CS209255B1

CS209255B1 - Manufacturing process of d-fructose

Info

Publication number: CS209255B1
Application number: CS639568A
Authority: CS
Inventors: Milos Kulhanek; Milan Tadra
Original assignee: Milos Kulhanek; Milan Tadra
Priority date: 1968-09-12
Filing date: 1968-09-12
Publication date: 1981-11-30

Description

(54) Způsob výroby D-fruktosy(54) Method for producing D-fructose

Vynález se týká způsobu výroby D-fruktosy, cukru, jehož význam v novější době značně stoupá. V čisté formě se používá v lékařství při léčbě : různých chorobných stavů.The present invention relates to a process for the production of D-fructose, a sugar which is of increasing importance in recent times. In pure form it is used in medicine in the treatment of: various disease states.

Ačkoliv je D-fruktosa velmi rozšířena v přírodě, i je její průmyslová výroba značně obtížná. Tento í cukr krystaluje totiž dobře pouze z roztoků nebo sirupů prostých organických i anorganických nečistot. Většina metod využívá při isolaci tvorby málo rozpustného fruktosátu (levulátu) vápenatého, v němž je jeden mol fruktosy vázán na jeden mol kysličníku vápenatého. Je možno ji získat též kyselou hydrolýzou inulinu, zásobního polysacha- ridu čekanky, topinambur, jiřin, pampelišek apod., i sestávajícího převážně z fruktosy (vedle asi 5 % | glukosy). Nejpřístupnější zdroj fruktosy pro výrobu ve velkém je invertní cukr. Od glukosy se fruktosa odděluje srážením ve formě fruktosátu vápenatého. Tato metoda je však pracná, izolovaná fruktosa je v důsledku působení alkalického ; prostředí znečištěna produkty isomerizace a musí. být čištěna rekrystalizací. Nejvýhodnější surovinou pro přípravu krystalické fruktosy je matečný louh po izolaci glukosy z invertního cukru krystalizací, tzv. fruktosový sirup, který obsahuje v sušině kolem 42 % glukosy a 58 % fruktosy a který byl použit k výrobě D-fmktosy způsobem podle tohoto vynálezu.Although D-fructose is very widespread in nature, its industrial production is also quite difficult. This sugar is only crystallized well from solutions or syrups free of organic and inorganic impurities. Most methods utilize the formation of sparingly soluble calcium fructosate (levulate) in which one mole of fructose is bound to one mole of calcium oxide. It can also be obtained by acid hydrolysis of inulin, chicory storage polysaccharide, Jerusalem artichoke, dahlias, dandelions, etc., consisting mainly of fructose (in addition to about 5% | glucose). The most accessible source of fructose for bulk production is invert sugar. Fructose is separated from glucose by precipitation in the form of calcium fructosate. However, this method is laborious, isolated fructose is due to alkaline action; environment is contaminated by products of isomerization and must. be purified by recrystallization. The most preferred raw material for the preparation of crystalline fructose is the mother liquor after the isolation of glucose from invert sugar by crystallization, the so-called fructose syrup, which contains about 42% glucose and 58% fructose in the dry state.

Podstata způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že se ve fruktosovém sirupu, zředěném vodou na obsah sušiny 10 až 25 %, obsažená D-glukosa oxiduje za aerobních podmínek působením glukosooxidázy na kyselinu D-gJukonovou, která se od přítomné D-fruktosy oddělí ve formě soli s kovem alkalických zemin, s výhodou soli vápenaté, a ze zbývajícího roztoku se po deionizaci izoluje krystalizací D-fruktosa.The process according to the invention is characterized in that the D-glucose is contained in the fructose syrup, diluted with water to a dry matter content of 10 to 25%, under aerobic conditions by the action of glucose oxidase to D-gluconic acid which is separated from the D-fructose present. an alkaline earth metal salt, preferably a calcium salt, and is isolated from the remaining solution after deionization by crystallization of D-fructose.

Oxidace D-glukosy na kyselinu D-glukonovou se provádí účelně glukosooxidázou, obsaženou v enzymovém systému mikroorganismů, zejména plísní nebo bakterií, např. ze skupiny černých aspergilů nebo octových bakterií, popř. za přítomnosti inhibitoru enzymů, blokujícího disimilaci přítomné D-fruktosy, s výhodou azidu sodného, v koncentraci řádové 10^-4M.The oxidation of D-glucose to D-gluconic acid is expediently carried out by the glucose oxidase contained in the enzyme system of microorganisms, in particular of fungi or bacteria, for example from the group of black aspergils or acetic bacteria, resp. in the presence of an enzyme inhibitor blocking the disimilation of the present D-fructose, preferably sodium azide, at a concentration of the order of 10 ^-4 M.

