CN217277877U - 一种具有高效率荧光收集的多光子显微系统 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及一种具有高效率荧光收集的多光子显微系统，包括飞秒脉冲激光发生器(101)、光学模块和荧光收集装置，所述光学模块包括激光光路、激光荧光双光路和荧光光路，所述荧光收集装置包括光电探测器(114)以及包围所述激光荧光双光路和荧光光路设置的反射镜(109、115)或者所述荧光收集装置包括光电探测器(114)以及设置于显微镜物镜(107)前方光路的片状光电探测器(108)。与现有技术相比，本实用新型不仅可以提高光子利用率，而且可以减少光损伤，实现更大成像深度。
Description
技术领域
本实用新型涉及多光子成像领域，尤其是涉及一种提高多光子显微系统光子探测效率的方法及装置。
背景技术
基于超快激光器的多光子成像包括双光子和三光子成像等，其基本原理是：多个光子在极短时间窗内一起撞击目标分子使之能近乎同时吸收多份能量，从而可被更长波长的光子激发。和传统的单光子激发荧光显微镜相比，多光子激发显微镜具有空间分辨率高、穿透组织能力强的优势。多光子激发的非线性过程决定其只会在很小的焦体积内激发荧光。而且采用近红外光子激发具有较大的穿透深度，这在深层散射组织成像中具有明显优势。
双光子成像首先于1990年由Webb实验室实现，业已成为生物学、医学成像的重要工具。近年来，三光子成像成为光学成像的前沿研究热点，是美国脑计划 (BrainInitiative)重点资助的成像方法之一，在深层成像领域取得了重要突破。 2017年ChrisXu课题组成功搭建三光子显微镜，将活体成像深度从500μm提高到 1100μm。然而很多具有重要功能的生物深层组织(如小鼠大脑中的纹状体等深部脑区，其深度大于1300μm)还需要更大的成像深度。如何提高三光子成像的深度？这依然是领域内亟需突破的问题。
由于脑组织对光的散射和吸收，动物可承受的光功率有限，多光子成像的深度受到限制。如何使用有限的光功率实现更深层成像成为目前多光子显微镜的主要研究方向。
实用新型内容
对活体生物组织这样的强散射介质进行深层成像，需要显微镜能够穿透较深的生物组织，并且能够克服强烈的光散射。既往研究中，多光子显微镜的改进主要集中于激光器和扫描模块，而少有针对荧光收集效率的研究。有研究对物镜进行设计改进，但还没有提高多光子显微镜探测效率的报道。但利用Monte Carlo方法对荧光光子在大脑中的散射传播进行模拟仿真分析可知，当使用传统光路时，最终可被荧光探测器接受的光子比例不足2％。因此，提高荧光光子收集效率可能是提升多光子成像深度的突破口。本实用新型即基于上述研究发现而产生。
本实用新型的目的就是为了克服现有技术中存在的光子探测效率不足的缺陷而提供一种具有高效率荧光收集的多光子显微系统，不仅可以提高光子利用率，而且可以减少光损伤，实现更大成像深度，特别适用于散射介质的深层成像。
本实用新型的目的可以通过以下技术方案来实现：
本实用新型提供一种具有高效率荧光收集的多光子显微系统，包括飞秒脉冲激光发生器、光学模块和荧光收集装置，所述光学模块包括激光光路、激光荧光双光路和荧光光路，所述荧光收集装置包括光电探测器以及包围所述激光荧光双光路和荧光光路设置的反射镜。
进一步地，所述激光光路包括依次设置的二维扫描振镜、第三透镜和第四透镜。
进一步地，所述二维扫描振镜之前还包括一个或多个用于调节光路中光斑大小的透镜元件。
进一步地，所述激光荧光双光路包括依次设置的双色镜和显微镜物镜，所述反射镜仅包围设置于所述显微镜物镜后方光路。
进一步地，所述激光荧光双光路包括依次设置的双色镜和显微镜物镜，所述反射镜同时包围设置于所述显微镜物镜前方光路和后方光路。
进一步地，所述荧光光路包括荧光滤波片，所述荧光滤波片和光电探测器依次设置。
进一步地，所述荧光收集装置还包括设置于显微镜物镜前方光路的片状光电探测器，且所述片状光电探测器为单个或多个，其内径大于显微镜物镜荧光收集入光口的外径。
进一步地，所述反射镜为筒状反射镜。
本实用新型还提供一种具有高效率荧光收集的多光子显微系统，包括飞秒脉冲激光发生器、光学模块和荧光收集装置，所述光学模块包括激光光路、激光荧光双光路和荧光光路，所述激光荧光双光路包括依次设置的双色镜、和显微镜物镜，所述荧光收集装置包括光电探测器以及设置于显微镜物镜前方光路的片状光电探测器，且所述片状光电探测器为单个或多个，其内径大于显微镜物镜荧光收集入光口的外径。
进一步地，所述荧光收集装置还包括包围所述激光荧光双光路和荧光光路设置的反射镜。
与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果：
