozumějí substance bílkovinné povahy, které se tvoří u obratlovců ve zvláštních buňkách (plazmatických buňkách) jako odezva na podávání antigenu a které s ním specificky reagují.

Výzkum reakcí mezi antigenem a antilátkou má značný teoretický význam z hlediska získání lepšího porozumění interakcím mezi molekulami a má však také praktickou důležitost v tom, že může vytvářet stále ve větší míře důvtipnější 'metody pro diagnózu nakažlivých chorob a identifikaci infikujících agens. Za tím účelem je jedna složka analyzována, přičemž druhá se zná. Co se týče antlgenů a -antilátek, existují zprávy o určitých metodách převedení do nerozpustné formy prostřednictvím chemických vazeb mezi zmíněnými produkty a polymerními materiály nerozpustnými ve vodném rozpouštědle.

Avšak tyto postupy mají nevýhodu neustálého styku s vnějším prostředím, možnosti disperze v reakční hmotě, a tedy případného' znečištění samotného' konečného produktu. Kromě toho by se mělo poznamenat, že přítomnost chemických vazeb může ovlivňovat chemickou podstatu samotné látky za případných důsledků narušujících její - aktivitu.

Na druhé straně -je také známo, že je možno připravit porézní vlákna, jež -mají v sobě zakotveny enzymy, které uchovávají, jsouce t akto i zmobilizovány, své katalytické vlastnosti, zatímco současně enzymu se zabraňuje uniknutí a dispergování .· do reakční hmoty, a tím i kontaminování reakčního¹ produktu. Vláknité struktury, které . se -mohou použít a. metoda zakotvení enzymu se popisují v popisu vynálezu k italskému patentu č. 836 46)2, podle něhož vlákna zakotvující enzym se mohou připravit vycházeje -z roztoků schopných tvořit vlákna, ve kterých se dispergují enzymatické přípravky ve formě velmi drobounkých kapiček řádově ve velikosti -emulzí. Takto získaná emulze se může zvlákňovat v podmínkách mokrého- nebo -suchého spřádání za vzniku vlákna, jež má uvnitř extrémně malé dutiny, ve kterých se -umístí enzymy -a kde jsou chráněny před okolní atmosférou velmi tenkou blankou, přičemž je zabráněno uvolnění enzymu ' a jeho- rozptýlení do reakční hmoty, přesto však je možné', -aby enzym působil -katalyticky.

Nyní -bylo· nalezeno, že je možné za použi209481 tí metod aplikovaných u .enzymů inkorporovat do porézních struktur antigeny, antilátky a antiséra, a to buď do· hotových nebo polymerovaných, a že takto získané přípravky nemají výše uváděné nevýhody, aniž je to na újmu jakémukoli poklesu aktivity vůči nativním bílkovinám.

Předmětem vynálezu je způsob přípravy vláken obsahujících antilátky, antigeny nebo antiséra, jehož podstata spočívá v tom, že se připraví antilátka, antigen nebo antisérum a¹ ověří se jejich nespecifická fixace a nepřítomnost nebo ' nepodstatná přítomnost inak- . tivace zvlákňovacím · roztokem, načež se uvedená antilátka, antigen nebo antisérum smísí s vodou nebo se směsí glycerolu a vody, vzniklá směs se přidá k roztoku polymeru, vybraného ze skupiny polymerů celulózy, esterifikované, éterifikované a nitrované celulózy, polyetylénu, polyamidů, polymerů nebo kopolymeru akrylonitrilu, butadienu nebo isoprenu, . akrylátů, methakrylátů, vinylesterů, vinylchloridu, vinylidenchtoridu, styrenu, viinylbutyrátu a gamma-methylglutamátu, směs se míchá do vytvoření homogenní emulze, která se zvlákňuje tryskou, ponořenou v koagulační lázni, za vzniku porézních vláken, obsahujících uvedenou antilátku, antigen nebo. antisérum, a koagulační roztok a rozpouštědlo· polymeru se odstraní z vlákna působením proudu vzduchu nebo jiného plynu.

