CN1986546A - 格尔德霉素衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有以下式I的化合物及其药学上可接受的盐，其中，R₁－R₄如权利要求所定义，本发明还涉及式I化合物的制备方法和制药用途。本发明用假轮枝链霉菌发酵生产并制取该类化合物，经实验证实，该类化合物可用于制备细胞周期抑制剂和抗肿瘤剂。

Description

格尔德霉素衍生物及其制备方法和用途

技术领域：

本发明涉及一类新的格尔德霉素类苯醌羰基的加成衍生物、通过发酵制备该类化合物的方法，以及该类化合物用于制备细胞周期抑制剂、细胞增殖抑制剂及抗肿瘤药物的用途。

背景技术：

格尔德霉素最早于1970年从链霉菌产物中发现[C.DeBoer，et al.；Geldanamycin，a new antibiotic：J.Antibiot.，1970，23(9)，442-447]，其后，从微生物产物中或通过人工合成陆续发现了许多同类化合物并发现该类化合物具有多种生物活性。如文献[M.Muroi，et al.；The structuresof macbecin I and II：Tetrahedron，1981，37，pp.1123-1131]、文献[R.C.Schnur，et al.；Inhibition of the oncogene product p185^erbB-2in vitro andin vivo by geldanamycin and dihydrogeldanamycin derivatives：J.Med.Chem.，1995，38，3806-3812]、文献[M.Bendin，et al.；Geldanamycin，aninhibitor of the chaperone activity of HS90，induces MAPK-independentcell cycle arrest：Int.J.Cancer，2004，109，643-652]、文献[Z.-Q.Tian etal.；Synthesis and biological activities of novel 17-aminogeldanamycinderivatives：Bioorg.Med.Chem.，2004，12，5317-5329]以及文献[J.-Y.L.Brazidec，et al.；Synthesis and biological evaluation of a new class ofgeldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90：J.Med.Chem.，2004，47，3865-3873]等都曾记载了天然或人工合成的格尔德霉素类化合物及其生物活性。该类化合物的生物活性多与热休克蛋白90有关。热休克蛋白90是细胞内最活跃的一种分子伴侣，许多信号传导途径均依赖于热休克蛋白90，并且，它在肿瘤细胞中的表达比正常细胞高出2～10倍，在肿瘤细胞生长和存活中可能起重要的调节作用。格尔德霉素类化合物能与热休克蛋白90特异性结合并抑制其功能，导致多种癌基因产物和细胞周期调控蛋白的降解，从而显示抗癌等多种生物活性，因此，该类化合物受到了癌症研究者的极大关注和深入研究。其中，17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔德霉素(17-AAG)作为治疗多发性骨髓瘤的药物产品在欧洲刚刚上市，而在美国则正在进行治疗肿瘤的II期临床试验。

格尔德霉素类化合物属于苯醌安莎霉素类抗生素，它们的结构特征是：一个苯醌片段与一个大环安莎桥相连，形成大环内酰胺苯醌的骨架结构。从结构类型上，从迄今已有记载的所有格尔德霉素类化合物中，尚未看到具有与本发明化合物相同的苯醌衍生片段结构的同类化合物。

发明内容：

本发明旨在提供一种具有细胞周期抑制等抗肿瘤活性的新的格尔德霉素类苯醌羰基的加成衍生物。

本发明人通过坚韧不拔的努力，发现了下述式I所示的一类具有细胞周期抑制活性的新结构类型的格尔德霉素类化合物：

式I

其中，

R₁-R₄各自独立地代表氢、羟基、氨基、羟基取代的C_1-6烷基或C_1-6烷氧基。

本发明上述式I化合物的一个结构特征是：格尔德霉素骨架结构中对苯醌的一个羰基被加成并还原，使原有的对苯醌结构片断成为一个2，5-环己二烯-1-酮结构片断，并且在该片段中的原羰基碳上还连接了一个通过碳-碳键相连的碳链取代基。本发明上述式I化合物的另一个结构特征是：所形成的2，5-环己二烯-1-酮进一步与一个五元二氧杂环稠合，形成一个二氧杂五元环并环己二烯酮的双环结构片断。

因此，本发明的第一个方面涉及式I所示的格尔德霉素类苯醌羰基的加成衍生物及其药学上可接受的盐：

式I

其中，

R₁-R₄各自独立地代表氢、羟基、氨基、羟基取代的C_1-6烷基或C_1-6烷氧基。

本发明的第二个方面涉及制备式I化合物的方法，所述方法包括通过发酵培养能生产式I化合物的微生物，如链霉菌属的假轮枝链霉菌(Streptomyces pseudoverticillus)，首先获取含有式I化合物的发酵物，继而再从发酵物中经过分离纯化得到式I化合物。

