CN219972301U - 一种检测血浆中miRNA-21浓度的光纤生化系统 - Google Patents
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Abstract
本实用新型提供了一种检测血浆中miRNA‑21浓度的光纤生化系统，旨在解决PCR核酸污染和荧光检测手段灵敏度不足等恶性肿瘤分子诊断的痛点。所述光纤生化系统包括取样系统、进样系统、生化反应系统、光纤生化传感器。本实用新型设计的磁纳米探针‑DSN酶捕获放大体系可在循环中放大脑胶质瘤标记物信号，释放的生物素分子与光纤金膜表面的亲和素结合可以有效增强SPR效应，导致SPR共振峰和TFBG包层共振峰的波长移动，进而实现对脑胶质瘤标志物miRNA‑21浓度的准确检测。本实用新型可实现特异性高、灵敏度高、检测限低，无需PCR扩增的脑胶质瘤标记物分子检测，缩短了检测时间，避免了核酸污染，使快速床旁检测成为可能。
Description
技术领域
本实用新型属于生物与新医疗技术领域，涉及一种检测血浆中miRNA-21浓度的光纤生化系统。
背景技术
脑胶质瘤是一种来自神经上皮的肿瘤，约占所有颅内肿瘤的40％～50％。手术结合放化疗等综合治疗效果不佳，其中星形细胞瘤四级为胶质母细胞瘤。总的来说，神经胶质瘤具有发病率高、复发率高、死亡率高的特点。因此早筛早诊和术后临床预后极为重要。
研究表明各miRNA可能与胶质瘤干细胞的性质有关，从而影响肿瘤的发生和发展。在这些稳定变化的miRNA中，miRNA-21的显著增加是神经胶质瘤的共同特征，因此检验miRNA-21浓度对高度恶性的脑肿瘤病情的判断起到重要作用。
然而miRNA-21在血浆中的低丰度性是检测的难题之一。大多数情况下，miRNA-21的检测采用PCR扩增。然而PCR检测费用昂贵、需要专业实验室检测、易造成核酸污染是其显著缺点。
随着生物技术和磁分离技术的发展，利用交叉学科方法将磁纳米粒子与生物探针技术结合，从而可以实现在分子水平上实时、高精度液体活检；磁纳米粒子表面易修饰以及修饰后具有良好的生物相容性，为进一步研究生命科学提供了可能。
DSN酶(duplex-specificnuclease，双链特异性核酸酶)，能够选择性切割DNA-RNA杂交体中的DNA，而对RNA几乎没有活性。由于DSN的独特的性质，在设计合成的DNA探针形成DNA-RNA杂交时，DSN非常适合于RNA的检测，且具有很高的灵敏度。
倾斜光纤布拉格格栅(TFBG)作为一种新型的通信波段无源光纤器件，不仅具有普通光纤布拉格光栅(FBG)的低成本、小型化、高灵敏度等传感优势，而且具有高效的包层模耦合特性。它可以灵活地激发高阶包层模式，有效地将纤维芯能量耦合到纤维表面，在与材料相互作用时形成不同的物理场耦合机制，实现对外部扰动的高灵敏度感知。然而，TFBG裸光纤的倏逝场较弱，其对外部环境的检测灵敏度较低。表面等离子体共振(SPR)技术具有灵敏度高、动态实时监测速度快等优点。随着SPR和光纤传感技术的发展，TFBG-SPR传感器可以提高检测灵敏度，降低检测限。因此，TFBG光纤生化检测技术广泛应用到了各种传感领域的领域。
采用生物素(Biotin)、亲和素(Avidin)结合体系作为传感桥梁。由于生物素亲和素的结合发生在光纤金膜表面，这种结合会导致TFBG包层模式的有效折射率发生变化，导致SPR共振峰和TFBG包层共振峰的波长发生移动。
实用新型内容
本实用新型的目的在于提供一种可以实现在患者血浆样本中捕获并检测微量miRNA-21的光纤生化传感仪系统，以替代当前广泛使用但具有成本高、耗时长和核酸污染等缺点的PCR技术。
本实用新型的技术方案如下：