Struktury připravené tímto způsobem vykazují vysokou aktivitu v .důsledku vysokého poměru specifického· povrchu k objemu, postup jejich výroby je velmi jednoduchý a nenákladný · k provedení a kromě toho umožňuje také zakotvení látek, které nemají vysoký stupeň · čistoty.

Vláknitá struktura · inkorporující antilátky, antigeny a .antiséra podle předloženého vynálezu nalézá aplikaci v .mnohých .oblastech, ve kterých se vždy využívá princip reciproční specifické reaktivity. Tak například pokud .se týká antisér a antilátek, lze takových vláken použít k odstranění antigenů, aptenů a látek . konjugovaných s proteiny nebo/a polypeptidy z vnějšího okolí, nebo v jiném případě je možné za použití zakotvených polymerovaných antigenů odstranit více či méně specifické. antilátky. Dále ještě lze použít vláknitých struktur k provádění extrakcí v průmyslovém měřítku, selektivním fixováním . a případným . oddělením fixované substance (antigenů, antilátek atd.), jakým je například extrakce enzymů jako amylázy, proteázy, invertázy a podobných. Je také možné použít takových vláken při chromatografických metodách a především zvláště při afinitní chromatografií, například k oddělení isoenzymových substancí typu cholinesterázy.

Rozdíl v .molekulové hmotnosti mezi proteiny zakotvenými v mikrodutinách zvnitřku vlákna a mezi látkami, které mají být na ně navázány, musí být dostatečný, aby byla možná difúze látky (látek), která (které) má (-mají) být navázána (navázány), do doby, kdy dosáhne (dosáhnou) substance mající . větší molekulovou hmotnost, která zůstává okludována v důsledku své vyšší molekulové hmotnosti.

Příklad 1

I. Příprava .antisér

Antiséra se získávala v morčatech, králících nebo. v . jiných živočiších.

Substance, pro-ti níž se chce získat antisérum (konjugovaný antigen nebo apten), se smíchá s kompletním Freundovým adjuvantem .a injikuje se do mediální části kyčle zadní nohy zvířete. Po 15 a. 30 dnech se injekce opakuje se stejnou dávkou imunizačního činidla . (antigen plus Freundovo adjuvans) a po. 15 dalších dnech se provádí další imunizace s poloviční dávkou. Potom. při 15den-ních intervalech se odebírají .vzorky intrakardiální krve a v získaném séru se určí titr antilátky. Toto. určení se provádí rozředěním antiséra veronalovým ústojným roztokem o 0,02 molární koncentraci při pH = 8,4, . obsahujícím 0,5 % humannního sérumalbuminu a 0,5 °/o normálního séra, do série.

Radioimunologickými pokusnými . metodami (RIA) se nalezne zředění . odpovídající poměru . —— = 1.

F

Také za použití RIA metod se stanoví afinita získaného antiséra.

II. Předběžné zkoušky

A. Nespecifické zkoušky fixace

B. Anťisérové inaktivační . zkoušky působením rozpouštědla použitého pro zvlákňování.

A. Nespecifická fixační zkouška

V trubicích z plastické hmoty .se . .odvážilo 50 mg vlákna získaného po procesu zvlákňování koagulace a odstranění rozpouštědla.

Vlákno neobsahuje . antisérum nebo jiná odstraněná činidla. avšak jen směs vody a glycerinu.

Připravily se tři řady malých trubic a to:

a) 50 mg vlákna plus 2,0 ml fosforečnanového· ústojného roztoku . [jako slepý pokus) ib) 50 mg vlákna .plus 1,5 ml fosforecinanového ústojného. roztoku plus 0,5 ml značeného antigenu (Ag—Ii25]

c) 50 mg vlákna plus 0,5 ml fosforečnanového ústojného roztoku plus 1,0 ml roztoku sérumalbuminu dobytčího skotu (BSA),

5. frakce při 2,5 % koncentrace ve fosforečnanovém ústojném roztoku plus 0,5 ml značeného antigenu (Ag—I12‘5).

Používal se 0,04 molární fosforečnanový ústojný roztok o· pH 7,4 a obsahujícího' 0,5 %

BSA.

Značený antigen byl inzulín-I¹²⁵ · o - -specifické aktivitě 100 mikro-C na mikrogram, který -se přidal v množství 0,1 - mikrc-C na 50 mg vlákna.

