CN1984559B - 植物培养方法 - Google Patents
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Abstract
生产草本观赏植物的植物幼苗和/或微型亲本原种的方法。生产草本观赏植物的植物幼苗和/或微型亲本原种的方法，该方法包括体外培养阶段，在此期间，对从要繁殖的物种的亲本原种获得的外植体，或所述外植体的衍生物进行微繁殖，它是在合适条件下以及在合适培养基上进行的，为了产生微型幼苗，然后经历体内培养阶段，可使之能发育成植株或发育成微型亲本原种，其特征在于，进行所述微繁殖：将外植体放置在其组成适合要繁殖的每一种植物物种的增殖培养基上，在无菌条件下，在黑暗中培养合适的一段时间，以便诱导包括腋芽的白色丝状体形成，将每一个白色丝状体分割成多个片段，每个片段中包括腋芽，并且所述片段在光照中，在无菌条件下培养合适的一段时间，放入生根培养基，该培养基使得每一个腋芽能产生具有根的微型小植株。
Description
本发明涉及生产植物的植物幼苗和/或微型亲本原种的方法，特别是属于草本观赏植物类的植物，该方法包括体外培养阶段，在此期间，对从要繁殖的植物物种的亲本原种获得的外植体或所述外植体的衍生物进行一个或多个微繁殖周期(micropropagation cycle)，所述繁殖周期是在合适条件下以及在合适培养基上进行的，以便产生微型小植株，然后经历体内培养阶段，以使之发育成植株或发育成微型亲本原种。
已知植物在光照中进行体外微繁殖通过使维持在特定培养基上的小植株产生最大可能数量的腋芽，使其分裂以便发育成芽而导致了较快的营养繁殖速度。
基于在光照中进行的体外培养阶段和随后进行的体内培养阶段的植物生产方法多年以来就已经为本领域技术人员所公知。本领域承认上述方法具有多种优点，该优点基本上通过体外阶段的结果，并且它不仅体现在单位面积所产生的植株数量方面，而且还体现在植物的健康，植株的质量和最终外观方面。不过，它们在园艺方面的应用目前仍然在很大程度上受到局限，因为每一种类型的植物的生长需要特定的培养条件，植物的发育需要大量的时间和精力，因此很昂贵。用所述方法所达到的繁殖速度仍然不足以弥补上述缺陷。
另外，已经发现，某些植物种，具体地讲，如天竺葵属植物在通过这种途径生产时不太适合于已知的微繁殖方法。
因此，本发明的目的是提供用于生产植物的植物幼苗和/或微型亲本原种的方法，该方法完全适合所述植物的培养，特别是属于草本观赏植物类的植物，具体地讲，如天竺葵属植物，包括级联矮牵牛的矮牵牛、大戟属植物、樱草属植物、菊属植物、凤仙花、马鞭草属植物或蝴蝶草属植物等获得尽快的繁殖速度。
另外，本发明的另一个目的是提供一种方法，该方法的应用能够实现比迄今为止用繁殖阶段在光照中进行的方法所获得的繁殖速度高得多的增殖速度。
另外，本发明的另一个目的是提供生产植物的植物幼苗和/或微型亲本原种的方法，特别是属于草本观赏植物类的植物，该方法结合特殊的体外微繁殖技术，通过这种方法可以获得具有极高分枝速度和更快生长的生活力更高的植物幼苗或亲本原种。
本发明的另一个目的是提供营养繁殖方法，该方法适合确保健康状态并且保持遗传学标准，特别是植物在不同世代之间的遗传学一致性，产生了表型上一致的、并且适当同步的植物群体。
本发明的体外培养阶段还适合机械化作业，这归功于切枝产品的小型化，这一目的可以通过采用本发明的方法实现。植物可以用高密度托盘提供，它可适用于自动化移栽系统，包括移栽机器人。
最后，作为本发明的主题的方法还涉及通过在特定条件下进行体外微繁殖降低繁殖所需要的时长和面积来提高植物生产的利润。
在一种实施方案中，本发明涉及生产植物的植物幼苗和/或微型亲本原种的方法，特别是属于草本观赏植物类的植物，该方法包括体外培养阶段，在此期间，对从要繁殖的物种的亲本原种获得的外植体或所述外植体的衍生物进行微繁殖阶段，它是在合适条件下以及在合适培养基上进行的，为了产生微型小植株，之后经历体内培养阶段，以使之发育成植株或发育成微型亲本原种，其特征在于，进行所述微繁殖：
(a)外植体是从要繁殖的物种的亲本原种获得的，或从所述外植体的衍生物获得的，
(b)所述外植体，在无菌条件下，放置在其组成适合要繁殖的每一种植物物种的发芽起始培养基上(shoot initiation medium)，并且在黑暗中培养合适的一段时间，使之生长以便诱导包括腋芽的白色丝状体的形成，
(c)有选择地将每一个白色丝状体分割成多个段或片，每一个包括腋芽，
(d)所述白色丝状体和/或它的片或段，在光照中，在无菌条件下培养合适的一段时间，放入生根培养基中或上，该培养基使得每一个腋芽能产生具有根的微型小植株。
在另一种实施方案中，本发明的方法涉及微繁殖步骤，其特征在于，
(a)外植体是从要繁殖的物种的亲本原种获得的，或从所述外植体的衍生物获得的，
(b)所述外植体，在无菌条件下，放置在其组成适合要繁殖的每一种植物物种的发芽起始培养基上，并且在黑暗中培养合适的一段时间，使之生长以便诱导包括一个或多个腋芽的白色丝状体形成，
(c)有选择地将每一个白色丝状体分割成多个段或片，每一个包括腋芽，而且包括至少一个腋芽，
(d)将在步骤b)中获得的白色丝状体和/或它的片或段，在无菌条件下转移到增殖培养基上，并且在黑暗中生长合适的一段时间，该时间足以使植物切割物的组织增殖，优选以指数形式增殖，并且产生包括大量腋节的大量的白化的白色丝状体，它能产生小植株，用于在“体内”阶段在光照条件下生长时进行发育；或发育成具有腋生枝的幼苗，如果在黑暗中生长的话，它白化成白色丝状体，
(e)根据需要多次重复步骤(d)，以便产生不同的连续世代的白色丝状体，直到获得所需数量的白色丝状体，
(f)并且将所述白色丝状体或其片，在光照中，在无菌条件下培养合适的一段时间，放入生根培养基中或上，使每一个腋芽能产生具有根的微型小植株。
用于步骤(b)中的起始培养基和在步骤(d)中提到的增殖培养基可以具有相同或基本相同的组成或可以是不同的培养基，这取决于用于本发明的微繁殖方法中的植物物种或基因型的要求。
适用于植物微繁殖的条件和培养基为植物培养领域的技术人员所熟知，并且披露于以下文献中，例如，“Plant Propagation by TissueCulture，Handbook and Directory of Commercial Laboratories，eds.Edwin F George and Paul D Sherrington，Exegetics Ltd，1984”。
