CS202570B2

CS202570B2 - Process for preparing aminoglycsidic antibiotics

Info

Publication number: CS202570B2
Application number: CS772453A
Authority: CS
Inventors: William A Million; Rhona M Plews; Kenneth Richardson
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1976-04-14
Filing date: 1977-04-14
Publication date: 1981-01-30
Also published as: PT66422A; DD135496A5; DK164277A; PT66422B; BG28072A4; JPS535141A; DE2716533B2; FR2348223A1; DE2716533C3; IL51775A0; AU2372177A; RO74431A; CH622528A5; LU77108A1; DD130661A5; NL7703567A; AT356267B; IE45030B1; GB1530201A; IE45030L

Description

Vynález se týká nového způsobu výroby amtoogilykosidových antibiotik pres nové meziprodukty.

Vynález se zvláště týká způsobu výroby l-N-substituovaného kanamycinu a jeho derivátů a N-chráněných derivátů téhož typu jako výhodných meziproduktů.

Příklady 1-N-substituovaných kanamycinových derivátů jsou uvedeny v čs. patentu č. 195 713; další deriváty jsou známé látky, například 1-N- [ 4-amino-2-hydrOxybutyryl ] kanamycin А (BB-K8), pqpsaný v britském patentu č. 1 401 221. Při výrobě těchto látek z kanamycinu, který je běžně dostupný, je žádoucí chránit některé aminoskupiny v poloze odlišné než poloha 1 nebo všechny tyto aminoskupiny. Pak je možno provést substituci téměř výlučně na aminoskujpině v poloze 1. Tím se také usnadní izolace výsledného l-N-substituovaného produktu. Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby 1-N-substituovaných kanamycinových derivátů přes selektivním způsobem chráněné meziprodukty.

Předmětem vynálezu je způsob výroby aminoglykosidových antibiotik obecného vzorce I

kde

R znamená aminoskupinu nebo hydroxylovou skupinu a

R¹ znamená alkyl o 3 až 6 atomech uhlíku, popřípadě dále substituovaný jednou nebo více hydroxyskupinami nebo aminoskuptoami, vyznačující se tím, že se podrobí alkylaci sloučenina obecného vzorce II

kde

R² znamená atom vodíku nebo· benzylovou skupinu,

R³ znamená acetylovou nebo trlfluoiracetylovou skupinu a

R⁴ znamená hydroxylovou skupinu nebo skupmu NlHR3, · kde

R3 · má svrchu · uvedený význam, reduktivní alkylací příslušným aldehydem o 3 až 6 atomech uhlíku za přítomnosti redukčního činidla _v organickém rozpouštědle, inertním za reakčních podmínek, za vzniku . sloučeniny obecného· vzorce III

(III) kde

R¹ až R4 mají svrchu uvedený význam, načež se odstraní · hydrolýzou skupina R3 a popřípadě hydrogenací skupina R2 v případě, že znamená benzyl a výsledná sloučenina obecného vzorce I se izoluje.

Alkylové · ' Skupiny o 3 až 6 atomech uhlíku mají přímý nebo· rozvětvený řetězec. Labilní ochrannou skupinou R3 na aminoskupině je acylová skupina, kterou je možno selektivně odstranit ze sloučeniny vzorce III běžným způsobem. V případě, že R3 znamená trifluoracetyl, tuto skupinu je možno odstranit hydrolýzou za mírných podmínek, například působením zředěného hydroxidu amonného, takže nedojde k porušení skupiny R1. V případě, že R3 znamená acetyl, je zapotřebí energičtější hydrolýzy k odstranění této skupiny.

Způsob výroby sloučenin obecného vzorce I se provádí talk, že se v · prvním' stupni a'lkyluje sloučenina obecného vzorce II . k zavedení substituentu R1 na aminoskupinu v poloze 1. Tuto reakci jé možno provést celou řadou známých způsobů. Je například možno provést reduktivní alkylaci při použití příslušného aldehydu, ketonu · nebo derivátu aldehydu, jak je popsáno například v čs. patentu č. 195 714 nebo redukcí odpovídajícího acylovaného · derivátu, · například diboranem. V případě, že se užije · sloučenina obecného vzorce II, v níž R2 · ·znamená atom vodíku dojde k reakci také v · poloze 3, avšak při použití pouze malého přebytku reakčního činidla · je · možno snadno oddělit žádaný 1-N-substituovaný isomer od substituovaného isomerů a od 1,3-di-N-substituovaného produktu běžným způsobem, například chro.matografií · na iontoměniči. Toto· · dělení je · možno provést hned po prvním stupni · nebo· s · výhodou po · odstranění · ochranné skupiny na aminoskupině.