1、本实用新型装置中增加了反射镜或片状光电探测器，因组织散射被传统探测光路遗失的荧光光子在收集透镜前经反射镜重新进入透镜或被片状光电探测器接收，可使荧光收集效率提高一个数量级以上，从而在有限的光功率下提升多光子成像深度。
2、本实用新型装置简便，同等成像信号强度需求下，可减少光功率使用，降低组织损伤，可高效利用有效功率，实现更大的成像深度。
附图说明
图1为本实用新型的结构示意图；
图2为本实用新型不同实施例与传统方案的探测光路示意图；
图3为本实用新型不同实施例与传统方案的光子收集效率随大脑组织深度变化的模拟结果；
图中，101-飞秒脉冲激光发生器，102-第一透镜，103-第二透镜，104-二维扫描振镜，105-第三透镜，106-第四透镜，107-显微镜物镜，108-片状光电探测器，109-物镜前反射镜，110-双色镜，111-第五透镜，112-荧光滤波片，113-第六透镜， 114-光电探测器，115-物镜后反射镜。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本实用新型进行详细说明。本实施例以本实用新型技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本实用新型的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
参考图1所示，本实施例提供一种具有高效率荧光收集的多光子显微系统，可应用于模式动物脑组织中实现活体三维深层荧光成像，包括飞秒脉冲激光发生器 101、光学模块和荧光收集装置，光学模块包括激光光路、激光荧光双光路和荧光光路，荧光收集装置包括光电探测器114以及包围激光荧光双光路和荧光光路设置的反射镜，以反射聚集各种角度的溢出光子。
具体地，激光光路包括依次设置的二维扫描振镜104、第三透镜105和第四透镜106。若需要对光路中光斑大小进行调节，二维扫描振镜104之前还可以设置第一透镜102和第二透镜103。激光荧光双光路包括依次设置的双色镜110和显微镜物镜107，进行成像时，显微镜物镜107位于生物样品上方，本实施例中，反射镜仅包围设置于显微镜物镜107后方光路，即仅设置物镜后反射镜115。荧光光路包括荧光滤波片112，位于光电探测器114之前。在优选的实施方式中可根据需要在荧光滤波片112之前或之后设置透镜元件，如在荧光滤波片112之前设置第五透镜 111，在之后设置第六透镜113。
飞秒脉冲激光发生器101产生的飞秒脉冲激光经第一透镜102、第二透镜103 准直后入射到二维扫描振镜104上，将光路从横轴转向纵轴；依次沿第三透镜105、第四透镜106和双色镜110至显微镜物镜107，通过显微镜物镜107将二维扫描振镜104上折射的光束聚焦到待测生物样品中；待测生物样品中标记的荧光分子受多光子激发后发射荧光，经强散射逃逸出组织；散射较弱的荧光光子，经显微镜物镜 107沿双色镜110、第五透镜111、荧光滤波片112和第六透镜113被光电探测器 114收集，对于在收集光路中耗散的光子，利用在显微镜物镜107后方加入的物镜后反射镜115进行反射，使进入显微镜物镜107的所有光子都可以并经透镜聚焦到光电探测器114上，增加荧光收集效率。探测光路如图2的实施例1所示。
本实施例中，反射镜为筒状反射镜，以用于收集进入物镜后因角度而在物镜内耗散而无法被光电探测器114收集的信号光子，提高探测效率，进而提高成像深度。
本实施例中，飞秒脉冲激光发生器101为飞秒脉冲激光发生器。
本实施例的多光子显微系统可为双光子显微系统或三光子显微系统。
实施例2
参考图1所示，本实施例中提供的具有高效率荧光收集的多光子显微系统与实施例1不同的是，在显微镜物镜107的前光路和后光路均包围设置反射镜，即同时设置物镜前反射镜109和物镜后反射镜115。在激发荧光收集路径中，对于因角度过大不能进入物镜或者在收集光路中耗散的光子，利用在显微镜物镜107前后中增加的筒状反射镜，使进入显微镜物镜107的所有光子都可以并经透镜聚焦到光电探测器114上，进一步增加荧光收集效率。探测光路如图2的实施例2所示。
实施例3
参考图1所示，本实施例中提供的具有高效率荧光收集的多光子显微系统是在实施例1的基础上，在所述荧光收集装置中增加片状光电探测器108，该片状光电探测器108设置于显微镜物镜107前方光路，即位于显微镜物镜107和生物样品之间，且所述片状光电探测器108可以为单个或多个，其内径大于显微镜物镜107 荧光收集入光口的外径。本实施例中片状光电探测器108为一种光电探测器，可用于收集主光路以外因散射而被遗漏的信号光子。
