CN1975418A - 一种叶酸－壳聚寡糖－花菁荧光染料生物探针及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种叶酸－壳聚寡糖－花菁荧光染料生物探针及制备方法。本发明探针是在一个壳聚寡糖分子上连接1至15个花菁染料分子，再与一个叶酸分子结合形成探针。本发明探针用于癌细胞的识别和诊断，具有较好的标记靶向性。本生物探针光谱范围广、摩尔消光系数大、无荧光背景、荧光量子产率高，与其他生物荧光染料探针相比，具有低毒性、低使用量、灵敏度高等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种高灵敏度叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针及制备方法，属于化学及生物化学技术交叉学科领域。
背景技术
癌症现已成为威胁人类健康的第一杀手，如何有效地控制其发生和发展乃至于实现早期识别已成为当务之急。多数学者认为，对癌症的早期诊断及有效识别可以极大地提高治疗效果。癌细胞的大小形态不一，通常癌细胞比正常细胞体积要大，核质比显著高于正常细胞；癌细胞的代谢旺盛，癌细胞组织的DNA和RNA聚合酶活性均高于正常细胞，核酸分解过程明显低于正常细胞，DNA和RNA的含量较高。其次叶酸受体在大部分恶性肿瘤组织表面高度表达，如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、结肠癌、鼻咽癌、肺癌等，而在正常细胞中表达高度保守。
传统的癌细胞识别和诊断主要通过癌胚蛋白检测，酶类标志物，肿瘤抗原检测，血浆蛋白检测和同位素检测法来确定。但这些方法均存在效率低、识别率低等缺点。近年来，随着分子生物标记技术不断发展，在医学领域尤其是在恶性肿瘤细胞的早期识别和诊断方面逐渐受到人们的关注。
采用生物荧光染料探针在生物领域的相关检测方法和技术，文献上已有报道，它与传统的同位素检测相比具有速度快、重复性好、用样量少及无辐射等特点。目前用于细胞标记的生物荧光染料探针主要有吖啶、菲啶类，荧光素类，二氟烷硼类，二苯乙烯类、萘酰亚胺类、菁染料类等。但除菁染料类外，其它的染料自身都会产生强的荧光背景干扰。
2005年1月的《Bioconjugate Chem》上报道了一种用叶酸修饰过的花菁染料作为生物荧光染料探针检测癌细胞的方法。
作为生物荧光染料探针，如何提高染料的水溶性，在增大其灵敏度的同时提高其光稳定性，并使其具有很好的癌细胞靶向性，是生物荧光染料探针研究的关键问题。
目前国内外关于生物荧光染料探针的研究主要集中在以下几个方面：1.荧光染料探针分子的设计、合成及修饰，以提高探针分子与DNA或细胞相互作用的光学灵敏性或增强水溶性为目的。2.增强荧光染料探针分子与癌细胞标记的靶向性修饰。染料分子用适当的配体修饰，通过配体-受体相互作用，实现对癌细胞的靶向性标记。
发明内容
本发明人进行了大量的研究工作后，提出了一种高灵敏度叶酸-壳聚寡糖-花菁染料探针及该探针的制备方法。这种新型探针的水溶性得到显著提高，并增加了染料与细胞的相容性，在与生物组织结合及成像时表现出荧光加合效应，探针分子与DNA或细胞相互作用的光学灵敏性显著提高，且具有很好的癌细胞标记的靶向性。
本发明新型探针结构如图1所示。本发明探针是在一个壳聚寡糖分子上连接1至15个花菁染料分子，再与一个叶酸分子结合形成探针。壳聚寡糖分子的分子量优选195～6000，更优选分子量为200-2000。
本发明探针的制备可以通过本领域常用的方法得以实现，优选通过下述途径实现，步骤包括：
1)壳聚寡糖-花菁染料的制备
将花菁染料、摩尔比为0.77∶1的苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯和1-羟基苯并三唑溶于溶剂中，将所得溶液冷却至-5℃后加入壳聚寡糖的水溶液或体积百分比为5％的盐酸溶液，此时保持花菁染料与壳聚寡糖的摩尔比为0.38∶1；再加入浓度为每毫升含二异丙基乙胺1-3mg的二甲亚砜溶液，混合均匀，于室温下连续搅拌反应8小时后加入乙醚，继续搅拌0.5小时，过滤，用乙醚洗涤所得沉淀，于20-30℃下真空干燥后，得到壳聚寡糖-花菁染料干品。
所述溶剂是N，N′-二甲基甲酰胺溶液、氯苯和/或丙酮。
2)叶酸-壳聚寡糖-花菁染料探针的制备
将上述壳聚寡糖-花菁染料干品与叶酸按摩尔比为1∶1溶解于二甲亚砜溶液中，于室温下搅拌反应10小时后加入乙醚，产生沉淀，过滤；所得沉淀用乙醚洗涤后于25-35℃下真空干燥，即得叶酸-壳聚寡糖-花菁染料探针干品。