Druhým stupněm · způsobu podle · vynálezu · je odstranění ochranné skupiny R3 na aminoskupině v poloze · 2‘, v případě, že se · v této poloze, áminoskupina nachází a v polohách· 6 ‘a 3“ a rovněž odstranění benzylové skupiny · z 3-aminoskupiny v případě, že produkt benzylovou skupinu obsahuje. V některých případech ještě sám nese aminoskupinu a v tomto případě je žádoucí chránit tuto skupinu v průběhu reakce a pak ochrannou skupinu odstranit v posledním realkčním stupni. K úplnému odstranění ochranných skupin na aminoskupinách je možno užít různých známých metod, · které · · závisí · · na · povaze užité, ochranné skupiny, · na reakčním · prostředí a také vzhledem. k substituentu v poloze N-l. Užité prostředí může být bežvodé nebo vodné, mimoto · jde obvykle · o · různě kyselé nebo · zásadité prostředí. Například benzylovou skupinu je možno· odstranit katalytickou hydrogenolýzou · při použití · paládia jako katalyzátoru Některé acylové · skupiny · je možno · odstranit · hydrolýzou za slabě zásaditých podmínek, například · trifluoracetylovou skupinu je možno · odstranit působením 1 N · hydroxidu amonného' · při teplotě · místnosti · za dobu ·24 hodin, kdežto acetylová skupina, benzo.ylová skupina a ethoxykarbo.nylová skupina· .vyžadují zahřívání za přítomnosti 5 N · hydroxidu sodného několik · hodin na teplotu .60 až 80 °C. Výsledný · produkt obecného vzorce · I je popřípadě možno čistit běžným způsobem, · například krystalizaci nebo chromiatografií.

Způsob · podle vynálezu je možno názorně vysvěttit na výrobě 1-N-[ (S)-4-amino-2-hydroxybutyryljkanamycinu A (BB-K8J z 3-N-benzyl-3^u,6‘-di-N-trffu^<ra^(^eyllk^anamycinu

A. · Acyliace se v tomto případě provádí pří použití N-hydroxysukcinimidesteru kyseliny (S) -4-benzyloxykarbonylaminO‘-2-hycIroxymáselné. Reakce se provádí v inertním organickém· rozpouštědle, například tetrahydrofuranu přidáním · roztoku aktivního· esteru k roztoku derivátu fenamycinu při teplotě 0 °C. ' Reakcí je možno sledovat cbromatografii · a · · je · · možno přidat · větší množství aktivního esteru, · · je-li to třeba k dovršení reakce. · Reakce probíhá · dobře při teplotě místnosti a bylo zjištěno, že za těchto podmínek se acyřace dovrší za 48 hodin. Produkt se izoluje odpařením rozpouštědla a · je možno jej čistit běžným způsobem, například krys tálizací · nebo chromatografií, · · je však poli · dlnější jej užít pro další stupeň v surovém stavu.

Odstranění · 3“- a e^N-trifluoracetylových skupin se provádí bydrolýzou za bazických podmínek, přičemž je možno tuto reakci provést tak, že se rozpustí produkt z prvního· stupně v 1 N hydroxidu amonném a tento roztok se nechá stát několik hodin, například přes noc při teplotě · místnosti. Pak se · odstraní benzylová a benzyloxykarbonylová skupina katalytickou hydrogenolýzou. Tato · reakce se snadno provede rozpuštěním ·. produktu z předchozího · stupně ve · vhodném rozpouštědle, například ve - směsi methanolu, vody a kyseliny octové s následnou hydrogenací . například při tlaku 446 kPá · a teplotě 40 °C za přítomnosti · paláidia jako katalyzátoru. Za těchto podmínek · je reakce · ukončena během 14 hodin. Produkt se po filtraci · izoluje odpařením rozpouštědla. Čištění produktu je možno provádět například chromatografií na iontoměniči, čímž se získá výsledný produkt v čisté formě.

Tentýž. · postup · je možno provést tak, · že se · · vychází z · 3‘\6‘-di-N-trifluoriacetylkanamycinu A. V tomto případě se získá 1-N-substituovaný .. produkt · spolu · s· · 3-N-substítuovaným derivátem a 1,3-N-disubstituovaným · produktem. V tomto případě· je možno oddělit · žádaný 1-N^;si^^bí^1:ituovaný produkt od vedlejších produktů například chromatografií na iontoměniči, přestože v tomto· případě je výtěžek nižší. Stejně dobře je možno užít jako· · výchozí látku 2^3^64^-^^1^0^00tyJkanamycin B, čímž se získají deriváty 1-N-substítuovaného kanamycinu B.

