CN1995346A

CN1995346A - 水稻木质素合成基因fc1及应用

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Publication number: CN1995346A
Application number: CNA2006100181055A
Authority: CN
Inventors: 吴昌银; 李向俊; 张启发
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2006-01-05
Filing date: 2006-01-05
Publication date: 2007-07-11
Anticipated expiration: 2026-01-05
Also published as: CN100451118C

Abstract

本发明公开了水稻木质素合成基因FC1及应用。本发明利用T－DNA标签技术从水稻软秆突变体中克隆并鉴定了控制水稻木质素合成基因FC1，通过共分离检测表明T－DNA插入失活的基因与软杆突变表型是共分离的。对该基因编码的氨基酸序列分析证明该基因所编码的蛋白是一个肉桂醛脱氢酶，该酶在植物木质素的合成过程中起重要的作用。本发明克隆的基因具有调控植物厚壁组织细胞壁的厚度和植株茎秆的支撑力的功能。本发明还在利用基因工程技术有目的地提高农作物的抗倒伏、抗逆和抗病虫害能力；改善木本植物的材质；提高秸秆资源的利用率等方面具有广泛的应用价值。

Description

水稻木质素合成基因FC1及应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及一种水稻木质素合成基因FC1，同时还涉及该基因在水稻中的应用。利用T-DNA标签(T-DNA tagging)技术从水稻软秆突变体中克隆并鉴定了水稻木质素合成基因FC1(flexible culm)，该基因的失活造成植物茎杆强度的降低，出现易倒伏的性状。通过共分离检测表明T-DNA插入失活的基因与软秆突变表型是共分离的。对该基因编码的氨基酸序列分析证明该基因所编码的蛋白是一个肉桂醛脱氢酶(Cinnamyl-alcoholdehydrogenase，CAD)，这个酶在植物木质素的合成过程中起重要的作用。形态学观察和细胞学观察进一步证明，本发明克隆的基因具有调控植物细胞壁的厚度和植株茎秆的支撑力的功能。利用该基因可以提高农作物的抗倒伏能力，提高水稻秸秆的利用率。

背景技术

植株茎秆的强度是植物，尤其是农作物的重要农艺性状之一。而茎秆的强度又与茎秆组织中相关细胞的细胞壁厚度直接相关。细胞壁的主要成分包括果胶质、纤维素、半纤维素、木质素、多糖以及含羟脯氨酸的糖蛋白。植物细胞壁可以分为中胶层(胞间层)、初生壁和次生壁。中胶层粘合相邻的细胞，主要由果胶质构成。初生壁是最先形成的细胞壁，正在生长的细胞主要以初生壁保护和支撑它的原生质体。次生壁是在细胞生长完成后沉积而成的，它能增强细胞的强度，是茎杆强度的主要决定成分。次生壁主要由木质素填充，其机械强度较高。木质素是包围在纤维组织细胞和厚壁组织细胞外的一类物质。它与纤维素和半纤维素合称为组成植物的“三素”。在木本植物中它的含量占大约27％-32％，草本植物中大约占14％-25％。

木质素在植物中的功能主要有以下几个方面：1)增加细胞壁的机械强度和防水性。植物在木质化时，木质素不仅可以以共价键的方式与细胞壁中的半纤维素相接，还可以同样的方式和细胞壁蛋白相连，从而增加了细胞壁的强度和致密度；2)促进水分的运输。由于有木质素的参与植物细胞经分化才能形成正常的微管系统，才能产生坚实的细胞壁，才能在有压力的情况下远距离输送水份；3)在植物防御体系中发挥重要作用。木质素保护了细胞内其他重要的成份，以免受到物理的、化学的和生物的破坏。同时木质素的低分子量酚类前体以及多聚作用时产生的游离自由基可以破坏细菌的膜、酶和毒素，可以作为植物防卫反应的物质来起作用(付伟等，植物体内的木质素，生物学通报，2004，39：12-14)。

在木质素的合成过程中，很多酶参与了该生化途径。木质素是由香豆醇、松柏醇和介子醇等三种主要的木质醇(monolignol)以多种不同的化学键连接而成的。木质素前体(木质醇)的生物合成是从苯丙氨酸开始的。苯丙氨酸通过苯丙氨酸裂解酶脱氨(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)生成肉桂酸，这是苯基丙烷类物质代谢的第一步，PAL是生物合成苯基丙烷类类化合物的一种关键酶。肉桂酸被4-羟化酶(C4H)羟基化后形成对香豆酸。对香豆酸在4-香豆酰辅酶A连接酶(4-Coumsrate-CoA Ligase，4CL)的作用下可转化为对香豆酰辅酶A。这种化合物是合成类黄酮、1，2-二苯乙烯和其他苯基丙烷类物质(包括木质素)的前体。对香豆酸在肉桂酸-3羟化酶(cinnamate 3-hdroxylase，C3H)的作用下，3位被羟基化生成咖啡酸，该羟基基团在O-甲基转移酶(caffeateO-methyl transferase，COMT)的作用下可进一步被甲基化生成阿魏酸。阿魏酸在阿魏酸5-羟化酶(ferulate 5-hydroxylase，F5H)的作用下被羟基化形成5-羟基阿魏酸，5-羟基阿魏酸中5位的羟基被COMT甲基化后形成芥子酸。羟基肉桂酸可被合成位相应的辅酶A硫酯。CoA硫酯在肉桂酰辅酶A还原酶的催化作用下被还原为相应的醛。这些醛与肉桂醛脱氢酶(Cinnamyl-alcohol dehydrogenase，CAD)反应被进一步还原形成木质醇，木质醇就是木质素的直接前体物质。

肉桂醛脱氢酶(CAD)在植物木质素的合成过程中起很重要的作用，它催化木质素前体-木质醇生物合成的最后一步，同时在植物抵抗真菌浸染中也起重要的作用。植物一般通过产生各种酚类物质来抵抗由于机械、化学以及病原诱导的损伤，这些酚类物质也包括通过各种生化反应从肉桂酸中得到的木质素合成的前体物质。因此这些木质素合成的前体物质很自然的就被植物用来合成酚类大分子，这些酚类大分子通过产生一个疏水的物理屏障来抵御病原入侵和增强损伤组织的机械强度(Vance等，Lignification as a mechanism of disease resistance.AnnuRev Phytopathol.1980，18：259-288)。由于木质素在植物细胞壁的结构和修复机制上起很重要的作用，因此人们希望通过基因工程的方法改善木质素的含量。例如，在造纸业制浆过程中通过化学的方法除去纸浆中的木质素的过程是很昂贵的，而且会对环境产生严重的污染，因此对植物木质素的含量的改善可以使造纸工业受益很多(Boudet等，Lignin genetic engineering.Mol Breeding.1996，2：25-39；Campbell等，Variation in Lignin Content and Composition(Mechanisms of Controland Implications for the Genetic Improvement of Plants).Plant Physiol.1996，110：3-13)。再例如，在大豆种子的储存过程中，木质素单体通常会被多酚氧化酶氧化，从而使大豆和豆制品中混入比较难看的黄色。而这个现象也许就可以通过降低CAD酶的活性得到解决。