Také -se používal digoxin-I125 v ethanolovém roztoku o aktivitě 0,25 mikro-C na 0,5 mililitrů a tento roztok se přidával v množství -0,025 mikro-C na 50 mg vlákna.

Oba roztoky -se zředily na žádanou -koncentraci- fosforečnanovým - ústojným roztokem.

Část vláken před přidáním značeného- antigenu -se uvedla po - dobu jedné hodiny do styku -s roztokem obsahujícím 2,5 % BSA.

Doby -styku vláken -se značeným antigenem se pohybovaly v rozmezí -od 40 minut do 48 hodin.

Aktivity malých trubiček -obsahujících vlákna -se změřily gama-počítačem.

Po skončení doby -styku se vlákna- promyla pětkrát s 2 ml fosfátového· pufru, tj. celkem 10 ml, a zbytková radioaktivita se změřila gama-počítačem.

Poté se vlákna promyla znovu pětkrát vždy po 2 ml fosfátového pufru a změřila se radioaktivita.

Potom se vlákna rozmíchala -s 2 ml fosfátového pufru při 37 °C a po· 17 hodinách se znovu změřila zbytková -radioaktivita. Tento -stupeň byl opakován ještě -dvakrát. Bylo zjištěno, že:

a) Radioaktivita doprovázející vlákna postupně roste, je-li doba -styku - se značeným antigeněm v rozmezí od 40 minut do 48 , hob) Pre-inkubace po dobu jedné hodiny -s

2,5 % BSA způsobuje, že množství radioaktivity -ve vlákně -se snížilo.

c) Co se týče radioaktivity přidané k malým trubičkám -se zjistllo-, že v důsledku úainků prcmývání se se stoupajícím číslem nálevů radioaktivita snížila a podobně tomu bylo, když vzrůstala doba styku - vlákna -s promývacím pufrem; po pr omývání popsaném. - nahoře zůstalo malé procento -radioaktivity.

Závěrem se tedy zjistilo, že podobně jako velká většina materiálů i vlákno· -adsorbovalo nespecifickým způsobem malou část radioaktivity přítomné v přípravku značeného antigenu a že BSA způsobil -snížení této absorpce v -důsledku vysycení části -receptorových míst lokalizovaných ve vlákně.

B. Antisérové inaktivační zkoušky působením -rozpouštědel použitých pro zvlákňování

Použily -se dvě malé lahvičky -anti-inzulínového antiséra -dodávaného- komerčně v souboru pro radioimunopokusy (prasecí antisérový -anti-inzulín získaný - v - morčatech) a do -každé trubičky -se přidalo 5 -ml dvakrát destilované vody, takže -se získah^· 10 ml -roztoku antisérového anti-inzulínu, který se označil Abz. Pak -se připravilo- 20 ml -směsi vody -a glycerinu (40 : 60) (obj./obj.), - což -se označUo jako· G160.

Jako další -se připravily tyto -směsi:

a)

2,5 ml Ab2

2,5 ml destilovaná voda

5,0 ml Abt

b)

7,3 ml	Ab2
+ 7,3 ml	Glso
14,6 ml	AbiGh^o
C)
5 ml	AbiGlD
+ 32.1 ml	methylenchlorid

37,5 -ml se udržovalo- v dobrém, styku mícháním po dobu 15 minut při 0 °C; pak po· odstředění při teplotě místnosti se vodná fáze oddělila a -methylenchlorid -se z ní odstranil proudem dusíku. Získalo -se tak 5 -ml roztoku, označeného jako AbiGboM.

d) ml + 2 ml

AbiGh^o toluen ml obou fází se udr^žov^ah^· v dobrém styku míchání po dobu 30 -minut při - teplotě místnosti. Po -odstředění při teplotě místnosti se vodná fáze -odtáhla a toluen se z ní odstranil proudem- dusíku. Nakonec se získalo 5 ml roztoku - označeného jako AbiGUoT.