Příkladem provádění způsobu podle vynálezu může být · také výroba · l-N-[ (S)-4-amino-2-hydroxybutyljkanamycinu A. V tomto · · · ' případě se chráněný meziprodukt kanamycinu vzorce II ·' nejprve ·· alkyl-uje například Deduktivní alkyiací . derivátem aldehydu, tak jak bylo · popsáno v popise vynálezu k · čs. patentu . · č. . 195 714 a pak se odstraní · N-bloikující skupiny a výsledný produkt se izoluje. Znamená to·, že například při použití 3~benzyl-6~-[SJ-dihydrOxymethyltetrahydrol-1,3- oxazin-2-onu pro · reduktivní alkyjaci spolu s 3^u,6^<-di-N-acetyl^tkanamycinem A je nutno provést hydrolýzu v zásaditém prostředí k odstranění acetylových skupin s· hydrogenolýzou k odstranění· beňzylové skupiny k získání výsledného produktu YžOTCe I, v němž R· znamená hydroxyskupinu a R1 · znamená · (S)-4-amino-2~-bydroxybutylovou skupinu. Reduktivní . alkylaci je možno provádět ve vhodném organickém rozpouštědle, například dimetbylformamidu při použití borohydridu sodíku v několika hodinách při teplotě 30 °C. Acetylová skupina se odstraní bydrolýzou 3 N hydroxidem sodným při teplotě 80 ^CC v průběhu 4 hodin, a benzylová skupina se odstraní katalytickou hydrogenací · při 60 °C a tlaku . 10⁵

Pa za ·16 hodin. Výsledný produkt se pak oddělí od 3 N substituovaného isomeru chromatografií.

Sloučeniny obecného· vzorce II užívané při výrobě sloučenin obecného vzorce . I a jejichž výroba je předmětem vynálezu jsou také nové sloučeniny popsané v čs. patentu č. 202 571. Tyto látky je možno získat . přesunutím acylové skupiny. Podle jednoho provedení se postupuje tak, že se adiční sůl kanamycinu A nebo B nebo 3-N-benzylkanamycinu A s kyselinou nejprve uvede v reakci s acylačním činidlem v kyselém prostředí, takže dojde k acylaci bydíroxylovýcb skupin. Palk se adiční sůl takto acylovaného produktu s kyselinou rozpustí· v· inertním organickém rozpouštědle a .. neutralizuje. Za těchto podmínek · . dojde k přemístění acylové skupiny na aminoskupmu, · která má acyloxyskuplnu ve vedlejší poloze na kruhu, například na aminosku'pinu v poloze . 6‘ a 3“, popřípadě· 2‘ v případě . kanamycinu B. Zbývající O-acylové skupiny se . pak . odstraní běžným způsobem, například hydrolýzou nebo alkoholýzou · a výsledný produkt se čistí například-čhromatografíí.

Tento způsob · výroby sloučenin vzorce II je zvláště účinný pro výrobu · těch látek, v nichž R4 znamená hydroxylovou skupinu a R³ znamená · trifluoracetylovru . . · skupinu.· V tomto případě se kanamycin A nebo 3-N-benzylkanamycin A rozpustí v kyselině trifluořoctové · a při teplotě 0 °C se · · uvede v .reakci s anhydridem kyseliny тПиогосОоУё. Reakce · je ukončena po několika hodinách při teplotě 0 °C a pak je možno izolovat výsledný peL^,-O--riflιιrгr)ceiylkanamycinrvý derivát a jeho sůl s trínu-oracetátem· odpařením rozpouštědla ve vakuu. Produkt se rozpustí v inertním organickém rozpouštědle, s výhodou tetrahydrofuranu a ' . neutralizuje zásadou, například uhličitanem sodným- nebo · draselným. Bylo · zjištěno, že · za těchto podmínek je možno provést přesun O -» . N acylové skupiny · velmi rychle, . reakce je -ukončena ' za 20· minut · při teplotě místnosti. Zbývající O-trifluorocetylové skupiny . se odstraní běžným způsobem, například metbanolýzou a výsledným 3“,6‘-ditN-trifluoracetylový derivát je možno izolovat odpařením rozpouštědla a · čistit běžnou · sloupcovou cbromatografií.

Je také možno postupovat tak, . že: s.e . kanamycin A nebo 3-N-benzylkanamycin· · A ··nejprve uvede v reakci s činidlem, jímž· ' je možno zavést · odstranitelnou ochrannou skupinu · n,a amínoskupině. Vhodnými skupinami jsou · například . . t-butyloxykarbonylová . skupina nebo benzylrxykarbrnylová skupina.