通过调节植物体中CAD酶的含量来改变植物体内木质素的含量，已经进行了很多有益的尝试。例如在烟草中进行CAD的反义表达，虽然没有使木质素含量减少，但却可导致木质素中结合的肉桂醛的量增加(Halpin等，Manipulation oflignin quality by down-regulation of cinnamyyl alcohol-dehydrogenase.Plant J.1994，6，339-350.)，并使这些转基因植物的木质部呈红色，而且其中的木质素在温和的碱性条件下很容易被提取。分光光度分析表明，来自CAD缺乏烟草中木质素的缩合程度降低，即交联部位较少(Stewart等，Fourier-transforminfrared and Raman spectroscopic evidence for the incorporation ofcinnamaldehydes into the lignin of transgenic tobacco(Nicotiana tabacumL)plants with reduced expression of cinnamyl alcohol dehydrogenase，Planta，1997，201，311-318.)，这对提高植物组织的消化性有很大的作用(Vailhe等，Cell wall degradability of transgenic tobacco stems inrelation to their chemical extraction and lignin quality，J.Agric.FoodChem.1996，44，1164-1169.)。也有研究表明下调紫花苜蓿CAD可以导致木质素组成发生相似的变化，消化性提高。

这里所描述的肉桂醛脱氢酶基因属于一个基因家族，因此通过同源序列可以找到来源不同物种的肉桂醛脱氢酶基因。现在人们对在木质素合成过程中起作用的基因有很大的兴趣，因为这些基因可能可以用来控制木质素的合成。因此，找到编码在木质素合成中起作用的酶的核苷酸序列，对研究木质素的合成是很重要的，同时这也提供了一种利用遗传学的手段来研究木质素的合成以及控制细胞壁结构的机制，而且还可以更好地理解植物自身防御和修复损伤的机制。

水稻(Oryza sativa)是最重要的粮食作物之一，是全球近一半人口赖以生存的基本食粮，在我国有很大的种植面积。FC1基因的克隆为我们利用基因工程技术调控植物的抗逆能力，提高水稻秸秆的利用效率方面有很大的作用。同时在相关领域，如林业、造纸方面也会起到很多积极的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻木质素合成基因FC1，有效地提高了水稻的抗倒伏能力，提高了水稻秸秆的利用效率。本发明提供了FC1基因的核苷酸序列和氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1所示的DNA序列，也包括与SEQ ID NO：1所示的DNA序列至少有50％同源性的基因序列；也包括在添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的突变体等位基因或衍生物，还含具有相同功能并能达到本发明目的的基因序列。本发明中的SEQ ID NO：2所示的蛋白质属於肉桂醛脱氢酶，其中进行一个或几个氨基酸的替换、插入或缺失氨基酸可以获得功能类似物。该基因的失活可以导致植物茎杆强度的降低，出现易倒伏的性状。该基因为调节植物茎杆的机械强度、提高禾本科植物的秸秆利用率提供了一个有用的技术途径。

本发明还涉及一种水稻木质素合成基因FC1在调节水稻茎杆强度中的应用，这种调节的方法可以是通过提高或者是降低FC1的表达。

本发明还提供了一种用FC1基因进行高效植物遗传转化的方法。具体地说，本发明提供了一种含有SEQ ID NO：1所示序列的基因或该基因的部分类似功能片段的载体，其中pCFC1，该载体可以表达由上述核酸序列编码的多肽或同源类似物。本发明还提供了一种含有以上表达载体的宿主细胞，宿主细胞包括大肠杆菌、农杆菌和植物细胞。

将本发明所描述的基因失活可以得到茎杆软化的水稻，可以降低其中的木质素含量，而且可以提高秸秆利用率，此方法切实可行。具体应用可以使用T-DNA插入的方法，或者使用其他使基因失活的方法，如基因敲除等。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：

本发明是使用T-DNA标签的技术进行基因的分离和克隆。使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化(Hiei等，Efficient transformationof rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries ofthe T-DNA.Plant J.1994，6：271-282)得到了大量的有T-DNA插入标签的水稻粳稻品种中花11号株系，转化使用的载体是pFX-E24.2-R15(Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome.Plant J.2003，35：418-27.)，本文所述的突变体就是在这个突变体库中通过筛选得到的。筛选方法如下所述，T-DNA转化植株当代为T₀代，由T₀代种子经过浸种、催芽后得到T₁代植株，将此T₁植株按5寸×8寸的间距种植于水稻田，按常规的水稻种植方法(王维金等，作物栽培学，1998，76-127)进行田间管理。通过观察筛选得到了表型稳定的水稻软秆突变体，将此突变体命名为fc1，该突变体与正常植株相比茎杆、叶片机械强度降低，植株略矮，并且容易倒伏，如图1所示。遗传学实验表明fc1是一个符合单基因控制遗传规律的隐性突变体。

采用TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)(Liu等，Thermalasymmetric interlaced PCR：Automatable amplification and sequencing of insert endfragments from P1 and YAC clones for chromosome walking.Genomics 1995，25，674-681.)的方法分离得到了这个株系的侧翼序列，进行序列分析表明该株系的T-DNA插入在水稻第4染色体上，插入位点所在片断在公共核苷酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的登陆号为AL731610.4，日本晴BAC克隆OSJNBa0022K06含有AL731610.4的部分核苷酸片断。通过序列分析发现，这个T-DNA的插入造成了一个木质素合成基因肉桂醛脱氢酶(CAD)基因内。根据分离得到的侧翼序列在基因组中设计引物，所设计的引物位于T-DNA插入位点两侧，通过PCR(polymerase chain reaction)检测验证了这个T-DNA序列的插入和突变表型是共分离的，从而确定了就是这个基因的失活造成了这种突变表型的出现。