Pomocí běžných RIA-metod byly vyneseny kalibrační křivky v koncentračním rozmezí cd -0 do· 200 mikro U/ml standardního humánního inzulínu za - použití antiséra, - které se zpracov-ato čtyřmi rozličnými postupy uvedenými nahoře a označenými dříve jako

Abt

AbiGb) AbiGlsoM AbiGboT

Na připojených kalibračních křivkách (obr. 1) je vidět, že prakticky . neklesá vazebná kapacita -antllátky v důsledku působení -antiséra s rozpouštědly použitými -při zvlákňování.

III. Příprava vláken •τχ. 7’ л

200 mg triacetylcelulózy se rozpustí v 2,65 gramu methylenchloridu (reagenční -čistoty, Carlo Erba) při teplotě místností.

Produkt, který má být zakotven, -se rozpustí nebo· disperguje ve vodě či jejích -směsích s glycerinem.

K roztoku polymeru, který byl před tím ochlazen na 0 °C, se přidá 0,4 ml vodného prostředí. Míchá se tak dlouho, až vznikne homogenní emulze; ta se pak ponechá stát minut.

To se provádí ve skleněném válci, jehož horní část je spojena -s dusíkovou nádobou a jejíž spodní část končící zvlákňovací hubicí je· ponořena do koagulační lázně obsahující toluen.

Otevřením tlakové dusíkové láhve se emulze vytlačuje tryskou a při pasáži toluenovou lázní se sráží. Vzniklé vlákno se navíjí na váleček a působí se na. ně proudem vzduchu, aby se -odstranil jak toluen,. tak i methylenchlorid.

IV. Zakotvení anti-inzulínové antilátky

Metodami popsanými již dříve se připravilo v morčatech anti-inzulínové antisérum, jehož titr odpovídá- podle stanovení 150 000.

K 0,2 m.l tohoto antiséra se přidalo 0,15 ml 0,02 -molárního veronálového pufru při pH

8,4 obsahujícího 0,5 % humánního sérumalbuminu a 0,15 ml glycerinu (reagenaiční čistoty).

0,4 ml tohoto- roztoku se přidaly k polymeru podle podmínek přípravy -vláken, jak bylo dříve- uvedeno.

V témž zařízení -se spředlo kontrolní vlákno, u kterého se použilo -namísto 0,2 ml antisérového -roztoku - 0,2 -ml 0,02 molárního- veronalového pufru o pH 8,4 obsahujícího 0,5 % humánního sérumalbuminu. Do malých plastických trubiček -použitých - při rad'o'mυrionokusech se -dala různá množství vlákna, jak se uvádí v -tabulce 1, kde:

a) je· řada kontrolních vláken

b) je řada vláken, -obsahujících anti-sérum, získaných při zvlákňování

c) je- řada vláken -obsahujících anti-sérum, která po skončení -spřádacího procesu se ponechala v 0,02 molárním veronálovém pufru o -pH = 8,4, -obsahujícím 0,5 °/o humánního sérumalbuminu a která -byla pro myta pětkrát po 2 -ml veronálového· pufru před zahájením zkoušky.

Ke každé malé trubičce se přidalo:

1,6 ml -0,04 molárního· fosfátového pufru, pH = 7,4, obsahujícího sérumalbumin ze skotu.

0,2 -ml inzulínu-I¹²⁵ o specifické aktivitě 100 mikro-Ci/.mikrogram -s ředěním, které adjustovalo -aktivitu měřenou ke -dni přípravy na hodnotu 0,01 mikro-Ci/0,1 -ml.

0,2 ml humánního inzulínového -standardu. o koncentraci 200 -mikro-j/ml.

Po promíchání se malé trubičky daly do· termostatu -při teplotě 4 °C na dobu 24 hodin. Pak -se z každé trubičky odebralo 1,5 ml roztoku, jehož radioaktivita -se -stanovila ga- ma-počítačem (Packardův model 256) majícím účinnost 54 % pro- I¹²⁵.

Vlákna se promyla třikrát po 2 ml fosfátového pufru, načež se měřila gama-počítačem, jak bylo -dříve -řečeno, -radioaktivita fixovaná ve vláknech. Na vzorcích téhož vlákna - se opakovalo - přidání činidel (pufru, inzulínu I!25, standardního- inzulínu), promývání a stanovení radioaktivity a to čtyřnásobně.