所述花菁染料为市售花菁荧光染料，优选1-(ε-羧戊基)-1’-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚碳菁-5，5′-二磺酸盐，1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚二碳菁-5，5′-二磺酸盐，2-(9-蒽基)-2-羟基乙酸，荧光素和/或带有羧基的多甲川花菁染料。
本发明探针以壳聚寡糖分子作为叶酸配体和染料分子之间的桥梁，增加了染料的细胞相容性、降低了对生物标记物的毒性，提高了生物探针的灵敏度、降低了探针标记的使用量。且由于壳聚寡糖具有很好的化学活性，很容易对其进行化学改性并修饰具有特定基团的荧光染料，还可根据特定的对象选择合适的生物分子进行修饰，如修饰配体定位受体及修饰探针DNA检测目标DNA等。
本发明的特点和优点为：
1、本发明生物探针制备方法简单，对变异细胞初步标记研究表明，该探针具有较好的标记靶向性，为采用该类生物探针标记变异细胞进行构效关系研究提供了一种方法。
2、对检测物的毒性低，灵敏度高，使用量少。由于一个壳聚寡糖分子上可连接众多花菁染料分子，本发明探针在标记过程中表现出明显的荧光加和效应，在提高其光稳定性的同时增大了其标记灵敏度，使用量减少。
3、亲水性明显增强，增加了生物探针和细胞的相容性。
4、具有光谱范围广、摩尔消光系数大、无荧光背景、荧光量子产率高和灵敏度高等特点。
附图说明
图1探针的叶酸-壳聚寡糖-荧光染料结构；
图2荧光染料-壳聚寡糖-叶酸探针标记牛血清蛋白的荧光光谱图。
其中：1.叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针、
2.花菁荧光染料、
3.叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针标记蛋白。
具体实施方式：
下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。
实施例1：叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针I号的制备
1.制备壳聚寡糖-花菁染料
将0.021mmol的1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚碳菁-5，5′-二磺酸盐，0.027mmol的苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯(HBTU)，0.027mmol的1-羟基苯并三唑(HOBT)溶解于5ml N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，将此溶液冷却至-5℃后；加入含0.054mmol的壳聚寡糖(分子量为1900)的10ml水溶液，再加入含0.108mmol二异丙基乙胺(DIEA)的二甲亚砜(DMSO)溶液1ml后，将该混合物混合均匀后于室温下连续搅拌反应8小时后加入乙醚并继续搅拌0.5h后过滤沉淀、再用乙醚洗涤，于室温(20-30℃)、真空(小于0.1MP)下干燥，得到壳聚寡糖修饰的花菁染料。
2.制备叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针
将上述干燥后的花菁染料-壳聚寡糖和0.02mmol蝶酰单谷氨酸(叶酸)溶解于10ml二甲亚砜(DMSO)溶液中于室温下搅拌反应10小时后，加入乙醚后产生沉淀，过滤，用乙醚洗涤后于25-35℃下真空度为0.1MP时真空干燥。干燥后即得叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针I号。
实施例2叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针II号的制备
将实施例1步骤1中的花菁染料1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚碳菁-5，5′-二磺酸盐换成同量的2-(9-蒽基)-2-羟基乙酸；分子量为1900的壳聚寡糖换成分子量为200的壳聚寡糖，其余不变，得到叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针II号。
实施例3叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针III号的制备