本发明的优点有：FC1基因具有影响植物茎秆机械强度的功能，因此它的发现使得应用基因工程技术调控植物茎秆的支撑力、叶片、叶鞘细胞壁的厚度成为可能，而且对调控植物的抗逆能力，提高水稻秸秆的利用效率方面有很大的作用。同时在相关领域，如林业、造纸方面也会起到很多积极的作用。

附图说明

图1.水稻软秆突变体fc1的表型图。左边是野生型，右边是突变体。

图2.插入基因的结构和T-DNA插入位点分析图。起始密码(ATG)和终止密码(TGA)已经标出，黑色方框表示FC1基因的编码区，白色方框表示了5’非翻译区和3’非翻译区。方框之间的线条表示内含子，T-DNA插入在第一个内含子内。a，b，c分别表示用来验证共分离的引物。

图3.检测基因型的结构示意图。a表示在T-DNA插入位点上游设计的引物，b表示在插入位点T-DNA下游设计的引物，c表示根据T-DNA末端序列设计的引物。在T1代植株中，若为T-DNA插入位点纯合单株，由于T-DNA片段为10Kb以上，因此a与b配对的PCR扩增为阴性，但a和c配对可以扩增得到一个0.8Kb的产物。若扩增位点为没有T-DNA的插入的野生型单株，由于没有c引物结合的位点，则只有a和b配对是可以得到一个1.0kb的产物。而对于T-DNA插入位点杂合单株，则在a和c配对以及a和b配对时都可以扩增得到产物。

图4.20株T1代植株的PCR检测T-DNA插入位点基因型结果图。根据PCR扩增结果，判断1、3、7、8、13、16是T-DNA插入位点纯合单株，2、4、6、9、10、12、14、18、19、20是T-DNA插入位点杂合单株，5、11、15、17是野生型单株。

图5.突变体的形态与结构特性图。fc1突变体和野生型的株高和含水量测定。图5a：株高测定，突变体与对照相比矮化大约30厘米。图5b：含水量测定，突变体的含水量和野生型相比提高8.6％。

图6.fc1突变体与野生型木质素染色结果图，使用间苯三酚染色，显微镜下放大400倍观察结果。图6a.突变体茎杆横切，图6b.野生型茎杆横切，图6c.突变体叶片横切，图6d.野生型叶片横切。

图7.fc1突变体与野生型茎杆机械强度测定结果图，突变体茎杆第一节间的平均折断力为22N，野生型茎杆第一节间的平均折断力为105N。

图8.互补试验使用的载体pCFC1示意图。使用限制性内切酶HindIII从BAC克隆OSJNBa0022K06上切下一个8.8 kb的核酸片段，这个核酸片段包含完整的FC1基因ORF区。

具体实施方式

实施例1：

1、水稻材料

水稻(Oryza sativa)T-DNA插入突变体fc1(flexible culm)来自原始野生型材料为“中花11”粳稻品种。此突变体的获得是通过农杆菌介导的遗传转化得到了大量的有T-DNA插入标签的中花11号株系，转化使用的载体是pFX-E24.2-R15(Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the ricegenome.Plant J.2003，35(3)：418-27)，本文所述的突变体就是在这个突变体库中通过筛选得到的。筛选方法如下所述，转化植株当代为T₀代，T₀代植株种子经过浸种、催芽后得到T₁代植株，将此T₁植株5寸×8寸的间距种植于水稻田，按常规的水稻种植方法进行田间管理。通过筛选得到了表型稳定的水稻软秆突变体(fc1)，该突变体与正常植株相比茎杆、叶片机械强度降低，植株变矮，并且容易倒伏。

2、T-DNA插入侧翼序列的分离

使用TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)的方法分离得到了这个突变体的T-DNA侧翼序列。具体操作步骤如下：取fc1突变体幼嫩的叶片，使用CTAB法(Liu等，A genome-wide arnalysis of wide compatibility in rice and preciselocation of s5 locus in the molecular map.TAG，1997，95：809-814)抽提其总DNA，然后进行PCR反应。根据转化载体pFX-E24.2-R15的T-DNA左侧末端设计的嵌套式特异引物序列和引物在载体上对应的位置如下：(后面的数字表示引物在载体上的位置)

LSP2：5’-GAA GTA CTC GCC GATAGT GGA AAC C-3’6701-6677；

LBT2：5’-ATA GGG TTT CGC TCA TGT GTT GAG CAT-3’6550-6524；

LBT3：5’-CCA GTA CTA AAA TCC AGA TCC CCC GAAT-3’6447-6420。

用于分离侧翼序列的简并引物及其序列为：

AD2a：5’-(AGCT)GT CGA(GC)(AT)G A(AGCT)A(AT)GA A-3’。

反应体系为：

第一轮：

DNA模板 1.0μl；

10×PCR buffer 2.0μl；

2mM dNTP 2.0μl；

25mM MgCl₂ 2.0μl；

10μM LSP2 0.2μl；

100μM AD2a 0.2μl；

Taq酶(rTaq，Takara公司) 1U；

加ddH₂O至 20μl。

第二轮：

DNA模板 1.0μl；

10×PCR buffer 2.0μl；

2mMdNTP 2.0μl；

25mM MgCl₂ 2.0μl；

50％甘油 2.0μl；

10μM LBT2 0.2μl；

100μM AD2a 0.2μl；

Taq酶(rTaq，Takara公司)1U；

加ddH₂O至 20μl。

第三轮：

DNA模板 1.0μl；

10×PCR buffer 2.0μl；

2Mm dNTP 1.5μl；

25Mm MgCl₂ 1.2μl；

50％甘油 2.0μl；

10μM LBT3 0.2μl；

100μM AD2a 0.2μl；

Taq酶(rTaq，Takara公司) 1U；

加ddH₂O至 20μl。

反应程序按照Liu的方法进行(Liu等，Thermal asymmetric interlaced PCR：Automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YACclones for chromosome walking.Genomics 1995，25，674-681.)。反应完成后，取第三轮反应产物5μl在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳检测。挑出有有效扩增的剩余产物5μl用去磷酸化酶(SAP，Takara公司)和核酸外切酶(ExoI，NEB公司)消化，消化产物取2μl使用美国Perkin Elmer公司的测序试剂盒(Big Dye Kit)进行测序反应，反应产物使用DNA自动测序仪进行序列测定(ABI377Sequencher)，测序引物序列和在载体上的位置为：NTLB5 5’-AAT CCA GAT CCCCCGAATTA-3’6437-6418，具体操作按操作手册进行(PE公司)。得到序列后，采用BLAST分析方法(Altschul等，Gapped BLAST and PSI-BLAST：a newgeneration of protein database search programs.Nucleic Acids Res.1997，25：3389-3402)将这条侧翼序列与公共核苷酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中已知染色体位置的水稻基因组序列进行比较分析，定位结果发现这条侧翼序列定位于水稻4号染色体，位于GenBank中的登陆号为AL731610.4的克隆中，插入位点是87249，日本晴BAC克隆OSJNBa0022K06含有AL731610.4的部分核苷酸片断，通过序列分析发现，这个T-DNA的插入造成了一个木质素合成基因肉桂醛脱氢酶(CAD)基因的失活。