在本发明的另一方面，将仅补充了属于生长调节剂的细胞分裂素家族的化合物或补充了属于生长调节剂的细胞分裂素家族的化合物和属于生长调节剂的生长素家族的化合物的传统培养基，特别是“MS”型培养基用作微繁殖阶段的起始和/或增殖培养基。所述生长调节化合物是专门选择的，并且以一定的浓度在所述培养基中使用，该浓度能促进要繁殖的植物物种的植物材料的增殖，特别是来自最初出现的所述外植体材料上的腋芽或节的白色丝状体的发育，和所述白色丝状体的伸长生长，以便在发育中的丝状体上产生最大数量的腋芽/每个原始芽或节，不过，至少为2-10个腋芽/每个原始芽，特别是3-7个腋芽/每个原始芽，不过，特别是4-5个腋芽/每个原始芽，保持高的增殖速度。
属于生长调节剂的细胞分裂素家族并且可用于本发明的方法中的作为起始和/或增殖培养基的合适的添加剂的化合物可以是选自下列一组的任何其他化合物：嘌呤型细胞分裂素，例如，激动素，玉米素，6-苄基氨基嘌呤(BAP)；6-(苄基氨基)-9-(2-四氢吡喃基O-9h-嘌呤(PBA)；或(6-(γ，γ-二甲基烯丙基)氨基)嘌呤(2iP)；和基于取代的苯脲的细胞分裂素，例如，噻苯隆(TDZ)或属于生长调节剂的细胞分裂素家族的任何其他化合物，这些化合物是已知的或被证实适合被直接或间接促进要繁殖的植物物种的繁殖潜力，特别是白色丝状体从最初存在于所述外植体材料上的腋芽或节的发育，和发育中的白色丝状体的伸长生长，以便在发育中的丝状体上产生最大数量的腋芽/每个原始芽或节，不过，至少为2-10个腋芽/每个原始芽，特别是3-7个腋芽/每个原始芽，不过，特别是4-5个腋芽/每个原始芽，保持高的增殖速度。
属于生长调节剂的植物激素家族并且可用于本发明的方法中作为起始和/或增殖培养基的合适的添加剂的化合物可以是选自下列组的任何化合物：吲哚-3-丁酸(IBA)；α-萘乙酸(NAA)；吲哚-3-乙酸(IAA)；和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)或任何其他属于生长调节剂的生长素家族化合物，它们是已知的或被证实适合直接或间接促进要繁殖的植物物种的繁殖潜力，特别是白色丝状体从最初存在于所述外植体材料上的腋芽或节的发育，和所述白色丝状体的伸长生长，以便在发育中的丝状体上产生最大数量的腋芽/每个原始芽或节，不过，至少为2-10个腋芽/每个原始芽，特别是3-7个腋芽/每个原始芽，不过，特别是4-5个腋芽/每个原始芽，保持高的增殖速度。
适合用作起始和/或增殖培养基的添加剂的其他化合物有，例如，环己六醇，特别是一种或多种这样的化合物：它的九种不同的同分异构体，常发现于植物和/或动物系统中，如肌醇，还有生物素，叶酸，半胱氨酸或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或任何其他化合物，这些化合物已知或被证实能直接或间接支持要繁殖的植物物种的生长和/或繁殖。
可用作本发明的繁殖培养基的添加剂的另外的化合物是合适的碳源，特别是糖类化合物，例如，蔗糖或葡萄糖或任何其他常用于植物培养的糖类化合物或它们的组合。
另外，本发明的方法还以以下事实为特征：获得了包含腋芽的白色丝状体，并且，所述第一代白色丝状体，特别是所述丝状体的段或片可以通过以下方式获得，例如，丝状体切成多个特定的包括至少一个腋芽的片或段，将其在无菌条件下和在黑暗中送回到新鲜的增殖培养基上，并且在黑暗中培养合适的时间，以便诱导新一代白色丝状体形成，以便在发育中的丝状体上产生存在于第一代丝状体上的最大数量的腋芽/每个原始芽，不过，至少为2-10个腋芽/每个原始芽，特别是3-7个腋芽/每个原始芽，不过，特别是4-5个腋芽/每个原始芽，保持高的增殖速度。可以根据需要多次重复所述过程，以便产生不同的连续世代的白色丝状体，直到获得所需数量的白色丝状体。
因此，本发明优选可提供通过一系列标准化的操作可用于既定植物物种的技术，特别是属于草本观赏植物类的植物物种，其中，如果需要的话，所述培养基的类型和培养条件可以进行专门改良，以便适合所述物种内的品种或种群，以便提高营养繁殖速度，并且在一个或多个，特别是多达10个，更优选多达5个在黑暗中的繁殖周期中保持高的繁殖速度。
可用于本发明的方法中的植物是属于草本观赏植物类的植物，如来自以下科的植物：铁线蕨科，苋科，石蒜科，伞形科，夹竹桃科，天南星科，五加科，萝藦科，铁角蕨科，菊科，蹄盖蕨科，凤仙花科，秋海棠科，黄杨科；桔梗科，美人蕉科，石竹科，景天科，鳞毛蕨科，大戟科，紫堇科，牻牛儿苗科，灰藓科，鸢尾科，唇形科植物，百合科，半边莲科；粘腺果科，紫萁科，胡椒科，白花丹科，禾本科，马齿苋科，毛茛科，蔷薇科，三白草科，虎耳草科，玄参科，茄科，马鞭草科，和堇菜科，具体地讲，属于天竺葵属植物类的植物，包括级联矮牵牛的矮牵牛，大戟属植物，樱草属植物，菊属植物，凤仙花，马鞭草属植物，或蝴蝶草属植物，特别是天竺葵属的植物。
在本发明的一种实施方案中，本发明方法的实施导致了第一种变体，其中，为了获得无细菌和无病毒的亲本原种，从亲本原种上获得分生组织，特别是生长中的分生组织，特别是幼苗分生组织，并且用作外植体，在每一个植物品种共同的发育培养基上，于无菌条件下，在光照中培养第一段时间，该时间足以形成具有初生叶原基的小植株，在每一个植物品种共同的生根培养基上或内培养第二段时间，以便获得没有细菌和病毒的长根的小植株，并且预计能放置在发芽起始培养基上，在黑暗中培养，以便产生本发明的白色丝状体。
适用于植物分生组织培养，以及适用于通过所述培养获得的生根小植株的条件和培养基为植物培养领域的技术人员所熟知，并且披露于以下文献中，例如，“Plant Propagation by Tissue Culture，Handbook and Directory of Commercial Laboratories，eds.EdwinF George and Paul D Sherrington，Exegetics Ltd，1984”。
在这种场合下，根据本发明方法的特征，所使用的生根培养基的体积是在所述小植株的生根阶段以合适的方式补充的。将长根的小植株移植到土壤或常用于植物栽培实践中的任何其他合适的支持培养基上，以便生长植物幼苗，用改变了的条件驯化，如存在于温室中的条件，并且在这里生长合适的时间，不过至少生长4周-10周，特别是5周-6周。