Ί

Takto chráněný produkt se pak podrobí 0-ácylaci známým způsobem, například působením· anhydridu nebo chloridu kyseliny, jako· anihycfridu kyseliny octové v pyridinu nebo působením alkylchlorm-ravenčanu jako ethylchlormravenčanu, načež se tyto blokující skupiny opět odstraní, například tak, Že t-butyloxykarbonylová skupina se odstraní působením· kyseliny trifluoroctové a benzyloxykarbonylová skupina katalytickou hydrogenolýzou. Přesun O - N a-cylových skupin se pák provádí stejně jako· svrchu a Zbývající O-acylové skupiny se odstraní a produkt se izoluje uvedeným způsobem.

Způsob podle vynálezu je možno provádět také při použití kanamycinu B, acylová skupina . se v tomto případě přemístí z 3‘-hydroxylové skupiny na sousední 2‘-aminoskupinu za vzniku tri-N-acylovaného meziproduktu.

Sloučeniny vzorce I, připravované způsobem podle vynálezu, stejně jako sloučeniny vzotrce II a III mohou existovat v několika formách. Substituenty na kruhu obvykle mohou být ekvatoriálně vzhledem ke kruhu. Mimoto· glykosidická vazba mezi hexopyranosylovým kruhem a 2-desoxyStreptaminovým kruhem je obvykle v poloze X.

3-N-benzylikanamycin A je nová sloučenina. Tuto· látku je možno· získat reduktivní alkylací kanamycinu a působením benzal'dehydu při určitém pH. Bylo zjištěno, že při · alkylaci kanamycinu A ve vodném· roztoku při teplotě místnosti nebo při nižší teplotě při použití přebytku benzaldehydu za přítomnosti kyanoborohydridu sodného je nutno· udržovat · pH roztoku na hodnotě 6. V tomto· případě je hlavním produktem reakce 3 N benzylkanámycin A. Obvykle dochází k tomu, že jako vedlejší produkty vznikají další N-substituované isomery a také polysubstituované produkty, tyto látky je možno oddělit běžnou chromatografií na iontoměniči. Hlavní frakcí, Izolovanou ze sloupce při vymývání hydroxidem amonným je 3-N-benzylkanamycin A spolu s malým množstvím 1-N-benzyl’so'meru. Pro praktické účely je tepto produkt dostatečně čistý, přestože l-N-benzylisomer povede po acyl'aci a alkylaci ke vzniku 3-N*substituovaného isomeru spolu s žádaným 1-N-substituova.ným produktem vzorce I. Tento produkt je možno oddělit c-híromatograficky.

V následujícím příkladu 1 je popsána výroba 3-N-benzylkanamycinu A. Příklady 2 až 5 popisují výrobu nových látek vzorce II. Příklady 6· až 9 popisují výrobu nových sloučenin vzorce I.

Chromatografie byla prováděna na tenké vrstvě kysliCníku křemičitého- ·při použití · uvedeného· systému rozpouštědel. Skvrny byly vyvolány po· usušení desek postřikem 5% · t-butylhypochloritem v cyklohexanu, usušením desek při 100 ^QC za· 10· -minut ve větrané sušárně, zchlazením s následným' postřikem roztokem jodidu draselného a škrobu.

Teploty jsou · uvedeny ve stupních Celsia. „AmbeeHt“ je chráněná slovní známka, označující ionexovou pryskyřici z polystyrénového základu zesítěného· se 3 až 5· % diVinylbenzenu a obsahující zbytky sulfonové kyseliny zavedené sulfonací.

Přikladl

24,3 g (0,03 то!и) kanamycinu A . ve formě síranu se rozpustí ve 150 ml vody a pH se upraví na hodnotu 6 ták, že se po· · kapkách přidává 5-N-kyselina chlorovodíková. Přidá se 1,95 g 0,03 molu kyanborohydridu sodného a směs se zchladí na 0°Ca míchá, přičemž se v průběhu 2,5 hodiny pomalu přidává roztok 3,61 g (0,33 molu) benzaldehydu v 15 ml methanu. Směs se nechá ohřát na teplotu místnosti. Po 16 · hodinách se p'H roztoku upraví na 5,5 přidáním- 1 N kyseliny chlorovodíkové a roztok se zfiltruje a nanese na sloupec íontoměničové pryskyřice (Am^e^eh^-t CG--50) ve NH4⁺-formě. Sloupec se vymývá vodou a pak se postupně zvyšujícím množstvím · amoniaku ve vodě, koncentrace amoniaku vzrůstá v rozmezí 0' až 0,7 N, · čímž se získá jáko hlavní produkt 3-N-ibenzzlkanamycin A spolu s malým množstvím- 1-N-benzylového derivátu, množství produktu je 5,0 g, výtěžek 28 ^)o/o, Rf 0,44 ve směsi methanolu, chloroformu a 17% hydroxidu amonného· v poměru 4:1:2. Čistý kazamyci'n A má hodnotu Rf 0,15.

