CS206546B1 - Způsob čištěni peptidů kapalinovou chromatografii - Google Patents
Způsob čištěni peptidů kapalinovou chromatografii Download PDFInfo
- Publication number
- CS206546B1 CS206546B1 CS70980A CS70980A CS206546B1 CS 206546 B1 CS206546 B1 CS 206546B1 CS 70980 A CS70980 A CS 70980A CS 70980 A CS70980 A CS 70980A CS 206546 B1 CS206546 B1 CS 206546B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- peptides
- liquid chromatography
- weight
- water
- alcohol
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 title claims description 7
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 title description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 25
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 7
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 4
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 2
- 229910000318 alkali metal phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N Vasopressin Natural products N1C(=O)C(CC=2C=C(O)C=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 2
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 2
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101000904173 Homo sapiens Progonadoliberin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102400000050 Oxytocin Human genes 0.000 description 1
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024028 Progonadoliberin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101000996723 Sus scrofa Gonadotropin-releasing hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N gonadorelin Chemical compound C1CCC(C(=O)NCC(N)=O)N1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CC=1NC=NC=1)NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 organic acid salts Chemical class 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 description 1
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
(54) Způsob čištěni peptidů kapalinovou chromatografii
Vynález se týká způsobu čištění peptidů kapalinovou chromatografii.
Syntetické peptidy se používají· jako léčiva v řadě indikací v humánní i veterinární ;
medicíně. Jejich účinky jsou velmi výrazné a často značně specifické. Protože působí intensivně ve velmi malých množstvích, je důležité při výrobě zaručit vysokou čistotu a v maximální míře odstranit ty látky, které by mohly mít nežádoucí nebo nekontrolovatelné vlivy na živý organismus.
Čištění peptidů obsahujících v sekvenci 10 až 20 aminokyselin představuje komplikovaný problém.. V průběhu syntézy vzniká řada vedlejších· produktů s velmi podobnými strukturními rysy a často s molekulovou hmotností blízkou žádoucí látce.
Pro čištění peptidů uvedeného typu je stále ještě používán způsob protiproudého roztřepávání. Způsob je však pracný a zdlouhavý a má omezenou kapacitu. Při separaci dochází často k tvorbě emulsí, což velmi komplikuje separační proces. Čistota získaných peptidů činí zpravidla 90 %.
Čištění peptidů elektroforesou je pomalé, má i v případě použití komplikované přístrojové techniky nedostatečnou kapacitu. Pro separaci látek s nepříliš rozdílným isoelektrickým bodem je nutné používat značně vysoké napětí, někdy 4 až 5 kV, což zvyšuje pracovní riziko a představuje i určitý energetický problém. Čistota peptidů čištěných elektroforesou je do 90 %.
Nejužívanějším postupem dělení peptidů je v současné době jejich gelová chromatografie na látkách polymerního charakteru. Gelově chromatograficky lze však separovat pouze látky, jejichž molekulová hmotnost se dostatečně liší (např. peptid a sůl nebo peptid a výšemolekulární vedlejěí produkt), čištění pouze touto technikou nemůže tedy v řadě případů zaručit požadovanou čistotu produktu.
Proto je nutné kombinovat několik způsobů čištěni,např. gelovou a ionexovou chromatografií, případně použít ještě další separační techniku. Tím se stává separace peptidů značně časově náročnou a ztrátovou operací. Podmínky čištění se nedají v řadě případů reprodukovat.
V současné době se začíná pro čištění peptidů používat vysokotlaké kapalinové chromatografie s kolonami plněnými chemicky vázanými fázemi na silikagelu. Jako mobilní fáze se používají směsi metanol-voda, které mají často upravené pH na požadovanou hodnotu. Výhodou je vysoká čistota takto získaných peptidů. Nevýhodou zůstává vysoká cena chemicky vázaných fází.