Oxidaci D-glukosy v kyselinu D-glukonovou při plném zachování přítbmné D-fruktosy je možno realizovat též specificky působící izolovanou glukosooxidázou, např. obchodním glukosooxidázo- j vým preparátem. Postup podle vynálezu, využívá- i jící glukosooxidázy přítomné v enzymovém systému buněk vhodného mikroorganismu, aktivně oxidující glukosu v glukonovou kyselinu bez disimilace fruktosy ve větším rozsahu, se ukázal být výhodnější. Ze skupiny plísní je vhodný např. Aspergillus niger. Jako produkt oxidace se izoluje kyselina glukonová, nejlépe ve formě vápenaté i soli, která má po rekrystalizaci lékopisnou kvalitu. Narostlé mycelium plísně je možno použít pro .( oxidací v další násadě. Při použití octových bakte- f rií, např. Acetobacter acetosum, může být primář- j ně vzniklá kyselina glukonová dále dehydrogeno- ‘ vána v kyselinu 2-keto-, popř. i v 2,5-diketoglukonovou.The oxidation of D-glucose to D-gluconic acid while fully retaining the present D-fructose can also be effected by specifically acting isolated glucose oxidase, for example a commercial glucose oxidase preparation. The process of the present invention, utilizing glucose oxidases present in the enzyme system of cells of a suitable microorganism actively oxidizing glucose to gluconic acid without fructose disimilation to a greater extent, has proved to be more advantageous. Aspergillus niger is suitable from the group of fungi. Gluconic acid is isolated as the oxidation product, preferably in the form of both calcium and salt, which has a pharmacopoeial quality after recrystallization. The grown fungal mycelium can be used for oxidation in another batch. By using acetic bacteria, e.g. Acetobacter acetosum, the primarily formed gluconic acid can be further dehydrogenated to 2-keto or 2-keto acid. i in 2,5-diketoglucon.

Mikrobiální oxidace se provádí v živném prostředí, které může obsahovat až 25 % sušiny fruktosového sirupu, za aseptických podmínek, za míchání a vzdušnění. Vznikající kyselina glukonová se neutralizuje přísadou nejméně ekvivalentního množství nerozpustného kovu alkalických zemin do živného prostředí, výhodně uhličitanu vápenatého, popř. postupným přidáváním roztoku rozpustného uhličitanu nebo hydroxidu v takovém množství, aby pH prostředí bylo trvale udržováno j ve slabě kyselé oblasti.___________________ ____________The microbial oxidation is carried out in a nutrient medium, which may contain up to 25% of the fructose syrup dry matter, under aseptic conditions, with stirring and aeration. The resulting gluconic acid is neutralized by adding at least an equivalent amount of insoluble alkaline earth metal to the nutrient medium, preferably calcium carbonate or calcium carbonate. by gradually adding a solution of soluble carbonate or hydroxide in such an amount that the pH of the medium is permanently maintained in the weakly acidic region .___________________ ____________

Aby byla snížena disimilace fruktosy v živném prostředí, k níž dochází zejména po dokončení oxidace glukosy, je účelné přidávat vhodný inhibitor enzymů, který blokuje disimilaci při použité koncentraci fruktosy, avšak neovlivňuje oxidaci glukosy. Vzhledem k tomu, že oxidace glukosy v kyselinu glukonovou probíhá bez fosforylace, zatímco disimilace fruktosy zpravidla probíhá přes fosforylované meziprodukty, jsou k tomuto účelu ί vhodné inhibitory blokující fosfoiylaci, jako např. j již zmíněný azid sodný.In order to reduce the disimilate of fructose in the nutrient medium, which occurs especially after glucose oxidation has been completed, it is expedient to add a suitable enzyme inhibitor that blocks disimillation at the fructose concentration used but does not affect glucose oxidation. Since the oxidation of glucose to gluconic acid proceeds without phosphorylation, while fructose disimillation generally proceeds through phosphorylated intermediates, phosphoilating blocking inhibitors, such as the sodium azide mentioned above, are suitable for this purpose.

Některé možnosti realizace způsobu podle vynálezu jsou uvedeny v následujících příkladech provedení.Some embodiments of the method according to the invention are set forth in the following examples.