分离得到的侧翼序列如下：

tacgtgccattccgaatcaaagcgagccgcaatgtgtattagagttgtct

aagcgtcatatggggtttacaccacattactagcattttactgagcctta

accttttagcagaactgcagtggttattacttcagcattgagagttcaga

ctctcaagtacacaagaagagagagcctaaacaccttgcttcacctccca

agattttaactaagccatgaactggtagaactgaaatttttcttttattt

tgctttccctttggttctccattatgactagcaaaaacaccgtatccagc

agggccatcagggtacatttgcttacgctgatgaggtggagcgtatgcca

tgccattgggtgctagttgtgacgttccgtttggcattacaaaaatacct

gctggcactgggcaaatagcgtgaatgctggattgcttggaatagttatg

aacaggccactggaggcaacatattatggagagaaaccatggtcgatatt

ggcaacgccgttttggataatggcaaattcatgctgggggtacttttggg

gggcactggggtgctcgagttgttgctgttaacagaaatgtgtctta

3、T-DNA插入侧翼序列与突变表型的共分离检测。

为了研究T-DNA的遗传分离，将T-DNA标记的水稻T₁代植株进行田间种植，并且进行了基因型的检测。从总共20株T₁代的幼嫩叶中提取的基因组DNA(CTAB法)用作基因型分析，以确定它们为纯合或杂合体。PCR反应条件：先94℃3分钟变性，然后94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1.5分钟，总共进行35个循环，最后72℃7分钟延伸。下述引物a、b和c用于PCR反应。

引物a(FC1基因特异性基因组正向引物)：

5’-GCGACCATTCTGGCTGTGAT-3’

引物b(FC1基因特异性基因组反向引物)：

5’-AACCTGAAACGGCGGTAGTG-3’

引物c(T-DNA边缘特异性反向引物)：

5’-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3’

如图2的示意图所示，引物a是来源于FC1基因内含子的正向引物，引物b是来源于FC1基因内含子的反向引物。引物c是来源于T-DNA边界区域的反向引物。T₁代纯合植株只有引物a和c组合可以得到一个0.8kb的PCR片段，这是因为通过引物a和b组合扩增由于片段太大而不能扩增DNA片段(14.3kb)(图3)。野生型植株由于在基因组中没有T-DNA插入，因此能够利用引物a和b的组合来得到一个1.0kb的PCR片段，而不能有引物a和c组合的PCR片段。杂合的T₁代植物则可以分别通过ac和ab的组合来得到0.8kb和1.0kb的PCR扩增物。

实验结果如图4所示。在基因型的检测中发现，泳道1、3、7、8、13、16是T-DNA插入位点纯合基因型单株，而泳道2、4、6、9、10、12、14、18、19、20为T-DNA插入位点杂合基因型单株，5、11、15、17为该位点不含T-DNA插入的野生型单株。在进行田间种植时发现，T-DNA插入位点纯合单株，也就是1、3、7、8、13、16这几个单株在田间出现了半矮、易倒伏的田间表型，而其他的植株都表现出正常的表型。这个结果证明T-DNA插入与突变表型共分离，而且突变体是由于这个T-DNA插入造成的单位点隐性突变。

将T₁代植株的子代种植得到T₂代，将T₂代再次种植到田间进行表型与T-DNA共分离的分析，分析发现T₁代T-DNA插入位点纯合突变体的子代(T₂代)不再分离，表型一致，T₁代T-DNA插入位点杂合突变体的子代(T₂代)出现了正常植株和突变植株，正常植株和突变植株的比例是3∶1，使用同样的方法进行PCR检测，检测结果表明T-DNA的插入与突变表型仍然是共分离的。由此确证，这个突变体是由于这个T-DNA插入造成的单位点隐性突变。

4、对fc1突变体的表型分析。

在正常田间种植条件下，fc1突变体与野生型相比，株型略矮，叶片与茎杆的机械强度也降低了(图1)。在水稻成熟期对株高进行测定，发现突变体比野生型矮约30厘米。对突变体和对照的含水量进行测定发现，突变体的含水量和野生型相比提高8.6％(图5)。含水量的具体测定方法如下：将突变体和对照于正常田间条件进行种植，待生长到成熟期，取突变体和对照的茎杆活体秤其鲜重M1，然后把茎杆放于烘箱中于80℃烘至衡重，然后再秤其干重M2，(M1-M2)/M1则为植株的含水量。

通过对突变体和野生型植株的组织切片表明，和野生型相比，在突变体的外皮层厚壁组织细胞中，木质素的含量出现了显著的降低，而且厚壁组织细胞的加厚不如野生型那样多，因此导致突变体的茎杆机械强度比野生型有显著的降低。在叶片中也出现了类似的情况，突变体的木质素着色较少(图6)，使突变体的叶片比野生型明显要软。染色方法使用间苯三酚进行木质素染色，间苯三酚主要对木质素中的醛类物质特异性染色，反应中染色的深浅一般定性地反映木质化部位的木质素总含量。具体操作如下，取突变体和野生型植株的第二节的节间，使用FAA固定液固定24小时，然后对固定的组织进行徒手切片，得到大约20μm厚的切片，将切片使用2％的间苯三酚溶液染色2分钟，然后在玻片上加入一滴浓盐酸进行显色1分钟，然后于光学显微镜(Olympus，Japan)下放大400倍进行观察。

使用微力材料试验机(Instron 5848 Microforce Tester)对突变体和对照的机械强度进行了测定，测定时分别取突变体和对照的主茎的第一节，从第一节上截取5cm长的一段，使用微力材料试验机的夹具夹住材料的两端，然后进行拉伸，读取将试验材料拉断所需要的力。测定结果发现，突变体的茎杆机械强度与对照相比有很显著的降低(图7)。