Uvedené nedostatky odstraňuje způsob čištění peptidů kapalinovou chromatografii podle vynálezu. Jeho podstata spočívá v tom, že se peptidy podrobí působení kapalinové chromatografie, jejíž stacionární fáze je tvořena silikagelem velikosti částic 2 až 200 yum, s výhodou 5 až 25 /im, a mobilní fáze obsahuje směs alkoholu nebo acetonitrilu s vodou v poměru 95:5 až 10:90, s výhodou 90:10, případně směs alkoholu, acetonitrilu a vody s obsahem vody od 5 do 90 % hmot., .výhodně 10 až 20 % hmot.
Podle dalšího význaku vynálezu se jako alkohol použije metanol a/nebo etanol a/nebo propanol a/nebo isopropylalkohol. Je výhodné použít v mobilní fázi pufr o pH 3 až 8, s výhodou pH 4,4 až 4,8. Jako pufry je možno použít látky na bázi fosfátů alkalických kovů a kyseliny fosforečné. Konečně je možno přidávat látky na bázi solí organické kyseliny v množství od stopového množství do 5 % hmot., tvořící s peptidy iontové péry.
Způsobem podle vynálezu se získá vysoká čistota peptidů, většinou vyšší než 95 až 99 %, přičemž jako stacionární fáze je použit namísto drahých ionexů a/nebo chemicky vázaných fází čistý silikagel, který je podstatně lacinější a ve větším množství dostupnější.
Způsob podle vynálezu je dále blíže popsán podle několika konkrétních příkladů provedení.
Přikladl
1,0 g surového peptidů (£l-kyselina-3-merkaptopropionová, 8-D-argeninJ vasopressin) rozpuštěného v mobilní fázi byl nanesen na chromatografickou kolonu průměru 40 mm, délky 270 mm, jejíž náplň tvořil silikagel pro chromatografii o velikosti částic 10 až 25/Jm.
Látka byla eluována, za zvýšeného tlaku, mobilní fázi tvořenou 90 % metanolu, 10 % vodného fosfátového pufru o pH 4.6. Retenční čas čištěného peptidů byl 15 min. Bylo získáno 0,72 g peptidů o čistotě 98 %. Čistota byla ověřena vysokotlakou kapalinovou chromatografii s použitím dvou různých kolon.
Příklad 2
0,1 g (8-D-argenin) vasopressinu byla rozpuštěna v 1 ml směsi obsahující 50 % metanolu a 50 % vody a nestříknuta na kolonu světlosti 8 mm, délky 250 mm, plněnou silikagelem pro chromatografii, velikosti částic 7,5 ^im. Průtok mobilní fáze, obsahující 90 % metanolu a 10 % vodného fosfátového pufru o pH 4,6,byl 100 ml/hod. Retenční čas čištěného peptidů byl 30 minut, celková délka děleni byla 45 minut. Bylo získáno 0,8 g peptidů čistoty 93 %.
Příklad 3
0,1 g (2-0-methylthyrosin) oxytocinu bylo rozpuštěno v mobilní fázi a nastříknuto na .206546 kolonu světlosti 8 mm, délky 250 min, plněnou silikagelem o velikosti částic 10 (tun. Mobilní fází je směs 80% metanolu a 20 % vody, průtok 50 ml/hod. Celková doba čiětění byla 25 minut, retenční čas čištěného peptidů 10 minut. Bylo získáno 0,7 g peptidů čistoty vyšší než 98 %.
Příklad 4
Byl čištěn LHRH - releasing factor pro luteinizační a folikuly stimulující hormon. 0,08 g této látky bylo nastříknuto na kolonu jako v případě 2 a eluováno mobilní fází obsa hující 80 % metanolu, 7 % acetonitrilu a 13 % vody. Bylo získáno 0,055 g hormonu čistoty vyšší rtež 99 %.
Claims (5)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZU1. Způsob čištění peptidů kapalinovou chromatografií vyznačený tím, že se peptidy podrobí působení kapalinové <phromatografie, jejíž stacionární fáze je tvořena silikagelem velikosti částic 2 až 200 <um, s výhodou 5 až 25 (Um, a mobilní fáze obsahuje směs alkoholu nebo acetonitrilu s vodou v poměru 95:5 až 10:90, s výhodou 90:10, případně směs alkoholu, acetonitrilu a vody s obsahem vody od 5 do 90 % hmot., výhodně 10 až 20 % hmot.