Vzorek produktu je možno převést na těkavý tntra-Niacetylhepta-O-tri·methylsilyli derivát působením anhydridu kyseliny octové v methanolu při teplotě místnosti 24 hodin s následnou reakcí se směsí hexamethylditllazazu a trimethylchlorsilazu v -:^(^]^ί^Γπ. 2 : 1 při teplotě místnosti 24 hodin, m/e pro Č54H106N4'O1SSl7: vypočteno 1246 a nalezeno 1246.

Poloha tuestitunntu byla potvrzena následujícím· sledem reakcí.

a) působením t-eutyloxykareozyla·zidu se získá sloučenina obsahující 3 tieutyloxykareozylové skupiny a současně benzylovou skupinu, jak bylo potvrzeno NMR-spektrem,

b) hydrogenací je možno odstranit benzylovou skupinu,

c) acylaci je možno provést pomocí N- [ (S) -4-ennzyloxyk'aгronzlamino-2-hydrOi xy'eutyryl·O'xy]sukcizimidu a

d) N-ochrannou skupinu je možno odstranit hydrogenací s následným · působením kyseliny trffu.iorcctt(wé, čímž se získá jako· hlavní produkt 3-N-[(Si-4-amino-2-lhydroxyeutyгyl]kazamyciz A (BB-K29) identický se vzorkem, získaným způsobem podle publikace Naito- · a další (J. Antibiotics, 1973, 26, 297).

Příklad 2

5,0· ml anhydridu kyseliny ^ΐί№ο·ΓΌ€ύ^ se pomalu· přidá za stálého· míchání k roztoku 1,0 g kanamycinu A ve 40 ml kyseliny trifluOTOCtové při 0 °C. Roztok se nechá stát při teplotě 0' až 4°C 20 hodin. Rozpouštědlo se pak odpaří ve vakuu a odparek se smísí s . 10 ml toluenu a odpaří do sucha. Trifluoracetátová sůl se smísí s bezvodým tetrahydrofuranem· a pomalu neutralizuje tak, že se za stálého. míchání přidává přebytek suspenze bezvodého uhličitanu draselného· v tetrahydrofuranu. Směs se míchá při teplotě místnosti 20 minut a suspenze se pak ziiltruje a filtrát se odpaří do sucha. Produkt se smísí s 20 ml methanolu a nechá stát 30 minut při teplotě místnosti. Rozpouštědlo· se odpaří za sníženého tlaku a odparek se chromatograiuje na kysličníku křemičitém, sloupec ^!se vymývá při proměnné koncentraci směsí chloroformu a methanolu v poměru 3 : 1, až směsí chloroformu, methanolu a 17% hydroxid amonný v poměru 8:4:1, čímž .se získá 0,52 g hydrátu 3“,6‘-di-N-tri^^lu^(^in(^(^e^>tyllk^anamycinu A jako· bílá hygroskopická látka. Rf = 0,7 při použití směsi methanolu, chloroformu a 17o/₀ hydroxidu amonného v poměru 4:1:1_, kanamycin A má Rf 0,05. vc=o 1665 cm~i.

Vzorek produktu se převede na těkavý di-N-ai^(^et^]^'he]^1^<^-^-^-tt^im(^t]^^^l'silylový derivát podle příkladu 1. m/e pro C47H94N4O15F6S17: vypočteno 1264, nalezeno 1264.

P říkl ad 3

0,7 ml (5 mmolů) anhydridu kyseliny triiluoroctové se přidá pomalu k roztoku 0,23 gramu (0,4 mmolu) 3-N-benzylkíanamycinu A v 15 ml kyseliny trinuoroctové při 0 °C. Roztok se udržuje 20 hodin na teplotě —4 ^CC. Pak se rozpouštědlo odpaří a odparek Se smísí s 10 ml toluenu .a odpaří do sucha. Produkt se rozpustí ve 20 ml tetrahydroiuranu a pomalu se přidá za stálého míchání k suspenzi· přebytku uhličitanu draselného v tetrahydrofuranu. Suspenze 'se míchá při teplotě místnosti 30 minut, ziiltruje se a filtrát se odpaří do sucha za sníženého tlaku. Odparek se smísí s 20 ml methanolu a nechá stát 30 minut při teplotě místnosti. Pak se rozpouštědlo odpaří ve vakuu, čímž se . získá 3-Ntbenzylt3“,6‘-di-N-trifluoιracetylkanamycin A o Rf 0,5 při použití methanolu, chloroformu a 8% hydroxidu amonného v poměru ·4:1:0,1. 3-N-benzylkanamycin A má Rf 0,01.

