CN202671546U - 苯丙酮尿症致病基因突变检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种苯丙酮尿症致病基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括包装盒体，包装盒体内的一侧设有口腔拭子，另一侧设有样本保存管、含有PCR扩增试剂的试管、含有PCR产物纯化试剂的试管和含DNA测序试剂的试管。本实用新型将样本采集、苯丙酮尿症致病基因突变位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便快捷，且成本更低。
Description
技术领域
本实用新型提供了一种苯丙酮尿症致病基因突变检测试剂盒，属于分子生物学技术领域。
背景技术
苯丙氨酸羟化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)基因定位于染色体12q22-24.2，全长约90kb，包括13个外显子和12个内含子。外显子长为1353bp的单链，mRNA翻译成含451个氨基酸的酶单体，单体聚合成有功能的PAH酶。PAH基因突变可导致肝脏苯丙氨酸羟化酶缺乏，苯丙氨酸不能正常转化为酪氨酸，从而在肝脏中代谢紊乱，导致患儿出现苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)。苯丙酮尿症是一种氨基酸代谢异常的常染色体隐性遗传病。在欧美地区的发病率为1/10000，在我国是1/16000，杂合子频率为1/50。
迄今已经发现PKU有440多种致病突变，国内仅发现30余种突变。PAH基因的突变大部分是错义突变，致病突变大多位于外显子或内含子与外显子的交接区，严重影响苯丙氨酸羟化酶基因转录和翻译及蛋白质的异常折叠、聚合，以及加速降解，从而影响苯丙氨酸羟化酶的催化活性。在不同种族和地区人群之间苯丙氨酸羟化酶基因座突变部位及分布具有较大差异。中国北方人群PAH最常见的突变是R243Q(22.1％)，其次是EX6-96A＞G、R111X、R413P和Y356X。而台湾PKU的发病率和突变图谱与大陆存在很大的差异，台湾中以轻型PKU为主，突变以R241C和R408Q最常见，发生率分别为32％和14％；其次是R243Q，其在台湾人群的发病率低于大陆人群的发病率。
发明内容
本实用新型的目的是提供一种检测苯丙酮尿症致病基因PAH是否发生突变的试剂盒。
为实现以上目的，本实用新型提供了一种苯丙酮尿症致病基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括包装盒体，包装盒体内的一侧设有口腔拭子，另一侧设有样本保存管、含有PCR扩增试剂的试管、含有PCR产物纯化试剂的试管和含DNA测序试剂的试管。
本实用新型将样本采集、苯丙酮尿症致病基因突变位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便快捷，且成本更低。本实用新型基于直接测序技术，可以对PCR产物直接进行DNA序列分析，明确突变位点，是现有基因突变检测方法中最直接最准确的方法，且可以实现机械化自动化，使测序工作更加简便快捷，结果判读更直观。
附图说明
图1为本实用新型提供的一种苯丙酮尿症致病基因突变检测试剂盒结构示意图；
图2为PAH基因第7号外显子实验无突变的结果示意图；
图3为PAH基因第7号外显子实验有突变的结果示意图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例
如图1所示，为本实用新型提供的一种苯丙酮尿症致病基因突变检测试剂盒的结构示意图，包括带盒盖的包装盒体1，包装盒体1靠近盒盖的一侧，即包装盒体1的后侧放置有口腔拭子2，前侧放置四个2×2排列的试管，分别是位于左后的样本保存管3、位于右后的含有PCR扩增试剂的试管4、位于左前的含有PCR产物纯化试剂的试管5和位于右前的含DNA测序试剂的试管6。
测试步骤如下：
步骤1：采集检测样品
用口腔拭子2在被测者口腔左右两腮分别各上下刮20次，保证采集到足量的细胞样本，采集完毕，样本保存于样本保存管3中。
步骤2：采用硅胶吸附法抽提样本的基因组DNA。
步骤3：PCR扩增
PCR扩增试剂(总体积为1ml)的成分包含：20mM Tris-HCL(PH8.0)、100mMKCL、500uM dNTPs、3mM MgCl2溶液、0.1U Taq DNA聚合酶/u1。
苯丙氨酸羟化酶(PAH)检测引物信息如下：
第1对引物扩增PAH外显子1
PAH-1F：cctcctgcgtcaggacaac；
PAH-1R：ttcgttggaagctgatgagaa。
第2对引物 扩增PAH外显子2
PAH-2F：ttgctttftccatggaggttt；
PAH-2R：acaggatctggaacaggcaga。
第3对引物 扩增PAH外显子3
PAH-3F：tgtgaactaactgccccacct；
PAH-3R：ttgctgttattttgcggaagc。
第4对引物 扩增PAH外显子4
PAH-4F：gggatccccacttctgatctc；
PAH-4R：aacaactctgccaactgcagg。
第5对引物 扩增PAH外显子5
PAH-5F：cccccattcaaagcattcata；
PAH-5R：cattcaagatttcaggccagc。
第6对引物 扩增PAH外显子6
PAH-6F：ccctttcatgtgggaaatcaa；