所述植物随后可以用合适的检测系统进行检测，以便检测并且丢弃受到病毒和/或细菌病原体感染的植物材料，例如，“ELISA”型试验，并且消除任何呈检测阳性的样品，并且保留检测阴性的样品作为无细菌和无病毒的亲本原种，并且用作外植体的来源。
在本发明的一种实施方案中，将所述小植株的叶和根抑制培养合适的一段时间，然后在无菌条件下在在黑暗中，放置在每一个植物品种专用的发芽培养基上，以便产生所述白色丝状体。
在本发明的另一种实施方案中，从无细菌和无病毒的亲本原种植株上采集微型切割物(microcutting)，并且用作外植体，所述原种植株是通过上文所披露的分生组织培养获得的。另外，可以将从商业渠道获得的合乎标准的无细菌和无病毒的亲本原种用于获得微型切割物。具体地讲，采集分枝，特别是包括一个或多个腋芽的幼苗顶端，并且切割成片段，每一个片段包括至少一个芽。
根据本发明的具体实施方案，将微型切割物的顶端部分的叶片和托叶抑制培养培养合适的一段时间，然后在无菌条件下，在黑暗中，放置在每一个植物品种专用的发芽培养基上，以便产生所述白色丝状体。
根据本发明方法的另一个有利特征，在生根阶段之前，具有腋芽的白色丝状体可以储存特定一段时间，在此期间，每一个芽能产生长根的微型亲本原种植株，所述植株可用于体内培养。
其次，本发明还涉及通过实施上述方法所获得的微型小植株、植物幼苗和微型亲本原种。
在特定实施方案中，本发明涉及植物幼苗，它的独特之处在于较快的分枝速度，快速生长，紧凑型叶子，植株的自我调节，特别涉及选自天竺葵属植物，包括级联矮牵牛的矮牵牛，大戟属植物，樱草属植物，菊属植物，凤仙花，马鞭草属植物，和蝴蝶草属植物的植物幼苗。
本发明还涉及通过以下说明可以看出的特征，并且它必须以孤立的方式考虑或按照它们的任何组合方式考虑。
本发明的方法包括“体外”培养阶段，在此期间，植物组织在无菌条件下进行不同的处理，特别是微繁殖处理，所述处理是在特定条件下进行的，以便使这些植物组织以指数形式繁殖，并且产生大量的小植株，这些植株预计能在“体内”阶段直接发育成植物或发育成微型亲本原种，以便用作获得植株的原材料。
预计，本发明的方法还适用于从任何亲本原种上获得的分生组织的小植株，或适用于从健康的亲本原种上采集的微型切割物，即合乎标准的无细菌或无病毒的亲本原种。
因此，所述方法的变形取决于分生组织的使用，并且它具有导致亲本原种消毒的优点，所述原种在获得小植株而需要的补充步骤中可能受到任何病原体的侵袭。最后获得了分生组织，特别是第一片叶原基的发育中的分生组织，并且首先在光照中在合适的容器中生长大约4个月时间，例如，在皮氏培养皿，玻璃罐或盆中，在发育培养基上生长，培养基的配方优选对本发明方法所涉及的所有植物物种来说是相同的，例如，传统上使用的植物培养基之一，例如，补充了属于生长调节剂的细胞分裂素家族的化合物的“MS”-型培养基(MS大量和微量元素；MS维生素)。
然后从发育的分生组织获得的小植株放置在无论什么植物品种配方都相同的生根培养基上或内，优选传统上用于植物培养的生根培养基，例如，“MS”-型培养基，在光照中培养，以便获得小植株，在大约一个月之后将所述小植株移植到容器中，例如，玻璃罐或玻璃盆中，使根容量增加。为了进一步促进根的发育，可以使用可透气容器。
在这一过程之后，获得了长根的小植株，这样的小植株可以方便地进入实际的体外微繁殖阶段，以与微型切割物相同的方式从健康的亲本原种上采集，例如，合乎标准的母本原种植株在温室中于控制植物病害的条件下生长。
在本发明的特定实施方案中，所述小植株或微型切割物在进行微繁殖处理之前，首先进行复壮，例如，抑制生根和生叶，然后放置在发芽起始培养基上，所述培养基是为了适合要繁殖的植物品种而专门开发的，并且在合适的容器，如皮氏培养皿中扩展。
具体地讲，将叶和根(如果存在的话)从要进行快繁的植株的茎秆或枝条上去掉，并且优选进行表面消毒。将其切成片或段使每一个片或段包括至少一个节或腋芽。将所述切割物转移到发芽起始培养基上，并且在黑暗中于一定条件下培养一段时间，使所述植物切割物增殖并且产生大量的白化的包括大量腋节的白色丝状体，由此产生了小植株，用于在光照条件下生长时在“体内”阶段发育，或者如果在黑暗中生长的话，发育成带有腋生枝的幼苗白化成白色丝状体。
植物切割物和从包括至少一个腋芽或节的白化的白色丝状体获得的切割物在黑暗中培养一段时间，足以使腋节或腋芽发育成幼苗，并且使腋生枝白化成包括腋芽的白色丝状体，使在发育中的丝状体上产生的腋芽的数量于切割物上至少为2-10个腋芽/每个起始节，特别是于切割物上3-7个腋芽/每个起始节，不过，特别是于切割物上4-5个腋芽/每个起始节，不过，至少培养大约2周-大约12周，特别是大约3周-大约7周，特别是大约4周-大约5周，特别是大约4周。
在特定实施方案中，为了发芽起始和维持，将植物外植体水平放置在栽培基质上，并且在特定条件下生长，迫使发育中的芽大体上水平生长。这一目的可以通过在诸如皮氏培养皿的容器中生长所述外植体而实现，所述培养皿被设计成能抑制所述外植体垂直生长，由于在垂直方向上的空间限制。对于发育中的芽来说，它优选与所述栽培基质体内接触，并且在微繁殖期间与所述培养基形成不止一个接触点。
根据本发明的方法，优选使用与上述发育培养基和生根培养基具有大体上相同的基础配方的起始和/或增殖培养基，即基于传统存在的大量和微量元素和维生素的配方，例如，出现在常用的MS培养基中的成分。
所述培养基中的大量和微量元素和维生素的组成和浓度在某种程度上可以根据相关的植物物种或基因型改变。这种微调属于植物栽培领域技术人员的公知范围，并且是它们常规优化工作的一部分。例如，在使用MS型培养基时，已经证实在某些场合下采用较低浓度的大量和/或微量元素和/或维生素的有利的，特别是位于全浓度和1/2浓度之间的某种浓度，不过，特别是1/2浓度。
所述基础配方还可以通过添加属于生长调节剂的细胞分裂素家族的化合物或通过同时添加属于生长调节剂的细胞分裂素家族的化合物和属于生长调节剂的生长素家族的化合物进一步补充，这取决于要繁殖的植物物种，所述生长调节剂可以通过促进腋芽分裂和发育成白化苗(白色丝状体)，并且进一步发育成白色丝状体和/或所述生长，特别是发育中的芽的伸长生长，发育成包括大量腋节的幼苗来支持幼苗增殖。