5、基因的分析。

根据BLAST(Altschul等，Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generationof protein database search programs.Nucleic Acids Res.1997，25：3389-3402)分析结果，发现FC1基因编码的蛋白质与肉桂醛脱氢酶(CAD)有60％同源性。将这个基因的序列在日本全长cDNA文库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中进行搜索，找到了这个基因的全长cDNA，克隆编号是AK102452，这个全长cDNA有1329bp，功能预测是一个肉桂醛脱氢酶(CAD)基因。这个全长cDNA的序列如下：

GGCATAGACCTAGCCAGCTAGCAACCGACAAGCCAAGGCGACGGCAATGGCGCCGACGAC

GACGGCCACGGCGGCGGCGGAGCAGGCGCCGCCGCCGCAGCATACGAGGAAGGCGGTGGG

GCTCGCCGCGCACGACGACTCCGGCCACCTCACACCCATCCGCATCTCGCGCAGGAAAAC

TGGAGATGACGACGTCGCTATAAAGGTGCTGTACTGTGGGATTTGTCACTCTGACCTGCA

CACCATCAAGAATGAGTGGAGAAACGCTGTCTACCCAGTTGTTGCAGGGCACGAGATCAC

CGGGGTGGTGACCGAGGTGGGGAAGAACGTGGCGAGGTTCAAGGCCGGCGACGAGGTCGG

CGTCGGGTGCATCGTGAACACCTGCGGCGGCTGCGAGAGCTGCCGGGACGGCTGCGAGAA

CTACTGCTCCGGCGGGGTCGTCTTCACCTACAACTCCGTCGACCGGGACGGCACGCGCAC

CTACGGCGGCTACTCCGACGCGGTGGTCGTCAGCCAGCGCTTCGTCGTGCGCTTCCCCTC

CTCCGCCGGCGGCGGCGCCGGCGCCGCGCTGCCGCTGGACAGCGGCGCGCCGCTGCTGTG

CGCCGGGGTGACGGTGTACGCGCCGATGAGGCAGCATGGGCTGTGCGAGGCCGGGAAGCA

CGTCGGCGTGGTGGGGCTCGGCGGGCTCGGCCACGTCGCCGTCAAGTTCGCCAGGGCGTT

CGGGATGAGGGTGACGGTGATCAGCACGTCGCCGGTGAAGAGGCAGGAGGCCCTGGAGAG

GCTCGGCGCCGACGGCTTCATCGTCAGCACCAACGCCAGTGAGATGAAGGCTGCGATGGG

CACCATGCATGGCATCATCAACACGGCCTCTGCAAGCACATCCATGCACTCTTACCTGGC

ACTCTTGAAGCCCAAGGGCAAGATGATCTTGGTTGGCCTGCCTGAGAAGCCTCTCCAGAT

CCCAACCTTCGCTTTGGTTGGAGGGGGCAAGATACTAGCTGGGAGCTGCATGGGGAGCAT

CAGTGAAACGCAGGAGATGATCGACTTCGCCGCCGAGCACGGGGTGGCCGCCGACATCGA

GCTGATCGGCGCCGACGAGGTGAACACGGCCATGGAGCGCCTCGCCAAGGGCGACGTCAG

GTACCGCTTCGTCGTCGACATCGGCAACACCCTCAGGTCGGATTGACTAGGGAGCTCACT

GTCACTGGTCTCAGCTCTGTAGCATACCGGACCTGCAATCCTGCAAAGTAGTGCAATCTT

CTTGCTACAAGACATACATATCACCTCTACTTGGTGTCAATAAATGTAGCAAAAGAGGTA

CATTGTTGT

实施例2 转化植物(水稻为例)

提取日本晴BAC克隆OSJNBa0022K06质粒5μg，使用限制性内切酶HindIII(Takara公司)完全消化质粒，将酶切产物使用0.8％琼脂糖凝胶电泳(40V，10小时)，挖取8.8kb的DNA片断回收。取回收产物100ng，与经过限制性内切酶HindIII(Takara公司)消化过的双元载体pCABIA2301(http://www.cambia.org)50ng使用T4 DNA连接酶(NEB公司)于16℃进行连接反应，pCAMBIA2301载体由澳大利亚CAMBIA实验室(Center for the Application of Molecular Biology toIntemational Agriculture)惠赠。反应进行16小时后，取连接产物2μl电转化大肠杆菌(E.Coli)感受态细胞DH10B(购自美国Invitrogen公司)，转化产物进行兰白斑筛选。挑取白色转化子，使用FC1基因特异的引物a和b组合进行PCR阳性克隆的筛选，PCR反应条件：先94℃5分钟变性，然后94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1.5分钟，总共进行35个循环，最后72℃7分钟延伸。获得了用于转化的质粒pCFC1(图7)，这个核酸片段包含完整的FC1基因ORF区，将这个质粒20ng通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中，使用农杆菌介导的遗传转化方法转化fc1突变体(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryzasativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of theT-DNA.Plant J，1994，6：271-282)的愈伤组织，同时将不含FC1基因的空载体转化FC1突变体愈伤组织，得到的转基因植株作为对照。

本发明共获得独立的转FC1基因水稻植株60株，PCR检测阳性植株为51株，转空载体的转基因植株32株。结果转空载体的转基因植株全部表现为软杆，而阳性的转FC1基因水稻植株有41株表型恢复了正常，而阴性的转FC1基因水稻植株仍然表现为软杆，部分转基因茎杆机械强度测定的结果见表2。由此可见，通过基因互补转化，FC1基因使FC1突变体的软杆表型得到了恢复，更进一步的证明了FC1基因具有控制水稻茎杆强度的功能。

农杆菌介导的遗传转化步骤和试剂如下：

(1)试剂和溶液缩写

6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；G418(卡拉霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS小量成分溶液)

(2)组织培养的溶液配方

1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]

硝酸钾(KNO₃) 28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄) 4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 1.66g

逐一溶解，然后20-25℃下定容至1000ml。

2)N6mix母液[100倍浓缩液(100X)]

碘化钾(KI) 0.08g

硼酸(H₃BO₃) 0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.15g

20-25℃下下溶解并定容至1000ml。

3)Fe₂EDTA贮存液(100X)

在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g

在另一个大三角瓶中加/入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73g

在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)

烟酸(Nicotinic acid) 0.1g

维生素B1(Thiamine HCl) 0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1g

甘氨酸(Glycine) 0.2g

肌醇(Inositol) 10g

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MSmax母液(10X)

硝酸铵(NH₄NO₃) 16.5g

硝酸钾 19.0g

磷酸二氢钾 1.7g

硫酸镁 3.7g

氯化钙 4.4g

20-25℃下溶解并定容至1000ml。

6)MSmix母液(100X)

碘化钾 0.083g

硼酸 0.62g

硫酸锰 0.86g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.0025g

20-25℃下溶解并定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)

2，4-D 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，20-25℃下保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)

6-BA 100mg.

