CN203148953U

CN203148953U - 一种快速检测水产品中硝基呋喃类代谢物的胶体金试剂板

Info

Publication number: CN203148953U
Application number: CN 201320077536
Authority: CN
Inventors: 吴光红; 杨洪生; 吴茂生; 黄奕雯; 王伟萍; 王振国; 苑淑宾
Original assignee: HANGZHOU NANKAI BIOTECH CO Ltd
Current assignee: HANGZHOU NANKAI BIOTECH CO Ltd; Jiangsu Fishery Quality Testing Center
Priority date: 2013-02-19
Filing date: 2013-02-19
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2023-02-19

Abstract

本实用新型涉及一种快速检测水产品中硝基呋喃类代谢物的胶体金试剂板，可用于快速检测水产品中硝基呋喃类代谢物。本实用新型试剂板由上下两块塑料模板、呋喃唑酮代谢物试纸条、呋喃西林代谢物试纸条、呋喃它酮代谢物试纸条和呋喃妥因代谢物试纸条组成，每个试纸条背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和质控线，硝基呋喃类代谢物检测结果能够以肉眼可见的颜色判断。该试剂板可进行半定量直观检测，整个操作过程仅需90min，且无需任何昂贵实验设备辅助，利于大规模样本筛选，适合工商部门、检验检疫机构、水产养殖、加工企业对水产中的硝基呋喃类代谢物进行大规模快速检测。

Description

一种快速检测水产品中硝基呋喃类代谢物的胶体金试剂板

技术领域

本实用新型涉及一种快速检测水产品中硝基呋喃类代谢物的胶体金试剂板，具体涉及一种检测水产品中硝基呋喃类代谢物的免疫胶体金快速检测试剂板。

背景技术

硝基呋喃类药物是一类人工合成的抗菌药物，主要包括呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林以及呋喃它酮。硝基呋喃类药物对大多数革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和原虫等病原体均有杀灭作用，而且价格低、药效好，曾经在水产养殖业中广泛使用。但是，硝基呋喃类药物对畜禽有一定毒性，动物大剂量或长期连续应用硝基呋喃类药物易引起中毒性反应，表现为厌食、腹泻、胃肠出血、周围神经炎、兴奋、惊厥、瘫痪等，中毒严重时可引起动物死亡。同时，硝基呋喃类药物也是一类具有潜在致癌和诱导有机体产生突变的物质。硝基呋喃类药物在动物体内迅速代谢，代谢产物能与蛋白结合形成稳定化合物。这些代谢物可以在人类的胃液的酸性条件下从蛋白质中释放出来而被人体吸收，从而对人类健康造成严重的危害。

自发现硝基呋喃类药物可存在的遗传毒理学毒性，1995年欧盟全面规定禁止使用硝基呋喃类抗菌药物，在动物源性食品中硝基呋喃类药物及代谢物残留的限值为不得检出。2002年美国全面禁止将硝基呋喃类药物用于食源性动物。2004年美国食品和药物管理局(FDA)公布了禁止在进口动物源性食品中使用的11种药物名单，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮。我国农业部于2002年4月发布193号公告，公布了《食品动物禁用兽药及其他化合物清单》，规定在所有食品动物中禁止使用硝基呋喃类抗生素，2003年又将水产品硝基呋喃类代谢物纳入残留监控计划。

目前，用于检测此类药物及其代谢物残留的方法主要有：分光光度法、液相色谱-紫外检测器法(LC-UV)、高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)、高效液相色谱-质谱/质谱联用(HPLC-MS/MS)以及酶联免疫法(ELISA)等。

分光光度法可以判定水产品中是否存在硝基呋喃类代谢物，且不需昂贵的仪器与试剂，样品前处理操作简单，有较好的推广及应用价值，缺点是测定结果准确度较低。

高效液相色谱法及其联用技术是目前国内测定硝基呋喃类代谢物应用普遍、权威的方法，灵敏度和精确度高，但样品前处理过程复杂、设备昂贵、检测周期长、所需试剂繁多，且操作时需要专门的技术人员，难以满足现代检测快速、简捷、现场化的要求。

酶联免疫吸附法是应用抗原抗体特异性反应和酶的高效催化作用来测定硝基呋喃类代谢物的分析方法，特异性高、灵敏度高、快速、简便，但是酶的活性易受反应条件影响，测定结果重复性较差。此外酶联免疫吸附法所需试剂寿命短，需低温保藏。