在特定实施方案中，双层培养方法用于本发明的方法中，其中植物栽培基质是以双层系统的形式提供的，包括固化的底层，它主要包括下文所披露的大量和微量元素、维生素和碳源，但是不含生长调节剂，在它上面覆盖流体表层，包含生长调节剂，特别是属于生长调节剂的细胞分裂素家族或属于生长调节剂的细胞分裂素家族和属于生长调节剂的生长素家族的生长调节剂的组合的生长调节剂，这取决于要繁殖的植物物种，所述生长调节剂可以通过促进腋芽分裂和发育成白化苗(白色丝状体)，并且进一步发育成白色丝状体和/或所述生长，特别是发育中的芽的伸长生长，发育成包括大量腋节的幼苗来幼苗增殖。
除了属于细胞分裂素和/或生长调节剂的生长调节剂的生长素家族的生长调节剂之外，所述流体表层可以包含不同家族的其他生长调节剂，例如，属于生长调节剂的赤霉素家族的生长调节剂，促进的幼苗伸长。
流体表层还可以含有能支持发育中的幼苗生长的化合物，例如，大量和微量元素、维生素和碳源。与固体底层相比流体表层的体积占大约1％-大约10％，特别是大约2％-大约7％，更特别是大约3％-大约5％，不过，特别是大约3％-大约4％。
在本发明的特定实施方案中，在常用于植物培养的合适容器中进行双层培养，例如，玻璃罐和玻璃盆，其尺寸大到足以让发育中的白色丝状体正常生长。另外，所述容器还可以是可透气的，以便支持白色丝状体的生长发育。
可以在本发明的方法中用作起始和/或增殖培养基的合适的添加剂并且属于生长调节剂的细胞分裂素家族的化合物，可以是选自下列组的任何化合物：激动素、玉米素、6-苄基氨基嘌呤(BAP)；6-(苄基氨基)-9-(2-四氢吡喃基0-9h-嘌呤(PBA)；(6-(γ，γ-二甲基烯丙胺基)嘌呤(2iP)；和噻苯隆(TDZ)或属于生长调节剂的细胞分裂素家族任何其他化合物，已知或证实的这些化合物适合要繁殖的植物物种的增殖。
属于生长调节剂的细胞分裂素家族的化合物在本发明的起始和/或增殖培养基中的使用浓度为0.01mg/l-5.0mg/l-7.0mg/l，特别是0.03-2.0mg/l，更特别是0.04-1.0mg/l，不过，特别是0.05-0.5mg/l。
可以在上述特定范围内进行调整，以便适应要繁殖的植物物种的特殊要求。
可用于本发明的方法的起始和/或增殖培养基的合适的添加剂并且属于生长调节剂的生长素家族的化合物，可以是选自吲哚-3-丁酸(IBA)；α-萘乙酸(NAA)；吲哚-3-乙酸(IAA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的任何化合物或属于生长调节剂的生长素家族任何其他化合物，已知或证实了这些化合物适合要繁殖的植物物种的增殖。
属于生长调节剂的生长素家族的化合物在本发明的起始和/或增殖培养基中的使用浓度为0.01mg/l-5.0mg/l，特别是0.03-2.0mg/l，更特别是0.04-1.0mg/l，不过，特别是0.05-0.5mg/l。
可以在上述范围进行调整，以便适应要繁殖的植物物种的特殊要求。
某些生长促进物质，如属于取代的苯脲的化合物，例如，噻苯隆(TDZ)，单独或与生长调节剂的细胞分裂素家族的另一种化合物，例如，6-苄基氨基嘌呤(BAP)已知是大量幼苗形成的有效促进剂。还进一步已知这些物质在0.001mg/l-0.1mg/l的低浓度下是相当持久和高度活性的，不过，在某些场合下能导致不希望的作用，例如，器官异常或妨碍幼苗生长。
通过添加赤霉素型生长调节剂，如能促进幼苗伸长的赤霉酸可以抵消上述不希望的影响。
用于避免由于存在于起始和/或增殖培养基中的生长调节剂，特别是可能对幼苗生长和伸长产生负面影响的生长调节剂，例如，TDZ，的不希望的影响的另一种方式是采用上述双层培养方法，以便将属于取代的苯脲的化合物，例如，噻苯隆(TDZ)，单独或与生长调节剂的细胞分裂素家族的另一种化合物，例如，6-苄基氨基嘌呤(BAP)的组合仅添加在流体表层中，其浓度高到足以促进幼苗增殖，但是，又低到足以避免出现任何不希望的影响，特别是浓度为大约0.001mg/1-2.0mg/l，更特别是大约0.005-1.0mg/l，不过，特别是0.01-0.1mg/ml。
适合用作起始和/或增殖培养基的添加剂的其他化合物是，例如，环己六醇，不过，它的九种不同的同分异构体中的至少一种，如肌醇，还有生物素，叶酸，半胱氨酸或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或任何其他化合物已知或被证实能直接或间接促进要繁殖的植物物种的生长和/或繁殖潜力的。
可用作本发明的繁殖培养基的添加剂的另一种化合物是合适的碳源，特别是糖类化合物，例如，蔗糖或葡萄糖，或任何常用于植物培养的任何其他糖类化合物或它们的组合。
在这一阶段或任何其他繁殖周期获得的白色丝状体可以放置在黑暗中，在特定条件下培养，可以保存丝状体用于随后生根，或作为原种用于进一步的繁殖周期。例如，在2℃-10℃，特别是3℃-8℃，特别是4℃-6℃的温度下保藏的丝状体可以保存至少长达10个月，特别是至少长达7个月，特别是至少长达5个月。
因此，可优选再次进行所述微繁殖阶段，根据需要进行，周期为大约3周-12周，特别是大约4周-6周，特别是大约4周-5周，以便获得大量的白色丝状体。
根据本发明方法的其他特征，它使得所生产的植物的品质能确保健康，通过培养分生组织和/或白色丝状体得到的植物用合适的检测系统进行检测，例如，“ELISA”-型试验，并且消除任何测试呈阳性的样品，而保留测试呈阴性的样品。
其次，根据本发明的另一个有利特征，可以将部分白色丝状体在黑暗中，在环境温度下，在定期更换的增殖培养基上，在生根阶段之前根据需要培养尽可能长的时间，在此期间，每一个芽产生了长根的微型小植株，这样的小植株可用于体内培养。
已经按照本发明的方法对若干植物物种进行了微繁殖处理。
因此，已经证实，通过使用添加了细胞分裂素或细胞分裂素和生长素的组合的传统“MS”型培养基作为发芽和增殖培养基，已经成功地生产出了天竺葵属植物的微型小植株，例如，纬向鹳(zonalgeranium)，双常春藤叶天竺葵，或单常春藤叶天竺葵，以及矮牵牛和南非万寿菊微型小植株。
另外，本发明的方法还可应用于其他属于草本观赏植物类的植物物种，例如，包括级联矮牵牛的矮牵牛、伽蓝菜属、蝴蝶草属、马鞭草属和玫瑰花丛属植物，以便成功地生产微型小植株。
另外，通过采用本发明的方法，已经发现从微型小植株上获得的植物幼苗或微型亲本原种具有特别有趣的特征。
通过这种方法获得的植物天然存在非常高程度的分枝，能快速生根，在体积方面生长一致，植株快速硬化，叶面积比通过传统培养方法获得的植株的叶面积小，并且具有突出的幼苗性状，这些性状特别分别出现在纬向鹳的微型小植株，纬向鹳的微型亲本原种和级联矮牵牛的微型亲本原种植株上。