P ř í . k 1 a d 4

A. Roztok 189,4 g l,3,3^u,6‘-tetratN-benzyloxykarbonylkanamycinu A (Bull. Chem. Soc. Japan, '1965, 38,· 1181) v 56.8 ml pyridinu a 189 ml anhydridu kyseliny octové se míchá přes noc při teplotě místnosti a pak se vlije do 1,9 litrů vody. Vodný roztok se extrahuje chloroformem (1 x 1,8 litrů a 1 x 1,0 litr) a organický extrakt se odpaří do sucha za sníženého, tlaku. Smísením odparku s etherem se získá 2,24,8 g penta-O-acetyi-l,3,3“,6‘-tetratNtbenzyloxykarbonyl^ιkanat mycin A, který se · zfiltruje a suší ve vakuu. Teplota tání produktu je 223 (až 229 °C, Rf = = 0,55 v chloroformu, σ = 1,8 až 2,05 (1'5 protonových multipletů, 5 acetylových skupin) a 7,4 (20 protonových singletů, 4 fenylové skupiny.

B. Roztok 53 g penta-O-aceΐyl-l,3,3“,6^<t -tetra-N-benzyloxykarbonylk^anamycin A ve 260 ml ethylacetátu s obsahem. 260 ml ledové kyseliny octové se hydrogenuje při použití 5 % paládia na aktivním uhlí v celkovém množství 15 g při teplotě 60' °C a tlaku 446 kPa 7 hodin. Roztok se zfiltruje a filtrát se odpaří do· sucha za sníženého tlaku. Odparek se smísí s etherem a výsledný penta-O-acetylkanamycin v množství 32,9 g se usuší ve vakuu. Produkt má teplotu tání 97 až 105 °C, Rf 0,0· ve směsi chloroformu a ethylalkoholu denaturovaného· methanolem v poměru 12 : 1 ve srovnání s Rf 0,55 výchozí · látky. Při protonové magnetické rezonanci byla prokázána úplná nepřítomnost aromatických protonů.

C. Roztok 139,2 g pentatOtacetyIkanamíycinu A v 1,4 litru methanolu, nasyceného amoniakem, se nechá stát přes noc při · teplotě místnosti a pak . se odpaří do sucha za sníženého tlaku. Odparek se rozpustí ve 140 ml methanolu a surový produkt se vysráží 2,5 litry chloroformu, zfiltruje a odpaří ve vakuu. Surový produkt se uvede v suspenzi ve 400· ml technického· ethylalkoholu denaturovaného methanolem a 91,9 g výsledného- 3“,6^ζtdi-Ntacetylkanamycinu A se oddělí filtrací, promyje etherem a suší ve vakuu. Produkt má teplotu tání 150 až 180 ⁰¹C, . Rf 0,77 v methanolu. NMR-spektrum a protonové spektrum bylo v plném souhlasu s předpokládanou strukturou.

P říklad 5

3,6 ml . anhydridu kyseliny t?rifloooccOové se pomalu přidá za stálého míchání k· roztoku 960· mg (2 mmoly) kanamycinu B v 50 · ml kyseliny tr^i^:Eh^£^]^í^c^i^o^v^é při teplotě 0^O!C. · Roztok se nechá stát při teplotě 0· až 4°C 20 hodin. Pak se .rozpouštědlo· odpaří za · sníženého tlaku a odparek se smísí s 10 ml toluenu, načež se odpaří do sucha. Trifluoracetátová .sůl se rozpustí ve 30· ml tetrahydrofuranu .a roztok se pomalu přidá za stálého· míchání k přebytku triethylaminu v te'trahydrofuranu. Roztok se nechá stát 40¹ minut při teplotě místnosti, načež se rozpouštědlo· odpaří za sníženého tlaku. Odparek se rozpustí v methanolu, čímž se hydrolyzuje zbývající O-triiluoracetylová skupina a po dalších 30 minutách při teplotě místnosti se -rozpouštědlo· odpaří za sníženého tlaku a produkt se chromatografuje .na kysličníku křemičitém, přičemž se k vymývání sloupce· užije směs chloroformu a methanolu v poměru 3 · :1 se .stoupajícím podílem hydroxidu amonného až do výsledné směsi chloroformu, methanolu a 17% hydroxidu amonného v poměru 20· : 10: 1, čímž se zís202570 ká 4'5'2 mg (29 '%) 2^<,3“,6^í-tri-N-trifh^orc^<^etylkanamycin B ve formě sklovité hmoty. Produkt (má Rf 0,70 ve směsi methanolu, chloroformu a 8% hydroxidu amonného v poměru 4:1: 0,1, kanamycin B imá Rf 0,0.

