PT1765060E - Método de cultura de plantas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODO DE CULTURA DE PLANTAS" A presente invenção refere-se a um método para a produção de plantas jovens e/ou de stock de micro-plantas parentais de plantas, mas especialmente a plantas que pertencem ao grupo de plantas ornamentais herbáceas, que compreende uma fase de cultura in vitro durante a qual explantes obtidos da planta parental de espécies vegetais a serem propagadas, ou derivados destes explantes, são submetidos a um ou mais ciclos de micropropagação os quais são realizados sob condições adequadas e em meios de cultura adequados, com a finalidade de produzir micro-plântulas as quais, quando são submetidas a uma fase de cultura in vivo, são destinadas a desenvolverem-se em plantas ou em micro-planta parental.

Sabe-se que a micropropagação in vitro de uma planta na luz tem como resultado uma velocidade aumentada de propagação vegetativa ao fazer com que o maior número possível de gemas axilares de uma plântula mantida num meio de cultura específico se rompa para desenvolver rebentos caulinares.

Os métodos para a produção de plantas que se baseiam numa fase de cultura in vitro na luz e uma fase de cultura in vivo subsequente são já conhecidos dos especialistas há vários anos. Reconhece-se na técnica que estes métodos têm um número de vantagens que são basicamente o resultado de passar por uma fase in vitro e que se reflecte não somente em termos das quantidades de plantas produzidas por área, mas também em termos da saúde, qualidade e aparência final da planta. No entanto, a sua utilização em horticultura está actualmente muito restringida uma vez que cada tipo de planta cultivada requer condições de cultura específicas cujo desenvolvimento envolve uma grande quantidade de tempo 2 e esforço e é portanto custoso. As velocidades de propagação que podem ser conseguidas com estes métodos ainda não são suficientes para compensar estas desvantagens.

Além disso, descobriu-se que certas espécies vegetais, tais como, em particular, pelargónio, para o qual se tentou a produção por meio desta via, não se adaptaram facilmente a métodos de micropropagação conhecidos. 0 documento Dl (Cassells et al, Scientia Horticulturae, Vol 21(1), pp. 53-66, 1983) revela um processo para micropropagação de cultivares de pelargónio. As pontas de gemas que consistem na cúpula apical e o primeiro par de primórdios foliares são excisadas sem esterilização. As gemas excisadas são cultivadas num meio Hamdorf modificado e colocadas na escuridão. As gemas já existentes nas pontas de gemas excisadas são cultivadas para se obter em plantas. 0 documento D2 (WO 92/18617) revela um processo para propagar variedades de Pelargonium x domesticum por meio da propagação de cultura de tecidos de secções de pecíolo obtidas a partir de uma planta parental. Uma etapa essencial neste processo inclui a condução da formação de callus pela cultura inicial da secção de pecíolo na escuridão.

Nem o processo revelado no documento Dl nem o processo do documento D2 leva a uma proliferação vegetal apreciável.

Um dos objectivos da presente invenção é portanto propor um processo para a produção de plantas jovens e/ou stock de micro-plantas parentais de plantas, cujo processo está adaptado perfeitamente para a cultura das ditas plantas, mas especialmente de plantas que pertencem ao grupo das plantas ornamentais herbáceas tais como, em particular, pelargónio, petúnia incluindo petúnia Cascade, estrela-de-natal, ciclame, crisântemo, Impatiens 3 walleriana, verbena ou torénia, tal como para alcançar velocidades de propagação aumentadas.

Além disso, outro objectivo da invenção é proporcionar um método cuja aplicação tornaria possível alcançar velocidades de proliferação que sejam muito mais altas que aquelas obtidas até o momento com métodos em que a fase de proliferação é levada a cabo na luz.

Além disso, também é um objectivo da invenção propor um método para a produção de plantas jovens e/ou stock de micro-plantas parentais de plantas, mas especialmente de plantas que pertençam ao grupo das plantas ornamentais herbáceas, cujo método integra uma técnica de micropropagação in vitro particular com cuja ajuda podem ser obtidas plantas jovens ou plantas parentais mais vigorosas com uma velocidade de ramificação excepcionalmente alta e crescimento mais rápido.

Outro objectivo da invenção é propor um método de propagação vegetativa que seja adequado para assegurar o estado de saúde e a manutenção de critérios genéticos, mas especialmente a conformidade genética das plantas através das gerações, tendo como resultado populações de plantas fenotipicamente uniformes e adequadamente sincronizadas. A fase de cultura in vitro de acordo com a presente invenção também é adequada para a mecanização devido à miniaturização da produção de estacas que pode ser alcançada ao aplicar o método de acordo com a presente invenção. As plantas podem ser fornecidas em bandejas de alta densidade, as quais podem ser utilizadas adequadamente em sistemas de transplante automatizados que incluem robôs de transplante.

Finalmente, o método que é o objecto da presente invenção, também está dirigido a melhorar os retornos financeiros da produção de plantas ao reduzir a quantidade de tempo e área requerida para a sua propagação levando a 4 cabo uma micropropagação in vitro sob condições específicas.

Revela-se no presente documento um método para a produção de plantas jovens e/ou de stock de micro-plantas parentais de plantas, mas especialmente plantas que pertencem ao grupo das plantas ornamentais herbáceas, cujo método compreende uma fase de cultura in vitro durante a qual explantes obtidos da planta parental de espécies a serem propagadas, ou derivados destes explantes, são submetidos a uma fase de micropropagação, a qual é levada a cabo sob condições adequadas e em meios de cultura adequados, com a finalidade de produzir micro-plântulas as quais, quando são submetidas a uma fase de cultura in vivo, são destinadas a desenvolverem-se em plantas ou em micro-plantas parentais, caracterizado por incluir as seguintes etapas para se realizar esta micropropagação: (a) obtêm-se explantes de planta parental de espécies a serem propagadas, ou derivados destes explantes, (b) os explantes estão, sob condições axénicas, colocados num meio de iniciação de rebentos caulinares o qual está composto de tal forma que seja adequado a cada espécie vegetal a ser propagada, e, na escuridão e durante um período de tempo adequado, crescidos de modo que se induza a formação de filamentos brancos que compreendem gemas axilares, (c) cada um dos filamentos brancos é dividido opcionalmente depois numa pluralidade de segmentos ou peças, cada um dos quais compreende uma gema axilar, (d) e os filamentos brancos e/ou peças ou segmentos dos mesmos estão, na luz, sob condições axénicas e durante um período de tempo adequado, colocados dentro ou num meio de enraizamento, o qual permite que cada gema axilar produza uma micro-plântula que tenha raízes.

Numa primeira forma de realização, o método para a produção de plantas jovens e/ou de stock de micro-plantas 5 parentais de plantas, que envolve uma etapa de micropropagação, é caracterizado pelo facto de que: (a) são obtidos caules de ramos como explantes a partir de plantas parentais de espécies a serem propagadas, (b) os explantes estão, sob condições axénicas, colocados num meio de iniciação de rebentos caulinares que está composto de tal maneira que seja adequado a cada espécie vegetal a ser propagada, e, na escuridão e durante um período de tempo adequado, crescidos de tal maneira que se induza a formação de filamentos brancos que compreendem uma ou mais gemas axilares, (c) cada um dos filamentos brancos é dividido opcionalmente depois numa pluralidade de segmentos ou peças, cada um dos quais compreende pelo menos uma gema axilar, (d) os filamentos brancos e/ou peças ou segmentos dos mesmos obtidos na etapa (b) estão, sob condições axénicas, transferidos a um meio de proliferação e crescidos na escuridão durante um período de tempo adequado suficiente para permitir que o tecido das estacas de plantas se multiplique e produza uma grande quantidade de filamentos brancos estiolados que compreendem entre 2 e 10 nós axilares, os quais se desenvolvem em rebentos caulinares, com os rebentos caulinares axilares que se estão tornar estiolados a originarem em filamentos brancos, se forem crescidos na escuridão, (e) esta etapa (d) é repetida tanto quanto seja necessário para produzir diferentes gerações consecutivas de filamentos brancos até que a quantidade desejada de filamentos brancos tenha sido obtida, (f) e os filamentos brancos ou peças dos mesmos estão, na luz, sob condições axénicas e durante um período de tempo adequado, colocados dentro ou num meio de enraizamento, o qual permite que cada gema axilar produza uma micro-plântula que tenha raízes. 6 0 meio de iniciação utilizado acima na etapa (b) e os meios de proliferação mencionados na etapa (d) podem ter uma composição idêntica ou essencialmente idêntica ou podem ser meios diferentes, dependendo dos requerimentos da espécie ou genótipo de planta utilizado no método de micropropagação de acordo com a invenção.

As condições e meios de cultura que podem ser utilizados adequadamente na micropropagação de plantas são bem conhecidos pelos peritos na especialidade de cultura de plantas e descrevem-se, por exemplo, em "Plant Propagation by Tissue Culture, Handbook and Directory of Commercial Laboratories, eds. Edwin F. George e Paul D. Sherrington, Exegetics Ltd., 1984".