本发明的方法还提供了有利的解决方案，与传统培养技术相比，它可以改善产量和生产过程的灵活性，特别是将传统上用于培养亲本原种的面积减少1/4。
另外，通过采用本发明的方法，可以获得的增殖速度比迄今为止在光照中进行繁殖阶段所获得的速度更高。如果假设由原始小植株获得的每一个白色丝状体都能够在每一个月内提供至少五个腋芽，这些腋芽本身又能够提供五个长根的微型小植株，这些小植株中的每一个反过来又能够在每个月提供五个白色丝状体，这就会导致在一个月的9个微繁殖循环之后，由一个原始小植株产生大约2百万个植株。
另外，本发明方法的实施还提供了体现在不同相关的园艺网络方面的很多优点，具体地讲，改善管理等级，以及获得更高的植株质量。
尽管已经结合具体实施方案对本发明进行了说明，可以理解的是，本发明并不局限于此，并且可以在不超出本发明的范围或构思的前提下对各种因素的形式，材料和它们的组合进行各种改变。
下面的实施例表示实施本发明方法的例子，这些例子是以说明性质提供，而不是以限定方式提供的，并且这些例子涉及天竺葵属植物，矮牵牛和南非万寿菊植物的生产，更具体地讲，涉及属于天竺葵属植物，矮牵牛和南非万寿菊的不同品种或基因型的生产。
实施例
实施例1：矮牵牛
1.1植物材料和白化
矮牵牛合乎标准的母本原种植株在温室中，在控制植物病害的条件下生长至少6周时间。从所述母本原种植株获得分枝，并且用作外植体用于幼苗增殖和白化。
去掉所述分枝上所有的叶子，并且用1.3％次氯酸钠溶液(30％的商用漂白剂)对去掉叶子的枝条进行表面消毒10分钟，并且用无菌蒸馏水洗涤三次。
在消毒之后，在无菌条件下将去掉叶子的分枝切成段，使每一段包括一个或两个节。
将外植体水平放置在皮氏培养皿中的固化发芽起始培养基上，使每一个皮氏培养皿中最多有三个外植体。用nescofilm密封皮氏培养皿。
为了白化，将两种MS型培养基用于发芽，即MS1和MS1-2。这两种培养基的主要差别在于MS大量元素的浓度方面，其中，MS1-2培养基所含大量元素仅为1/2浓度。这两种培养基都可用于矮牵牛外植体的发芽和白化，尽管某些基因型似乎具有对一种或另一种培养基的偏好。
MS1培养基包括MS微量盐+MS大量盐+MS维生素，蔗糖作为碳源，肌醇，生物素和叶酸作为额外的，非MS维生素，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)作为其他添加剂，和BAP(6-苄基氨基嘌呤)和2iP(2-异戊烯-腺嘌呤)作为生长调节剂的细胞分裂素家族的生长激素。用植物琼脂固化所述培养基。在高压灭菌之前将pH设定为5.8(有关培养基配方的进一步的细节，参见下面的表A)。
M1-2培养基包括1/2浓度MS大量盐+全量MS微量盐和MS维生素，蔗糖作为碳源，肌醇，生物素和叶酸作为额外的，非MS维生素，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)作为其他添加剂，和BA(6-苄基氨基嘌呤)和2iP(2-异戊烯-腺嘌呤)作为生长调节剂的细胞分裂素家族的生长激素。用植物琼脂固化所述培养基。在高压灭菌之前将pH设定为5.8(有关培养基配方的进一步的细节，参见下面的表A)。
外植体在黑暗中于18℃-20℃的温度下生长4周时间。一般，所述外植体的60％-90％能形成丝状体(参见下面的表1)。
在黑暗中培养4-5周之后，腋生枝被白化成白色丝状体。每一个丝状体具有一个或多个腋节。
表1：在4周之后每个外植体的丝状体的数量
| 基因型 | MS1 | MS1-2 |
| A971-1 | 3.0 | 5.0 |
| A895-3 | 4.5 | 8.0 |
| A1019-1 | - | 6.2 |
| A938-5 | 5.0 | 1.0 |
| A1010-3 | 5.0 | 17.0 |
| A948-1 | 6.0 | 10 |
| 平均 | 3.9 | 7.9 |
1.2增殖
为了维持，将在例1.1中获得的白色丝状体切成包括一个或两个腋节的片段，并且转移到皮氏培养皿中的新的MS1或MS1-2培养基中。为了保存所述原种，将皮氏培养皿放置在黑暗中，在4℃下保存至少4个月。
为了有效增殖，所使用的丝状体包括一个以上腋节。不过，使用仅包括一个腋节作为起始材料的丝状体也获得了令人满意的结果。
将通过包括2-6腋节的丝状体的切割物获得的丝状体或其片段放置在装有66ml培养基的玻璃罐中生长。所述培养基是SP1，该培养基包括改进的MS大量盐、MS微量盐+MS维生素，蔗糖作为碳源，肌醇、生物素、叶酸作为其他的非MS维生素，BAP(6-苄基氨基嘌呤)作为生长调节剂的细胞分裂素家族的代表，和IAA(吲哚-3-乙酸)作为生长调节剂的生长素家族的代表，用植物琼脂固化所述培养基(有关培养基配方的进一步的细节，参见下面的表A)。
将6个丝状体或其片段放入一个玻璃罐中，使第一节恰好位于琼脂表面下面。将玻璃罐放置在黑暗中，在18℃-22℃的温度下培养5-6周时间。在5-8周之后，可以进行其他继代培养循环，按照大体上与上述相同的方法进行。
在每一次继代培养时，增殖率可以通过用所形成的丝状体的数量(在分离或将组织切割成原始数量的节之后)除以丝状体的原始数量。在4-5周期间测定2次连续继代培养的6种基因型的增殖率(参见下面的表2)。
表2：基因型的增殖率
| 继代培养 | 1 | 2 |
| A971-1 | 7.0 | 5.5 |
| A895-3 | 3.0 | 4.8 |
| A1019-1 | 3.0 | 4.2 |
| A938-5 | 1.0 | 5.8 |
| A1010-3 | 2.0 | 1.4 |
| A948-1 | 3.5 | 8.0 |
| 平均 | 3.3 | 5.0 |
1.3生根
为了生根，使用较小的外植体。每一个丝状体包括一个或两个腋节。将所述外植体转移到可透气的容器中(具有XXL过滤器的ecoline盒子)。生根培养基是MS0-2(1/2浓度MS大量盐，全浓度MS微量盐和MS维生素，蔗糖作为碳源，肌醇、生物素、叶酸作为其他的非MS维生素，和植物琼脂作为固化剂)或RAI2-2(1/2浓度MS大量盐，全浓度MS微量盐和MS维生素，蔗糖作为碳源，肌醇，生物素，叶酸作为其他的非MS维生素，吲哚-乙酸，吲哚-丁酸作为生长调节剂的生长素家族的生长调节剂，和植物琼脂作为固化剂)。