本发明的第三个方面涉及含有作为活性成分的式I格尔德霉素类苯醌羰基的加成衍生物以及一种或多种药用载体或赋形剂的药物组合物。

本发明的第四个方面涉及式I格尔德霉素类苯醌羰基的加成衍生物用于制备细胞周期抑制剂、肿瘤细胞增殖抑制剂和抗肿瘤剂的用途。

在本发明的一个实施方式中，本发明涉及式I所示的格尔德霉素类苯醌羰基的加成衍生物及其药学上可接受的盐：

式I

其中，

R₁-R₄各自独立地代表氢、羟基、氨基、羟基取代的C_1-6烷基或C_1-6烷氧基。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明涉及式I格尔德霉素类苯醌羰基的加成衍生物及其药学上可接受的盐：

式I

其中，

R₁为羟基；

R₂-R₄各自独立地代表羟基或甲氧基。

在本发明进一步优选实施方案中，本发明涉及式I格尔德霉素类苯醌羰基的加成衍生物及其药学上可接受的盐：

式I

其中，

R₁和R₃为羟基，R₂和R₄为甲氧基。

本发明的式I化合物可通过微生物发酵法来制取，具体而言，通过发酵培养能生产式I化合物的微生物，首先获取含有式I化合物的发酵物，再从发酵物中分离纯化而得到式I化合物。

所述分离纯化包括利用本领域技术人员熟知的天然产物分离纯化的常规方法，如液液萃取、柱层析、薄层层析及重结晶等。

所述能够生产式I化合物的微生物包括链霉菌属的生产菌。在本发明的实施例中，所用生产菌是从西双版纳土壤样品中分离，并经分类学研究鉴定为假轮枝链霉菌如链霉菌属的假轮枝链霉菌(Streptomycespseudoverticillus)的YN17707株。该菌株已于2005年9月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏编号为1452(CGMCC No.1452)，其具有如下微生物菌学特征：

各种培养基上的培养特征和形态特征

培养特征

在高氏合成一号琼脂、葡萄糖天门冬素琼脂、无机盐淀粉琼脂、酵母精麦芽琼脂、燕麦粉琼脂、马铃薯块等六种培养基上，于28摄氏度培养7～10天后观察气生菌丝和基内菌丝的颜色和色素的产生等情况，有关特征见表1。

表1  菌株YN17707在6种培养基上的培养特征

培养基	气生菌丝	基内菌丝	可溶色素
				高氏合成一号琼脂葡萄糖天门冬素琼脂无机盐淀粉琼脂酵母精麦芽琼脂燕麦粉琼脂马铃薯块	银灰鼠灰黑灰棕灰灰鼠灰	淡茧黄杏仁黄浅黄暗黄黄棕暗棕	无无无无无无

形态特征

在高氏合成一号琼脂和葡萄糖天门冬素琼脂上28摄氏度培养7～10天后，用光学显微镜和电子显微镜，按常规方法进行菌丝及孢子表面特征的观察，结果观察到：菌丝无横隔，不断裂；气生菌丝呈假轮生状，一根主轴，两侧不对称地生有孢子丝，在孢子丝顶端弯曲成圈环状；孢子卵圆形，表面略有突起(光学显微镜电子显微镜照片略)。

化学分类特征

胞壁化学组分分析

按照Lechevalier的薄层层析(TLC)法进行了该菌株全细胞水解液氨基酸和糖型分析，结果表明，YN17707菌株全细胞水解液含有LL-DAP(左旋二氨基庚二酸，Diaminopimelic acid)，甘氨酸；无特征性糖(糖型C)。细胞壁化学组分属于I型。

生理生化特征

参照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》Vol.IV的内容对菌株进行了生理生化鉴定。该YN17707菌株的生理生化特征见表2。

表2  菌株YN17707的生理生化特征

特征	结果	特征	结果
				D-葡萄糖L-阿拉伯糖卫矛醇山梨糖D-果糖蔗糖L-鼠李糖D-甘露醇棉籽糖	++--+++++	L-肌醇明胶液化牛奶凝固牛奶胨化淀粉水解硝酸盐还原纤维素上生长H2S产生黑色素产生	++-+++---