Příklad 1. -------—----------------254 g fruktosového sirupu, obsahujícího 117 g D-fruktosy a 83 g D-glukosy, se smíchá s 1 g kukuřičného extraktu a 8 mg azidu sodného a do- ! plní vodou na 1 litr. Po sterilizaci se asepticky přidá í 30 g sterilního uhličitanu vápenatého. Půda se I zaočkuje sporami plísně Aspergillus niger, splách- l nutými s kultury inkubované 4 dny na šikmém I j sladinovém agaru při 30 °Č a inkubuje se ve varné baňce obsahu 6 litů na reciproké třepačce při 30 °C. Po 3 dnech poklesne celkový obsah redukujících cukrů, počítáno jako fruktosa, na 116 g a chromatografickou analýzou lze v katexovaném ; vzorku roztoku zjistit fruktosu a kyselinu glukono; vou. Roztok se zfiltruje a odpaří při nízké teplotě l na řídký sirup. Přísadou malého množství metha1 nolu vykrystaluje glukonan vápenatý, jehož výtěžek po izolaci a vysušení je 101 g. Filtrát se po odpaření methanolU ve vakuu a po zředění vodou deionizuje na katexu a pak na anexu až do dosažení pH 3,5, odbarví a odpaří na hustý sirup. Po rozmíchání s ethanolem a krystalizaci v chladnici se izoluje 75 g fruktosy vyhovující kvality. Z matečného louhu lze obdobným způsobem získat ještě 22 g fruktosy. Druhý matečný louh váží po zahuštění 32 g, obsahuje chromatografícky čistou fruktosu, ale již nekrystaluje.Example 1. ------- 254 g of fructose syrup containing 117 g of D-fructose and 83 g of D-glucose are mixed with 1 g corn extract and 8 mg sodium azide and do-! filled with water to 1 liter. After sterilization, 30 g of sterile calcium carbonate are added aseptically. The soil is inoculated with spores of Aspergillus niger, rinsed with cultures incubated for 4 days on slant wort agar at 30 ° C and incubated in a 6-liter flask on a reciprocating shaker at 30 ° C. After 3 days the total content of reducing sugars, calculated as fructose, drops to 116 g and can be cation-exchanged by chromatographic analysis; a sample of the solution to detect fructose and gluconic acid; vou. The solution is filtered and evaporated at low temperature 1 to a thin syrup. By adding a small amount of methanol, calcium gluconate crystallizes, yielding after isolation and drying is 101 g. The filtrate is deionized on the cation exchange resin and then on the anion exchange resin to pH 3.5 after evaporation of the methanol under vacuum and then dilution with water until the pH is 3.5. syrup. After stirring with ethanol and crystallization in a refrigerator, 75 g of satisfactory quality fructose is isolated. 22 g of fructose can be similarly obtained from the mother liquor. The second mother liquor weighs 32 g after concentration, containing pure fructose by chromatography, but no longer crystallizes.

I Příklad 2.I Example 2.

Mikroorganismus Acetobacter acetosum CCMAcetobacter acetosum CCM

2363 se nejprve dvakrát pasážuje v dvoudenních intervalech na šikmých agarech složení: 5 % glukosy, 12,5 % 20%ního kvasničného autolyzátu, % uhličitanu vápenatého a 2,5 % agaru a této kultury se použije k zaočkování 100 ml půdy, obsahující 5 % glukosy, 0,5 % kukuřičného ex¹ traktu a 1,4 % uhličitanu vápenatého, sterilizovaί ného zvlášť. Po dvoudenní inkubaci na reciproké i třepačce při 30 °C se získanou kulturou zaočkuje (jeden litr půdy obsahující 202 g fruktosového ! sirupu, 7,5 g kukuřičného extraktu a 16,5 g uhličitanu vápenatého, sterilizovaného zvlášť. Po dvoudenní inkubaci na třepačce při 30 °C nebyla již v roztoku přítomna glukosa.'Vyfermentovaná půda, obsahující fruktosu, glukonan vápenatý a malé množství 2-ketoglukonanu vápenatého, se zpracuje stejně jako v příkladu 1. Izoluje se celkem 86 g vápenatých solí a ve dvou frakcích celkem 59 g fruktosy. Druhý matečný louh váží po zahuštění 35 g, obsahuje fruktosu a již nekrystaluje.2363 was first passaged twice at two-day intervals on sloping agar compositions: 5% glucose, 12.5% 20% yeast autolysate,% calcium carbonate, and 2.5% agar, and this culture was used to inoculate 100 ml of soil containing 5% glucose, 0.5% maize ex ¹ tract and 1.4% calcium carbonate, sterilized separately. After two days of incubation on reciprocal and shaker at 30 ° C, the culture is inoculated (one liter of soil containing 202 g of fructose syrup, 7.5 g of corn extract and 16.5 g of calcium carbonate, sterilized separately. The fermented broth containing fructose, calcium gluconate and a small amount of calcium 2-ketogluconate was treated as in Example 1. A total of 86 g of calcium salts and a total of 59 g of fructose were isolated in two fractions. The second mother liquor weighs 35 g after concentration, contains fructose and no longer crystallizes.

Claims

SUBJECT

OF THE INVENTION

1. A process for producing D-fructose from a so-called fructose! syrup, containing in the dry state about 58% fructose and 42% glucose, after isolation of crystalline D-glucose from invert sugar, characterized in that the fructose syrup, diluted with water to a dry matter content of 10-25%, contains D Glucose is oxidized under aerobic conditions by the action of glucose oxidase to D-gluconic acid, which is separated from the present D-fructose in the form of an alkaline earth metal salt, preferably calcium salt, and crystallized from the remaining solution after deionization. D-fructose. . _________

2. The method according to claim 1, wherein the oxidation of D-glucose to D-gluconic acid is carried out by a glucose oxidase contained in the enzyme system of microorganisms, in particular fungi or bacteria, for example from the group of black aspergils or acetic bacteria.

3. The process according to claim 1, wherein the oxidation is carried out in the presence of an enzyme inhibitor blocking the disimilization of the present D-fructose, preferably sodium azide, in a concentration of the order of 10 ^-4 M. --- ·