两种培养基都可以使用，并且能产生相似的结果。让植物在18℃-22℃的温度下，在大约3000lux的16小时光周期中长根四周时间。在4-6周之后测定生根百分比。
将长根的小植株从容器中取出，并且用水洗涤，以便除去微量的培养基和琼脂。将所述小植株移植到土壤里，在温室里中于20℃下生长，在这里对它们进行驯化，并且作为正常的组织培养植株处理。
实施例2：南非万寿菊
2.1植物材料和白化
南非万寿菊合乎标准的母本原种植株在温室中在控制植物病害的条件下生长至少6周时间。从所述母本原种植株获得枝条，并且用作外植体用于幼苗增殖和白化。
将所述枝条上的所有叶子去掉，并且用1.3％次氯酸钠溶液(30％商用漂白剂)对去掉叶子的枝条进行表面消毒10分钟，并且用无菌蒸馏水洗涤三次。
在消毒之后，在无菌条件下将去掉叶子的分枝切成段，使每一段包括一个或两个节。将外植体水平放置在皮氏培养皿中的固化发芽培养基上，使每一个皮氏培养皿中最多有两个外植体。用nescofilm密封皮氏培养皿。
为了进行白化，使用两种MS-型培养基，MS1-2和MS2Z，它们的主要区别在于MS大量元素的浓度和所述生长激素的组成。这两种培养基都可用于南非万寿菊外植体的白化，尽管某些基因型似乎对一种或另一种培养基具有偏好。
M1-2培养基包括1/2浓度MS大量盐+全浓度MS微量盐和MS维生素，蔗糖作为碳源，肌醇，生物素，和叶酸作为其他的维生素，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)作为其他添加剂，和BAP(6-苄基氨基嘌呤)，和2iP(2-异戊烯-腺嘌呤)作为生长调节剂的细胞分裂素家族的生长因子的代表。通过添加植物琼脂使所述培养基固化。在高压灭菌之前将pH设定为5.8(有关培养基配方的进一步的细节，参见下面的表A)。
MS2Z培养基包括全浓度MS微量盐+MS大量盐+MS维生素，蔗糖作为碳源，肌醇，生物素，和叶酸作为其他的非MS维生素，和玉米素作为生长调节剂的细胞因子家族的生长因素。通过添加植物琼脂固化所述培养基。在高压灭菌之前将pH设定为5.8(有关培养基配方的进一步的细节，参见下面的表A)。
外植体在黑暗中于18℃的温度下生长(参见下面的表3)。在黑暗中培养4周之后，腋生枝被白化成白色丝状体。每一个丝状体具有一个或多个腋节。
表3：在4周之后每个外植体的丝状体的数量
| 基因型 | MS1-2 | MS2Z |
| E192-1 | 0.75 | 0 |
| D209-3 | 0 | 0 |
| E207-2 | 3.3 | 2.2 |
| E206-1 | 0.6 | 0.3 |
| 平均 | 1.2 | 0.6 |
2.2增殖
2.2.1单层培养
将在实施例2.1中获得的白色丝状体切割成包括一个或两个节的片段，并且转移到皮氏培养皿中的新的MS1-2上，以便维持4-5周时间。为了保存所述原种，可以将皮氏培养皿放置在黑暗中，在4℃下保存至少4个月。
为了有效增殖，所使用的丝状体包括至少两个腋节。其他步骤大体上与在实施例1.2中用于矮牵牛的步骤相同。
表4：在皮氏培养皿中培养4周之后丝状体的增殖率
| 基因型 | Sub1 | Sub2 |
| E192-1 | 1.0 | 4.7 |
| D209-3 | 0.8 | 4.3 |
| E207-2 | 4.8 | 6.5 |
| E206-1 | 5.5 | 4.5 |
| 平均 | 3.0 | 5.0 |
2.2.2双层培养
在第二个实验中，将通过切割物获得的并且包括至少2个腋节的白色丝状体或其片段放置在装有66ml培养基的玻璃罐中生长。所述培养基是MS0，它包括MS微量盐+MS大量盐+MS维生素，蔗糖作为碳源，肌醇，生物素，叶酸作为额外的，非MS维生素和植物琼脂作为固化剂(有关培养基配方的进一步的细节，参见下面的表A)。
在一个罐中放置大约5个丝状体，使第一节恰好位于琼脂表面下面。然后将2ml液体培养基B1(MS微量盐+MS大量盐+MS维生素，蔗糖作为碳源，肌醇，生物素，叶酸作为额外的，非MS维生素，和玉米素和BAP(6-苄基氨基嘌呤)作为生长调节剂的细胞分裂素家族的生长调节剂(有关培养基配方的进一步的细节，参见下面的表A))添加到所述固体培养基顶部。对于100ml的固体培养基来说，要使用3ml液体B1。将所述罐放置在黑暗中于18-22℃下培养5周时间。
在每一次继代培养时增殖率可以通过用所形成的丝状体的数量(在分离或者将组织切割成原始数量的节之后)除以丝状体的原始数量。
2.3生根
为了生根，使用较小的外植体。每一个丝状体包括一个或两个腋节。将所述外植体转移到可透气的容器中(具有XXL过滤器的ecoline盒子)。生根培养基是MS0-2(1/2浓度MS大量盐，全浓度MS微量盐和MS维生素，蔗糖作为碳源，肌醇，生物素，叶酸作为其他的非MS维生素，和植物琼脂作为固化剂)或RAI2-2(1/2浓度MS大量盐，全浓度MS微量盐和MS维生素，蔗糖作为碳源，肌醇，生物素，叶酸作为其他的非MS维生素，吲哚-乙酸，吲哚-丁酸作为生长调节剂的生长素家族的生长调节剂，和植物琼脂作为固化剂)。
两种培养基都可以使用并且能够产生相似的结果。在培养基上让植物在18℃-22℃的温度下在大约3000 lux的16小时光周期中长根4周时间。在4-6周之后测定生根百分比。将长根的小植株从所述容器中取出，并且用水洗涤，以便除去微量培养基和琼脂。将小植株转移到20℃的温室中的土壤中，在这里对它们进行驯化，并且作为正常组织培养植株处理。
实施例3：天竺葵属的植物
3.1植物材料和白化
天竺葵属的植物合乎标准的母本原种植株在控制植物病害的条件下在温室中生长至少6周时间。从所述母本原种植株获得枝条，并且用作外植体进行白化。在消毒之前，去掉所有叶子。用1.3％次氯酸钠溶液(30％商用漂白剂)对所述外植体进行表面消毒15分钟，并且用无菌蒸馏水洗涤三次。
将去掉叶子的并且消过毒的枝条切割成片段，使每一个片段包括一个或两个节。将外植体水平放置在皮氏培养皿中的培养基上，使每一个皮氏培养皿最多具有三个外植体。用nescofilm密封皮氏培养皿。
为了幼苗增殖和白化，使用两种不同的MS-型培养基(MS1和MS2Z)。两种培养基都适用于天竺葵属的植物外植体的幼苗增殖和白化。某些试验过的基因型表现出对一种或另一种培养基的偏好，不过，总体上看，所获得的结果对这两种培养基来说是非常相似的。