将实施例1步骤1中的花菁染料1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚碳菁-5，5′-二磺酸盐换成同量的荧光素；分子量为1900的壳聚寡糖换成分子量为5900的壳聚寡糖，其余条件不变，得到叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针III号。
试验例1：叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针标记蛋白
1.叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针标记蛋白
将实施例1中所得的叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针I号溶解于10ml蒸馏水中备用。吸取该溶液2ml，加入5ml浓度为5mg/L的牛血清蛋白(BSA)或人血清蛋白(HSA)溶液，用pH＝7.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-HCl)缓冲溶液稀释至25mL，搅拌30min后于荧光分光光度计上测定其荧光强度。
2.叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针荧光强度的变化
由于该探针上含有羧基，能和含有氨基的物质如蛋白结合，结合后该探针的荧光性会明显减弱，由此可以判断该荧光探针具有识别生物活性物质的能力。图2是荧光光谱图，表示了本发明探针用于标记牛血清蛋白时其荧光强度的变化。
试验发现，叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针在和牛血清蛋白结合后探针的荧光强度在518nm处荧光强度明显减弱，表明该探针能很好地和蛋白结合，完全可以用于标记蛋白。对蛋白的标记可以确定，该染料探针在用于识别癌细胞时，该探针可很好地和癌细胞表面的叶酸受体结合，染料分子能穿透细胞膜和细胞壁进入细胞核中，到达细胞核的染料分子能表现出荧光可用于识别癌细胞。
Claims (5)
1、一种叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针，其特征在于具有如下结构：
其中：n＝1～15。
2、根据权利要求1所述叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针，其特征在于：
195＜壳聚寡糖分子量＜6000。
3、根据权利要求1所述叶酸-壳聚寡糖-花菁荧光染料生物探针，其特征在于：
200＜壳聚寡糖分子量＜2000。
4、根据权利要求1所述壳聚寡糖-花菁染料探针的制备方法，其特征在于：制备步骤包括：
1)壳聚寡糖-花菁染料的制备：
将花菁染料、摩尔比为0.77∶1的苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯和1-羟基苯并三唑溶于溶剂中，将所得溶液冷却至-5℃后加入壳聚寡糖的水溶液或体积百分比为5％的盐酸溶液，此时保持花菁染料与壳聚寡糖的摩尔比为0.38∶1；再加入浓度为每毫升含二异丙基乙胺1-3mg的二甲亚砜溶液，混合均匀，于室温下连续搅拌反应8小时后加入乙醚，继续搅拌0.5小时，过滤，用乙醚洗涤所得沉淀，于20-30℃下真空干燥后，得到壳聚寡糖-花菁染料干品；
所述溶剂是N，N′-二甲基甲酰胺溶液、氯苯和/或丙酮；
2)叶酸-壳聚寡糖-花菁染料探针的制备：
将上述壳聚寡糖-花菁染料干品与叶酸按摩尔比为1∶1溶解于二甲亚砜溶液中，于室温下搅拌反应10小时后加入乙醚，产生沉淀，过滤；所得沉淀用乙醚洗涤后于25-35℃下真空干燥，即得叶酸-壳聚寡糖-花菁染料探针干品。
5、根据权利要求4所述壳聚寡糖-花菁染料探针的制备方法，其特征在于：
制备步骤1)中的花菁染料是1-(ε-羧戊基)-1’-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚碳菁-5，5′-二磺酸盐，1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚二碳菁-5，5′-二磺酸盐，2-(9-蒽基)-2-羟基乙酸，荧光素和/或带有羧基的多甲川花菁染料。
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