根据上述实验结果，将该菌株鉴定为链霉菌属的假轮枝链霉菌(Streptomyces pseudoverticillus)YN17707。

需要特别说明的是：本发明通过微生物发酵法来制取式I化合物的方法可以采用但绝不仅限于采用假轮枝链霉菌(Streptomycespseudoverticillus)YN17707，链霉菌属的其它任何微生物只要能生产式I化合物均可作为生产菌用于制备式I化合物。

本发明采用流式细胞术，测试了式I化合物对小鼠乳腺癌tsFT210细胞的细胞周期抑制和细胞凋亡诱导等作用。经实验证实，式I化合物可显著抑制癌细胞的细胞周期周转，从而对肿瘤细胞显示出抑制其增殖的生物学活性，因而具有抗肿瘤作用。

本发明中的术语“药学上可接受的盐”可以是药用无机或有机盐。本发明式I中具有碱性基团的化合物可以与无机酸形成药用盐，例如硫酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐；也可与有机酸形成药用盐，例如乙酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、葡萄糖酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、马来酸盐等。本发明式I中具有酸性基团的化合物可以与碱金属或碱土金属形成药用盐，优选但不限于钠盐、钾盐、镁盐或钙盐。

本发明的式I化合物可与各种药物上可接受的载体、赋形剂或辅料配伍制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。

本发明化合物可单独或以药物组合物的形式给药。给药途径可以是口服、非肠道或局部给药。药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。

本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。

当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。

本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

另外需要指出，本发明化合物使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用剂量介于0.01～100mg/kg体重/天。

本发明的式I化合物还可作为抑制细胞周期的低分子生物探针用于生命科学研究中。当把式I化合物用于生命科学研究中时，可溶于甲醇或含水甲醇中，也可溶于二甲基亚砜的含水溶液中加以应用。

附图说明：

图1是非同步化培养的小鼠乳腺癌tsFT210细胞经化合物I处理17小时后测得的流式细胞直方图；

图2是G2期同步化的小鼠乳腺癌tsFT210细胞经化合物I处理4小时后测得的流式细胞直方图。

具体实施方式：

下列实施例将进一步说明本发明，但并不对本发明构成限制。

在以下实施例中，称为化合物I的本发明化合物经核磁共振等鉴定具有如下结构：

化合物I

在结构研究中，熔点用北京天地宇科技有限责任公司X-4型精密显微熔点测定仪测定，温度未校正。比旋光度用JSASCO P-1020型旋光仪测定。正负离子ESI-MS和HR-ESI-MS分别用美国ABI公司API 3000型液相色谱-质谱联用仪和英国Micromass公司LCT型质谱仪测定，紫外光谱用Shimadzu UV2501PC型紫外分光光度仪测定，红外光谱用Nicolet Magna-IR^TM 550型红外光谱仪测定，核磁共振谱用JEOLEclips-600型超导核磁共振仪(600MHz¹H-NMR，150MHz¹³C-NMR)测定。

实施例1.化合物I的发酵生产及分离精制

发酵生产

生产菌株  本实施例中用于发酵生产化合物I的产素菌从采自西双版纳的土壤样品中分离并经分类学研究鉴定为假轮枝链霉菌(Streptomyces pseudoverticillus)YN17707。

发酵培养  按微生物培养的常规方法，取假轮枝链霉菌(Streptomyces pseudoverticillus)YN17707适量，接种到茄形瓶中高氏合成一号琼脂固体斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中活化培养7天。取活化培养7天的茄形瓶斜面，加入15毫升无菌水，用接种针刮下孢子，制成孢子悬液，倒入接种瓶中，接入含20升液体种子培养基(含豆粉0.5％，可溶性淀粉1.5％，甘油1.5％，蛋白胨1.5％，CaCO₃0.2％；灭菌前调pH7.4)的50升发酵罐中，28摄氏度培养48小时。取种子培养液，按10％的接种量接入含120升发酵培养基(组成与种子培养基相同)的250升发酵罐中，在罐压为0.8个大气压、温度为28摄氏度、转速为350rpm的条件下发酵培养4天，获得发酵物约120升。

化合物I的制备和分离

将上述发酵物过滤，分为滤液和菌丝体两部分。滤液直接用等量的氯仿萃取三次；菌丝体用80％丙酮水溶液提取，减压浓缩至无丙酮味，所得水混悬液用等量氯仿萃取三次。合并由滤液和菌丝体得到的氯仿萃取液，减压浓缩、干燥，得到含化合物I的氯仿萃取物70克。