Num aspecto adicional do presente método, utiliza-se como um meio de iniciação e/ou proliferação na fase de micropropagação um meio de cultura tradicional, mas especialmente um meio de cultura do tipo "MS", quer seja suplementado somente com um composto que pertence à família das citocininas de reguladores de crescimento ou suplementado com um composto que pertence à família das citocininas de reguladores de crescimento e com um composto que pertence à família das auxinas de reguladores de crescimento. Os ditos compostos reguladores de crescimento são seleccionados especificamente e são proporcionados no meio numa concentração que promove a proliferação do material vegetal a partir da espécie de planta a ser multiplicada, mas especialmente o desenvolvimento de filamentos brancos a partir das gemas axilares ou nós presentes inicialmente no material de explante e o crescimento por alongamento destes filamentos brancos de tal maneira que um número máximo de gemas axilares/por gema ou nó inicial é produzido nos filamentos em desenvolvimento, mas pelo menos entre 2 e 10 gemas axilares/por gema inicial, especificamente entre 3 e 7 gemas axilares/por gema inicial, mas especialmente entre 4 7 e 5 gemas axilares/por gema inicial, mantendo uma alta velocidade de multiplicação.

Os compostos que pertencem à família das citocininas de reguladores de crescimento e os quais podem ser utilizados no método de acordo com a presente invenção como um suplemento adequado para o meio de iniciação e/ou proliferação podem ser qualquer composto seleccionado do grupo que consiste em citocininas à base de purinas, tais como, por exemplo, cinetina, zeatina, 6-benzilaminopurina (BAP); 6-(benzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil-l0-9h-purina (PBA) ou (6- (Jr γ-dimetilalilamino)purina (2iP); e citocininas à base de fenil ureias substituídas tais como, por exemplo, tidiazuron (TDZ) ou qualquer outro composto que pertence à família das citocininas de reguladores de crescimento que seja conhecido ou tenha demostrado ser adequado para promover directamente ou indirectamente o potencial de propagação das espécies de plantas a serem multiplicadas, mas especialmente o desenvolvimento de filamentos brancos a partir das gemas ou nós axilares presentes inicialmente no material de explante e o crescimento por alongamento dos filamentos brancos em desenvolvimento de tal maneira que se produza um número máximo de gemas axilares/por gema ou nó inicial nos filamentos em desenvolvimento, mas pelo menos entre 2 e 10 gemas axilares/por gema inicial, especialmente entre 3 e 7 gemas axilares/por gema inicial, mas especialmente entre 4 e 5 gemas axilares/por gema inicial, mantendo uma alta velocidade de multiplicação.

Os compostos que pertencem à família das auxinas de reguladores de crescimento e os quais podem ser utilizados no método de acordo com a presente invenção como um suplemento adequado para o meio de iniciação e/ou proliferação podem ser qualquer composto seleccionado do grupo que consiste em ácido indol-3-butírico (IBA); ácido α-naftalenoacético (NAA); ácido indol-3-acético (IAA) e ácido 2,4-diclofenoxiacético (2,4-D) ou qualquer outro composto que pertence à família das auxinas de reguladores de crescimento que seja conhecido ou tenha demostrado ser adequado para promover directamente ou indirectamente o potencial de propagação das espécies vegetais a serem multiplicadas, mas especialmente o desenvolvimento de filamentos brancos a partir das gemas ou nós axilares presentes inicialmente no material de explante, e o crescimento por alongamento destes filamentos brancos de tal maneira que um número máximo de gemas axilares/por gema ou nó inicial se produza nos filamentos em desenvolvimento, mas pelo menos entre 2 e 10 gemas axilares/por gema inicial, especialmente entre 3 e 7 gemas axilares/por gema inicial, mas especialmente entre 4 e 5 gemas axilares/por gema inicial, mantendo uma alta velocidade de multiplicação.

Os compostos adicionais que podem ser utilizados adequadamente como um suplemento para o meio de proliferação e/ou iniciação são, por exemplo, inositol, mas especialmente um ou mais dos seus nove isómeros distintos encontrados comummente em sistemas vegetais e/ou animais, tais como mio-inositol, adicionalmente, biotina, ácido fólico, cisteína ou polivinilpirrolidona (PVP) ou qualquer outro composto que seja conhecido ou tenha demostrado suportar directamente ou indirectamente o crescimento e/ou a propagação das espécies de plantas a serem multiplicadas.

Outro composto que pode ser utilizado como um suplemento no meio de propagação de acordo com a invenção é uma fonte de carbono adequada, especialmente um composto de açúcar tal como, por exemplo, sacarose ou glicose, ou qualquer outro composto de açúcar utilizado comummente na cultura de plantas ou uma combinação dos mesmos.

Além disso, o presente método caracterizado ainda pelo facto de que se obtêm filamentos brancos que compreendem gemas axilares e que a primeira geração de filamentos 9 brancos, mas especialmente segmentos ou peças dos ditos filamentos que podem ser obtidos através, por exemplo, do corte dos filamentos numa pluralidade de peças ou segmentos definidos que contêm pelo menos uma gema axilar, são retornados sob condições axénicas e na escuridão a um meio de proliferação fresco e cultivados na escuridão durante um período de tempo adequado de modo a induzir a formação de uma nova geração de filamentos brancos de tal maneira que um número máximo de gemas axilares/por gema inicial presentes no filamento da primeira geração seja produzido nos filamentos em desenvolvimento, mas pelo menos entre 2 e 10 gemas axilares/por gema inicial, especificamente entre 3 e 7 gemas axilares/por gema inicial, mas especialmente entre 4 e 5 gemas axilares/por gema inicial, mantendo um alta velocidade de multiplicação. 0 procedimento pode ser repetido tanto quanto seja necessário para produzir diferentes gerações consecutivas de filamentos brancos até que se tenha obtida a quantidade de filamentos brancos desejada.

Assim, a presente invenção torna adequadamente possível propor uma técnica que pode ser definida para uma dada espécie de planta, em particular uma espécie vegetal que pertence ao grupo das plantas ornamentais herbáceas por uma sequência de operações padronizadas nas quais o tipo dos meios e as condições de cultura podem, se for requerido, ser adaptados especificamente para serem adequados a variedades ou grupos de variedades dentro destas espécies e com a finalidade de incrementar a velocidade de propagação vegetativa e manter esta alta velocidade de propagação durante um ou mais, especificamente durante até 10, mais especificamente mais de até 5, ciclos de propagação na escuridão.

As plantas que podem ser utilizadas num processo de acordo com a presente invenção são plantas que pertencem ao grupo de plantas ornamentais herbáceas tais como plantas 10 das famílias Adiantáceas, Amarantáceas, Amarillidáceas, Apiáceas, Apocináceas, Aracéas, Araliáceas, Asclepiadáceas, Aspleniáceas, Asteráceas, Atiriáceas, Balsamináceas,

Begoniáceas, Carofiláceas, Fumariáceas, Lamináceas, Osmundáceas, Portulacáceas,

Buxáceas; Campanuláceas, Canáceas,

Crasuláceas, Driopteridáceas, Euforbiáceas, Geraniáceas, Hyperáceas, Iridáceas,

Liliáceas, Lobeliáceas; Nictagináceas, Piperáceas, Plumbagináceas, Poáceas,

Ranunculáceas, Rosáceas, Saururáceas,

Saxifragáceas, Escrofulariáceas, Solanáceas, Verbenáceas e

Violáceas, em particular, plantas que pertençam ao grupo de pelargónio, petúnia incluindo petúnia Cascade, estrela-de-natal, cíclame, crisântemo, Impatiens walleriana, verbena ou torénia, mas especialmente pelargónio.

Numa forma de realização da presente invenção, a implementação do presente método tem como resultado uma primeira variante em que, com a finalidade de obter uma planta parental livre de bactérias e vírus, meristemas, especialmente meristemas em crescimento, mas especialmente meristemas de brote, são tomadas de uma planta parental e utilizam-se como explantes que se cultivam sob condições axénicas na luz durante um primeiro período de tempo num meio de desenvolvimento comum para cada variedade vegetal, suficiente para ocasionar a formação de plântulas pequenas as quais têm primeiras primórdios foliares e em seguida, durante um segundo período de tempo, em ou dentro de um meio de enraizamento comum para cada variedade vegetal, com a finalidade de obter plântulas enraizadas as quais estão livres de bactérias e vírus e que se pretende que sejam colocadas num meio de iniciação de rebentos caulinares na escuridão com a finalidade de produzir os filamentos brancos de acordo com a invenção.

As condições e meios de cultura que podem ser utilizados adequadamente na cultura de meristemas vegetais bem como para enraizar as plântulas obtidas por meio desta 11 cultura são bem conhecidos por aqueles peritos na especialidade de cultura de plantas e descrevem-se, por exemplo, em "Plant Propagation by Tissue Culture, Handbook and Directory of Commercial Laboratories, eds. Edwin F. George e Paul D. Sherrington, Exegetics Ltd., 1984".