胶体金免疫层析法是在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，除了具备酶联免疫法的诸多优点外，还克服了酶联免疫法的一些不足。该方法将反应所需要的原料的全部或大部分均已整合到试剂中，反应通常只需数分钟至数十分钟，检测结果以肉眼可见的显色条带来判读。此法具有简便快速、操作简单、特异性强、不需要额外设备等优点。

实用新型内容

为了克服现有硝基呋喃类药物及其代谢物残留检测分析方法检测时间长，成本高，需配备昂贵仪器设备，不适于大量样本的现场快速筛检的缺陷。本实用新型针对检测需求，对水产品中硝基呋喃类代谢物残留的检测方法展开研究，提供一种用于现场快速筛检水产品中呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃它酮代谢物(AMOZ)、呋喃西林代谢物(SEM)及呋喃妥因代谢物(AHD)的免疫胶体金快速检测试剂板。本实用新型试剂板操作简单、便捷，灵敏度高，实验结果肉眼可直观判断，无需仪器设备配合测定，检测既可在实验室中操作，也可在野外、水产市场等地进行，90min内即可完成对样品中硝基呋喃类代谢物的定性和半定量测定。

本实用新型试剂板应用层析式抗体免疫竞争原理，通过抗原和金标抗体反应显色，特异性检测水产品中的硝基呋喃类代谢物残留。如果样品溶液中含有硝基呋喃类代谢物残留，代谢物先和胶体金颗粒上的抗体反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的硝基呋喃类代谢物占据而无法与检测线上的硝基呋喃类代谢物特异性抗原结合；当样品中的硝基呋喃类代谢物含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色较质控线浅甚至无显色，则判定为阳性。相反，当样品中硝基呋喃类代谢物含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色与质控线相近或偏深，则判定为阴性。

本实用新型试剂板由上下两块塑料模板、呋喃唑酮代谢物试纸条、呋喃西林代谢物试纸条、呋喃它酮代谢物试纸条和呋喃妥因代谢物试纸条组成。每个试纸条背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。其中样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻各部分间有1～2mm的重叠，其目的一方面是保证层析作用从样品垫到吸水垫部位顺利进行，另一方面是为了使样品溶液与样品垫有充分反应时间，样品垫上的缓冲体系可以中和样品溶液的酸碱度，保证样品溶液中的有效成分与胶体金结合垫上的金标抗体顺利发生反应。

每个试纸条的胶体金结合垫上分别包被有相应的抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体与胶体金的结合物；硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次分别包被有相应的硝基呋喃类代谢物-卵清蛋白(OVA)偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。

本实用新型试剂板的各部分组成成分与功能如下：

塑料模板，起固定试纸条及标示功能区(加样孔、检测区、质控区)的作用。

背衬为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。

样品垫由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液与缓冲样品溶液pH值的作用。

胶体金结合垫由聚酯膜制成，其上标记有抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体与胶体金的偶联物，是样品溶液中的有效成分与金标抗体发生反应的场所。

硝酸纤维素膜部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。

吸水垫为滤纸，作为吸水部分其作用是将移动上来的多余的溶液吸收。

本实用新型试剂板具有如下有益效果：

(1)特异性好、灵敏度高

本实用新型试剂板的抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体与其相应的硝基呋喃类代谢物的交叉反应率均为100％，与其他三项硝基呋喃类代谢物的交叉反应率均小于0.1％，与其他种类的抗生素包括磺胺类药物、氯霉素、孔雀石绿等没有交叉反应。

本实用新型试剂板检测呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃西林代谢物及呋喃妥因代谢物的灵敏度均可达到1.0μg/kg(ppb)，完全可以满足市场的检测需求。

(2)操作简便、快速

本试剂板的操作不需任何专业培训，只需按说明进行样品前处理，滴样后数分钟内即可用肉眼判读检测结果。本实用新型试剂板将免疫层析反应所需的大部分原料已整合到试纸条中，滴样后抗原抗体反应在固相膜上快速进行，滴样后3～5min内即可读取结果，且样品前处理方法相同，四项硝基呋喃类代谢物可同时检测，大大缩短了检样时间。