Musí se uvést, že inzulín I¹²⁵, použitý jialko stopovací -sloučenina, nepřesahuje 5 % standardního humánního inzulínu použitého jako nosič. Získané výsledky se uvádějí v -tabulce 1 a lze- z nich zjistit, že, zatímco u kontrolních vláken -neobsahujících antilátky - fixace inzulínu, která -se nazve nespecifickou, dosahuje vrcholové -hodnoty v první zkoušce -a zůstává ve -skutečnosti konstantní v -dalších zkouškách, u vláken, v nichž je zakotvena antilátka, fixace inzulínu pokaždé stoupne, kdy se opakuje přidání -reagencií.

Poněvadž kontrolní vlákno· -se připravilo prakticky za -stejných podmínek jako vlákno se zakotvenou antilátkou, -rozdílné chování je nutno přičíst jedině na -vrub vzniku vazby -antigen-antllátka uvnitř vlákna mezi zakotveným -anti-inzulínem -a inzulínovým antigenem, který je v prostředí přítomen.

Tabulka. 1

4	VLÁKNO	Pbčet/10‘ íl°	Počet/10‘ . 2°	Počet/10‘ 3°	Počet/10‘ 4°	ZKOUŠKY Počet/10‘ 5°
Vzorek C.	Váha (mg)
Kontrol-	ai	7,0	6,822	5,059	2,703	2,579	2,718
ní řada	az	12,5	12,716	11,162	5,567	4,966	5,127
	a3	18,4	15,328	13,405	5,132	5,543	6,314
	U4	25,0	16,060	16,595	6,594	6,983	7,059
	a5	33,7	15,317	20,919	9,564	8,474	7,915
	06	41,8	22,412	22,695	11,668	11,960	10,396
Řada	bi	7,1	22,895	39,193	48,025	57,800	64,907
obsahující	b2	12,7	44,149 .	73,026	80,498	87,945	94,489
antisé-	bs	16,1	28,299	49,550	58,295	66,435	74,112
rum	b4	22,1	45,831	79,268	30,734	103,182	113,027
	bs	33,6	54,870	119,867	135,862	150,248	166,087
	b6	40,5	50,910	116,575	135,154	152,010	170,242
Řada	Cl	9,8	32,593	52,763	67,770	74,800	85,678
obsahující	C2	11,3	39,403	65,432	79,011	84,292	91,836
anti-	C3	12,3	43,554	66,607	83,098	97,018	107,592
sérum,	C4	12,1	. 42,794	68,325	82,292	94,203	105,739
promytá	05	40,1	50,883	104,108	121,027	132,263	148,442
před	Co	42,7	—	66,490	89,960	99,300	111,166
užitím	C7	32,4	—	53,654	70,901	82,805	93,805
Příklad 2				0,2	ml standardního HGH -o	koncentracích
				blíže určených v tabulce 2.
Postupem,	jaký byl	popsán	dříve, -se při	- Po	•promíchání	se malé trubičky daly do

pravilo v morčatech anti-HGH-antisérum, jehož -antilátkový titr odpovídal podle -měření hodnotě 2000. .

K 0,2 ml tohoto antiséra se přidalo 0,15 ml 0,02 molárního veroonalového pufru, pH 8,4, obsahujícího 0,5 % humánního sérumalbuminu a 0,15 ml glycerinu (reagenční čistoty, C. Erba).

Z-vlákňování se provádělo u kontrolního vlákna s týmž zařízením jako dříve, -avšak namísto 0,2 ml antisérového roztoku se použilo 0,2 ml 0,02 molárního veronalového pufru, pH — 8,4, obsahujícího- 0,5 % lidského -sérumalbuminu.

Do malých plastických trubiček téhož druhu, jaké se použily pří radioimunopokusech, se -dala různá množství vláken, jak je uvedeno v tabulce- 2, kde a·) je řada kontrolních vláken,

b) je řada vláken obsahujících antisérum a získaných zvlákňovacím procesem.