Nesta situação, de acordo com uma característica do presente método, o volume do meio de enraizamento utilizado é suplementado de uma maneira adequada durante a fase de enraizamento das ditas plântulas. As plântulas enraizadas são depois transferidas ao solo ou a qualquer outro meio de suporte adequado utilizado comummente na prática de cultura de plantas para cultivar plantas jovens, aclimatadas a condições ambientais alteradas tais como aquelas presentes numa estufa e crescidas aí durante um período de tempo adequado, mas pelo menos durante 4 semanas a 10 semanas, especialmente durante 5 semanas a 6 semanas.

As plantas podem ser submetidas depois a um sistema de teste adequado para detectar e descartar material vegetal que esteja infectado com patogénios virais e/ou bacterianos tais como, por exemplo, uma teste do tipo "ELISA" e quaisquer amostras cujo teste deu positivo são eliminadas, enquanto que aquelas que dão negativo são conservadas como plantas parentais livres de bactérias e vírus e utilizam-se como uma fonte de explantes.

Numa forma de realização da invenção, as folhas e raízes das plântulas são suprimidas durante um período de tempo adequado antes de serem colocadas, sob condições axénicas e na escuridão, num meio de iniciação de rebentos caulinares que seja específico para cada variedade com a finalidade de produzir os filamentos brancos.

Em outra forma de realização da invenção, obtêm-se micro-estacas a partir das plantas parentais livres de bactérias e vírus que podem ser obtidas através de uma cultura de meristemas como foi descrito anteriormente na presente e utilizam-se como explantes. Como alternativa, 12 plantas parentais certificadas livres de bactérias e vírus que podem ser compradas de uma fonte comercial podem ser utilizadas para obter micro-cortes. Em particular, ramos, mas especialmente pontas de rebentos caulinares que compreendem uma ou mais gemas axilares são tomadas e cortadas em peças com cada peça contendo pelo menos uma gema.

De acordo com uma forma de realização específica da invenção, as folhas e as estipulas da porção apical dos micro-cortes são suprimidas durante um período de tempo adequado antes de serem colocadas, sob condições axénicas e na escuridão, num meio de iniciação de rebentos caulinares que seja específico para cada variedade vegetal, com a finalidade de produzir os filamentos brancos.

De acordo com outra característica vantajosa do presente método, os filamentos brancos que têm gemas axilares podem ser armazenados durante um dado período de tempo antes da fase de enraizamento, tempo durante o qual cada gema produz uma micro-planta parental enraizada que é destinada a ser cultivada in vivo.

Revelam-se adicionalmente as micro-plântulas, plantas jovens e micro-plantas parentais obtidas ao levar a cabo o método como foi definido anteriormente no presente documento. 0 método da presente invenção leva a plantas jovens as quais se distinguem em particular por uma velocidade de ramificação aumentada, crescimento rápido, folhagem compacta, auto-regulação da planta, mas especialmente a plantas jovens seleccionadas do grupo que consiste em pelargónio, petúnia incluindo petúnia Cascade, estrela-de-natal, ciclame, crisântemo, Impatiens walleriana, verbena e torénia. A presente invenção também se refere às características que serão observadas a partir da descrição 13 a seguir, e as quais devem ser consideradas isoladas ou de acordo com qualquer combinação possível das mesmas. 0 método de acordo com a invenção compreende uma fase de cultura " in vitro" durante a qual tecidos vegetais estão, sob condições axénicas, submetidos a tratamentos diferentes, em particular de micropropagação, tratamentos que são levados a cabo sob condições específicas para fazer com que estes tecidos vegetais se multipliquem exponencialmente e produzam uma grande quantidade de plântulas que são destinadas a se desenvolver durante uma fase " in vivo", quer seja directamente em plantas ou em micro-planta parental destinada a actuar por si mesma como um material de partida para obter plantas.

Espera-se além disso que o método de acordo com a invenção seja adequado para ser aplicado quer seja a plântulas obtidas a partir de meristemas tomados de qualquer planta parental, ou a micro-cortes tomados de uma planta parental saudável, em particular plantas parentais certificadas livres de bactérias ou vírus.

Assim, a variante do método que se baseia na utilização de meristemas e que tem a vantagem de levar a uma desinfecção de plantas parentais que podem ser atacadas por qualquer patogénio requer etapas suplementares de obtenção de plântulas. Para este fim, meristemas, mas especialmente meristemas desenvolvidos com os primeiros primórdios foliares são obtidos e primeiro crescem durante um período de aproximadamente 4 meses na luz num recipiente adequado tal como, por exemplo, uma placa de Petri, um frasco ou pote de vidro, num meio de desenvolvimento cuja composição é vantajosamente comum para todas as espécies de plantas às quais se refere o presente método, por exemplo, um dos meios de cultura de plantas tradicionalmente utilizado tal como, por exemplo, um meio de cultura do tipo "MS" (macro e microelementos MS; vitaminas MS) que é 14 suplementado com compostos que pertençam à família das citocininas de reguladores de crescimento.

As plântulas pequenas obtidas dos meristemas desenvolvidos, são colocadas posteriormente em ou dentro um meio de enraizamento cuja composição é idêntica, qualquer que seja a espécie de planta, preferivelmente um meio de enraizamento utilizado tradicionalmente na cultura de plantas tal como, por exemplo, um meio de cultura do tipo "MS", na luz, para obter plântulas pequenas, as quais, aproximadamente depois de um mês, são transferidas para um recipiente adequado tal como, por exemplo, um frasco de vidro ou pote de vidro, que permita que se aumenta o volume de raízes. Para promover adicionalmente o desenvolvimento de raízes pode ser utilizado um recipiente ventilado.

Depois deste procedimento são obtidos plântulas enraizadas que estão prontas para entrar na fase de micropropagação in vitro real, da mesma maneira que as micro-estacas obtidas a partir de uma planta parental saudável tal como, por exemplo, plantas parentais certificadas cultivadas na estufa sob condições fitossanitárias controladas.

Numa forma de realização especifica da invenção, as plântulas ou micro-estacas, antes de serem submetidas a um tratamento de micropropagação, são primeiro rejuvenescidas ao, por exemplo, suprimir as raízes e as folhas, e em seguida são colocadas num meio de iniciação de rebentos caulinares o qual se desenvolve especificamente para ser adequado à variedade vegetal a ser propagada e o qual é disperso num recipiente adequado tal como uma placa de Petri.

Em particular, folhas e, se estiverem presentes, raízes, são removidas do caule ou ramos da planta a ser micropropagada e, preferivelmente, esterilizam-se as suas superfícies. Depois se cortam em peças ou segmentos e cada peça ou segmento contém pelo menos um nó ou gema axilar. Os 15 cortes são transferidos a um meio de iniciação de rebentos caulinares e cultivados na escuridão sob condições e durante um período de tempo, que permitam que os cortes de plantas se multipliquem e produzam uma grande quantidade de filamentos brancos estiolados que compreendem um alto número de nós axilares, os quais originam plântulas destinadas a desenvolverem-se durante uma fase "in vivo" se crescidas na luz; ou a desenvolver rebentos caulinares com os rebentos caulinares axilares que estão a se tornarem estiolados em filamentos brancos, se crescidos na escuridão. A cultura na escuridão de cortes de plantas bem como de cortes obtidos de filamentos brancos estiolados que compreendem pelo menos uma gema ou nó axilar é levada a cabo durante um período de tempo suficiente para permitir que os nós axilares ou gemas axilares se desenvolvam em rebentos caulinares, e os rebentos caulinares axilares que estão a se tornarem estiolados em filamentos brancos que compreendem gemas axilares, com o número de gemas axilares produzidas nos filamentos em desenvolvimento equivalendo a pelo menos entre 2 e 10 gemas axilares/por nó inicial presente no corte, especificamente entre 3 e 7 gemas axilares/por nó inicial presente no corte, mas especialmente entre 4 e 5 gemas axilares/por nó inicial presente no corte, mas pelo menos durante um período de entre aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 12 semanas, especificamente de entre aproximadamente 3 semanas a aproximadamente 7 semanas, mais especificamente de entre aproximadamente 4 semanas a aproximadamente 5 semanas, mas especialmente de aproximadamente 4 semanas.

Numa forma de realização especifica, para a iniciação e manutenção de rebentos caulinares os explantes vegetais são colocados horizontalmente no meio de cultura e crescidos sob condições, as quais forçam os rebentos caulinares em desenvolvimento a crescer essencialmente em 16 forma horizontal. Isto pode ser alcançado ao cultivar os explantes num recipiente tal como uma placa de Petri, a qual é desenhada de tal maneira que evita que o explante cresça verticalmente devido a limitações de espaço na direcção vertical. Para os rebentos caulinares em desenvolvimento é preferível que estejam em contacto íntimo com o meio de cultura e se estabeleça mais de um único ponto de contacto com o meio durante a micropropagação.