(3)对实验设备的依赖性小

本实用新型试剂板在检测组织中硝基呋喃类代谢物时，除在样品前处理过程中需要用到一些轻便的小型仪器外，其它过程均不需要使用仪器。滴样跑板后，通过肉眼判断硝酸纤维素膜上检测线和质控线的颜色深浅对比来判读结果，此优点使其便于野外及现场操作。

(4)成本低，效益好

本实用新型试剂板生产工艺简单，检测过程中需要的试剂价格低廉，既可检测单个样本，也适用于大批量样品同时检测，生产成本低，大大降低了检测费用。

附图说明

图1为硝基呋喃类代谢物免疫胶体金快速检测试剂板结构示意图，其中1为样品垫，2为胶体金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为质控线，6为吸水垫，7为不干胶，8为PVC板。

图2为硝基呋喃类代谢物免疫胶体金快速检测试剂板操作示意图，其中S为加样孔，C为质控区，T为检测区。

图3、4、5为硝基呋喃类代谢物免疫胶体金快速检测试剂板结果判定示意图，其中T为检测区，C为质控区；图3为阴性结果，图4为阳性结果，图5为无效。

具体实施方式

本实用新型试剂板的制备包括硝基呋喃类代谢物-载体蛋白偶联物的制备、抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体的制备、胶体金溶液的制备、金标抗体的制备和硝基呋喃类代谢物试剂板的组装。

1.硝基呋喃类代谢物-载体蛋白偶联物的制备

1.1免疫原的制备

在安装有磁力搅拌装置的烧杯中加入蒸馏水10mL和3mL1mol/L盐酸(HCl)，再加入对醛基苯甲酸3.0g，缓慢滴加二甲基甲酰胺(DMF)至对醛基苯甲酸完全溶解，测试pH约为4.0，搅拌中加入1.0gAOZ，搅拌溶解，60℃下反应过夜。得到白色固体，离心弃上清并水洗3次，即得呋喃唑酮代谢物对醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)，避光保存。

称取23.4mg CPAOZ溶于2mL DMF，搅拌加入27.5mg的DCC，14.4mg的NHS，4℃反应过夜，4500r/min离心10min，取上清液标记为A液。取170mg的BSA溶于10mL0.1mol/L的PBS(pH8.0)缓冲溶液，加入1mL的DMF溶解，标记为B液。将A液逐滴加入到B液中，同时搅拌，4℃下密封反应4h。4500r/min下离心10min，取上清液，4℃下PBS(pH7.4)透析3d，每天换液2次。反应产物即为呋喃唑酮代谢物-牛血清蛋白偶联物(CPAOZ-BSA)，保存于-20℃冰箱备用。

采用同样方法制备呋喃西林代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃妥因代谢物-牛血清蛋白偶联物。

1.2包被原的制备

用卵清蛋白(OVA)替代牛血清蛋白(BSA)，采用同样方法制备硝基呋喃类代谢物-卵清蛋白偶联物。

2.抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体的制备

2.1抗血清的制备

取6～8周龄雌性Balb/c小鼠，将作为免疫原的CPAOZ-BSA偶联物与等体积的弗氏完全佐剂乳化，按100μg/只剂量皮下注射，之后每隔2周加强免疫1次，用不完全佐剂腹腔注射。融合前3d用不加佐剂的抗原强化免疫1次，剂量加倍。细胞融合按常规方法进行：将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1∶10的比例混合，在50％聚乙二醇作用下融合，HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中，37℃、5％CO₂培养箱中培养。

融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初筛选择50μg/L BSA包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRP(1∶1000)，OPD显色。筛选出的阳性孔再用CPAOZ-OVA偶联物包被的酶联板进行阻断间接ELISA。将细胞培养上清与2×10^-3mol/L CPAOZ溶液等量混合，37℃反应1h，加入已包被的酶标板中。另外用PBS(0.01mol/L、pH7.4)替代CPAOZ溶液作对照，其余步骤同上。若CPAOZ阻断后的OD值降至对照孔的50％以下，则判为阳性孔。经2～3次检测都呈阳性的孔，用有限稀释法进行克隆化。

2.2扩大培养

取6～8周龄Balb/c小鼠，腹腔注入0.5mL不完全弗氏佐剂。7～10d后接种0.5mL约2×10⁶个/mL数量的阳性杂交瘤细胞，同时接种相同数量的Sp2/0细胞，作为阴性对照。接种后7～10d可见小鼠腹部明显膨大，用注射器抽取腹水。3000r/min离心15min，弃去沉淀，收集上清。