取氯仿萃取物30克，用适量氯仿溶解，加50克青岛海洋化工厂产硅胶G(200-300目)搅拌干燥，添加到装有300克薄层层析用硅胶60H(青岛海洋化工厂产品)的玻璃减压柱上，进行减压柱层析，用氯仿-甲醇梯度(100∶0→80∶20)洗脱，接收每500ml为一个馏分，得到若干馏分。根据薄层检测及活性测试结果，合并馏分，得到含化合物I的活性组分Fr-3(氯仿-甲醇90∶10洗脱部位)。将该活性组分Fr-3溶于适量氯仿中，加适量硅胶G(200-300目)，搅拌干燥，添加到装有适量薄层层析用硅胶60H的玻璃减压柱上，以氯仿-甲醇(30∶1)为洗脱剂进行减压柱层析，接取含化合物I的层析组分，经制备硅胶薄层层析(石油醚-丙酮13∶7展开)及Sephadex LH-20凝胶柱(氯仿)精制，得到化合物I(4mg)。

化合物I的理化常数与波谱数据

化合物I为淡黄色无定型粉末，溶于氯仿、甲醇、乙醇，不溶于水，[α]_D ²⁷+34.3°(c 0.25，氯仿)。正离子ESI-MS m/z：619[M+H]⁺；负离子ESI-MS m/z：617[M-H]^-。负离子HR-ESI-MS m/z：实测值617.3066[M-H]^-，计算值617.3070，与分子式C₃₂H₄₆O₁₀N₂相符。UVλ_maxnm(logε)in MeOH：275(4.25)。IR v_max cm^-1(KBr)：3365，3205，2929，1722，1660，1620，1514。¹H与¹³C NMR数据见表3。

表3  化合物I在氘代氯仿中的600MHz¹H和150MHz¹³C NMR数据^a)

标位	δH(J in Hz)	1H-1H COSYb)	HMBCc)	δC
					12345678910111213141516171819202122(N H)2324	————6.86 d(11.7)6.55t(11.7)5.82dd(11.7，9.5)4.31d(9.5)5.14s——5.87d(9.1)2.77m3.51dd(8.4，7.0)3.39m1.81m1.79m1.64m2.42dd(13.1，9.9)2.35dd(13.1，2.9)——————7.41s————8.65brs2.00s3.29s	————H-4，H-23H-3，H-5H-4，H-6H-5，H-7H-6——H-10，H-27H-9，H-28HO-11，H-12H-11，H2-13H-12，H-13(δ1.79)，H-14H-12，H-13(δ1.81)，H-14H-13，H-15(δ2.42)，H-30H-14，H-15(δ2.35)H-14，H-15(δ2.42)——————————H-3	————C-1C-6C-3C-4，C-24C-9，C-25，C-27——C-7，C-11，C-27C-8，C-9，C-28C-12，C-28C-14C-14，C-16，C-21C-16，C-17，C-21，C-30——————C-17，C-18，C-20，C-21————C-1，C-19，C-21C-1，C-2，C-3C-6	168.9s135.2s126.1d126.6d135.5d81.6d82.1d133.3s133.6d32.0d72.5d81.3d34.6t27.2d32.2t118.1s167.7s79.6s119.4d131.4s182.6s——12.6q57.2q

2526(N H 2)272829303132333411-O H18-OH

——5.16brs4.76brs1.80s0.97d(7.0)3.37s0.98d(6.6)5.75d(5.1)5.19d(5.1)——1.22s1.50s3.95brs3.03brs

——H-9H-10H-14H-31(δ5.19)H-3 1(δ5.75)——H-34H-33H-11

——C-7，C-8，C-9C-9，C-10，C-11C-12C-13，C-14，C-15C-18C-17，C-18——C-18，C-32，C-34C-18，C-32，C-33C-17，C-18，C-19，C-32

156.0s——12.7q12.0q56.9q23.4q89.0t70.8s23.2q21.3q————

a)本表信号归属基于DEPT、PFG¹H-¹H COSY、PFG HMQC及PFG HMBC图谱解析结果。b)此栏中的数字代表在PFG¹H-¹H COSY谱中与相应行中的¹H给出偶合相关信号的¹H核。c)此栏中的数字分别代表在PFG HMBC(¹J_CH＝8Hz)中与相应行中的碳信号HMBC信号的¹H核。