Struktura produktu byla potvrzena .následujícím sledem reakcí:

a) byla provedena acetylace působením anhydridu kyseliny octové v methanolu 20 hodin při teplotě místnosti s následným působením. 1 N hydroxidu amonného 18 hodin k odstranění trifluoracetyiové skupiny, čímž byl získán, produkt s obsahem dvou acetylových skupin, rn/e pro C22H42N5O12: vypočteno 568, nalezeno 568,

b) působením anhydridu kyseliny octové s obsahem deuteria v methanolu při teplotě místnosti 24 hodin is následnou reakcí se směsí hexametíhyldisilazanu a trimethylchlorsllanu v poměru 2 : 1 při .teplotě místnosti za 24 hodin byl získán, těkavý tri-N-deuteroacetyl-di-N-acetyl-hexa-O-trimethylsilylový derivát, m/e pro C46H86N5O15D9Sie: vypočteno 1134, nalezeno 1134. Došlo k diacetýlaci na 2-desoxystreptaminovéim · kruhu, čímž je možno prokázat, že trifluoracetylace byla původně provedena v polohách ’2‘,3“, a 6‘ kanamycinu B.

přiklad 6

3“,6^<-di-N-trifiuoracetylkanamycin A, připravený z 1,0· g .kanamycinu způsobem. podle příkladu 2, ve 40 ml tetrahydrofuranu se uvede . v reakci s 1,08 g (3,1 mmolů) N- (S) -4-benzy loxykareonylamino-2-hydroxybutyryloxysukcinimidu v 50· . ml tetrahydrofuranu. Roztok se nechá stát při teplotě místnosti 24 hodin a pak se přidá 0,54 g téže látky a roztok se . udržuje při teplotě místnosti dalších 24 hodin. Rozpouštědlo. se odpaří ve . vakuu a odparek se rozpustí v 1 N hydroxidu amonném a roztok se . nechá stát 20 -hoďn při teplotě místnosti. Pak se roztok odpaří ve vakuu a odparek se smísí se směsí d . oxanu, vody a kyseliny octové v celkovém množství 55 ml při jejich vzájemném poměru 5:5:1 a hydrogenuje se 6 hodin na 5% paládiu na aktivním uhlí při 30' °C a tlaku 446 kPa. Směs se ziiltruje a filtrát se odpaří. Odparek se chromatografuje na iontoměničové pryskyřici (Amberlit CG-50) v N<H4⁺-formě, .sloupec se vymývá při stoupajícím' množství hydroxidu amonného· od koncentrace 0 až do· 0,5 N, čímž se získá 0,11 g l-N-[ (S )-4-amino-2’-hyddOxybutyryl] kanamycinu B (BB-K8) ve výtěžku 9,2 o/₀ vztaženo· na kanamycin A. Vzorek je totožný se vzorkem čisté látky.

Příklad 7

3-N-benzyl-3‘\6‘-di-N-trifluoracetylkanamycin A připravený z 0,23 g .3-N-benzylkanamycinu A způsobem podle příkladu 3 se . uvede . v reakci s roztokem. 0,017 g (0,5 mmolu) N- [ (S) -4-b^i^:^5^1o^^:^_lkarbonyl^amíno-

-2-hyddooy:Уetyryloxy]sukcimmidu· v 15 .ml tetrahydrafuranu při 0 °C. Roztok se nechá stát při teplotě místnosti 24 hodin. Pak . se přidá 0,35 g aktivního esteru v tetráhydrofuranu a roztok se udržuje dalších 20. hodin na teplotu místnosti. Pak .se roztok odpaří ve vakuu a odparek se smísí se směsí methanolu, vody a kyseliny .octové v množství 30 ml při poměru 10 : 10^;: 1 a hydrogenuje se při použití paládia na aktivním uhlí při teplotě 40' °C a tlaku 446 kPa 13,5 hodiny. . Suspenze se zfiltruje a .se odpaří. Produkt se čistí chromatografií .na iontoměničové pryskyřici (Amberlit CG-50) v NH4⁺-formě stejně jako svrchu, čímž se získá 84 mg l-N-[ (S)-4-aInino-2-hyddOxybutyryl]kanamycinu B (BB-K8) ve výtěžku 36 . %, vztaženo na 3-N-be.nzylikanamycm A. Produkt je totožný s čistým vzorkem.