采用同样方法制备抗AMOZ单克隆抗体、抗SEM单克隆抗体、抗AHD单克隆抗体。将四种单克隆抗体纯化后进行抗体蛋白质量浓度测定，分装、保存于-20℃冰箱中。

3.胶体金溶液的制备

在100mL去离子水中加入1mL1％柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入1mL1％氯金酸，继续煮沸10min，冷却后，4℃下保存备用。经试验筛选，测定该胶体金颗粒的粒径约为40nm。

4.金标抗体的制备

取已制备好的胶体金溶液100mL，用0.1mol/L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边分别加入2mg抗AOZ单克隆抗体，搅拌20min，逐滴加入2mL25mol/L聚乙二醇20000(PEG20000)，搅拌15min。20000rpm离心15min，弃上清液，加入10mL pH7.4的PBS缓冲液(含0.4mol/L PEG)清洗2次。将沉淀用10mL含2％BSA的PBS缓冲液(pH7.4)溶解，用0.22μm无菌过滤器过滤后，4℃保存备用，即为金标抗AOZ单克隆抗体。

采用同样方法制备金标抗AMOZ单克隆抗体、金标抗SEM单克隆抗体、金标抗AHD单克隆抗体。

5、硝基呋喃类代谢物免疫胶体金快速检测试剂板的组装

用点膜机把适当浓度的呋喃唑酮代谢物-卵清蛋白偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质控线，37℃烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的金标抗AOZ单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。检测试剂组成为一个PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。大卡组装完毕后，干燥箱内烘干。然后用切割机将贴好的大卡切割成3.84mm宽的条，即为呋喃唑酮代谢物试纸条。

采用同样方法制备呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因代谢物检测试纸条。

依次将AOZ、AMOZ、SEM和AHD试纸条装入塑料模板中制成检测试剂板，组装完毕后再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。

6.硝基呋喃类代谢物免疫胶体金快速检测试剂板检测实施操作方法

6.1样品前处理

取一定量的去脂肪组织样本，用剪刀剪碎，称取2g剪碎样本于50mL离心管中，并加入4mL去离子水，0.5mL1M的盐酸，0.1mL样本衍生化试剂，充分混合3min。60℃水浴条件下孵育1h，取出后加入5mL0.1M的磷酸氢二钾，0.4mL1M的氢氧化钠，6mL提取剂，充分混合1min，4000r/min离心5min。移取上层溶液3mL于5mL离心管中，65℃下空气吹干，向吹干的试管中加入1mL净化剂，加盖振荡1min，然后加入0.5mL复溶液，充分混匀，4000r/min离心1min(或静置至明显分层)，吸取0.4mL下层溶液，待检。

6.2检测步骤

水平放置检测板，用滴管分别吸取待检样品处理溶液100μL，滴加到加样孔中，加样后开始计时；结果应在3～5min读取，其他时间判读无效。

6.3结果判断

读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面。

阴性(一)：T线显色(检测线，靠近加样孔一端)比C线(对照线)深或一样深，表示样品中硝基呋喃代类谢物残留含量低于检测限或不含硝基呋喃类代谢物。

阳性(+)：T线显色比C线浅，或T线无显色，表示样品中硝基呋喃类代谢物残留含量等于或高于检测限，T线显色比C线越浅，表示样品中硝基呋喃类代谢物含量越高。

无效：未出现C线，可能是操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新的试剂板重新测试。

Claims

1.一种快速检测水产品中硝基呋喃类代谢物的胶体金试剂板，试剂板由上下两块塑料模板、呋喃唑酮代谢物试纸条、呋喃西林代谢物试纸条、呋喃它酮代谢物试纸条和呋喃妥因代谢物试纸条组成，每个试纸条背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫各部分之间有1～2mm的重叠。

2.根据权利要求1所述的试剂板，其特征在于硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次分别包被有相应的硝基呋喃类代谢物-卵清蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。

3.根据权利要求1所述的试剂板，其特征在于背衬为一面涂有不干胶的PVC板，样品垫由玻璃纤维制成，胶体金结合垫由聚酯膜制成，吸水垫为滤纸。

4.根据权利要求1所述的试剂板，其特征在于胶体金颗粒的平均大小为40nm。