9)NAA贮存液(1mg/ml)

NAA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)IAA贮存液(1mg/ml)

IAA 100mg.

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)

葡萄糖 125g

蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液

AS 0.392g

DMSO 10ml

分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

氢氧化钾 5.6g

蒸馏水溶解定容至100ml，20-25℃下保存备用。

14)KT贮存液(1mg/ml)

KT 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃下保存。

(3)培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.5ml

脯氨酸(Proline) 0.3g

CH 0.6g

蔗糖(Sucrose) 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.0ml

脯氨酸 0.5g

CH 0.6g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

3)预培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6mix母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.15g

蔗糖 5g

琼脂粉(Agarose) 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6mix母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.2g

蔗糖 5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X) 5ml

N6mix母液(100X) 0.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 0.5ml

维生素贮存液(100X) 1ml

2，4-D贮存液 0.2ml

CH 0.08g

蔗糖 2g

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6mix母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.625ml

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的抗生素G-418(Sulfate)和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6mix母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

6-BA贮存液 0.5ml

KT贮存液 0.5ml

NAA贮存液 50μl

IAA贮存液 50μl

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。

8)分化培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

6-BA贮存液 2ml

KT贮存液 2ml

NAA贮存液 0.2ml

IAA贮存液 0.2ml

CH 1g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X) 50ml

MSmix母液(100X) 5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 5ml

维生素贮存液(100X) 5ml

蔗糖 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

10)LA培养基(LB培养基不含琼脂粉)

蛋白胨 2.5g

酵母粉 1.25g

氯化钠 2.5g

琼脂粉 3.2g

蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后20-25℃保存备用。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

4.1愈伤诱导

(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)15分钟；

(2)灭菌水洗种子4-5次；

(3)将种子放在诱导培养基上；

(4)置于黑暗处培养4周，温度24-26℃。

4.2愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度24-26℃。

4.3预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度24-26℃。

4.4农杆菌培养

(1)在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105两天，温度28℃；

(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

4.5农杆菌侵染

(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

(2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

4.6愈伤洗涤和选择培养

(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

(2)浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；

(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(G418筛选浓度为50μm)

4.7分化

(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；

(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养(2000 1x)，温度26℃。

4.8生根

(1)拔出分化好的幼苗，剪掉分化时产生的根；

(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

4.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

表1.FC1突变体和对照茎杆强度的测定结果

编号	折断力(N)
	折断力(N)		突变体	对照
	123平均值	23231922±2	突变体	对照	1029112105±16

p＝0.00091，t＝8.8247，t_0.05＝4.6041，平均值＝样品平均折断力±标准偏差

表2.T₀代转基因植株茎杆强度测定结果

编号	机械强度(N)	拷贝数
编号	机械强度(N)	拷贝数	MpC1-1MpC1-2MpC1-3MpC1-4MpC1-5MpC1-6MpC1-7MpC1-8MpC1-9MpC1-10MpCFC1-1MpCFC1-2MpCFC1-3MpCFC1-4MpCFC1-5MpCFC1-6MpCFC1-7MpCFC1-8MpCFC1-9MpCFC1-10MpCFC1-11MpCFC1-12MpCFC1-13MpCFC1-14	2518232824171626192395261208999231231058312065108106123	*********2421313324212

MpCFC1-15MpCFC1-16MpCFC1-17MpCFC1-18MpCFC1-19MpCFC1-20

27597812230106

341223

注：MpC1-1到MpC1-10这10株是使用PC1301空载体转化突变体愈伤所得到的植株，MpCFC1-1到MpCFC1-20这20株是使用互补载体pCFC1转化突变体愈伤所得到的植株，*表示没有数据。

SEQ.ID No.1

<110>华中农业大学

<120>水稻木质素合成基因FC1及用途

<130>

<140>

<141>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>4106

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<220>

<221>CDS

<222>(47)..(174)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1696)..(1809)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2371)..(2911)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(3506)..(3659)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(3761)..(3960)

<223>

<400>1

ggcataaacc tagccagcta gcaaccgaca agccaaggcg acggca atg gcg ccg 55

Met Ala Pro

1

acg acg acg gcc acg gcg gcg gcg gag cag gcg ccg ccg ccg cag cat 103

Thr Thr Thr Ala Thr Ala Ala Ala Glu Gln Ala Pro Pro Pro Gln His

5 10 15

acg agg aag gcg gtg ggg ctc gcc gcg cac gac gac tcc ggc cac ctc 151

Thr Arg Lys Ala Val Gly Leu Ala Ala His Asp Asp Ser Gly His Leu

20 25 30 35

aca ccc atc cgc atc tcg cgc ag gtatgaacag ccaaccgtat accgctccat 204

Thr Pro Ile Arg Ile Ser Arg Arg

40

gctaagagga tctttgtcgt gctcgatgat tgctcgatga ttctcccgcg ccatggcgcc 264

attgatggga gattgggaga catatggagc tttttttttt ctctccagag tttaagatga 324

tctatcgtgt ttgaatttga ctgttactct cgtagcaaca atagtttaca ggatgtccac 384

atcgaattag tgaaaatcgc cgtttggttc atggagttaa tagaatctga agctctcatg 444

agccagcgtc acttgagctt tcgatttttg ttttcccctt ccatttccag tcatttccag 504

ccttctcatc ggatttgtag attgtagttt tgcatttgat ttccctgcga gcaacggtgc 564

tcagcatttg cacatcgaat ttcggtcatc catgtgcaaa ggaagcaaaa ttcaccactt 624

tttgaaactg ttctttttta aaaatctttt agagaagtgt atttattacc tggcctcgtt 684

caaccggata tatgcagcca tttaaattgg ttctgaaact gttcttgatc aaatggagta 744

tctcaaccaa gccctttcgt gccaaatcaa caaacaacag caaaatcttt ccccagacgt 804

ctacagtaca aaaaccctga ccatccagca ccagccagcg ctggctcact gacctgcagc 864

aaccagcttt aaaaaccatg cgcatttgca gcacgtattc tgtaccagga atacgggatc 924

cgtcagatct caactgcaag gcaccctttc ttcaattgtt tttggtggtg agttaatact 984

gttcaacagt gaccatactg ggcatgcctc agctgcaaga atttatggtg ctcgatcgct 1044

actacgtcat ccatcttctt ttcatgtgcg accattctgg ctgtgattgg ctggctgctg 1104

ctgtcaaagt aacaggagtg atttactttc acagtctggt tgtatggtac ataattcagt 1164

tatccttctg gaatctgaac tcctcctggc ttagtcatag cagtaaaaat gttcattcaa 1224

gaaacaggct ttcaagcagt aggcggcttg ctgcacatgg cttgtttttg ttaccagttt 1284

ttttgtcgag cctatgtgaa ttttcacaag tttacagcca tctgtgtgat ggtaaattga 1344

ggatcttgct gtatgccaat tcacttgcta gtgttgtaag catgcatctt ctttcagctt 1404

cagcagttca aggctgttga tttgatggta ctgaattagt tccctgaaat acttcagata 1464

aagtaaaagg gaaagcaaaa taaaagaaaa atttcagttc taccagttca tggcttagtt 1524

aaaatcttgg gaggtgaagc atggtgttta ggctctctct tcttgtgtac ttgagagtct 1584

gaactctcaa tgctgaagta ataaccactg cagttctgct aaaaggttat tggctcagta 1644

gagaaatagt atatgtttct gacttgtgtt ctatatattg ccatttttca g g aaa 1699

Lys

act gga gat gac gac gtc gct ata aag gtg ctg tac tgt ggg att tgt 1747

Thr G1y Asp Asp Asp Val Ala Ile Lys Val Leu Tyr Cys G1y I1e Cys

45 50 55 60

cac tct gac ctg cac acc atc aag aat gag tgg aga aac gct gtc tac 1795

His Ser Asp Leu His Thr Ile Lys Asn Glu Trp Arg Asn Ala Val Tyr

65 70 75

cca gtt gtt gca gg gtacatcctt cttattgcat caccaattta tcaatcaatc 1849

Pro Val Val Ala Gly

80

gtttttcttt tcttcttggt tctgtgcgca tccagatgga aaggctggat gcaatttcat 1909

tgcttagtga aatatccatt atcagttcat actttcttcc ggcaaagctg aattatcata 1969

ctgtaaactg caaatcttgt cagttttttt tcacgataat gaaattcatt ttgtttttac 2029

ttcaaagaag ctacaaccaa ccactaccgc cgtttcaggt tataagacgt tttaacttta 2089

gtcaaagtca aactgcttca agtttgacta agtttgtaga aaaaataata ataacatttt 2149

caacccaaga caaatttatt atgaaaatat attcagttat taatttaata aaactaattt 2209

ggtattacaa atattactat atttgtttat aaacttagtc agactttatc aaagtcaaaa 2269

catcctgtaa cctaaaacgg agggagtatt actctaaagt gctttcaact tacttggaaa 2329

aaagaaatgc aaactttggc tgcatggttt gattgatgca g g cac gag atc acc 2383

His Glu Ile Thr

85

ggg gtg gtg acc gag gtg ggg aag aac gtg gcg agg ttc aag gcc ggc 2431

Gly Val Val Thr Glu Val Gly Lys Asn Val Ala Arg Phe Lys Ala Gly

90 95 100

gac gag gtc ggc gtc ggg tgc atg gtg aac acc tgc ggc ggc tgc gag 2479

Asp Glu Val Gly Val Gly Cys Met Val Asn Thr Cys Gly Gly Cys Glu

105 110 115

agc tgc cgg gac ggc tgc gag aac tac tgc tcc ggc ggg gtc gtc ttc 2527

Ser Cys Arg Asp Gly Cys Glu Asn Tyr Cys Ser Gly Gly Val Val Phe

120 125 130

acc tac aac tcc gtc gac cgg gac ggc acg cgc acc tac ggc ggc tac 2575

Thr Tyr Asn Ser Val Asp Arg Asp Gly Thr Arg Thr Tyr Gly Gly Tyr

135 140 145

tcc gac gcg gtg gtc gtc agc cag cgc ttc gtc gtg cgc ttc ccc tcc 2623

Ser Asp Ala Val Val Val Ser Gln Arg Phe Val Val Arg Phe Pro Ser

150 155 160 165

tcc gcc ggc ggc ggc gcc ggc gcc gcg ctg ccg ctg gac agc ggc gcg 2671

Ser Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Leu Pro Leu Asp Ser Gly Ala

170 175 180

ccg ctg ctg tgc gcc ggg gtg acg gtg tac gcg ccg atg agg cag cat 2719

Pro Leu Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr Ala Pro Met Arg Gln His