本实施例在激发荧光收集路径中，对于在收集光路中耗散的光子，利用在显微镜物镜107后方加入的物镜后反射镜115进行反射，使进入显微镜物镜107的所有光子都可以并经透镜聚焦到光电探测器114上；对于超出显微镜物镜107采集范围的强散射的荧光光子，利用置于显微镜物镜107前的片状光电探测器108进行采集。探测光路如图2的实施例3所示。图像重构时，同时基于光电探测器114和片状光电探测器108的接收信号，将强散射和弱散射的荧光光子数叠加获得增强的荧光信号，并重构出待测样品的图像。
实施例4
参考图1所示，本实施例中提供的具有高效率荧光收集的多光子显微系统，包括飞秒脉冲激光发生器101、光学模块和荧光收集装置，光学模块包括激光光路、激光荧光双光路和荧光光路，激光荧光双光路包括依次设置的双色镜110和显微镜物镜107，进行成像时，显微镜物镜107位于生物样品上方，荧光收集装置包括光电探测器114以及设置于显微镜物镜107前方光路的片状光电探测器108，且所述片状光电探测器108可以为单个或多个，其内径大于显微镜物镜107荧光收集入光口的外径，即片状光电探测器108位于显微镜物镜107荧光入口处的周围。片状光电探测器108可收集超出显微镜物镜107收集范围的散射光子。
实验结果
散射介质对荧光光子的强散射，采用蒙特卡洛(Monte Carlo)模拟荧光光子在散射介质内的空间分布，得到光子散射次数、分布区域和出射角度。
具体实验中展示聚焦深度为从0.15mm到3.75mm的视场范围时，双光子激发荧光光子的空间分布情况。采用920nm的飞秒脉冲激光作为激发光，在高散射介质中激发荧光。其中散射组织的吸收系数为0.02cm-1，散射系数为8.7cm-1，散射结构因子g为0.9，组织的光学折射率为1.36。这里模拟108个荧光光子。图3为实施例1、2、3与传统装置在不同深度时的荧光理论收集效率的折线图。
仿真模拟从数据上证明了本实用新型装置在荧光光子收集效率上比传统装置高出一个数量级以上，证明了本实用新型的正确性和重要性。
以上详细描述了本实用新型的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本实用新型的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本实用新型的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种具有高效率荧光收集的多光子显微系统，包括飞秒脉冲激光发生器(101)、光学模块和荧光收集装置，所述光学模块包括激光光路、激光荧光双光路和荧光光路，其特征在于，所述荧光收集装置包括光电探测器(114)以及包围所述激光荧光双光路和荧光光路设置的反射镜。
2.根据权利要求1所述的具有高效率荧光收集的多光子显微系统，其特征在于，所述激光光路包括依次设置的二维扫描振镜(104)、第三透镜(105)和第四透镜(106)。
3.根据权利要求2所述的具有高效率荧光收集的多光子显微系统，其特征在于，所述二维扫描振镜(104)之前还包括一个或多个用于调节光路中光斑大小的透镜元件。
4.根据权利要求1所述的具有高效率荧光收集的多光子显微系统，其特征在于，所述激光荧光双光路包括依次设置的双色镜(110)和显微镜物镜(107)，所述反射镜仅包围设置于所述显微镜物镜(107)后方光路。
5.根据权利要求1所述的具有高效率荧光收集的多光子显微系统，其特征在于，所述激光荧光双光路包括依次设置的双色镜(110)和显微镜物镜(107)，所述反射镜同时包围设置于所述显微镜物镜(107)前方光路和后方光路。
6.根据权利要求1所述的具有高效率荧光收集的多光子显微系统，其特征在于，所述荧光光路包括荧光滤波片(112)，所述荧光滤波片(112)和光电探测器(114)依次设置。
7.根据权利要求4所述的具有高效率荧光收集的多光子显微系统，其特征在于，所述荧光收集装置还包括设置于显微镜物镜(107)前方光路的片状光电探测器(108)，且所述片状光电探测器(108)为单个或多个，其内径大于显微镜物镜(107)荧光收集入光口的外径。
8.根据权利要求1所述的具有高效率荧光收集的多光子显微系统，其特征在于，所述反射镜为筒状反射镜。
9.一种具有高效率荧光收集的多光子显微系统，包括飞秒脉冲激光发生器(101)、光学模块和荧光收集装置，所述光学模块包括激光光路、激光荧光双光路和荧光光路，所述激光荧光双光路包括依次设置的双色镜(110)、和显微镜物镜(107)，其特征在于，所述荧光收集装置包括光电探测器(114)以及设置于显微镜物镜(107)前方光路的片状光电探测器(108)，且所述片状光电探测器(108)为单个或多个，其内径大于显微镜物镜(107)荧光收集入光口的外径。
10.根据权利要求9所述的具有高效率荧光收集的多光子显微系统，其特征在于，所述荧光收集装置还包括包围所述激光荧光双光路和荧光光路设置的反射镜。
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