Ke dvěma řadám malých trubiček (8 -malých trubiček v každé řadě) se přidalo:

1,6 .ml 0,13 molá-r-ního boritanového pufru, pH = 8,4, obsahujícího 0,5 % BSA;

0,2 ml HGH-I125 o specifické aktivitě 150 mikro-Ci/mikrogram a se zředěním, které upravilo .aktivitu, měřenou v den přípravy, na 0,015 mikro-Ci/mil, termostatu při teplotě 4 °C in-a -24 hodin. Pak se z každé malé trubičky odebralo. 1,5 ml roztoku, jehož radioaktivita se stanovila gama-počítačem (Packard, model 256) - majícím účinnost 54 % pro I125.

Vlákna se -promyla -třikrát po 2 -ml borátového pufru, načež -se změřila radioaktivita- fixovaná na vláknech jako -dříve^; gama-počítačem. U týchž vláknitých vzorků se- opakovalo- přidání reagenc.ií (pufru, HGH-I^, standardního HGH), promývání a změření radioaktivity. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce- 2. Lze -pozorovat, -že -u vláken, která -obsahují anti-HGH-antilátku, je při všech koncentračních hladinách -přidaného HGH určité množství fixované radioaktivity, která je vyšší vzhledem k -odpovídajícím kontrolním vláknům, jež neobsahují uvnitř v -sobě antisérum, zpracovaly se však velmi podobným způsobem jako vlákna, která mají v sobě zakotveno antisérum.

Je třeba připomenout, že použité - anti-HGH-antisérum má titr 2000 a že proto specifický jev k odloučení je méně nápadný, než jak bylo patrno- ze zkoušky uvedené v -příkladu 1, při které se použilo anti-inzulínové antisérum. o titru 150 000.

Avšak -specifická fixace v -důsledku aintigen-antilátkové vazby ve vláknech, -která obsahují anti-HGH-antilátky, je nepopiratelná také -v předmětném případě.

ZKOUŠKY '-Po-četlO* Počet/10‘

Tabulka 2

VLÁKNO

Vzorek Váha

č. (mg)

Kontrolní	ai	10,1
řada	az	10,0
	as	10,2
	ia4	9,7
	as	10,1
	a6	9,6
	ia7	9,7
	ae	9,9
Řada	bi	9,6
obsahující	b2	10,4
antisérum	b3	10,2
	b4	10,5
	b5	10,0
	bs	10,2
	b7	9,8
	bs	9,8

Příklad 3

Podle postupů popsaných dříve st připravilo anti-trijodtyroninové antisérum voekováním trijodtyroninu (T) vázaného na lidský sérumalbumin do králíků. U získaného antiséra se stanovil antilátkový titr hodnotou 4000. K 0,2 ml séra se přidalo 0,15 ml 0,08 molárního veronálového pufru, pH = — 7,5, obsahujícího 0,5 g/litr humánního sérumalbuminu · a 0,15 ml glycerinu.

0,4 mil roztoku se· zakotvily na 200 mg triacetylcelu^l^ózy postupu přípravy vlákna již popsaného'.

Týmž postupem se připravilo kontrolní vlákno, v němž namísto antisérového· roztoku se zakotvUo do 200 mg triacetylceluilózy 0,4 ml roztoku získaného smícháním 0,35 ml 0,08 molárního veronálového pufru, pH = = 7,5, · obsahujícího 0,5 g/litr humánního · sérumaibuminu, a 0,15 ml glycerinu.

mg vlákna obsahujícího antilátku a 50 mg vlákna bez antilátky s-e daly do dvou malých trubiček z plastického materiálu a promyly pětkrát s 2 ml zmíněného veronálového pufru.

Pak se do· každé malé trubičky přidalo:

ml 0,08 moiánního veronálového pufru, pH = 7,5, obsahujícího 0,4 g/litr humánního sérumalbuminu a 4 mg/litr Тз.

0,2 ml T3—112⁵ o specifické aktivitě 90 mikro-Ci/mlkrogram zředěné na aktivitu 0,1 mikro-Ci/ml.

Po promíchání se malé trubičky daly na dobu 24 'hodin do · termostatu vyhřívaného na 4 · °C.

Potom se vlákna zbavila roztoku obsahujícího reagencie a promyla pětkrát 2 ml zmíněného· veronálového· pufru.