P říkl ad 8¹

2^<,3“,6‘-tri-N-tri.lluoracetylkanamycm B se uvede v reakci s N-[ (S)-4-benzy.loxykarbonylamino-2-hydroxy butyry loxy ] sukcinimidem obdobně jako v příkladu 6, čímž se po odstranění ochranných skupin a po čištění získá l-N-[ (S)-4-a mlno-2-Hy y doox УгИ у rr i ]kanamycin B (BB-K8).

Příklad 9

Roztok 2,84 g 3“,6‘-di-N-acetylkanamycinu A a 1,305 g 3-benzyl-6-(S)-di-УydroxymnthýltetraIiydro-l,3-oxazin-2-onu ve 28,4 ml dimethylformamidu se hodinu zahřívá na 60 °C a pak se zchladí na 30 °C. Přidá se 0;189 g borohydridu sodíku a směs se míchá další hodinu. Přidá se 1,0 ml vody a směs se nechá stát přes noc, načež se rozpouštědlo. odpaří za sníženého tlaku. Odparek se zahřívá :s 28,4 ml roztoku 3 N hydroxidu sodného při teplotě 80' °C 4 .hodiny, po zchlazení se pH reakční směsi upraví na hodnotu

5,7 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou. Surový roztok l-N^ (S)-4-benzylamino-2-hyrdroíxybutyl) . kanamycinu A a 3-N- [ (S) -4-benzzlamino-2-hydroxybuty1 Jkanamycinu A se nechá projít sloupcem iontoímeničové pryskyřice (Amberlit .CGr50) v NH4⁺-formě, přičemž sloupec se vymývá nejprve vodou k odstranění anorganických složek a pa'.k 0,15 M hydroxidem amonným k izolaci surové směsi aminoglykosidů. Žádané frakce se odpaří a odparek se rozpustí ve směisi 15. ml. methanolu, 16 ml kyseliny octové a 15 ml vody a .pak se hydr^ogenuje při použití 30% paládia na aktivním uhlí při teplotě 60^ °C a tlaku . 514 kPa 16 hodin. Roztok se zfiltruje a rozpouštědlo. se odpaří za sníženého tlaku. Produkt se čistí chromatografií na iontoměnlči tak, jak bylo svrchu popsáno, čímž se získá 1-N4 . (S)-4-a.mino-2-hydroxybutyl ] kanamycin A, .jehož vzorek je totožný se vzorkem čisté látky.

Claims

1. Způsob výroby aminoglykosidových antibiotik obecného vzorce I kde

R znamená aminoskupinu nebo hydroxylovou skupinu a

R¹ znamená alkyl o 3 až 6 atomech uhlíku, popřípadě dále substituovaný alespoň jednou hydroxyskupinou a/nebo* aminoskupinou, vyznačující se tím, že se podrobí alkylaci sloučenina obecného vzorce II

R³ znamená acetylovou nebo trifluoracetylovou skupinu a

R⁴ zmámená hydroxylo-vou skupinu nebo skupinu N'HR³, kde

R³ má svrchu uvedený význam, reduktivní alkylací při použití příslušného aldehydu o 3 až 6 atomech uhlíku za přítomnosti redukčního činidla v organickém rozpouštědle inertním za reakčních podmínek, za vzniku sloučeniny obecného vzorce III (un kde

R² znamená atom vodíku nebo benzylovou skupinu, kde

R¹ a R⁴ mají svrchu uvedený význam, načež se odstraní hydrolýzou skupina R³ a popřípadě hydrogenací skupina R² v případě, že znamená benzyl, a výsledná sloučenina obecného vzorce I se izoluje.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použije sloučeniny obecného vzorce II, v němž R³ znamená trifluoracelylovou skupinu nebo< acetylovou 'skupinu.

3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se jako sloučeniny obecného vzorce II použije 3-N-benzyI-3“,6‘-'di-N-trifluoracetylkanamycinu, 4,3“,6‘-di-N-t\rifluoracetylkanamycinu A, 2\3‘\6‘-tri-N-trifluoraicetylkanamycinu В nebo 3“,6‘-di-N-ace.tylkanamycinu A.