一种检测血浆中miRNA-21浓度的光纤生化系统，包括取样系统、进样系统、生化反应系统和光纤生化传感器系统；所述的取样系统、进样系统、生化反应系统和光纤生化传感器系统依次相连。
所述的取样系统包括上下步进电机、取样针、样品架、电池、电磁铁、转盘步进电机。电池的开关控制电磁铁磁性的有无，以控制对磁纳米探针的吸引；转盘步进电机与样品架相连，控制样品架的旋转；上下步进电机与取样针相连，控制取样针的上下运动。电磁铁置于样品架下方。所述样品架为六孔结构，其中1’、2’、3’孔为洗针孔，A、B、C孔为样品孔，DSN、MDB探针、患者血浆样本盛放于A、B、C孔。取样针的末端有软管相连。
所述的进样系统包括抽气排气一体机、软管、两路电磁阀、样品装载区、蠕动泵、储液池。其中抽气排气一体机、样品装载区、蠕动泵、储液池与软管相连，软管通过两路电磁阀，形成进样的两路。所述的两路电磁阀可控制两流路的通断和流体流速。
所述的生化反应系统包括DSN酶、MDB探针、患者血浆样本中的miRNA-21、金膜表面的亲和素修饰层、流通池、MDB探针释放出的生物素分子。MDB探针和患者血浆样本中的miRNA-21在样品架的A、B、C孔中发生碱基互补配对反应、DSN酶特异性剪切MDB探针。所述流通池有四个开口，均与软管相连，其中①、②、③号口装有活塞。金膜表面的亲和素修饰层与MDB探针释放出的生物素分子在流通池中结合。
所述的光纤生化传感器系统包括宽谱光源、光纤生化传感器、光纤、光纤光栅解调仪。所述的宽谱光源通过光纤依次与光纤生化传感器和光纤光栅解调仪相连。
所述光纤生化传感器包括光纤纤芯、光纤包层、光纤金膜、TFBG栅区。TFBG栅区利用相位掩模版刻写，TFBG的角度为8°,光纤金膜厚度为50nm，该金膜厚度可以有效激发SPR效应。金膜表面亲和素修饰层经过Au-S键固定在光纤金膜上。
本发明的有益效果如下：
本实用新型设计的磁纳米探针-DSN酶捕获放大体系可在循环中放大脑胶质瘤标记物信号，释放的生物素分子与光纤金膜表面的亲和素结合可以有效增强SPR效应，导致SPR共振峰和TFBG包层共振峰的波长移动，进而实现对脑胶质瘤标志物miRNA-21浓度的准确检测。本实用新型实现特异性高、灵敏度高、检测限低，无需PCR扩增的脑胶质瘤标记物分子检测，缩短了检测时间，避免了核酸污染，使快速床旁检测成为可能。
附图说明
图1为本实用新型的实施示意图。
图2为本实用新型的光纤生化传感器示意图。
其中：1、抽气排气一体机；2、软管；3、两路电磁阀；4、样品装载区；5、注液泵；6、缓冲液；7、上下步进电机；8、取样针；9、样品架(1’、2’、3’孔为洗针孔，A、B、C孔为样品孔)；10、DSN酶；11、MDB探针；12、患者血浆样本中的miRNA-21；13、电池；14、转盘步进电机；15、废液池；16、电磁铁；17、宽谱光源；18、半导体加热芯片；19、光纤生化传感器；20、光纤纤芯；21、光纤包层；22、光纤金膜；23、TFBG栅区；24、金膜表面的亲和素修饰层；25、流通池；26、MDB探针释放出的生物素分子；27、蠕动泵；28、储液池；29、光纤；30、光纤光栅解调仪；31、输出端。
具体实施方式
为了更加清楚明白地解释本实用新型所要解决的技术问题、技术方案以及技术效果，以下将结合附图及实施细节，对本实用新型进行详细说明。此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本实用新型，并不用于限定本实用新型。
实施例1：
一种检测血浆中miRNA-21浓度的光纤生化系统，包括取样系统、进样系统、生化反应系统和光纤生化传感器系统；所述的取样系统、进样系统、生化反应系统和光纤生化传感器系统依次相连。