De acordo com o presente método, é vantajoso utilizar um meio de iniciação e/ou proliferação que tenha substancialmente a mesma composição básica que o meio de desenvolvimento e meio de enraizamento mencionados acima, por exemplo uma composição à base da presença tradicional de macro e microelementos e vitaminas tais como, por exemplo, aquelas presentes nos meios MS utilizados comummente. A composição e concentração dos macro e microelementos e vitaminas dentro destes meios podem variar até certo grau dependendo da espécie ou genótipo da planta envolvida. Tais adaptações menores estão dentro da capacidade do perito na especialidade na área de cultura de plantas e é parte do seu trabalho de optimização de rotina. Por exemplo, quando se utiliza um meio do tipo MS provou-se que é vantajoso em alguns casos utilizar concentrações reduzidas de macro-e/ou microelementos e/ou vitaminas, especialmente uma concentração que estabeleça por si mesma em algum ponto entre uma concentração de potência completa e potência média, mas em particular, uma concentração de potência média.

Esta composição básica pode ser suplementada ainda por meio da adição de compostos que pertencem à familia das citocininas de reguladores de crescimento ou por meio da adição simultânea de compostos que pertencem à família das citocininas de reguladores de crescimento e compostos que pertençam à família das auxinas de reguladores de 17 crescimento, dependendo da espécie vegetal a ser propagada, cujos compostos suportam a multiplicação dos rebentos caulinares ao promover a ruptura e desenvolvimento de gemas axilares em rebentos caulinares estiolados e ainda em filamentos brancos, e/ou o crescimento, mas especialmente o crescimento por alongamento dos rebentos caulinares em desenvolvimento em rebentos caulinares que compreendem um alto número de nós axilares.

Numa forma de realização especifica, utiliza-se uma abordagem de cultura de duas camadas no método de acordo com a invenção, em que o meio de cultura de plantas é proporcionado na forma de um sistema de duas camadas que compreende uma camada inferior solidificada que compreende essencialmente macro e microelementos, vitaminas e uma fonte de carbono como será descrito no presente documento a seguir, mas sem regulador de crescimento, a qual é coberta com uma camada superior fluida que compreende um regulador de crescimento, especialmente um regulador de crescimento que pertence à família das citocininas de reguladores de crescimento ou uma combinação de reguladores de crescimento que pertencem à família das citocininas de reguladores de crescimento já a família das auxinas de reguladores de crescimento, dependendo da espécie vegetal a ser propagada, estes reguladores de crescimento suportam a multiplicação dos rebentos caulinares ao promover a ruptura e desenvolvimento de gemas axilares em rebentos caulinares estiolados (filamentos brancos) e/ou o crescimento, mas especialmente o crescimento por alongamento dos rebentos caulinares em desenvolvimento em rebentos caulinares que compreendem um alto número de nós axilares. A camada superior fluida pode conter, além dos reguladores de crescimento que pertencem à família das citocininas e/ou à família das auxinas de reguladores de crescimento, outros reguladores de crescimento de uma família diferente de reguladores de crescimento tais como, 18 por exemplo, reguladores de crescimento que pertençam à família giberelina de reguladores de crescimento, o qual se sabe que promovem o alongamento de rebentos caulinares. A camada superior fluida pode conter além disso compostos que suportam o crescimento do rebento em desenvolvimento tais como, por exemplo, macro e microelementos, vitaminas e uma fonte de carbono. 0 volume da camada superior fluida em comparação com a camada inferior sólida equivale a entre aproximadamente 1 % e aproximadamente 10 %, especificamente entre aproximadamente 2 % e aproximadamente 7 %, mais especif icamente entre aproximadamente 3 % e aproximadamente 5 %, mas especialmente entre aproximadamente 3 % e aproximadamente 4 O. o ·

Numa forma de realização específica da invenção, é levada a cabo a cultura de duas camadas num recipiente adequado utilizado comummente na cultura de plantas tal como, por exemplo, um frasco de vidro ou um pote de vidro com um tamanho grande o suficiente para permitir que os filamentos brancos em desenvolvimento cresçam adequadamente. Os recipientes podem, além disso, ser ventilados para suportar assim o crescimento e desenvolvimento dos filamentos brancos.

Os compostos que pertencem à família das citocininas de reguladores de crescimento e os quais podem ser utilizados no método de acordo com a presente invenção como um suplemento adequado para o meio de iniciação e/ou proliferação podem ser qualquer composto seleccionado do grupo que consiste em cinetina, zeatina, 6-benzilaminopurina (BAP); 6-(benzilamino)-9-(2-tetrahidropiranil-10-9h-purina (PBA); ou (6- (γ,γ-dimetilalilamino)purina (2iP) e tidiazuron (TDZ) ou qualquer outro composto que pertence à família das citocininas de reguladores de crescimento que seja 19 conhecido ou tenha demostrado ser adequado para a propagação das espécies vegetais a serem multiplicadas.

Os compostos que pertencem à família das citocininas de reguladores de crescimento são oferecidos no meio de iniciação e/ou proliferação de acordo com a invenção numa concentração de entre 0,01 mg/1 e 5,0 mg/1 - 7,0 mg/1, especificamente entre 0,03 e 2,0 mg/1, mais especificamente entre 0,04 e 1,0 mg/1, mas especialmente entre 0,05 e 0,5 mg/1.

Pode ser necessário fazer adaptações dentro dos intervalos definidos acima com a finalidade de acomodarem-se às necessidades específicas da espécie vegetal a ser multiplicada.

Os compostos que pertencem à família das auxinas de reguladores de crescimento e os quais podem ser utilizados no método de acordo com a presente invenção como um suplemento adequado para o meio de iniciação e/ou proliferação podem ser qualquer composto seleccionado do grupo que consiste em ácido indol-3-butírco (IBA); ácido a-naftalenacético (NAA); ácido indol-3-acético (IAA); e ácido 2,4-diclofenoxiacético (2,4-D) ou qualquer outro composto que pertence à família das auxinas de reguladores de crescimento que seja conhecido ou tenha demostrado ser adequado para a propagação da espécie vegetal a ser multiplicada.

Os compostos que pertencem à família das auxinas de reguladores de crescimento são oferecidos no meio de iniciação e/ou proliferação de acordo com a invenção numa concentração de entre 0,01 mg/1 e 5,0 mg/1, especificamente entre 0,03 e 2,0 mg/1, mais especif icamente entre 0,04 e 1,0 mg/1, mas especialmente entre 0,05 e 0,5 mg/1.

Pode ser necessário fazer adaptações dentro dos intervalos definidos acima com a finalidade de acomodarem-se às necessidades específicas da espécie vegetal a ser multiplicada. 20

Sabe-se que algumas das substâncias promotoras de crescimento tais como compostos que pertencem ao grupo das fenil ureias substituídas, por exemplo, tidiazuron (TDZ), em separado ou em combinação com outro composto da família das citocininas de reguladores de crescimento, tais como, por exemplo, 6- benzilaminopurina (BAP) são potentes estimuladores da formação de muitos rebentos caulinares. Sabe-se também que estas substâncias são bastante persistentes e altamente activas já a baixas concentrações num intervalo de entre 0,001 mg/1 e 0,1 mg/1, mas podem, em alguns casos, causar alguns efeitos indesejáveis tais como, por exemplo, aberrações em órgãos ou um crescimento de rebentos caulinares atrofiados.

Estes efeitos não desejados podem ser compensados pela adição de um regulador de crescimento do tipo giberelina tal como ácido giberélico, o qual promove o alongamento dos rebentos caulinares. mais

Outra possibilidade de evitar efeitos indesejáveis causados pela presença de reguladores de crescimento, mas especialmente reguladores de crescimento que podem afectar negativamente o crescimento e alongamento dos rebentos caulinares tais como, por exemplo, TDZ, no meio de iniciação e/ou proliferação, é a aplicação de uma abordagem de cultura de duas camadas como foi mencionado no presente documento anteriormente, por meio do qual os compostos que pertencem ao grupo das fenil ureias substituídas tais como, por exemplo, tidiazuron (TDZ), em separado ou em combinação com outro composto da família das citocininas de reguladores de crescimento tais como, por exemplo, 6-benzilaminopurina (BAP) somente estão presentes na camada superior fluida numa concentração alta o suficiente para promover a multiplicação dos rebentos caulinares, mas baixa o suficiente para evitar que ocorra qualquer efeito não desejado, mas especificamente numa concentração de aproximadamente entre 0,001 mg/1 e 2,0 mg/1, 21 especificamente entre aproximadamente 0,005 e 1,0 mg/1, e especialmente entre 0,01 e 0,1 mg/ml.

Compostos adicionais que podem ser utilizados adequadamente como um suplemento para o meio de iniciação e/ou proliferação são, por exemplo, inositol, mas pelo menos um dos seus nove isómeros distintos, tais como mio-inositol, além disso, biotina, ácido fólico, cisteína ou polivinilpirrolidona (PVP) ou qualquer outro composto que seja conhecido ou tenha demostrado promover directamente ou indirectamente o potencial de crescimento e/ou propagação da espécie vegetal a ser multiplicada.