185 190 195

ggg ctg tgc gag gcc ggg aag cac gtc ggc gtg gtg ggg ctc ggc ggg 2767

Gly Leu Cys Glu Ala Gly Lys His Val Gly Val Val Gly Leu Gly Gly

200 205 210

ctc ggc cac gtc gcc gtc aag ttc gcc agg gcg ttc ggg atg agg gtg 2815

Leu Gly His Val Ala Val Lys Phe Ala Arg Ala Phe Gly Met Arg Val

215 220 225

acg gtg atc agc acg tcg ccg gtg aag agg cag gag gcc ctg gag agg 2863

Thr Val Ile Ser Thr Ser Pro Val Lys Arg Gln Glu Ala Leu Glu Arg

230 235 240 245

ctc ggc gcc gac ggc ttc atc gtc agc acc aac gcc agt gag atg aag 2911

Leu Gly Ala Asp Gly Phe Ile Val Ser Thr Asn Ala Ser Glu Met Lys

250 255 260

gtaattttaa agctagtttg atcaagtcaa gagattatta aatgaacttt aagaacggat 2971

tacacgatag taattacaat ctacaactcc tgtacaagta gtaaattaat aggaccactt 3031

tggactgagt taagaagaga tcaatgaact attcagttct acattaatcg tgtagtcata 3091

tggaaggaca tcctactgat gcagatgcag taatatggca catcacaaac atacaatttc 3151

aaatttgact tttacaagtt gcgtttgata tgttattttt gttacaaatt atagaagtcg 3211

aatttgaatt tgcatgtttg tggagtgtta tattagtaga tgtcaatcta ttttttcaat 3271

tttttttaat atttttataa tcgtttaatt aacatgcaat aaacgggtta acatccactc 3331

aagtggttat aatccatctc catcaattta ttgatgtgct gcagtgcaac tttgcaaggc 3391

tatgcaagcc gaagaaatct ttgaatacaa ctgatgcacc tcattgccga cagagcatct 3451

taagattgtt tggtcaagta tctgaatttg cattttggac ttgtgttttt gcag gct 3508

Ala

gcg atg ggc acc atg cat ggc atc atc aac acg gcc tct gca agc aca 3556

Ala Met Gly Thr Met His Gly Ile Ile Asn Thr Ala Ser Ala Ser Thr

265 270 275

tcc atg cac tct tac ctg gca ctc ttg aag ccc aag ggc aag atg atc 3604

Ser Met His Ser Tyr Leu Ala Leu Leu Lys Pro Lys Gly Lys Met Ile

280 285 290

ttg gtt ggc ctg cct gag aag cct ctc cag atc cca acc ttc gct ttg 3652

Leu Val Gly Leu Pro Glu Lys Pro Leu Gln Ile Pro Thr Phe Ala Leu

295 300 305 310

gtt gga g gtaatttact agtttgtctg acgctgcatc gtctgattcc ttctcaaatt 3709

Val Gly

catggcaaaa tttgacagtt tgttttgtga caaatctttg caaatcaaca g gg ggc 3765

Gly Gly

aag ata cta gct ggg agc tgc atg ggg agc atc agt gaa acg cag gag 3813

Lys Ile Leu Ala Gly Ser Cys Met Gly Ser Ile Ser Glu Thr Gln Glu

315 320 325 330

atg atc gac ttc gcc gcc gag cac ggg gtg gcc gcc gac atc gag ctg 3861

Met Ile Asp Phe Ala Ala Glu His Gly Val Ala Ala Asp Ile Glu Leu

335 340 345

atc ggc gcc gac gag gtg aac acg gcc atg gag cgc ctc gcc aag ggc 3909

Ile Gly Ala Asp Glu Val Asn Thr Ala Met Glu Arg Leu Ala Lys Gly

350 355 360

gac gtc agg tac cgc ttc gtc gtc gac atc ggc aac acc ctc agg tcg 3957

Asp Val Arg Tyr Arg Phe Val Val Asp Ile Gly Asn Thr Leu Arg Ser

365 370 375

gat tgactaggga gctcactgtc actggtctca gctctgtagc ataccggacc 4010

Asp

tgcaatcctg caaagtagtg caatcttctt gctacaagac atacatatca cctctacttg 4070

gtgtcaataa atgtagcaaa agtggtacat tgttgt 4106

SEQ.ID No.2

<110>华中农业大学

<120>水稻木质素合成基因FC1及用途

<130>

<141>

<170>PatentIn version 3.1

<210>2

<211>379

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<400>2

Met Ala Pro Thr Thr Thr Ala Thr Ala Ala Ala Glu Gln Ala Pro Pro

1 5 10 15

Pro Gln His Thr Arg Lys Ala Val Gly Leu Ala Ala His Asp Asp Ser

20 25 30

Gly His Leu Thr Pro Ile Arg Ile Ser Arg Arg Lys Thr Gly Asp Asp

35 40 45

Asp Val Ala Ile Lys Val Leu Tyr Cys Gly Ile Cys His Ser Asp Leu

50 55 60

His Thr Ile Lys Asn Glu Trp Arg Asn Ala Val Tyr Pro Val Val Ala

65 70 75 80

Gly His Glu Ile Thr Gly Val Val Thr Glu Val Gly Lys Asn Val Ala

85 90 95

Arg Phe Lys Ala Gly Asp Glu Val Gly Val Gly Cys Met Val Asn Thr

100 105 110

Cys Gly Gly Cys Glu Ser Cys Arg Asp Gly Cys Glu Asn Tyr Cys Ser

115 120 125

Gly Gly Val Val Phe Thr Tyr Asn Ser Val Asp Arg Asp Gly Thr Arg

130 135 140

Thr Tyr Gly Gly Tyr Ser Asp Ala Val Val Val Ser Gln Arg Phe Val

145 150 155 160

Val Arg Phe Pro Ser Ser Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Leu Pro

165 170 175

Leu Asp Ser Gly Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr Ala

180 185 190

Pro Met Arg Gln His Gly Leu Cys Glu Ala Gly Lys His Val Gly Val

195 200 205

Val Gly Leu Gly Gly Leu Gly His Val Ala Val Lys Phe Ala Arg Ala

210 215 220

Phe Gly Met Arg Val Thr Val Ile Ser Thr Ser Pro Val Lys Arg Gln

225 230 235 240

Glu Ala Leu Glu Arg Leu Gly Ala Asp Gly Phe Ile Val Ser Thr Asn

245 250 255

Ala Ser Glu Met Lys Ala Ala Met Gly Thr Met His Gly Ile Ile Asn

260 265 270

Thr Ala Ser Ala Ser Thr Ser Met His Ser Tyr Leu Ala Leu Leu Lys

275 280 285

Pro Lys Gly Lys Met Ile Leu Val Gly Leu Pro Glu Lys Pro Leu Gln

290 295 300

Ile Pro Thr Phe Ala Leu Val Gly Gly Gly Lys Ile Leu Ala Gly Ser

305 310 315 320

Cys Met Gly Ser Ile Ser Glu Thr Gln Glu Met Ile Asp Phe Ala Ala

325 330 335

Glu His Gly Val Ala Ala Asp Ile Glu Leu lle Gly Ala Asp Glu Val

340 345 350

Asn Thr Ala Met Glu Arg Leu Ala Lys Gly Asp Val Arg Tyr Arg Phe

355 360 365

Val Val Asp Ile Gly Asn Thr Leu Arg Ser Asp

370 375

Claims

1.一种分离的水稻木质素合成基因FC1，它具有SEQ.ID No.1所示核苷酸序列至少50％同源性的序列。

2.一种分离的水稻木质素合成基因FC1编码的蛋白质，其具有SEQ.ID No.2所示氨基酸序列至少50％同源性的序列。

3.一种水稻木质素合成基因在调节水稻茎杆强度中的应用。