所述的取样系统包括上下步进电机7、取样针8、样品架9、电池13、电磁铁16、转盘步进电机14。电池13的开关控制电磁铁16磁性的有无，以控制对磁纳米探针的吸引；转盘步进电机14与样品架9相连，控制样品架的旋转；上下步进电机7与取样针8相连，控制取样针的上下运动。电磁铁16置于样品架9下方。所述样品架9为六孔结构，其中1’、2’、3’孔为洗针孔，A、B、C孔为样品孔，DSN酶10、MDB探针11、患者血浆样本盛放于A、B、C孔。取样针8的末端有软管相连。
所述的进样系统包括抽气排气一体机1、软管2、两路电磁阀3、样品装载区4、蠕动泵27、储液池28。其中抽气排气一体机1、样品装载区4、蠕动泵27、储液池28与软管2相连，软管2通过两路电磁阀3，形成进样的两路。所述的两路电磁阀3可控制两流路的通断和流体流速。
所述的生化反应系统包括DSN酶10、MDB探针11、患者血浆样本中的miRNA-21 12、金膜表面的亲和素修饰层24、流通池25、MDB探针释放出的生物素分子26。MDB探针11和患者血浆样本中的miRNA-21 12在样品架9的A、B、C孔中发生碱基互补配对反应、DSN酶10特异性剪切MDB探针11。所述流通池25有四个开口，均与软管2相连，其中①、②、③号口装有活塞。金膜表面的亲和素修饰层24与MDB探针释放出的生物素26在流通池25中结合。
所述的光纤生化传感器系统包括宽谱光源17、光纤生化传感器19、光纤29、光纤光栅解调仪30。所述的宽谱光源17通过光纤29依次与光纤生化传感器19和光纤光栅解调仪30相连。
所述光纤生化传感器19包括光纤纤芯20、光纤包层21、光纤金膜22、TFBG栅区23。TFBG栅区23利用相位掩模版刻写，TFBG的角度为8°,光纤金膜22厚度为50nm，该金膜厚度可以有效激发SPR效应。金膜表面亲和素修饰层24经过Au-S键固定在光纤金膜22上。
实施例2：
首先，取下样品架，在其中的A、B、C孔中加入5mg/mL的MDB探针(MB1000磁性纳米粒子-Capture DNA-Biotin)、10μL的10×反应缓冲液(660mM Tris-HCl，6.6mM MgCl2，pH＝8.0)，0.06UμL-1的DSN酶,再加入三位不同患者的血浆样本，并在37℃下持续孵育2小时，而孔1’、2’、3’作为洗针孔无需任何处理。
Capture DNA的修饰方式为：5’-biotin-TEG-ATC AGT CTG ATA AGC TAC-biotin-3’；磁珠修饰的方式为：直径为1000nm的MB1000表面用链霉亲和素修饰，二者在0.5mL Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4，5mM Tris-HCl，1mM EDTA，1M NaCl)中在25℃下反应1小时。
在孵育的同时，对流通池进行相应操作：先关闭流通池活塞①、③，打开活塞②，打开蠕动泵和电磁阀，向流通池A口泵入10mM a-硫辛酸，使光纤金膜吸附20分钟；然后切换两路电磁阀，向A口泵入100mg/mL的EDC/NHS混合液活化羧基，此时上一步骤多余溶液会从②口流出；待活化羧基后，打开活塞①，关闭活塞②，蠕动泵泵入200μg/mL的亲和素，进入B口的亲和素将上步反应液从①口排出，亲和素固定完成后，打开活塞③，排出废液。
孵育完成后，打开宽谱光源，打开电磁铁电池开关磁力吸附5min,并使取样针对准初始洗针孔1’，开始洗针。洗针过程如下：打开注液泵，待缓冲液充满取样针并滴入洗针孔中时，关闭注液泵。再打开抽气排气一体机，使软管及取样针中的缓冲液流入洗针孔1’中。
磁吸完成后，转盘步进机带动样品架旋转至样品口A，上下步进电机使取样针下降，浸没在样品液中，切换两路电磁阀的通路，开启抽气排气一体机，使其反向抽气通过两路电磁阀口将样品抽至样品装载区中，上下步进电机使取样针上升，完成第一次取样。