Potom, jak bylo· v předchozích řádcích uvedeno, se stejným' způsobem podruhé přiKoncentrace přidaného standardu HGH (mikrogramy/ /ml)

1,25	5,186	6,453
10	·. 5,772	5,959
10	5,739	7,529
—	4,060	4,523
20	5,093	6,,756
—	3,799	4,783
50	3,970	4,890
—	4,500	5,233
1,25	6,239	9,169
—	6,029	9,492
10	6,266	9,112
—	5,616	8,779
20	5,259	7,739
—	5,653	8,163
50	4,943	6,736
	5,366	7,899

daly reagencie a opakovalo se promývání.

Ke konci se změřila dříve uvedeným gama-počítačem radioaktivita přítomná na vláknech.

Na vláknu zbaveném ·antilátek bylo naměřeno 45 ·000 impulsů/10‘: na vlákně, které obsahovalo antilátku · bylo naměřeno 146000 impulsů/10‘.

Příklad 4

Podle postupů již popsaných s-e připravil anti-lehký řetězec lambda a antilátka K o koncentraci 25 miligramů/mililitr ve fyziologickém · roztoku pufrovaném na -pH = 7,3 fosforečnanem sodným o koncentraci 0,01 mol.

K 0,35 mil tohoto roztoku se · přidalo 0,15 mililitrů glycerinu. “

0,4 ml posléze uvedeného roztoku se zakotvilo -v 200 mg triacetátu celulózy podle postupu popsaného· 'dříve. Za použití téhož zvlákňovacího postupu se zakotvilo· v kontrolním vlákně 0,4 · ml již popsaného pufru.

100 mg vlákna obsahujícího antilátku a 100 mg kontrolního vlákna se daly do dvou malých plastických trubiček. Vlákna se promyla pětkrát 2- ml 0,01 molárního fosfátového pufru o pH 7,3.

Potom se· do malých trubiček přidalo 1 ml 0,01 molárního fosfátového pufru, pH = 7,3, obsahujícího 0,9 % chloridu sodného a 0,5 mg/ml lambda- a· K-lehkých řetězců.

Malé trubičky se udržovaly po dvě hodiny při 22 · °C · a · dalších 22 hodin · při 4 °C.

Po inkubaci se z malých trubiček roztoky vylily ia vlákna se promývala pětkrát 1 ml

0,01 tnolláDnflho fosfátového pufru, pH = 7,3, obsahujícího 0,9 % chloridu sodného.

Promývací kapalina se spojila s roztoky vylitými po inkubaci z trubiček a u takto získaného roztoku se stanovila bílkovinná koncentrace Lowry-ho metodou.

V roztocích, které byly ve styku s kon13 trolním vláknem, bylo zjištěno 0,447 mg bílkovin. V roztocích, které byly ve styku s vláknem obsahujícím antílátku, bylo zjištěno 0,385 mg bílkovin.

Claims

PŘEDMĚT VYNALEZU

Způsob přípravy vláken obsahujících a.ntilátky, antigeny nebo antiséra, při kterém se používá zvlákňovací roztok a polymer, který nezpůsobuje inaktivaci uvedených látek, vyznačující se tím, že se připraví antřlátkia, antigen nebo antisérum a ověří se jejich nespecifická fixace a nepřítomnost nebo nepodstatná přítomnost inaktivace zvlákňovacím roztokem, načež se uvedená antilátka, antigen nebo antisérum smísí s vodou nebo se směsí glycerolu a vody, vzniklá směs se přidá к roztoku polymeru, vybraného ze skupiny polymerů celulózy, esterifikované, éte rifikované a nitrované celulózy, polyetylénu, polyamidů, polymerů nebo kopolymerů akrylonitrilu, butadienu nebo isoprenu, akrylátů, methiakrylátu, vinylesterů, vrnylchloridu, vinylidenchloridu, styrenu, vinylbutyrátu a gamma-methylglutamátu, směs se míchá do vytvoření homogenní emulze, která se zvlákňuje tryskou, ponořenou v koagulační lázni, za vzniku porézních vláken, obsahujících uvedenou antílátku, antigen nebo antisérium, a kcagulačiní roztok a rozpouštědlo polymeru se odstraní z vlákna působením proudu vzduchu nebo· jiného· plynu.