Outro composto que pode ser utilizado como um suplemento no meio de propagação de acordo com a invenção é uma fonte de carbono adequada, especialmente um composto de açúcar tal como, por exemplo, sacarose ou glicose, ou qualquer outro composto de açúcar utilizado comummente na cultura de plantas, ou uma combinação dos mesmos.

Os filamentos brancos obtidos neste ou em qualquer outro ciclo de propagação adicional podem ser colocados na escuridão sob condições que permitam a conservação dos filamentos para o seu posterior enraizamento ou como uma planta parental para rondas de propagação adicionais. Por exemplo, os filamentos armazenados a uma temperatura entre 2 °C e 10 °C, especif icamente entre 3 °C e 8 °C, mas especificamente entre 4 °C e 6 °C podem ser armazenados durante pelo menos até 10 meses, especificamente durante pelo menos até 7 meses, mas especialmente durante pelo menos até 5 meses.

Assim, a fase de micropropagação pode ser levada a cabo vantajosamente de novo, tanto quanto seja necessário em ciclos de entre aproximadamente 3 semanas a 12 semanas, especificamente de entre aproximadamente 4 semanas a 6 semanas, mas especialmente de entre aproximadamente 4 semanas a 5 semanas, com a finalidade de obter grandes quantidades de filamentos brancos. 22

De acordo com uma característica adicional do presente método, o qual permite que a qualidade das plantas produzidas seja assegurada em termos de saúde, as plantas resultantes da cultura de meristemas e/ou os filamentos brancos são submetidos a um sistema de testes adequado tal como, por exemplo, um teste do tipo "ELISA" e quaisquer amostras cujo teste deu positivo são eliminadas, enquanto que aquelas cujo teste deu negativo são conservadas.

Em segundo lugar, de acordo com outra caracteristica vantajosa, é possivel armazenar durante tanto tempo como seja necessário as porções de filamentos brancos na escuridão a temperatura ambiente num meio de proliferação que é substituído periodicamente, antes da fase de enraizamento durante a qual cada gema produz uma micro-plântula enraizada que está destinada à cultura in vivo. Várias espécies vegetais foram submetidas já a um tratamento de micropropagação de acordo com o método da presente invenção.

Assim foi possivel demostrar que, por meio da utilização de um meio do tipo "MS" tradicional suplementado com citocininas ou uma combinação de citocininas e auxinas como um meio de iniciação e de proliferação de rebentos caulinares, foram produzidas de maneira bem-sucedida micro-plântulas de pelargónio, por exemplo, de gerânio zonal, de gerânio de hera dupla, ou de gerânio de hera simples, bem como micro-plântulas de petúnia e osteospermo.

Além disso, o método de acordo com a invenção também pode ser aplicado a outras espécies de plantas que pertencem ao grupo de plantas ornamentais herbáceas tais como, por exemplo, plantas de petúnia incluindo petúnia Cascade, calancói, torénia, verbena e roseira para produzir de maneira bem-sucedida micro-plântulas.

Além disso, ao aplicar o método de acordo com a invenção também se descobriu que as plantas jovens ou 23 micro-planta parental obtida a partir de micro-plântulas tiveram características particularmente interessantes.

As plantas produzidas através deste método apresentam naturalmente um grau de ramificação muito alto, rápido enraizamento, crescimento homogéneo em termos de volume, rápido endurecimento da planta, uma área foliar que é menor que aquela das plantas obtidas em métodos de cultura tradicionais, e um carácter juvenil pronunciado, o qual pode ser observado em particular a partir de micro-plântulas de gerânio zonal, uma micro-planta parental de gerânio zonal e uma micro-planta parental de petúnia Cascade, respectivamente. 0 presente método oferece também uma solução adequada que torna possível uma produtividade e flexibilidade melhoradas no processo de produção em comparação com as técnicas de cultura tradicionais, em particular ao reduzir as superfícies que são alocadas tradicionalmente à cultura de planta parental por um factor de quatro.

Além disso, ao aplicar o método de acordo com a invenção seria possível alcançar velocidades de proliferação que são muito mais altas que aquelas obtidas até o momento realizando a fase de proliferação na luz. Se for assumido que cada filamento branco obtido de uma plântula de partida seja capaz de proporcionar pelo menos cinco gemas axilares por mês, as quais, por si mesmas, são capazes de proporcionar cinco micro-plântulas enraizadas, cada uma das quais, por sua vez, é capaz de proporcionar cinco filamentos brancos por mês, isto levaria, depois de 9 ciclos de micropropagação de um mês, a aproximadamente 2 milhões de plantas obtidas a partir de uma única plântula de partida.

Além disso, a implementação do presente método oferece além disso muitas vantagens que são reflectidas nas diferentes redes hortícolas envolvidas, em particular, numa melhora da administraçao de pedidos, e na qualidade vegetal mais alta.

Os seguintes exemplos de trabalho referem-se a exemplos para implementar o presente método, os quais são dados por meio de ilustração e não por meio de limitação e os quais se referem à produção de plantas de pelargónio, petúnia e osteospermo, mais especificamente à produção de plantas que pertencem a diferentes variedades ou genótipos de pelargónio, petúnia e osteospermo.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Petúnia 1,1 Material vegetal e estiolamento

Plantas parentais de petúnia certificadas são crescidas na estufa durante pelo menos 6 semanas sob condições fitossanitárias controladas. Obtêm-se ramos das plantas parentais e utilizam-se como explantes para multiplicação e estiolamento de rebentos caulinares.

Todas as folhas são retiradas dos ramos e os ramos desfoliados têm a superfície esterilizada com uma solução de hipoclorito de sódio a 1,3 % (branqueador comercial a 30 %) durante 10 minutos e são lavadas três vezes com água destilada estéril.

Depois da esterilização, os ramos desfoliados são cortados em peças sob condições axénicas, cada peça contendo um ou dois nós.

Os explantes são colocados horizontalmente num meio de iniciação de rebentos caulinares solidificado numa placa de Petri, com um máximo de três explantes por placa de Petri. As placas de Petri são vedadas com Nescofilm.

Para o estiolamento utilizam-se dois meios à base de MS para a iniciação dos rebentos caulinares, MSI e MS1-2. Os dois meios diferem essencialmente na concentração dos macroelementos MS em que o meio MS1-2 contém os macroelementos somente numa concentração de potência média. Ambos meios podem ser utilizados para a iniciação e 25 estiolamento de rebentos caulinares de explantes de petúnia, mesmo apesar de que certos genótipos parecem ter preferências por um ou outro meio. 0 meio MSI contém micro sais MS + macro sais MS + vitaminas MS, sacarose como uma fonte de carbono, mio-inositol, biotina e ácido fólico como vitaminas não MS adicionais, PVP (polivinilpirrolidona) como um suplemento adicional e BAP (6-benzilaminopurina) e 2iP (2-isopentenil-adenina) como hormonas de crescimento da família das citocininas de reguladores de crescimento. 0 meio é solidificado com agar vegetal. 0 pH é fixo a 5,8 antes de esterilizar em autoclave (para detalhes adicionais da composição do meio veja-se a seguir o quadro A). 0 meio MS1-2 contém macro sais MS de potência média + micro sais MS completas e vitaminas MS, sacarose como uma fonte de carbono, mio-inositol, biotina e ácido fólico como vitaminas não MS adicionais, PVP (polivinilpirrolidona) como um complemento adicional e BAP (6-benzilaminopurina) e 2iP (2-isopentenil-adenina) como hormonas de crescimento da família das citocininas de reguladores de crescimento. 0 meio é solidificado com agar vegetal. 0 pH é fixo a 5,8 antes de esterilizar em autoclave (para detalhes adicionais da composição do meio veja-se o quadro A a seguir).

Os explantes são crescidos na escuridão durante quatro semanas a uma temperatura de entre 18 °C e 20 °C. Em geral 60 % - 90 % dos explantes formarão filamentos (veja-se quadro 1 a seguir):

Depois de quatro a cinco semanas de cultura na escuridão os rebentos caulinares axilares são estiolados para criar filamentos brancos. Cada filamento tem um ou mais nós axilares.

Quadro 1: Número de filamentos por explante depois de quatro semanas

Genótipo MSI MS1-2 A971-1 3,0 5, 0 26 A895-3 4,5 O 00 A1019-1 - 6,2 A938-5 5, 0 1,0 A1010-3 O LO 17,0 A948-1 6,0 10 média 3,9 7,9 1.2 Proliferação

Para a manutenção, os filamentos brancos obtidos no Exemplo 1.1 são cortados em peças que contêm um ou dois nós axilares e são transferidos a meio MSI ou MS1-2 fresco em placas de Petri. Para conservar a planta parental as placas de Petri podem ser colocadas na escuridão a 4 °C durante pelo menos quatro meses.

Para uma proliferação eficiente utilizam-se filamentos que contêm mais de um nó axilar. No entanto, resultados satisfatórios também podiam ser obtidos com filamentos que contêm somente um nó axilar como o material de partida.