MS1培养基包括MS微量盐+MS大量盐+MS维生素，蔗糖作为碳源，肌醇，生物素，叶酸作为额外的，非MS-维生素，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)作为其他添加剂，BAP(6-苄基氨基嘌呤)，和2iP(2-异戊烯-腺嘌呤)作为生长调节剂的细胞分裂素家族的生长调节剂，和植物琼脂作为固化剂。在高压灭菌之前将pH设定为5.8(有关培养基配方的进一步的细节，参见下面的表A)。
MS2Z培养基包括MS微量盐+MS大量盐+MS维生素，蔗糖作为碳源，肌醇，生物素，叶酸作为额外的，非MS-维生素，玉米素作为生长调节剂的细胞分裂素家族的生长调节剂，和植物琼脂作为固化剂。在高压灭菌之前将pH设定为5.8(有关培养基配方的进一步的细节，参见下面的表A)。
外植体在黑暗中在22℃-24℃的温度下生长3-4周时间。一般，所述外植体的60％-80％能形成丝状体。
在黑暗中培养3-4周之后，腋生枝被白化成白色丝状体。每一个丝状体具有一个或多个腋节。
3.2增殖
将在实施例3.1中获得的白色丝状体转移到皮氏培养皿中的新的MS1或MS2Z培养基中进行维持。将它们切割成包括一个或两个节的片段。为了保持所述原种，可以将皮氏培养皿放置在黑暗中，在4℃下保存至少4个月。
为了有效增殖，通过切割物获得的每一个丝状体或其片段在继代培养开始时包括至少两个或三个，优选四个腋节。丝状体在装有66ml培养基的玻璃罐中生长。所述培养基是MS0，它包括MS微量盐+MS大量盐+MS维生素，蔗糖作为碳源，肌醇，生物素，叶酸作为其他的非MS维生素，和植物琼脂作为固化剂(有关培养基配方的进一步的细节，参见下面的表A)。
将大约15±5个丝状体放入一个罐中，使第一节恰好位于琼脂表面下面。然后在固体培养基的顶部添加2ml液体培养基KE(MS微量盐+MS大量盐+MS维生素，蔗糖作为碳源，肌醇，生物素，叶酸作为其他的非MS维生素，玉米素和噻苯隆作为生长调节剂的细胞分裂素家族的生长调节剂(有关培养基配方的进一步的细节，参见下面的表A))。对于100ml的固体培养基来说可以使用3ml液体KE。将罐放置在黑暗中在22-24℃下培养4周时间。在周4之后，重复进行上述相同的增殖方法。
在每一次继代培养时，可以通过用所形成的丝状体的数量(在分离或将组织切割成原始数量的节之后)除以丝状体的原始数量确定增殖率或繁殖率。测定了3次继代培养的10种基因型的增殖率(参见下面的表5)。
表5：10种基因型的增殖率
| 继代培养 | 1 | 2 | 3 |
| Apache | 4.7 | 5.0 | 3.7 |
| Mirage | 5.2 | 5.0 | 4.7 |
| Charlotte | 4.7 | 5.1 | 4.2 |
| Helios | 5.2 | 5.2 | 3.7 |
| Olavi | 5.4 | 4.9 | 3.6 |
| Verseau | 4.3 | 4.0 | 4.4 |
| P.Blanche | 4.7 | 5.5 | 3.9 |
| Super Rose | 5.0 | 4.4 | 3.9 |
| Philiomel 1 | 14.8 | 4.8 | 4.5 |
| Balcon Rose | 4.5 | 5.0 | 3.6 |
| 平均 | 4.9 | 4.9 | 4.0 |
3.3生根
为了生根，使用较小的外植体。每一个丝状体包括一个或两个腋节。将所述外植体转移到可透气的容器种(具有XXL过滤器的ecoline盒子)。生根培养基是MS0-2(1/2浓度MS大量盐，全浓度MS微量盐和MS维生素，蔗糖作为碳源，肌醇，生物素，叶酸作为其他的非MS维生素，和植物琼脂作为固化剂)或RAI2-2(1/2浓度MS大量盐，全浓度MS微量盐和MS维生素，蔗糖作为碳源，肌醇，生物素，叶酸作为其他的非MS维生素，吲哚-乙酸，吲哚-丁酸作为生长调节剂的生长素家族的生长调节剂，和植物琼脂作为固化剂)。
可以使用两种培养基，并且能产生类似的结果。让植物在22℃-24℃的温度下在大约3000 lux的16小时光周期种长根4周时间。在4周之后测定了10种基因型的生根百分比(参见下面的表6)。
Table 6：10种基因型的生根％
| 基因型 | MS0-2 | RAI2-2 |
| Apache | 93 | 100 |
| Helios | 91 | 91 |
| Charlotte | 97 | 97 |
| 0lavi | 90 | 85 |
| Mirage | 95 | nd |
| S.Rose | 87 | 100 |
| P.Blanche | 79 | 93 |
| Philiomel 1 | 100 | 100 |
| B.Rose | 88 | 83 |
| Verseau | 82 | 100 |
| 平均 | 90 | 94 |
将长根的小植株从容器中取出，并且用水洗涤，以便除去微量培养基和琼脂。将小植株转移到温度为20℃的温室中的土壤里，在这里对它们进行驯化，并且作为正常组织培养植株进行处理。
表A：培养基
| 组合物 | MS0 | MS0-2 | MS1 | MS1-2 | MS2Z | SP1 | B1 | KE | RAI2-2 |
| 大量元素 | MS | MS half | MS | MS half | MS | MS mod. | MS | MS | MS half |
| KNO3 | 1.9g.l-1 | 0.95g.l-1 | 1.9g.l-1 | 0.95g.l-1 | 1.9g.l-1 | 1.8g.l-1 | 1.9g.l-1 | 1.9g.l-1 | 0.95g.l-1 |
| NH4NO3 | 1.65g.l-1 | 0.825g.l-1 | 1.65g.l-1 | 0.825g.l-1 | 1.65g.l-1 | 0.4g.l-1 | 1.65g.l-1 | 1.65g.l-1 | 0.825g.l-1 |
| Ca(NO3)2×4H2O | --- | --- | --- | --- | --- | 1.2g.l-1 | --- | --- | --- |
| CaCl2×2H2O | 0.44g.l-1 | 0.22g.l-1 | 0.44g.l-1 | 0.22g.l-1 | 0.44g.l-1 | 0.44g.l-1 | 0.44g.l-1 | 0.22g.l-1 | |
| MgSO4×7H2O | 0.37g.l-1 | 0.185g.l-1 | 0.37g.l-1 | 0.185g.l-1 | 0.37g.l-1 | 0.36g.l-1 | 0.37g.l-1 | 0.37g.l-1 | 0.185g.l-1 |
