CS209255B1 - Způsob výroby D-fruktosy - Google Patents

Description

(54) Způsob výroby D-fruktosy

Vynález se týká způsobu výroby D-fruktosy, cukru, jehož význam v novější době značně stoupá. V čisté formě se používá v lékařství při léčbě : různých chorobných stavů.

Ačkoliv je D-fruktosa velmi rozšířena v přírodě, i je její průmyslová výroba značně obtížná. Tento í cukr krystaluje totiž dobře pouze z roztoků nebo sirupů prostých organických i anorganických nečistot. Většina metod využívá při isolaci tvorby málo rozpustného fruktosátu (levulátu) vápenatého, v němž je jeden mol fruktosy vázán na jeden mol kysličníku vápenatého. Je možno ji získat též kyselou hydrolýzou inulinu, zásobního polysacha- ridu čekanky, topinambur, jiřin, pampelišek apod., i sestávajícího převážně z fruktosy (vedle asi 5 % | glukosy). Nejpřístupnější zdroj fruktosy pro výrobu ve velkém je invertní cukr. Od glukosy se fruktosa odděluje srážením ve formě fruktosátu vápenatého. Tato metoda je však pracná, izolovaná fruktosa je v důsledku působení alkalického ; prostředí znečištěna produkty isomerizace a musí. být čištěna rekrystalizací. Nejvýhodnější surovinou pro přípravu krystalické fruktosy je matečný louh po izolaci glukosy z invertního cukru krystalizací, tzv. fruktosový sirup, který obsahuje v sušině kolem 42 % glukosy a 58 % fruktosy a který byl použit k výrobě D-fmktosy způsobem podle tohoto vynálezu.

Podstata způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že se ve fruktosovém sirupu, zředěném vodou na obsah sušiny 10 až 25 %, obsažená D-glukosa oxiduje za aerobních podmínek působením glukosooxidázy na kyselinu D-gJukonovou, která se od přítomné D-fruktosy oddělí ve formě soli s kovem alkalických zemin, s výhodou soli vápenaté, a ze zbývajícího roztoku se po deionizaci izoluje krystalizací D-fruktosa.

Oxidace D-glukosy na kyselinu D-glukonovou se provádí účelně glukosooxidázou, obsaženou v enzymovém systému mikroorganismů, zejména plísní nebo bakterií, např. ze skupiny černých aspergilů nebo octových bakterií, popř. za přítomnosti inhibitoru enzymů, blokujícího disimilaci přítomné D-fruktosy, s výhodou azidu sodného, v koncentraci řádové 10^-4M.

Oxidaci D-glukosy v kyselinu D-glukonovou při plném zachování přítbmné D-fruktosy je možno realizovat též specificky působící izolovanou glukosooxidázou, např. obchodním glukosooxidázo- j vým preparátem. Postup podle vynálezu, využívá- i jící glukosooxidázy přítomné v enzymovém systému buněk vhodného mikroorganismu, aktivně oxidující glukosu v glukonovou kyselinu bez disimilace fruktosy ve větším rozsahu, se ukázal být výhodnější. Ze skupiny plísní je vhodný např. Aspergillus niger. Jako produkt oxidace se izoluje kyselina glukonová, nejlépe ve formě vápenaté i soli, která má po rekrystalizaci lékopisnou kvalitu. Narostlé mycelium plísně je možno použít pro .( oxidací v další násadě. Při použití octových bakte- f rií, např. Acetobacter acetosum, může být primář- j ně vzniklá kyselina glukonová dále dehydrogeno- ‘ vána v kyselinu 2-keto-, popř. i v 2,5-diketoglukonovou.

Mikrobiální oxidace se provádí v živném prostředí, které může obsahovat až 25 % sušiny fruktosového sirupu, za aseptických podmínek, za míchání a vzdušnění. Vznikající kyselina glukonová se neutralizuje přísadou nejméně ekvivalentního množství nerozpustného kovu alkalických zemin do živného prostředí, výhodně uhličitanu vápenatého, popř. postupným přidáváním roztoku rozpustného uhličitanu nebo hydroxidu v takovém množství, aby pH prostředí bylo trvale udržováno j ve slabě kyselé oblasti.___________________ ____________

Aby byla snížena disimilace fruktosy v živném prostředí, k níž dochází zejména po dokončení oxidace glukosy, je účelné přidávat vhodný inhibitor enzymů, který blokuje disimilaci při použité koncentraci fruktosy, avšak neovlivňuje oxidaci glukosy. Vzhledem k tomu, že oxidace glukosy v kyselinu glukonovou probíhá bez fosforylace, zatímco disimilace fruktosy zpravidla probíhá přes fosforylované meziprodukty, jsou k tomuto účelu ί vhodné inhibitory blokující fosfoiylaci, jako např. j již zmíněný azid sodný.