Os filamentos ou peças dos mesmos obtidos através da clivagem dos filamentos que compreendem entre 2 e 6 nós axilares são crescidos em frascos de vidro que contêm 66 ml de meio. 0 meio é SPl, o qual contém macro sais MS modificados, micro sais MS + vitaminas MS, sacarose como a fonte de carbono, mio-inositol, biotina, ácido fólico como vitaminas não MS adicionais, BAP (6- benzilaminopurina) como um representante da família das citocininas de reguladores de crescimento, e IAA (ácido indol- 3-acético) como um representante da família das auxinas de reguladores de crescimento. 0 meio é solidificado com agar vegetal (para detalhes adicionais da composição do meio veja-se o quadro A a seguir). 6 filamentos ou peças dos mesmos são colocados num frasco, com o primeiro nó justo abaixo da superfície do agar. Os frascos são colocados na escuridão a uma temperatura de entre 18 °C e 22 °C durante 5-6 semanas. 27

Depois de cinco a oito semanas ciclos de subcultura adicionais podem ser levados a cabo seguindo essencialmente o mesmo procedimento como foi descrito acima.

Em cada subcultura a velocidade de proliferação ou velocidade de multiplicação pode ser determinada ao dividir o número de filamentos formados (depois de separar ou cortar o tecido de volta ao número original de nós) pelo número inicial de filamentos. As velocidades de proliferação são determinadas para 6 genótipos para 2 subculturas consecutivas de entre 4 a 5 semanas (veja-se quadro 2 a seguir)

Quadro 2: Velocidades de proliferação de genótipos subcultura 1 2 A971-1 7,0 5, 5 A895-3 3,0 00 A1019-1 3,0 4,2 A938-5 1,0 00 LO A1010-3 O CM 1,4 A948-1 3,5 O co média 3,3 5, 0 1.3 Enraizamento

Para o enraizamento utilizam-se explantes menores. Cada filamento contém um ou dois nós axilares. Os explantes são transferidos a recipientes ventilados (caixas Ecoline com filtro XXL). 0 meio de enraizamento é MSO-2 (macro sais MS de potência média, micro sais MS de potência completa e vitaminas MS, sacarose como a fonte de carbono, mio-inositol, biotina, ácido fólico como vitaminas não MS adicionais e agar vegetal como o agente de solidificação) ou RAI2-2 (macro sais MS de potência média, micro sais MS de potência completa e vitaminas MS, sacarose como a fonte de carbono, mio-inositol, biotina, ácido fólico como vitaminas não MS adicionais, ácido indol-acético, ácido 28 indol-butírico como reguladores de crescimento da família das auxinas de reguladores de crescimento e agar vegetal como o agente de solidificação).

Ambos meios podem ser utilizados e darão resultados similares. As plantas são enraizadas durante quatro semanas a uma temperatura de entre 18 °C e 22 °C num fotoperíodo de 16 horas de aproximadamente 3.000 lux. As percentagens de enraizamento são determinadas depois de 4-6 semanas.

As plântulas enraizadas são retiradas dos recipientes e são lavadas com água para remover traços de resíduos de meio e agar. As plântulas são transferidas ao solo na estufa a 20 °C onde se aclimatam e se tratam como plantas de cultura de tecido normais.

Exemplo 2: Osteospermo 2.1 Material vegetal e estiolamento

Plantas parentais de osteospermo certificadas são crescidas na estufa durante pelo menos 6 semanas sob condições fitossanitárias controladas. Obtêm-se ramos das plantas parentais e utilizam-se como explantes para a multiplicação e estiolamento dos rebentos caulinares.

Todas as folhas são retiradas dos ramos e os ramos desfoliados têm a superfície esterilizada com uma solução de hipoclorito de sódio a 1,3 % (branqueador comercial a 30 %) durante 10 minutos e são lavadas três vezes com água destilada estéril.

Depois da esterilização, os ramos desfoliados são cortados em peças sob condições axénicas, cada peça contendo um ou dois nós axilares. Os explantes são colocados horizontalmente num meio de iniciação de rebentos caulinares solidificado numa placa de Petri, com um máximo de dois explantes por placa de Petri. As placas de Petri são vedadas com Nescofilm.

Para o estiolamento utilizam-se dois meios à base de MS, MS1-2 e MS2Z, os quais diferem essencialmente na concentração dos macroelementos MS e a composição de 29 hormonas de crescimento. Ambos meios podem ser utilizados para a estiolamento de explantes de osteospermo, mesmo apesar de que certos genótipos pareçam ter preferência por um ou outro meio. 0 meio MS1-2 contém macro sais MS de potência média + micro sais MS de potência completa e vitaminas MS, sacarose como uma fonte de carbono, mio-inositol, biotina e ácido fólico como vitaminas adicionais, PVP (polivinilpirrolidona) como um complemento adicional, e BAP (β-benzilaminopurina) e 2iP (2-isopentenil-adenina) como representantes de factores de crescimento da família das citocininas de reguladores de crescimento. 0 meio é solidificado por meio da adição de agar vegetal. 0 pH é fixo a 5,8 antes de esterilizar em autoclave (para detalhes adicionais da composição do meio veja-se o quadro A à seguir). 0 meio MS2Z contém micro sais MS de potência média + macro sais MS + vitaminas MS, sacarose como uma fonte de carbono, mio-inositol, biotina e ácido fólico como vitaminas não MS adicionais e zeatina como o factor de crescimento da família das citocininas de reguladores de crescimento. 0 meio é solidificado por meio da adição de agar vegetal. 0 pH é fixo a 5,8 antes de esterilizar em autoclave (para mais detalhes da composição do meio veja-se quadro A a seguir).

Os explantes são crescidos na escuridão a uma temperatura de 18 °C (veja-se quadro 3 a seguir). Depois de quatro semanas de cultura na escuridão os rebentos caulinares axilares são estiolados em filamentos brancos. Cada filamento tem um ou mais nós axilares.

Quadro 3: Número de filamentos por explante depois de quatro semanas genótipo MS1-2 MS2Z E192-1 0, 75 0 30 D209-3 0 0 E207-2 3,3 2,2 E206-1 0,6 0,3 média 1,2 0,6 2.2 Proliferação 2.2.1 Cultura de uma única camada Os filamentos brancos obtidos no Exemplo 2.1 são cortados em peças que contêm um ou dois nós e são transferidos a MSI- -2 fresco em placas de Petri para manutenção depois de quatro-cinco semanas. Para conservar a planta parental as placas de Petri podem ser colocadas na escuridão a 4 °C durante pelo menos quatro meses.

Para uma proliferação eficiente utilizam-se filamentos que contêm pelo menos dois nós axilares. As etapas adicionais são levadas a cabo essencialmente como foi descrito no Exemplo 1.2 para petúnia.

Quadro 4: Velocidade de proliferação de filamentos depois de quatro semanas em placas de Petri genótipo Sub 1 Sub 2 E192-1 1,0 4,7 D209-3 co o 4,3 E207-2 oo 6,5 E206-1 5,5 4,5 média 3,0 5,0 2.2.2 Cultura de camada dupla

Num segundo experimento os filamentos brancos ou peças dos mesmos obtidos através de corte e que compreendem pelo menos dois nós axilares são crescidos em frascos de vidro que contêm 66 ml de meio. 0 meio é MSO, o qual contém micro sais MS modificadas + macro sais MS + vitaminas MS, sacarose como a fonte de carbono, mio- inositol, biotina, ácido fólico como vitaminas não MS adicionais e agar vegetal como um agente de solidificação (para detalhes 31 adicionais da composição do meio veja-se quadro A a seguir).

Aproximadamente 5 filamentos são colocados num frasco, com o primeiro nó justo abaixo da superfície do agar. Depois, 2 ml de meio líquido BI (micro sais MS + macro sais MS + vitaminas MS, sacarose como a fonte de carbono, mio-inositol, biotina, ácido fólico como vitaminas não MS adicionais e zeatina e BAP (6-benzilaminopurina) como reguladores de crescimento da família das citocininas de reguladores de crescimento (para mais detalhes da composição do meio veja-se quadro A a seguir)) são adicionados na parte superior do meio sólido. Para 100 ml de meio sólido BI serão utilizados 3 ml de líquido. Os frascos são colocados na escuridão a 18 °C-22 °C durante cinco semanas.

Em cada subcultura a velocidade de proliferação ou velocidade de multiplicação pode ser determinada ao dividir o número de filamentos formados (depois de separar ou cortar o tecido de volta ao número original de nós) pelo número inicial de filamentos. 2.3 Enraizamento

Para o enraizamento utilizam-se explantes menores. Cada filamento contém um ou dois nós axilares. Os explantes são transferidos a recipientes ventilados (caixas Ecoline com filtro XXL). 0 meio de enraizamento é MSO-2 (macro sais MS de potência média, micro sais MS de potência completa e vitaminas MS, sacarose como a fonte de carbono, mio-inositol, biotina, ácido fólico como vitaminas não MS adicionais e agar vegetal como os agentes de solidificação) ou RAI2-2 (macro sais MS de potência média, micro sais MS de potência completa e vitaminas MS, sacarose como a fonte de carbono, mio- inositol, biotina, ácido fólico como vitaminas não MS adicionais, ácido indol-acético, ácido indol-butírico como reguladores de crescimento da família 32 das auxinas de reguladores de crescimento e agar vegetal como os agentes de solidificação).