实施例2.化合物I的活性测试

实验样品及实验方法

被测样品溶液的配制

测试样品为上述实施例I中分离精制的纯品化合物I。精密称取适量样品，用甲醇配成所需浓度的溶液，供测活性。

细胞系及细胞的继代培养

活性测试采用温敏型小鼠乳腺癌tsFT210细胞系，细胞用含10％FBS的RPMI-1640培养基，在32摄氏度于通入5％二氧化碳的细胞培养箱中继代培养。

流式细胞术活性测试方法

非同步化培养测试法

取对数生长期的tsFT210细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×10⁵个细胞的细胞悬液，按每孔0.5毫升接种于24孔细胞培养板中，每孔加入5微升不同浓度的样品溶液，32摄氏度下培养17小时。将细胞从24孔细胞培养板转移至1.5毫升Eppendorf离心管中，4摄氏度下每分钟3000转离心3分钟，吸去上清液，加0.5毫升磷酸缓冲溶液(PBS)震荡洗涤一次，相同条件下离心收集细胞，加150微升碘化丙啶(PI)水溶液(在100毫升水中含5毫克PI、100毫克柠檬酸钠和200毫克NP-40)，4摄氏度下染色30分钟后，加入180微升PBS稀释，用流式细胞仪分析测定细胞中的DNA含量。细胞在细胞周期各时相中的分布利用库尔特公司产计算机软件WinCycle进行分析计算。

同步化培养测试法

取对数生长期的tsFT210细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×10⁵个细胞的细胞悬液，按每孔0.5毫升接种于24孔细胞培养板中，置于39.4摄氏度二氧化碳培养箱中培养17小时，使细胞在细胞周期的G2期同步化。再往每孔细胞中分别加入5微升待测样品的甲醇溶液，置于32摄氏度二氧化碳培养箱中培养4小时。将细胞从24孔细胞培养板转移至1.5毫升Eppendorf离心管中，4摄氏度下每分钟3000转离心3分钟，吸去上清液，加0.5毫升PBS震荡洗涤一次，相同条件下离心收集细胞，加150微升碘化丙啶水溶液，4摄氏度下染色30分钟后，加入180微升PBS稀释，用流式细胞仪分析测定细胞中的DNA含量。细胞在细胞周期各时相中的分布利用库尔特公司产计算机软件WinCycle进行分析计算。

实验结果

非同步化培养法测试结果

非同步化培养的tsFT210细胞经用不同浓度的化合物I处理17小时后测得的流式细胞术直方图见附图1。化合物I在5μM～20μM的浓度范围内显示出一定的细胞周期G2/M期抑制活性，而在40μM以及40μM以上浓度时则主要将细胞周期抑制在G0/G1期(参见附图1)。

同步化培养法测试结果

用不同浓度的化合物I处理G2期同步化的tsFT210细胞4小时后测得的流式细胞术直方图见附图2。化合物I对G2期同步化的tsFT210细胞显示出较强的细胞周期G2/M期抑制活性，而且从2.5μM开始呈较好的剂量依赖性抑制作用(参见附图2)。

结论

化合物I将癌细胞阻滞在细胞周期的G0/G1期或G2/M期，从而抑制其增殖，因此化合物I可用作为细胞周期抑制剂、肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。

Claims (10)

1.式I化合物，或其药学上可接受的盐：

式I

其中，

R₁-R₄各自独立地代表氢、羟基、氨基、羟基取代的C_1-6烷基或C_1-6烷氧基。

2.权利要求1的式I化合物，其中，

R₁为羟基；

R₂-R₄各自独立地代表羟基或甲氧基。

3.权利要求1的式I化合物，其中，

R₁和R₃为羟基，并且R₂和R₄为甲氧基。

4.权利要求1的式I化合物的制备方法，该方法包括通过发酵培养能生产式I化合物的微生物，首先获取含有该类化合物的发酵物，继而再从发酵物中分离纯化得到式I化合物。

5.权利要求4的方法，所述能生产式I化合物的微生物为链霉菌属的假轮枝链霉菌YN17707，即CGMCC No.1452。

6.药物组合物，其含有作为活性成分的权利要求1的式I化合物以及一种或多种药用载体或赋形剂。

7.权利要求1所述的式I化合物用于制备细胞周期抑制剂和肿瘤细胞增殖抑制剂的用途。

8.权利要求1所述的式I化合物用于制备抗肿瘤药物的用途。

9.假轮枝链霉菌YN17707CGMCC No.1452。

10.权利要求9所述菌株用于生产权利要求1-3任一项的化合物的用途。