| KH2PO4 | 0.17g.l-1 | 0.085g.l-1 | 0.17g.l-1 | 0.085g.l-1 | 0.17g.l-1 | 0.27g.l-1 | 0.17g.l-1 | 0.17g.l-1 | 0.085g.l-1 |
| 微量元素 | MS | MS | MS | MS | MS | MS | MS | MS | MS |
| 维生素 | MS | MS | MS | MS | MS | MS | MS | MS | MS |
| 蔗糖 | 30g.l-1 | 30g.l-1 | 30g.l-1 | 30g.l-1 | 30g.l-1 | 20g.l-1 | 30g.l-1 | 30g.l-1 | 10g.l-1 |
| 肌醇 | 0.1g.l-1 | 0.1g.l-1 | 0.1g.l-1 | 0.1g.l-1 | 0.1g.l-1 | 0.1g.l-1 | 0.1g.l-1 | 0.1g.l-1 | 0.1g.l-1 |
| 生物素 | 0.05mg.l-1 | 0.05mg.l-1 | 0.05mg.l-1 | 0.05mg.l-1 | 0.05mg.l-1 | 0.1mg.l-1 | 0.05mg.l-1 | 0.05mg.l-1 | 0.05mg.l-1 |
| 叶酸 | 0.5mg.l-1 | 0.5mg.l-1 | 0.5mg.l-1 | 0.5mg.l-1 | 0.5mg.l-1 | 0.5mg.l-1 | 0.5mg.l-1 | 0.5mg.l-1 | 10.5mg.l-1 |
| PVP(聚乙酮吡咯烷酮) | 0.5g.l-1 | 0.5g.l-1 | --- |
| BA(6-苄基氨基嘌呤) | 0.1mg.l-1 | 0.1mg.l-1 | 0.25mg.l-1 | 5.0mg.l-1 | |||||
| 2iP(2-异苄基腺嘌呤) | 0.1mg.l-1 | 0.1mg.l-1 | |||||||
| 玉米素 | 0.2mg.l-1 | 0.2mg.l-1 | 0.2mg.l-1 | ||||||
| 噻苯隆(TDZ) | 0.05mg.l-1 | ||||||||
| IAA(吲哚-3-乙酸) | 0.1mg.l-1 | 0.5mg.l-1 | |||||||
| IBA(吲哚-3-丁酸) | 0.5mg.l-1 | ||||||||
| 植物琼脂 | 6g.l-1 | 6g.l-1 | 6g.l-1 | 6g.l-1 | 6g.l-1 | 6g.l-1 | 6g.l-1 | ||
| pH | 5.8(在高压灭菌前) | 5.8(在高压灭菌前) | 5.8(在高压灭菌前) | 5.8(在高压灭菌前) | 5.8(在高压灭菌前) | 5.8(在高压灭菌前) | 5.8(在高压灭菌前) | 5.8(在高压灭菌前) | 5.8(在高压灭菌前) |
Claims (12)
1.生产属于矮牵牛、南非万寿菊或天竺葵属植物的植物的植物幼苗和/或微型亲本原种的方法，该方法包括体外培养阶段，在此期间，对从要繁殖的物种的亲本原种获得的外植体进行微繁殖，所述的微繁殖是在合适条件下以及在合适培养基上进行的，为了产生微型小植株，之后经历体内培养阶段，以使之发育成植株或发育成微型亲本原种，其特征在于，进行所述微繁殖：
a)外植体是从要繁殖的物种的亲本原种获得的，
b)所述外植体在无菌条件下，在黑暗中培养合适的时间，放置在发芽起始培养基上，该培养基的组成适合要繁殖的每一种植物物种，导致白色的第一代丝状体形成的诱导，所述第一代丝状体包括一个或多个腋芽，
e)并且将所述丝状体和/或片段，在光照中，在无菌条件下培养合适的一段时间，放置在生根培养基上或内，该培养基使得每一个腋芽能产生具有根的微型小植株。
2.如权利要求1的方法，其特征在于，所述方法进一步包括下列步骤：
c)将白色丝状体中的每一个分割成多个片段，每一个片段包括至少一个腋芽，并且将从第一代白色丝状体获得的所述丝状体和/或片段在无菌条件下和黑暗中送回到增殖培养基中并培养合适的一段时间，该时间足以使得所述植物切割物的组织增殖，并且产生包括大量腋节的大量的白化的白色丝状体，以便诱导新一代白色丝状体形成。
3.如权利要求2的方法，其特征在于，所述植物切割物的组织以指数数量增殖。
4.如权利要求2或3的方法，其特征在于，多次重复步骤c)中的所述过程，以便产生不同的连续世代的白色丝状体，直到获得所需数量的白色丝状体。
5.如权利要求1或2的方法，其特征在于，为了获得无细菌和无病毒的亲本原种，将由亲本原种获得的分生组织用作外植体，后者在无菌条件下在光照中在要繁殖的每一个植物品种共同的发育培养基上生长第一段时间，以便导致具有初生叶原基的小植株形成，然后在每一个植物品种共同的生根培养基上培养第二段时间，以便获得没有细菌和病毒的长根的小植株。
6.如权利要求1或2的方法，其特征在于，由起始节发育而来的白色丝状体的腋芽数量为2-10个腋芽/起始节。
7.如权利要求1或2的方法，其特征在于，将“MS”型培养基用作发芽起始和/或增殖培养基，其中补充了以能支持幼苗增殖的浓度提供的属于生长调节剂的细胞分裂素家族的生长调节剂，或属于生长调节剂的细胞分裂素家族和属于生长调节剂的生长素家族的生长调节剂的组合，所述生长调节剂通过下列方式来支持幼苗增殖：促进腋芽发育成白化苗，并且进一步发育成白色丝状体，和/或促进发育中的芽的生长，形成包括大量腋节的幼苗。
8.如权利要求7的方法，其特征在于，所述发育中的芽的生长为发育中的芽的伸长生长。
9.如权利要求7的方法，其特征在于，所述属于生长调节剂的细胞分裂素家族或属于生长调节剂的生长素家族的生长调节剂是以0.01mg/l-5.0mg/l的浓度提供的。
10.如权利要求1或2的方法，其特征在于，所述白色丝状体是在常温下并且在黑暗中保存在增殖培养基中，所述培养基要定期更换，然后再经历生根阶段，在此期间，每一个芽产生长根的微型小植株，所述长根的微型小植株用于提供植物幼苗或微型亲本原种植株。
11.如权利要求10的方法，其特征在于，在进行所述生根阶段之前将所述白色丝状体在2℃-10℃的温度下保存至少达10个月。
12.如权利要求1或2的方法，其特征在于，所述矮牵牛为级联矮牵牛。
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