Ambos meios podem ser utilizados e darão resultados similares. As plantas são enraizadas durante quatro semanas a uma temperatura de entre 18 °C e 22 °C num fotoperiodo de 16 horas de aproximadamente 3.000 lux. As percentagens de enraizamento são determinadas depois de 4-6 semanas.

As plântulas enraizadas são retiradas dos recipientes e lavadas com água para remover traços de resíduos de meio e agar. As plântulas são transferidas ao solo na estufa a 20 °C onde se aclimatam e em seguida se tratam como plantas de cultura de tecido normais.

Exemplo 3: Pelargónio 3.1 Material vegetal e estiolamento

Plantas parentais de pelargónio ou gerânio certificadas são crescidas na estufa durante pelo menos seis semanas sob condições fitossanitárias controladas. Obtêm-se ramos das plantas parentais e utilizam-se como explantes para o estiolamento. Antes da esterilização todas as folhas são removidas. Os explantes são tratados e esterilizados superficialmente com uma solução de hipoclorito de sódio a 1,3 % (branqueador comercial a 30 %) durante 15 minutos e lavados três vezes com água destilada estéril.

Os ramos desfoliados e esterilizadas são cortados em peças de tal maneira que cada peça resultante contenha um ou dois nós axilares. Os explantes são colocados horizontalmente sobre o meio numa placa de Petri, com um máximo de três explantes por placa de Petri. As placas de Petri são vedadas com Nescofilm.

Para a multiplicação e estiolamento dos rebentos caulinares utilizam-se dois meios à base de MS diferentes (MSI e MS2Z). Ambos meios podem ser utilizados adequadamente para a multiplicação de rebentos caulinares e o estiolamento dos explantes de pelargónio. Certos dos 33 genótipos testados parecem ter preferências por um ou outro

meio, no entanto, em geral os resultados obtidos são muito similares para ambos meios. 0 meio MSI contém micro sais MS + macro sais MS + vitaminas MS, sacarose como uma fonte de carbono, mio- inositol, biotina, ácido fólico como vitaminas não MS adicionais, PVP (polivinilpirrolidona) como um complemento adicional, BAP (6-benzilaminopurina) e 2iP (2-isopentenil-adenina) como reguladores de crescimento da família das citocininas de reguladores de crescimento e agar vegetal como um agente de solidificação. 0 pH é fixo a 5,8 antes de esterilizar em autoclave (para detalhes adicionais da composição do meio veja-se quadro A a seguir). 0 meio MS2Z contém micro sais MS + macro sais MS + vitaminas MS, sacarose como uma fonte de carbono, mio-inositol, biotina, ácido fólico como vitaminas não MS adicionais, zeatina como um regulador de crescimento da família das citocininas de reguladores de crescimento e agar vegetal como o agente de solidificação. 0 pH é fixo a 5,8 antes de esterilizar em autoclave (para mais detalhes da composição do meio veja-se quadro A a seguir).

Os explantes são crescidos na escuridão a uma temperatura de entre 22 °C e 24 °C durante 3 a 4 semanas. Em geral 60 %-80 % dos explantes formarão um filamento.

Depois de três a quatro semanas na escuridão os rebentos caulinares axilares são estiolados em filamentos brancos. Cada filamento tinha um ou mais nós axilares. 3.2 Proliferação

Os filamentos brancos obtidos no Exemplo 3.1 são transferidos a meio MSI ou MS2Z fresco em placas de Petri para manutenção. São cortados em peças que contêm um ou dois nós. Para conservar a planta parental as placas de Petri podem ser colocadas na escuridão a 4 °C durante pelo menos quatro meses. 34

Para uma proliferação eficiente cada filamento ou peças dos mesmos obtidos através de corte contém pelo menos dois ou três, mas preferivelmente quatro nós axilares no inicio da subcultura. Os filamentos são crescidos em frascos de vidro que contêm 66 ml de meio. 0 meio é MSO, o qual contém micro sais MS + macro sais MS + vitaminas MS, sacarose como a fonte de carbono, mio-inositol, biotina, ácido fólico como vitaminas não MS adicionais e agar vegetal como o agente de solidificação (para detalhes adicionais da composição do meio veja-se o quadro A a seguir).

Aproximadamente 15 ± 5 filamentos são colocados num frasco, com o primeiro nó justo abaixo da superfície do agar. Depois, 2 ml de meio líquido KE (micro sais MS + macro sais MS + vitaminas MS, sacarose como a fonte de carbono, mio-inositol, biotina, ácido fólico como vitaminas não MS adicionais e zeatina e tidiazuron como reguladores de crescimento da família das citocininas de reguladores de crescimento (para mais detalhes da composição do meio veja-se quadro A a seguir)) são adicionados sobre o meio sólido. Para 100 ml de meio sólido serão utilizados 3 ml de KE líquido. Os frascos são colocados na escuridão a 22 °C-24 °C durante quatro semanas. Depois de quatro semanas pode ser repetido o mesmo procedimento como foi descrito acima para a proliferação.

Em cada subcultura a velocidade de proliferação ou velocidade de multiplicação pode ser determinada ao dividir o número de filamentos formados (depois de separar ou cortar o tecido de volta ao número original de nós) pelo número inicial de filamentos. As velocidades de proliferação são determinadas para 10 genótipos para 3 subculturas (veja-se quadro 5 a seguir).

Quadro 5: Velocidades de proliferação de 10 genótipos subcultura 1 2 3 35

Apache 4,7 O LO 3,7 Mirage 5, 2 O LO 4,7 Charlotte 4,7 5,1 4,2 Hélios 5, 2 5, 2 3,7 Olavi 5,4 4,9 3,6 Verseau 4,3 4,0 4,4 P. Branche 4,7 5, 5 3,9 Super Rose 5, 0 4,4 3,9 Philiomel 1 1 00 oo 4,5 Balcon rose 4,5 o LO 3,6 média 4,9 4,9 4,0 3.3 Enraizamento

Para o enraizamento utilizam-se explantes menores. Cada filamento contém um ou dois nós axilares. Os explantes são transferidos a recipientes ventilados (caixas Ecoline com filtro XXL). 0 meio de enraizamento é MSO-2 (macro sais MS de potência média, micro sais MS de potência completa e vitaminas MS, sacarose como a fonte de carbono, mio-inositol, biotina, ácido fólico como vitaminas não MS adicionais e agar vegetal como os agentes de solidificação) ou RAI2-2 (macro sais MS de potência média, micro sais MS de potência completa e vitaminas MS, sacarose como a fonte de carbono, mio-inositol, biotina, ácido fólico como vitaminas não MS adicionais, ácido indol-acético, ácido indol-butirico como reguladores de crescimento da família das auxinas de reguladores de crescimento e agar vegetal como os agentes de solidificação).

Ambos meios podem ser utilizados e darão resultados similares. As plantas são enraizadas durante quatro semanas a uma temperatura de entre 22 °C e 24 °C num fotoperíodo de 16 horas de aproximadamente 3.000 lux. As percentagens de enraizamento são determinadas para 10 genótipos, depois de quatro semanas (veja-se quadro 6 a seguir). 36

Quadro 6: Percentagem de enraizamento de 10 genótipos genótipo MSO-2 RAI2-2 Apache 93 100 Hélios 91 91 Charlotte 97 97 Olavi 90 85 Mirage 95 nd S. Rose 87 100 P. Branche 79 93 Philiomel 1 100 100 B. rose 00 00 83 Verseau 82 100 média 90 94

As plântulas enraizadas são retiradas dos recipientes e lavadas com água para remover traços de resíduos de meio e agar. As plântulas são transferidas ao solo na estufa a 20 °C onde se aclimatam e em seguida se tratam como plantas de cultura de tecido normais. 37