PAH-6R：gtgcttgtaggaatgcatgca。
第7对引物 扩增PAH外显子7
PAH-7F：atgtccctgggcagttatgtg；
PAH-7R：tgagaacaggaacaagtggca。
第8对引物 扩增PAH外显子8
PAH-8F：gggagcatgtccacaggaata；
PAH-8R：tatgatcccacctgaaatggg。
第9对引物 扩增PAH外显子9
PAH-9F：ggccacccatcacctttttat；
PAH-9R：gtagcccttgaaaacccttgg。
第10对引物 扩增PAH外显子10
PAH-10F：tcccttcatccagtcaaggtg；
PAH-10R：attccaaggctgacctatgca。
第11对引物 扩增PAH外显子11
PAH-11F：cagcatttgggctgtgatgta；
PAH-11R：cgttctctgttggaaggttgg。
第12对引物 扩增PAH外显子12
PAH-12F：accctgctctagggaggtgtc；
PAH-12R：cctctccatcccttctacgct。
第13对引物 扩增PAH外显子13
PAH-13F：agcccacttatcccctagtgc；
PAH-13R：atttgggacctgcttcattca。
然后在ABI9700型PCR扩增仪上进行检测，分为13个反应孔，每个反应孔分别放入上述13对PAH引物，每对正反向引物各0.5ul(引物浓度为10umol/L)，各加入检测样品2ul，PCR反应液7.5ul，去离子水4.5ul，反应孔总体积15ul。
反应条件为95℃预热10分钟；再进行35个循环的95℃、45秒，60℃、45秒，72℃、60秒；72℃、7分钟后，降温至4℃。
步骤4：PCR产物纯化
每一个反应孔反应体系总体积为7ul，由PCR产物纯化试剂4ul和PCR产物3ul组成。反应条件为：37℃、60分钟；80℃、15分钟。
步骤5：DNA测序反应
每一个反应孔反应体系总体积为5ul，由PCR纯化产物1ul、DNA测序试剂1ul、测序引物1ul和去离子水2ul组成。反应条件为：96℃2分钟；25个循环的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分钟；60℃、4分钟。
反应结束后每管加入1ul 125mM乙二胺四乙酸EDTA和无水乙醇15ul，室温沉淀15分钟；3650转/分，4℃离心30分钟，轻轻倒去上清液；每孔加30ul 70％乙醇，3650转/分，4℃离心15分钟，倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8ul，上测序仪。
步骤4：结果分析
在测序仪上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果。
1.未检出突变：未发现PAH基因存在突变；
2.检出突变：发现PAH基因第7外显子上存在突变。
在测序仪上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果。若PAH基因无突变，则分析结果如图2所示；若PAH基因第7号外显子存在突变，则分析结果如图3所示。
Claims (1)
1.苯丙酮尿症致病基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括包装盒体(1)，包装盒体(1)内的一侧设有口腔拭子(2)，另一侧设有样本保存管(3)、含有PCR扩增试剂的试管(4)、含有PCR产物纯化试剂的试管(5)和含DNA测序试剂的试管(6)。
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| CN 201220306857 CN202671546U (zh) | 2012-06-27 | 2012-06-27 | 苯丙酮尿症致病基因突变检测试剂盒 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106841427A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-06-13 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种检测pku和cah的串联质谱试剂盒制备及其应用 |
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2012
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN106841427A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-06-13 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种检测pku和cah的串联质谱试剂盒制备及其应用 |
| CN106841427B (zh) * | 2016-12-30 | 2019-05-14 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种检测pku和cah的串联质谱试剂盒 |
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