Některé možnosti realizace způsobu podle vynálezu jsou uvedeny v následujících příkladech provedení.

Příklad 1. -------—----------------254 g fruktosového sirupu, obsahujícího 117 g D-fruktosy a 83 g D-glukosy, se smíchá s 1 g kukuřičného extraktu a 8 mg azidu sodného a do- ! plní vodou na 1 litr. Po sterilizaci se asepticky přidá í 30 g sterilního uhličitanu vápenatého. Půda se I zaočkuje sporami plísně Aspergillus niger, splách- l nutými s kultury inkubované 4 dny na šikmém I j sladinovém agaru při 30 °Č a inkubuje se ve varné baňce obsahu 6 litů na reciproké třepačce při 30 °C. Po 3 dnech poklesne celkový obsah redukujících cukrů, počítáno jako fruktosa, na 116 g a chromatografickou analýzou lze v katexovaném ; vzorku roztoku zjistit fruktosu a kyselinu glukono; vou. Roztok se zfiltruje a odpaří při nízké teplotě l na řídký sirup. Přísadou malého množství metha1 nolu vykrystaluje glukonan vápenatý, jehož výtěžek po izolaci a vysušení je 101 g. Filtrát se po odpaření methanolU ve vakuu a po zředění vodou deionizuje na katexu a pak na anexu až do dosažení pH 3,5, odbarví a odpaří na hustý sirup. Po rozmíchání s ethanolem a krystalizaci v chladnici se izoluje 75 g fruktosy vyhovující kvality. Z matečného louhu lze obdobným způsobem získat ještě 22 g fruktosy. Druhý matečný louh váží po zahuštění 32 g, obsahuje chromatografícky čistou fruktosu, ale již nekrystaluje.

I Příklad 2.

Mikroorganismus Acetobacter acetosum CCM

2363 se nejprve dvakrát pasážuje v dvoudenních intervalech na šikmých agarech složení: 5 % glukosy, 12,5 % 20%ního kvasničného autolyzátu, % uhličitanu vápenatého a 2,5 % agaru a této kultury se použije k zaočkování 100 ml půdy, obsahující 5 % glukosy, 0,5 % kukuřičného ex¹ traktu a 1,4 % uhličitanu vápenatého, sterilizovaί ného zvlášť. Po dvoudenní inkubaci na reciproké i třepačce při 30 °C se získanou kulturou zaočkuje (jeden litr půdy obsahující 202 g fruktosového ! sirupu, 7,5 g kukuřičného extraktu a 16,5 g uhličitanu vápenatého, sterilizovaného zvlášť. Po dvoudenní inkubaci na třepačce při 30 °C nebyla již v roztoku přítomna glukosa.'Vyfermentovaná půda, obsahující fruktosu, glukonan vápenatý a malé množství 2-ketoglukonanu vápenatého, se zpracuje stejně jako v příkladu 1. Izoluje se celkem 86 g vápenatých solí a ve dvou frakcích celkem 59 g fruktosy. Druhý matečný louh váží po zahuštění 35 g, obsahuje fruktosu a již nekrystaluje.

Claims (3)

1. PŘEDMĚT

   VYNÁLEZU

   1. Způsob výroby D-fruktosy z tzv. fruktosové-! ho sirupu, obsahujícího v sušině kolem 58 % i fruktosy a 42 % glukosy, odpadajícího po izolaci i krystalické D-glukosy z invertního cukru, vyznačující se tím, že se ve fruktosovém sirupu, zředěném vodou na obsah sušiny 10-25 %, obsažená D-glukosa oxiduje za aerobních podmínek působením glukosooxidázy na kyselinu D-glukonovou, která se od přítomné D-fruktosy oddělí ve formě soli s kovem alkalických zemin, s výhodou soli vápenaté, a ze zbývajícího roztoku se po deionizaá izoluje krystalizaci. D-fruktosa. . _________
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se oxidace D-glukosy na kyselinu D-glukonovoii provádí glukosooxidázou, obsaženou v enzymovém systému mikroorganismů, zejména plísní nebo, bakterií, například ze skupiny černých aspergilů nebo octových bakterií.
3. 3. Způsob podle bodu 1 a 2, vyznačující se tím, že se oxidace provádí za přítomnosti inhibitoru enzymů, blokujícího disimilaci přítomné D-fruktosy, s výhodou azidu sodného, v koncentraci řádově 10^-4M. ----------- ·