打开活塞②，关闭活塞①、③，使抽气排气一体机处于排气模式，将样品装载区中的样本通过两路电磁阀缓慢泵入流通池中，亲和素与生物素结合导致SPR效应增强,TFBG-SPR图谱显著变化，多余反应液从②排出。
图谱不再发生显著变化后，使用光纤光栅解调仪，采集光谱变化并结合MatLab进行光谱解调，判断当前溶液的有效折射率，从而确定血浆样品中miRNA-21脑胶质瘤标志物的浓度。
关闭抽气排气一体机，将半导体加热芯片通电，将光纤传感器局域加热至70℃，持续10min,除去金膜表面的Au-S键，实现传感器的重复利用，从废液池中回收被吸附的磁纳米粒子。最后打开抽气排气一体机，将废液从②口排出。
重复上述操作可完成对多个患者的血浆样本的检测。
作为实施案列，该光纤生化传感器不止针对miRNA-21脑胶质瘤标志物检测，也同样适用于其他RNA，仅需重新设计Capture DNA的碱基互补序列。实现了无PCR、特异性高、可重复循环利用的生物分子抓捕识别检测。
Claims (4)
1.一种检测血浆中miRNA-21浓度的光纤生化系统，其特征在于，包括取样系统、进样系统、生化反应系统和光纤生化传感器系统；所述的取样系统、进样系统、生化反应系统和光纤生化传感器系统依次相连；
所述的取样系统包括上下步进电机(7)、取样针(8)、样品架(9)、电池(13)、电磁铁(16)、转盘步进电机(14)；电池(13)的开关控制电磁铁(16)磁性的有无，以控制对磁纳米探针的吸引；转盘步进电机(14)与样品架(9)相连，控制样品架的旋转；上下步进电机(7)与取样针(8)相连，控制取样针的上下运动，电磁铁(16)置于样品架(9)下方；
所述的进样系统包括抽气排气一体机(1)、软管(2)、两路电磁阀(3)、样品装载区(4)、蠕动泵(27)、储液池(28)；其中抽气排气一体机(1)、样品装载区(4)、蠕动泵(27)、储液池(28)与软管(2)相连，软管(2)通过两路电磁阀(3)，形成进样的两路；
所述的生化反应系统包括DSN酶(10)、MDB探针(11)、患者血浆样本中的miRNA-21(12)、金膜表面的亲和素修饰层(24)、流通池(25)、MDB探针释放出的生物素分子(26)；MDB探针(11)和患者血浆样本中的miRNA-21(12)在样品架(9)的A、B、C孔中发生碱基互补配对反应、DSN酶(10)特异性剪切MDB探针(11)；所述流通池(25)有四个开口，均与软管(2)相连，金膜表面的亲和素修饰层(24)与MDB探针释放出的生物素分子(26)在流通池(25)中结合；
所述的光纤生化传感器系统包括宽谱光源(17)、光纤生化传感器(19)、光纤(29)、光纤光栅解调仪(30)；所述的宽谱光源(17)通过光纤(29)依次与光纤生化传感器(19)和光纤光栅解调仪(30)相连；
所述光纤生化传感器(19)包括光纤纤芯(20)、光纤包层(21)、光纤金膜(22)、TFBG栅区(23)；TFBG栅区(23)利用相位掩模版刻写，TFBG的角度为8°,金膜表面亲和素修饰层(24)经过Au-S键固定在光纤金膜(22)上。
2.如权利要求1所述的一种检测血浆中miRNA-21浓度的光纤生化系统，其特征在于，所述样品架(9)为六孔结构，其中1’、2’、3’孔为洗针孔，A、B、C孔为样品孔，DSN酶(10)、MDB探针(11)、患者血浆样本盛放于A、B、C孔，取样针(8)的末端与软管相连。
3.如权利要求1或2所述的一种检测血浆中miRNA-21浓度的光纤生化系统，其特征在于，所述流通池(25)的①、②、③号口装有活塞。
4.如权利要求1或2所述的一种检测血浆中miRNA-21浓度的光纤生化系统，其特征在于，所述光纤金膜(22)厚度为50nm，该金膜厚度可以有效激发SPR效应。
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