- 2. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že se jako alkohol použije metanol a/nebo etanol a/nebo propanol a/nebo isopropylalkohol.
- 3. Způsob podle bodů 1 a 2 vyznačený tím, že v mobilní fázi se použije pufr o pří 3 až 8, s výhodou pH 4,4 až 4,8.
- 4. Způsob podle bodů 1 až 3 vyznačený tím, že se používají pufry na bázi fosfátů alkalických kovů a kyseliny fosforečné.
- 5· Způsob podle bodů 1 až 4 vyznačený tím, že se přidávají látky, tvořící s peptidy iontové páry, například na bázi soli anorganických a organických kyselin v množství od stopového množství do 5 % hmot.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS70980A CS206546B1 (cs) | 1980-02-01 | 1980-02-01 | Způsob čištěni peptidů kapalinovou chromatografii |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS70980A CS206546B1 (cs) | 1980-02-01 | 1980-02-01 | Způsob čištěni peptidů kapalinovou chromatografii |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS206546B1 true CS206546B1 (cs) | 1981-06-30 |
Family
ID=5339692
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS70980A CS206546B1 (cs) | 1980-02-01 | 1980-02-01 | Způsob čištěni peptidů kapalinovou chromatografii |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS206546B1 (cs) |
-
1980
- 1980-02-01 CS CS70980A patent/CS206546B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Swingle et al. | Tricalcium phosphate as an adsorbent in the chromatography of proteins | |
| Hancock et al. | Use of mixed-mode, high-performance liquid chromatography for the separation of peptide and protein mixtures | |
| EP0134385A3 (en) | A protein having cell growth stimulating action, composition thereof and method for producing the same | |
| US4332717A (en) | Purification of human growth hormone | |
| JP2002511484A (ja) | Ｃａ＋＋を含有する溶出液を用いたタンパク質の新規な分離方法 | |
| Craig et al. | Bacitracin A. Isolation by counter double-current distribution and characterization | |
| CA1305285C (en) | Production of proteins in active forms | |
| Gráf et al. | On the primary structure of pituitary bovine growth hormone | |
| DE3688712T2 (de) | Reinigung von Proinsulinstoffen. | |
| Wang et al. | SOLID PHASE SYNTHESIS OF BOVINE PITUITARY GROWTH HORMONE‐(123–131) NONAPEPTIDE | |
| Bishop et al. | High-performance liquid chromatography of amino acids, peptides and proteins: XXI. The application of preparative reversed-phase high-performance liquid chromatography for the purification of a synthetic underivatised peptide | |
| SENSHU et al. | Fractionation of calf thymus histone by a new method of CM-cellulose chromatography | |
| JPH03118393A (ja) | ペプチド又はプソイドペプチド構造の低分子量化合物の精製方法 | |
| KR890001244B1 (ko) | 성장 호르몬-양 물질의 정제방법 | |
| CS206546B1 (cs) | Způsob čištěni peptidů kapalinovou chromatografii | |
| Dobashi et al. | Optical resolution of D-and L-amino acid derivatives by silica gel liquid chromatography with chiral additive N-acetyl-L-valine tert-butylamide | |
| Jorgensen et al. | Angiotensin II analogs. 6. Stereochemical factors in the 5 position influencing pressor activity. 1 | |
| US4677192A (en) | Process for the separation of mixtures of insulin, insulin derivatives and, where appropriate, impurities | |
| DE3605908A1 (de) | Verfahren zum reinigen von interferon | |
| KR840001516B1 (ko) | 인체 섬유아세포 인터페론의 제조방법 | |
| DD157613A5 (de) | Verfahren zur herstellung eines insulins oder insulinanalogs | |
| CN115260293B (zh) | 一种醋酸加尼瑞克的纯化方法 | |
| KR100400638B1 (ko) | 재조합 인간 성장호르몬 유사체의 분리방법 | |
| Westall | The use of ion‐exchange resins for the isolation of glutamine and other nitrogenous substances from beetroot | |
| Wälti et al. | Synthesis of [1-(L-2-hydroxy-3-mercaptopropanoic acid)] oxytocin, a highly potent analogue of oxytocin |