Quac Iro A: Me: LOS Composto HSO MSO-2 MSI MS1-2 MS2Z SP1 BI KE RA12-2 Mâcroelementos MS Metade MS MS Metade MS MS MS mod. MS MS Metade MS KN03 1,99.1·* 0,95 g.l4 19 g.14 0,95 g.l4 19 g.l4 1,8 g.l4 1,9 g.l4 1,9 g.l4 0,95 g.l4 NH4N03 1,65 g.l4 0,825 g.l4 1,65 g.l4 0,825 g.l4 1,65 g.l4 0,4 g.l4 1,65 g.l4 1,65 g.l4 0,825 g.l4 Ca(NO,)2 X 4H20 1,2 g.l4 CaCl2 x 2H20 0,44 g.l4 0,22 g.l4 0,44 g.l4 0,22 g.l4 0,44 g.l4 0,44 g.l4 0,44 g.l4 0,22 g.l4 MgSO, x 7H20 0,37 g.l4 0,185 g.l4 0,37 g.l4 0,185 g.l4 0,37 g.l4 0,36 g.l4 0,37 g.l4 0,37 g.l4 0,185 g.l4 kh2po4 0,17 g.l4 0,085 g.l4 0,17 g.l4 0,085 g.l4 0,17 g.l4 0,27 g.l4 0,17 g.l4 0,17 g.l4 0,085 g.l4 Mícroelementos MS MS MS MS MS MS MS MS MS Vitaminas MS MS MS MS MS MS MS MS MS Sacarose 30 g.l4 30 g.l4 30 g.l4 30 g.l4 30 g.l4 20 g.l4 30 g.l4 30 g.l4 30 g.l4 Mio-inositol λ 1 T1 1 1 -1 u,1 g.i 0 1 g l"1 íl 1 r1 u,1 g.i íl 1 r1 u,1 g.i íl 1 r1 u,1 g.i M g.14 íl 1 r1 u,1 g.i íl 1 r1 u,1 g.i Biotina 0,05 mg.l"1 0,05 mg.l"1 0,05 mg.l'1 0,05 mg.l"1 0,05 mg.l"1 0,1 mg.l4 0,05 mg.l"1 0,05 mg.l'1 0,05 mg.l4 Ácido fólico 0,5 mg.l4 0,5 mg.l'1 0,5 mg.l'1 0,5 mg.l4 0,5 mg.l'1 0,5 mg.l'1 0,5 mg.l4 0,5 mg.l'1 0,5 mg.l'1 PVP (polivinilpirrolidona) 0,5 g.l4 0,5 g.l4 38 (continuação)

Composto MSO MSO-2 MSI MSl-2 MS2Z SFl BI KE RAI2-2 BA (6- benzilaminopurina) 0,1 mg.1"1 0,1 mg.l"1 0,25 mg.l4 5,0 mg.l1 2íP (2-isopentenil-adenina) 0,1 mg.r1 0,1 mg.l-1 Zeatína 0,2 mg.r1 0,2 mg.l"1 0,2 mg.l4 Tídíazuron (TDZ) 0,05 mg.l'1 IAA (ácido indol-3-acético) 0,1 mg.l-1 0,5 mg.l"1 IBA (ácido índol-butíríco) 0,5 mg.l"1 Agar vegetal g.l4 g.l4 g.l4 g.l4 6 g.l4 6 g.l4 6 g.l4 pH 5,8 (antes da autoclave) 5,8 (antes da autoclave) 5,8 (antes da autoclave) 5,8 (antes da autoclave) 5,8 (antes da autoclave) 5,8 (antes da autoclave) 5,8 (antes da autoclave) 5,8 (antes da autoclave) 5,8 (antes da autoclave) 39

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor da presente solicitação de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 9218617 A [0006]

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • CASSELLS et al. Scientia Horticulturae, 1983, vol. 21 (1), 53-66 [0005] • Plant Propagation by Tissue Culture, Handbook and Directory of Commercial Laboratories. Exegetics Ltd, 1984 [0017] [0027]

Claims (12)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a produção de plantas jovens e/ou de stock de micro-plantas parentais de plantas que pertencem ao grupo das plantas ornamentais herbáceas, sendo que o método compreende uma fase de cultura in vitro durante a qual explantes obtidos de um stock parental de espécies a serem propagadas são submetidos a micropropagação que é realizada sob condições adequadas e em meios de cultura adequados, com a finalidade de produzir micro-plântulas as quais, quando são submetidas a uma fase de cultura in vivo, destinam-se a desenvolverem-se em plantas ou em stock de micro-plantas parentais, caracterizado por, incluir as seguintes etapas para realizar a referida micropropagação: a) são obtidos caules de ramos como explantes a partir de stock de plantas parentais de espécies a serem propagadas, b) os explantes estão, sob condições axénicas, na escuridão e durante um período de tempo adequado, colocados num meio de iniciação de rebentos caulinares o qual está composto de tal forma que seja adequado a cada espécie vegetal a ser propagada, tendo como resultado a indução de uma primeira geração de formação de filamentos brancos sendo que a primeira geração de filamentos compreende uma ou mais gemas axilares, c) cada um dos filamentos brancos é dividido numa pluralidade de peças, cada uma das quais compreende pelo menos uma gema axilar, e os ditos filamentos brancos e/ou peças obtidas de uma primeira geração de filamentos brancos são recolocados sob condições axénicas e na escuridão num meio de proliferação durante um período de tempo adequado suficiente para permitir que o tecido das estacas se multiplique e produza uma grande quantidade de filamentos brancos estiolados que compreendem entre 2 e 10 nós axilares, de modo a induzir a formação de uma nova 2 geração de filamentos brancos, e o procedimento é repetido tanto quanto seja necessário para produzir diferentes gerações consecutivas de filamentos brancos até que a quantidade desejada de filamentos brancos tenha sido obtida, e) e os ditos filamentos e/ou peças estão, na luz, sob condições axénicas e durante um periodo de tempo adequado, colocados em ou dentro de um meio de enraizamento, o qual permite que cada gema axilar produza uma micro-plântula que tenha raizes.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por meristemas retirados do stock parental serem utilizados como explantes que se cultivam sob condições axénicas na luz durante um primeiro periodo de tempo num meio de desenvolvimento comum para cada variedade vegetal a ser propagada, com a finalidade de causar a formação de pequenas plântulas que tenham primeiros primórdios foliares e em seguida, durante um segundo periodo de tempo, num meio de enraizamento comum para cada variedade vegetal, com a finalidade de obter plântulas enraizadas as quais estejam livres de bactérias e virus e que se pretende que sejam colocadas no meio de proliferação na escuridão com a finalidade de produzir os referidos filamentos brancos.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por micro-estacas obtidas a partir de plantas parentais certificadas livres de bactérias e virus serem utilizados como explantes.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por os filamentos e/ou peças dos mesmos obtidos a partir de uma primeira geração de filamentos brancos serem recolados sob condições axénicas num meio de crescimento fresco e cultivados na escuridão durante um 3 período de tempo adequado de modo a induzir a formação de uma nova geração de filamentos brancos, e por o procedimento ser repetido tanto quanto seja necessário para produzir diferentes gerações consecutivas de filamentos brancos até que se tenha obtido a quantidade desejada de filamentos brancos.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por um sistema de cultura de duas camadas ser utilizado com a finalidade de promover a multiplicação dos rebentos caulinares caracterizada por o meio de iniciação e/ou o meio de proliferação de rebentos caulinares ser proporcionado na forma de um sistema de duas camadas que compreende uma camada inferior solidificada que compreende essencialmente macro e microelementos, vitaminas e uma fonte de carbono, mas sem regulador de crescimento, sendo que a camada inferior é coberta com uma camada superior fluida que compreende um regulador de crescimento, o qual suporta a multiplicação dos rebentos caulinares ao promover a ruptura e desenvolvimento de gemas axilares em rebentos caulinares estiolados e ainda em filamentos brancos e/ou o crescimento dos rebentos caulinares em desenvolvimento em rebentos caulinares que compreendem entre 2 e 10 nós axilares.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o número de gemas axilares de um filamento branco em desenvolvimento proveniente de um nó inicial ser de pelo menos entre 2 e 10 gemas axilares/por nó inicial.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por um meio de cultura do tipo "MS" ser utilizado como o meio de iniciação e/ou proliferação de rebentos caulinares, suplementado com um 4 regulador de crescimento que é proporcionado numa concentração que suporta a multiplicação dos rebentos caulinares ao promover a ruptura e desenvolvimento de gemas axilares em rebentos caulinares estiolados, e ainda em filamentos brancos e/ou o crescimento dos rebentos caulinares em desenvolvimento em rebentos caulinares que compreendem entre 2 e 10 nós axilares.

8. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por o meio de iniciação e/ou proliferação de rebentos caulinares compreender um regulador de crescimento que pertence à família das citocininas de reguladores de crescimento e à família das auxinas de reguladores de crescimento.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por os reguladores de crescimento que pertencem à família das citocininas de reguladores de crescimento ou à família das auxinas de reguladores de crescimento serem proporcionados numa concentração entre 0,01 mg/1 e 5,0 mg /1.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por os filamentos brancos estarem, a temperatura ambiente e na escuridão, armazenados num meio de proliferação que é trocado periodicamente, antes de ser submetido à fase de enraizamento, durante a qual cada gema produz uma micro-plântula enraizada destinada a proporcionar uma planta jovem ou uma micro-planta parental de stock.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por os filamentos brancos serem armazenados a uma temperatura entre 2 °C e 10 °C até 10 meses antes de serem submetidos à fase de enraizamento. 5

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por plantas seleccionadas a partir do grupo que consiste em pelargónio, petúnia incluindo petúnia Cascade, estrela-de-natal, ciclame, crisântemo, Impatiens walleriana, verbena e torénia, serem utilizadas no método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores.