CN108384786A - 一种适配子结合蛋白的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可以特异、灵敏地检测适配子结合蛋白的分析方法。该方法通过识别探针去招募结合蛋白，利用DNA双链杂交的方式将光交联基团引入到结合蛋白，并通过光引发将结合蛋白共价键合到捕捉探针上，实现了适配子结合蛋白的高效鉴定。本方法解决了由于适配子与结合蛋白作用力较弱，适配子结合蛋白难以鉴定的问题，适用于丰度较低的、结合力较弱的适配子互作蛋白分析。本发明的探针合成过程简单、选择性好、灵敏度高，可以实现对实际体系中适配子结合蛋白的特异性检测与富集。

Description

一种适配子结合蛋白的检测方法
技术领域
本发明涉及生物化学和生物医学检测技术领域，尤其是涉及适配子结合蛋白的检测与鉴定，特别是涉及到溶菌酶的检测和鉴定。
背景技术
蛋白质是生命体的重要物质基础，尤其是与疾病相关的生物标志物的鉴定对于疾病的诊断和治疗具有非常重要的意义。基于适配子的“钓鱼”技术在疾病相关的生物标记物的检测中逐渐发展起来。利用适配子作为“诱饵”，在其末端修饰报告基团，如用于生物成像的荧光基团或用于亲和富集的生物素，将修饰有报告基团的适配子与复杂的蛋白体系孵育，找到与适配子特异性结合的蛋白等生物标记物，然后通过报告基团对蛋白进行亲和富集或者荧光标记，最后通过质谱等对蛋白进行定性及定量分析。
适配子(aptamer)是一段人工合成的单链DNA或RNA，可以通过非常成熟的指数级富集配子系统进化(SELEX)技术从特定的寡核苷酸库中筛选出来，对某种特定的靶标具有特异性识别。它具有一定的空间结构，可以特异性地识别蛋白、小分子以及复杂的细胞、组织等。由于适配子具有亲和力强、特异性好、稳定性好、易改造修饰、快速合成等优点，作为生物探针在生命科学、临床诊断、药物发现和环境科学等方面可以部分取代抗体的作用。
传统的适配子为诱饵的蛋白质捕获技术难以捕捉分子间弱的以及暂时的相互作用，并且在复杂的洗脱过程中容易损失蛋白。因此发展出一种光交联技术，在适配子上修饰光交联基团，通过紫外光照引发光交联，使适配子与蛋白质之间的弱作用力转化为强的共价键作用，以解决上述问题。然而，光交联基团对适配子骨架的修饰通常会影响适配子的结构，进而影响适配子对目标蛋白的识别特性。另外，由于化学合成技术的限制，光交联基团只能被修饰到适配子DNA链上有限几种不同的碱基上且合成步骤繁琐，无法灵活地改变光交联基团与目标蛋白之间的相对位置，使得该分析方法具有一定的局限性。
目前也有很多基于适配子检测或识别蛋白质的其他方法出现，例如表面等离子体共振、原子力、电化学发光等等。但在采用适配子检测时，如何控制检测并避免修饰官能团对蛋白质与适配子间识别与互作的干扰，是提高检测方法的灵敏性和特异性需要解决的关键技术。
溶菌酶是一种由多形核白细胞分泌的抗菌蛋白质，又称为N‐乙酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N‐乙酰胞壁酸和N‐乙酰氨基葡糖之间的β‐1,4糖苷键，导致细胞壁破裂、内容物逸出而使细菌溶解。并且，溶菌酶可以与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。此外，溶菌酶还是多种动物组织的内源性免疫系统的重要组成部分。
该酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的唾液、泪液、气管分泌物等中，而且在不同组织其正常含量也各不相同。溶菌酶在人体液中的浓度在临床上可以作为许多疾病诊断的辅助标志，例如口咽部念珠菌感染的病人唾液中的溶菌酶浓度会升高；肾病患者的尿液中会出现溶菌酶；血液、脑脊髓液中溶菌酶的浓度是白血病和中枢神经系统肿瘤疾病的重要辅助诊断依据；新生儿体内溶菌酶缺乏可能会导致支气管性肺发育障碍等等。因此对于溶菌酶的检测在临床诊断学上具有重要的辅助诊断意义。
目前溶菌酶检测的常见方法有凝胶电泳法、高效液相色谱法、免疫电泳法、酶联免疫吸附法、电化学检测方法等，但由于人体液中溶菌酶的浓度较低，通常只有10‐7mol·L‐1，采用这些方法检测前，一般需要先对溶菌酶进行富集、分离和提取，使得整个检测方法操作复杂，成本高。因此需要开发能直接适用于复杂样品体系的，无需事前对溶菌酶进行富集、分离和提取操作的溶菌酶检测方法。
发明内容
本发明旨在针对目前适配子结合蛋白的检测中存在的上述问题，提供一种稳定、灵敏、特异性检测适配子结合蛋白的方法和试剂。
本发明的技术方案如下：
本发明的第一个方面是提供一种双探针。
根据本发明，所述双探针包括识别探针和捕捉探针，所述识别探针是单链寡核苷酸，包括串联连接的适配子序列和被捕捉序列；所述捕捉探针包括捕捉序列以及修饰在捕捉探针上的光交联基团和报告基团，所述捕捉序列是单链寡核苷酸。识别探针上的适配子序列用于识别并结合适配子结合蛋白，捕捉探针的捕捉序列识别识别探针上的被捕捉序列，并通过碱基互补作用与识别探针的被捕捉序列结合。
在本发明的一些实施方式中，所述识别探针的被捕捉序列为5’‐ATG TCG CTGTAG‐3’；所述捕捉探针的捕捉序列为5’‐CTA CAG CGA CAT‐3’。
在本发明的一个具体实施方式中，所述适配子序列为5’‐ATC AGG GCT AAA GAGTGC AGA GTT ACT TAG‐3’，该适配子序列能识别并结合溶菌酶。
根据本发明，在一些情况下，所述识别探针的被捕捉序列位于适配子序列的3’端，并且光交联基团位于捕捉探针的3’端，报告基团位于捕捉探针的5’端。在另一些情况下，所述识别探针的被捕捉序列位于适配子序列的5’端，并且光交联基团位于捕捉探针的5’端，报告基团位于捕捉探针的3’端。
在本发明的一个具体实施方式中，所述识别探针为：5’‐ATC AGG GCT AAA GAGTGC AGA GTT ACT TAG ATG TCG CTG TAG‐3’。该序列包含从5’端起的能够识别溶菌酶的30个碱基的适配子序列，以及12个碱基的被捕捉序列，这12个碱基的被捕捉序列用于与捕捉探针中的捕捉序列进行后续寡核苷酸自组装，其序列不会与适配子序列的碱基互补，因而不影响适配子的空间结构。该识别探针的作用是识别溶菌酶。
进一步，根据本发明，所述捕捉探针的捕捉序列和光交联基团之间具有延长臂序列，延长臂序列用于将捕捉探针上的光交联基团“悬挂”在识别探针被捕捉序列和捕捉探针捕捉序列形成的双链结构之外，使光交联基团从空间上接近被识别探针结合的适配子结合蛋白。在一些实施方式中，所述延长臂序列为‐Y‐(CH2)6‐，其中Y为含有n个碱基的短序列，n为0‐12的整数，并且‐Y‐与捕捉序列相连，‐(CH2)6‐与光交联基团连接。Y的碱基选择只要使延长臂序列不与捕捉探针上的其他序列产生互补，不与识别探针产生互补即可。在一些实施方式中，n为0‐9，例如0，3，6，或9，优选为3。在本发明的一个具体实施方式中，所述延长臂序列为‐TTG‐(CH2)6‐。
进一步，根据本发明，所述捕捉探针的捕捉序列和报告基团之间具有悬臂序列，悬臂序列用于将捕捉探针上的报告基团“悬挂”在识别探针被捕捉序列和捕捉探针捕捉序列形成的双链结构之外，以提供充足空间使报告基团伸展，例如生物素等更好的伸展以及与链霉亲和素beads等的结合。在一些实施方式中，所述悬臂序列为‐Z‐，其中Z为含有m个碱基的序列，m为大于等于0的任意整数。Z的碱基选择只要使悬臂序列不与捕捉探针上的其他序列产生互补，不与识别探针产生互补即可。在一些实施方式中，m为0‐9，例如0，3，6，9，优选为6。在本发明的一个具体实施方式中，所述悬臂序列为TTT TTT。
进一步，在本发明的优选方式中，所述捕捉探针在捕捉序列和光交联基团之间具有延长臂序列，并且在捕捉序列和报告基团之间具有悬臂序列。
在本发明的一些实施方式中，所述捕捉探针为5’‐报告基团‐Z‐CTA CAG CGA CAT‐Y‐(CH2)6‐X‐光交联基团，Y为含有n个碱基的短序列，n为0‐12的整数；Z为含有m个碱基的序列，m为大于等于0的任意整数；X为光交联基团和延长臂序列的连接键。优选n为0‐9，m为3‐9。更优选为n＝3，m＝6。
在本发明的一些实施方式中，所述捕捉探针为5’‐报告基团‐TTT TTT CTA CAGCGA CAT TTG‐(CH2)6‐X‐光交联基团。其中12个碱基序列CTA CAG CGA CAT与识别探针的被捕捉序列的12个碱基完全互补，具有很高的特异性，以保证捕捉探针对识别探针的特异性结合；3’端3个碱基TTG和六个亚甲基((CH2)6)作为延长臂序列，由于延长臂长度对于最终的光交联效果具有重要影响，当延长臂中碱基的个数为3时，该长度的延长臂能保证光交联基团和目标蛋白的最佳相对位置，从而使光交联效率最高；5’端6个碱基TTT TTT为悬臂序列，能保证提供充足空间以使报告基团，例如生物素更好的伸展以及与链霉亲和素beads等的结合。
在一些具体实施方式中，X为酰胺键或由叠氮炔点击化学反应所形成的五元环。
在本发明的一些实施方式中，报告基团优选为荧光化合物或者生物素。在一些实施例中，荧光化合物可以是荧光素类、罗丹明类、菁染料、二苯乙烯类、萘酰亚胺类、香豆素类、吖啶类或芘类等，包括但不限于：异硫氰酸荧光素、羧基荧光素(FAM)、四氯荧光素、六氯荧光素、四乙基罗丹明、四甲‐6‐羧罗丹明、羧基四甲基异硫氰酸酯、四甲基异硫氰酸罗丹明、噻唑橙、Cy3、Cy5、噁唑橙或藻红蛋白等。在本发明的一个实施方式中，所述荧光化合物是羧基荧光素(FAM)。
在本发明的一些实施方式中，光交联剂优选是双吖丙啶、二苯甲酮或芳香叠氮类化合物(例如叠氮苯)。在本发明的一个实施方式中，所述光交联剂是双吖丙啶。
在本发明的一些实施方式中，所述捕捉探针为5’‐荧光化合物‐TTT TTT CTA CAGCGA CAT TTG‐(CH2)6‐X‐光交联基团，或者5’Biotin‐TTT TTT CTA CAG CGA CAT TTG‐(CH2)6‐X‐光交联基团，其中X为酰胺键或由叠氮炔点击化学反应所形成的五元环，光交联基团为双吖丙啶、二苯甲酮或芳香叠氮类化合物(例如叠氮苯)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述捕捉探针为5’FAM‐TTT TTT CTA CAG CGACAT TTG‐(CH2)6‐NH‐CO‐双吖丙啶，或5’Biotin‐TTT TTT CTA CAG CGA CAT TTG‐(CH2)6‐NH‐CO‐双吖丙啶。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的双探针中，识别探针为5’‐ATC AGG GCTAAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG ATG TCG CTG TAG‐3’，捕捉探针为5’FAM‐TTT TTT CTACAG CGA CAT TTG‐(CH2)6‐NH‐CO‐双吖丙啶，或5’Biotin‐TTT TTT CTA CAG CGA CAT TTG‐(CH2)6‐NH‐CO‐双吖丙啶。
本发明的第二个方面是提供一种试剂盒。
根据本发明，所述试剂盒含有本发明第一方面所述的双探针。
根据本发明，除了双探针之外，该试剂盒中还可以含有缓冲液等。
根据本发明，所述试剂盒可用于检测或富集适配子结合蛋白。
本发明的第三个方面是提供一种适配子结合蛋白的检测或富集方法。
根据本发明，所述方法使用本发明第一方面所述的双探针或者本发明第二方面所述的试剂盒。
根据本发明，所述方法包括以下步骤：1)将识别探针加入样品中，孵育；2)将捕捉探针加入步骤1)得到的样品中，孵育；3)将步骤2)得到的样品进行光照引发反应，优选为紫外光照射；4)通过报告基团检测或富集适配子结合蛋白。
根据本发明，所述检测或富集方法优选为非疾病诊断目的的检测或富集方法。
本发明的第四个方面是提供本发明第一方面所述的双探针在制备检测或富集适配子结合蛋白的试剂或试剂盒中的用途。
在本发明的一些实施方式中，所述适配子结合蛋白可以是核蛋白、胞浆蛋白、膜蛋白或分泌蛋白等，例如：组蛋白、激酶蛋白、骨架蛋白、转录因子、胰岛素、G蛋白或溶菌酶等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的适配子结合蛋白是溶菌酶。
本发明的工作原理如下：
首先通过带有适配子序列和被捕捉序列的识别探针去招募适配子结合蛋白，然后加入捕捉探针，利用碱基互补原理，使带有与识别探针被捕捉序列互补的捕捉序列、光交联基团和报告基团的捕捉探针与识别探针进行结合，从而使光交联基团从空间上靠近适配子结合蛋白。通过光照引发光交联基团的光交联反应，将捕捉探针共价键合到适配子结合蛋白上。最后利用捕捉探针上的报告基团，例如荧光化合物或生物素标签等，实现适配子结合蛋白的检测或富集，并最终可以通过荧光计量、质谱技术等鉴定手段进行定性或定量的检测或鉴定。
本发明中捕捉探针上光交联基团的引入，使得适配子结合蛋白与适配子之间的结合转化为适配子结合蛋白与捕捉探针之间的强的共价键，因而可以承受较强烈条件的洗脱以除去非特异结合的蛋白，从而使得识别探针可以捕获较低丰度以及瞬态相互作用的蛋白。传统方法中，将光交联基团修饰到适配子的骨架上，可能影响适配子自身形成二级结构，这种二级结构对目标蛋白的识别具有重要作用；同时为了获得较好的交联效率，光交联基团需要尽可能的靠近结合位点，这些最终都会影响探针的识别效率；另外，光交联基团对适配子的修饰步骤繁琐，为了获得最佳的交联产量，需要不断地调整光交联基团在适配子骨架上的位置，这就进一步增加了寻找适用的适配子“诱饵”的合成成本。与传统的方法相比，本发明将光交联基团连接到捕捉探针上，巧妙地避免了过多基团修饰对适配子骨架的改变，能保持适配子的原始结构和识别特性，不影响检测方法对目标蛋白的富集和标记效率。同时光交联基团的位置可以通过改变捕捉探针上延长臂序列的碱基数量来调节，而不需要重新选择交联的碱基位置，使得对于最优交联产量的选择，以及不同适配子及其结合蛋白的检测，更具有灵活性且避免了复杂的光交联基团修饰的合成过程。
本发明的方法可以检测实际样品中丰度较低、作用力弱的目标蛋白样品。
本发明的术语定义：
术语“适配子”(aptamer)是指人工合成的单链寡核苷酸(DNA或RNA)，能与非核苷酸靶目标物质(例如蛋白质)进行高亲和力、高特异性的结合。适配子可通过指数富集配基的系统进化技术(SELEX)进行体外筛选、扩增和富集。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核酸”是指由两个或更多个，优选地超过三个并且通常超过十个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的分子。精确的大小将取决于许多因素，其继而取决于寡核苷酸最终的功能或用途。寡核苷酸可以以多种方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。本发明中的寡核苷酸是由脱氧核糖核苷酸组成的分子或由核糖核苷酸组成的分子。本发明中的寡核苷酸含有2‐100个核苷酸，优选含有10‐60个核苷酸。
本文中术语“核苷酸”和“碱基”可以互换使用，是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，以及任何其他经修饰的/未经修饰的嘌呤/嘧啶碱基的N‐糖苷。所述嘌呤或嘧啶可以是但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和/或尿嘧啶，以及其他经修饰的、非标准或衍生的碱基。
术语“互补”或“互补性”参照通过碱基配对规则相关的多核苷酸(例如，核苷酸序列)使用。例如，序列5’‐A‐G‐T‐3’与序列3’‐T‐C‐A‐5’互补。互补性可为“部分的”，其中仅核酸碱基的一些依照碱基配对规则匹配。或者在核酸之间可存在“完全的”或“总体的”互补性。核酸链之间互补性的程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著作用。如本文所使用的，寡核苷酸、多核苷酸或核酸的“互补序列”指根据碱基配对规则与所述寡核苷酸、多核苷酸或核酸完全或部分互补的寡核苷酸、多核苷酸或核酸。在本发明的实施方式中，优选互补序列是完全互补的。
术语“识别探针”指的是特异性结合样品中的目标蛋白的单链寡核苷酸。在一定条件下，识别探针与目标蛋白质形成复合物。
术语“捕捉探针”指的是特异性结合样品中识别探针‐目标蛋白质复合物中的识别探针的具有报告基团和光交联基团的单链寡核苷酸。在一定条件下，捕捉探针与识别探针‐目标蛋白质复合物形成复合物，而后通过光交联反应，捕捉探针与目标蛋白质共价结合。这样一来，捕捉探针‐目标蛋白质的共价结合物可以从样品的其余部分分离。在某些实施方案中，该分离可以包括洗去样品中不结合捕捉探针的物质或材料。在某些实施方案中，捕捉探针可以附着到固体支持物表面上，例如，举例来说，但不限于，板或珠。在本发明中，捕捉探针是通过捕捉序列与识别探针的被捕捉序列互补作用识别并结合到识别探针上的。
术语“延长臂”是指位于捕捉探针上捕捉序列和光交联基团之间的序列，不与捕捉探针上的其他序列产生互补，不与识别探针产生互补，其作用是将捕捉探针上的光交联基团“悬挂”在识别探针被捕捉序列和捕捉探针捕捉序列形成的双链结构之外，并使光交联基团从空间上接近适配子结合蛋白，有利于将捕捉探针共价键合到适配子结合蛋白上。
术语“悬臂”是指位于捕捉探针上捕捉序列和报告基团之间的序列，不与捕捉探针上的其他序列产生互补，不与识别探针产生互补，其作用是将捕捉探针上的报告基团“悬挂”在识别探针被捕捉序列和捕捉探针捕捉序列形成的双链结构之外，以提供充足空间使报告基团，例如生物素更好的伸展以及与链霉亲和素beads等的结合。
术语“报告基团”和“标记”或“可检测标记”含义相同，指的是可以连接至要检测或定量的物质(例如，目标蛋白质、捕捉探针)的任何化学基团或部分。典型地，报告基团是适合于物质的灵敏检测或定量的可检测标记。报告基团的例子包括，但不限于，发光标记(例如，荧光，磷光，化学发光，生物发光和电化学发光标记)，放射性标记，酶，颗粒，磁性物质，电活性种类等。备选地，可检测标记可以通过参与特异性结合反应而表明其存在。这样的标记的例子包括半抗原，抗体，生物素，链霉亲和素，his‐标签，次氮基三乙酸，谷胱甘肽S‐转移酶，谷胱甘肽等。
作为报告基团种类之一的“荧光化合物”，是本领域已知各种各样的荧光部分。可用作荧光部分的化合物的实例包括但不限于氧杂蒽、蒽、花青、卟啉和香豆素染料。可用于所述技术的氧杂蒽染料的实例包括但不限于荧光素、6‐羧基荧光素(6‐FAM)、5‐羧基荧光素(5‐FAM)、5‐或6‐羧基‐4,7,2',7'‐四氯荧光素(TET)、5‐或6‐羧基‐4',5',2',4',5',7'‐六氯荧光素(HEX)、5'或6'‐羧基‐4',5'‐二氯‐2,'7'‐二甲氧基荧光素(JOE)、5‐羧基‐2',4',5',7'‐四氯荧光素(ZOE)、对甲氨基酚(rhodol)、罗丹明、四甲基罗丹明(TAMRA)、4,7‐二氯四甲基罗丹明(DTAMRA)、罗丹明X(ROX)和德克萨斯红。可用于本发明的花青染料的实例包括但不限于Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和Cy7.5。可用于本发明的其它荧光部分和/或染料包括但不限于能量转移染料、复合染料和其它产生荧光信号的芳香族化合物。在一些实施方案中，荧光部分包含量子点。
因此，根据所述技术，可用的示例性的荧光团和染料包括，但不限于，荧光染料。荧光染料包括，但不限于，d‐罗丹明受体染料(包括Cy5、二氯[R110]、二氯[R6G]、二氯[TAMRA]、二氯[ROX]等)、荧光素供体染料(包括荧光素、6‐FAM、5‐FAM等)、吖啶(包括吖啶橙、吖啶黄、原黄素、pH7等)、芳香烃(包括2‐甲基苯并噁唑、对二甲氨基苯甲酸乙酯、苯酚、吡咯、苯、甲苯等)、芳基甲川型染料(包括金胺O、结晶紫、结晶紫‐甘油、孔雀石绿等)、香豆素染料(包括7‐甲氧基香豆素‐4‐乙酸、香豆素1、香豆素30、香豆素314、香豆素343、香豆素6等)、花青染料(包括1,1'‐二乙基‐2,2'‐花青碘化物、隐花青、吲哚羰花青(C3)染料、吲哚二羰花青(C5)染料、吲哚三羰花青(C7)染料、氧羰花青(C3)染料、氧二羰花青(C5)染料、氧三羰花青(C7)染料、碘化频那氰醇、全染色剂、硫羰花青(C3)染料‐乙醇、硫羰花青(C3)染料‐正丙醇、硫二羰花青(C5)染料、硫三羰花青(C7)染料等)、二吡咯甲烯(Dipyrrin)染料(包括N,N'‐二氟硼基‐1,9‐二甲基‐5‐(4‐碘苯基)‐二吡咯甲烯、N,N'‐二氟硼基‐1,9‐二甲基‐5‐[(4‐(2‐三甲基硅烷基乙炔基)、N,N'‐二氟硼基‐1,9‐二甲基‐5‐苯基二吡咯甲烯等)、部花青(包括4‐(二氰亚甲基)‐2‐甲基‐6‐(对二甲氨基苯乙烯基)‐4H‐吡喃(DCM)‐乙腈、4‐(二氰亚甲基)‐2‐甲基‐6‐(对二甲氨基苯乙烯基)‐4H‐吡喃(DCM)‐甲醇、4‐二甲氨基‐4'‐硝基芪、部花青540等)、杂染料(包括4',6‐二脒基‐2‐苯基吲哚(DAPI)‐二甲基亚砜、7‐苄氨基‐4‐硝基苯并‐2‐氧杂‐1,3‐二唑、丹磺酰甘氨酸、丹磺酰甘氨酸‐二氧六环、Hoechst33258‐DMF、Hoechst33258、荧光黄CH、吡罗昔康、硫酸奎宁、方酸箐染料III等)、寡苯撑类(包括2,5‐二苯基噁唑(PPO)、联苯、POPOP、对四联苯、对三联苯等)、噁嗪类(包括甲酚紫高氯酸盐、尼罗蓝‐甲醇、尼罗红‐乙醇、噁嗪1、噁嗪170等)、多环芳香烃(包括9,10‐双(苯乙炔基)蒽、9,10‐二苯基蒽、蒽、萘、二萘嵌苯、芘等)、多烯/聚炔类(包括1,2‐二苯基乙炔、1,4‐二苯基丁二烯、1,4‐二苯基丁二炔、1,6‐二苯基己三烯、β‐胡萝卜素、茋类等)、氧化还原活性的发色团类(包括蒽醌、偶氮苯、苯醌、二茂铁、核黄素、三(2,2'‐联吡啶)钌络合物(II)、四吡咯、胆红素、叶绿素a‐乙醚、叶绿素a‐甲醇、叶绿素b、二质子化‐四苯基卟啉、血色素、八乙基卟啉镁(MgOEP)、酞菁镁(MgPc)‐PrOH、酞菁镁(MgPc)‐吡啶、四‐三甲苯基卟啉镁(MgTMP)、四苯基卟啉镁(MgTPP)、八乙基卟啉、酞菁(Pc)、卟吩、ROX、TAMRA、四叔丁基氮杂卟吩、四叔丁基萘酞菁、四(2,6‐二氯苯基)卟啉、四(邻氨基苯基)卟啉、四‐三甲苯基卟啉(TMP)、四苯基卟啉(TPP)、维生素B12、八乙基卟啉锌(ZnOEP)、酞菁锌(ZnPc)‐吡啶、四‐三甲苯基卟啉锌(ZnTMP)、四‐三甲苯基卟啉锌自由基阳离子、四苯基卟啉锌(ZnTPP)等)、氧杂蒽类(包括曙红Y、荧光素‐碱性乙醇、荧光素‐乙醇、罗丹明123、罗丹明6G、罗丹明B、孟加拉玫瑰红、磺酰罗丹明101等)或其混合物或组合或其合成衍生物。
报告基因与捕捉探针中寡核苷酸连接方法可以采用本领域已知的各种方法，例如：酶学法、化学法等。比如，在用DNA合成仪合成寡核苷酸的最后一步，使用氨基连接臂试剂，连接上氨基后与N‐羟基琥珀酰亚胺基‐生物素或N‐羟基琥珀酰亚胺基‐荧光素作用，将生物素或荧光素连接到寡核苷酸5’端。
光交联基团是一种光活性物质，在光照下，尤其是紫外光照下，可以产生氮烯或者碳烯中间体，这些中间体可以插入到邻近的C‐C或C‐H等形成新的共价键，例如：双吖丙啶、二苯甲酮、或芳香叠氮类化合物如叠氮苯等。双吖丙啶交联剂，体积小，具有较高的生物相容性，激发波长对生物样品的伤害较小，特异性高，交联产量较高，是目前在生物检测中使用率较高的一种光交联基团。
光交联基团与捕捉探针中寡核苷酸的连接方法可以采用本领域已知的各种方法，例如：化学法。比如在寡核苷酸3’端连接上氨基后，与N‐羟基琥珀酰亚胺‐双吖丙啶交联剂，通过酰胺化反应将双吖丙啶连接到寡核苷酸3’端的氨基上。
术语“检测”指确定样品中一个或多个靶(例如，适配子结合蛋白等)出现或存在或其结构情况的行为。在本发明中，报告基因的检测方法可以是本领域已知的各种检测方法，例如：通过荧光信号、放射性信号、酶联反应报告(其随后在测定中读出)检测，或者通过固定化的标记，例如，亲和素或链霉亲和素‐HRP，被捕获到微量滴定板上再进行检测。
术语“富集”指将样品中微量的一个或多个靶(例如，适配子结合蛋白等)特异性收集的行为。在本发明中，靶的富集方法可以是本领域已知的各种富集手段，例如：采用链霉亲和素琼脂糖beads，通过生物素与亲和素的相互作用，将靶捕获收集。
术语“样品”以其最广泛的含义使用。在某种意义上其可指动物细胞、组织或者体液等。在另一种意义上，其意味着包括从任何来源获得的样本或培养物，以及生物和环境样品。生物样品可从植物或动物(包括人类)获得并且包括液体、固体、组织和气体。环境样品包括环境材料例如表面物质、土壤、水和工业样品。这些实例不解释为限制适用于本发明的样品类型。
本发明对适配子结合蛋白的检测或富集可以是对任何样品中的适配子结合蛋白的检测或富集，所述检测或富集的目的可以是用于疾病的诊断，或疾病的辅助诊断，或者非疾病诊断目的的检测或富集。以溶菌酶的检测或富集为例，可以是对任何生物体或药品制剂中的溶菌酶进行检测或富集，检测结果可用于了解溶菌酶的含量或活性。例如，研究发现水域中鱼体内的溶菌酶活性与水体中重金属镉或菲的浓度负相关，通过检测水域中鱼体内的溶菌酶活性，可了解相应水域重金属镉或菲的污染情况。又如，对含有溶菌酶的滴眼剂进行溶菌酶含量或活性的检测，能用于溶菌酶滴眼剂的质量控制。
术语“试剂盒”：本文还提供包含本文所述的双探针的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒可用于实施一种或多种本文所提供的方法。在一些实施方案中，方法在试剂盒中提供的用于使用本文所述方法和组合物的一组说明书中描述。双探针在一种或多种容器中提供(例如，瓶、小瓶、安瓿、管等)，并且可为立即使用的形式或为可重构的形式(例如，以向其中加入水的冻干形式。水可由试剂盒或使用者提供)。在一些实施方案中，试剂盒包含对照。对照的实例为阳性对照，例如，包含试剂盒的探针和/或方法所针对使用的一个或多个靶蛋白，和阴性对照，例如，不包含试剂盒的探针和/或方法所针对使用的一个或多个靶蛋白。在一些实施方案中，试剂盒还可包含缓冲液。一些试剂盒实施方案以多重形式提供预分配和即用型的所述技术的组合物，例如，以多孔板的形式，例如96孔板、384孔板、1536孔板或包含根据待运行的检验数目更多或更少孔的板。
附图说明
图1为基于寡核苷酸互补和光交联的分析方法的实施过程示意图
图2捕捉探针不同延长臂长度对分析方法标记效率的影响，图中n值代表延长臂中碱基的个数。
图3为双探针在细胞裂解液的复杂背景下对目标蛋白溶菌酶的荧光标记图。图中，泳道1为实验组：采用双探针和光照处理；泳道2为对照例：采用双探针但无光照处理；泳道3为对照例：仅采用捕捉探针和光照处理；泳道4为对照例：仅采用识别探针和光照处理；泳道5为对照例：采用了识别探针的寡核苷酸与捕捉探针序列不互补的双探针和光照处理。图中：BP代表识别探针，CP代表捕捉探针，Hela代表Hela细胞裂解液，UV代表紫外光照射，mis代表识别探针的寡核苷酸与捕捉探针的序列不互补。
图4为双探针在细胞裂解液的复杂背景下对目标蛋白溶菌酶的亲和富集的SDS‐PAGE电泳图。图中，泳道1为分子量标记；泳道2为溶菌酶样品；泳道3为从泳道2的样品中富集得到的溶菌酶；泳道4为细胞裂解液与溶菌酶的混合样品；泳道5为从泳道4的样品中富集得到的溶菌酶。
图5为双探针对蛋清实际样品中目标蛋白溶菌酶的识别以及荧光标记。A是样品的SDS‐PAGE电泳图，其中，泳道1为实验组：采用双探针和光照处理；泳道2为对照例：采用双探针但无光照处理；泳道3为对照例：仅加入捕捉探针和光照处理；B为带有荧光的探针对A图中样品的荧光标记图。
图6A‐图6E为合成的捕捉探针的MALDI‐TOF表征，图中CP1、CP2、CP3、CP4、CP5分别为对应捕捉探针的命名编号。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。需要说明的是，实施例不能作为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员理解，任何在本发明基础上所作的改进和变化都在本发明的保护范围之内。
在以下的实施例中，以溶菌酶为例，说明采用本发明的方法检测适配子结合蛋白的方法。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：溶菌酶检测探针的合成
识别探针：包括适配子序列和被捕捉序列，序列为：5’‐ATC AGG GCT AAA GAG TGCAGA GTT ACT TAG ATG TCG CTG TAG‐3’，其中前30个碱基为适配子序列，后12个碱基是被捕捉序列。
捕捉探针：包括悬臂序列、捕捉序列、延长臂序列、光交联基团以及荧光素或生物素。本实施例中共合成五个捕捉探针，分别命名为：CP1、CP2、CP3、CP4、CP5，其中：
CP1为5’FAM‐TTT TTT CTA CAG CGA CAT‐(CH2)6‐NH‐CO‐双吖丙啶，延长臂中的碱基个数n为0；
CP2为5’FAM‐TTT TTT CTA CAG CGA CAT TTG‐(CH2)6‐NH‐CO‐双吖丙啶，延长臂中的碱基个数n为3；
CP3为5’FAM‐TTT TTT CTA CAG CGA CAT TTG GGT‐(CH2)6‐NH‐CO‐双吖丙啶，延长臂中的碱基个数n为6；
CP4为5’FAM‐TTT TTT CTA CAG CGA CAT TTG GGT CAG‐(CH2)6‐NH‐CO‐双吖丙啶，延长臂中的碱基个数n为9；
CP5为5’Biotin‐TTT TTT CTA CAG CGA CAT TTG‐(CH2)6‐NH‐CO‐双吖丙啶，延长臂中的碱基个数n为3。
上述捕捉探针中：TTT TTT为悬臂序列，CTA CAG CGA CAT为捕捉序列。
所述识别探针和5个捕捉探针中带有荧光素或生物素和氨基修饰的序列均委托上海生工生物合成。
对捕捉探针进行光交联基团修饰的方法如下：
由DNA上的氨基与N‐羟基琥珀酰亚胺‐双吖丙啶(SDA)交联剂通过酰胺化反应得到。将DNA粉末用适量0.1M的NaHCO3溶液溶解使得母液浓度为100μM，向其中加入适量的SDA溶液(用DMSO溶解，SDA：DNA(摩尔比)＝20:1)。混匀后室温反应两个小时。产物采用冰乙醇沉淀，沉淀用乙醇洗三次后真空浓缩最终得到捕捉探针产物的粉末。
带有光交联基团的含有荧光素或生物素的捕捉探针的制备方法相同。
粉末用适量的水溶解后，其浓度利用紫外‐可见光谱仪测定，并通过MALDI‐TOF进行分子量表征，相应的检测图参见附图6A‐6E。
以下实施例中所用探针均来自于本实施例中所制备的探针，且为描述方便，所用探针及其命名编号与本实施例中制备的探针对应相同。
实施例2：采用实施例1中制备出的捕捉探针CP1‐CP4进行溶菌酶检测
取4份总量相同的溶菌酶样品(终浓度为20μM)编号为样品1、2、3、4，分别与相同总量的识别探针(20μM)在缓冲溶液(20mM Tris‐HCl，pH 7.4，100mM氯化钠，5mM氯化镁)中4℃度孵育过夜，然后向4份样品中分别加入相同量的捕捉探针(20μM)CP1、CP2、CP3、CP4，室温孵育1h使得识别探针与捕捉探针杂交，将所有样品都转移至冰上，在365nm下光照8min引发光交联反应，最后将样品抽干，并加入适量的上样缓冲液(上海生工生物，C508320)，95℃加热10min后SDS‐PAGE分离，于紫外光下进行胶内成像。
结果如附图2所示。
由图2可见CP2(n＝3)的泳道上目标条带的荧光最强，条带最宽，证明CP2经光交联后共价结合的溶菌酶最多。
实施例3：溶菌酶特异性和选择性的检测
将溶菌酶与20μg的Hela细胞裂解液(采用碧云天P0013B裂解液裂解Hela细胞)混合，使混合体系中的溶菌酶为20μM，然后与识别探针(20μM)在缓冲溶液(20mM Tris‐HCl，pH7.4，100mM氯化钠，5mM氯化镁)中4℃孵育过夜。然后向孵育后的样品中加入捕捉探针CP2(20μM)，室温孵育1h，使识别探针与捕捉探针杂交，之后将样品转移至冰上，在365nm紫外灯下光照8min，引发光交联反应。最后将样品真空浓缩成粉末，向粉末中加入适量的上样缓冲溶液(上海生工生物，C508320)，95℃加热10min后上样，SDS‐PAGE表征。将胶片置于凝胶成像仪中成像，观察荧光标记效果。
同时，采用同样的实验条件做四个对照样品，分别是：在检测体系中不加光照处理，在检测体系中不加入识别探针，在检测体系中不加入捕捉探针，在检测体系中所使用的识别探针和捕捉探针不互补。
结果如图3所示。
从图中可以看出，加入互补的双探针并光照后的样品泳道中出现了溶菌酶的荧光，而加入互补的双探针但未进行光照的样品泳道未出现溶菌酶的荧光，说明未进行光照的样品因未形成捕捉探针与溶菌酶之间的共价连接，不能起到稳定标记溶菌酶的效果，因而在实验过程中溶菌酶损失较多，不再容易被检测到。没有识别探针，或者没有捕捉探针，或者识别探针和捕捉探针不互补时，都没有溶菌酶被荧光标记。
实施例4：溶菌酶的富集
将溶菌酶与20μg的Hela细胞裂解液(采用碧云天P0013B裂解液裂解Hela细胞)按一定的比例混合，使混合体系中的溶菌酶为20μM，然后与识别探针(20μM)在缓冲溶液(20mMTris‐HCl，pH 7.4，100mM氯化钠，5mM氯化镁)中4℃孵育过夜。然后向孵育后的样品中加入生物素修饰的捕捉探针CP5(20μM)，室温孵育1h，使识别探针与捕捉探针杂交，之后将样品转移至冰上，在365nm紫外灯下光照8min，引发光交联反应。将溶液转移至盛有预先用PBS缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4)洗过的链霉亲和素琼脂糖beads的离心管中，置于4℃孵育4h，低转速离心，beads用缓冲液(10mM HEPES，pH 7.4，2M NaCl，1mM EDTA，0.1％Triton X100)洗三次后，向beads中加入适量体积的上样缓冲溶液(上海生工生物，C508320)，95℃加热10min，室温低转速离心，上清上样SDS‐PAGE表征，凝胶进行银染显色以观察探针富集的效果(对应为泳道5)。作为对照，除不加入双探针孵育处理之外，采用同样的实验方式和条件，将溶菌酶与细胞裂解液的混合物，加入适量的上样缓冲液(上海生工生物，C508320)95℃加热10min，SDS‐PAGE表征(对应为泳道4)。
同时，采用相同的实验条件和方法，对纯的溶菌酶样品进行探针的富集实验：将溶菌酶(20μM)与识别探针(20μM)在缓冲溶液(20mM Tris‐HCl，pH 7.4，100mM氯化钠，5mM氯化镁)中4℃孵育过夜。然后向孵育后的样品中加入生物素修饰的捕捉探针CP5(20μM)，室温孵育1h，之后将样品转移至冰上，在365nm紫外灯下光照8min，引发光交联反应。将溶液转移至盛有预先用PBS缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4)洗过的链霉亲和素琼脂糖beads的离心管中，置于4℃孵育4h，低转速离心，beads用缓冲液(10mM HEPES，pH 7.4，2M NaCl，1mM EDTA，0.1％Triton X100)洗三次后，向beads中加入适量体积的上样缓冲溶液(上海生工生物，C508320)，95℃加热10min，室温低转速离心，上清上样SDS‐PAGE表征(对应为泳道3)。作为对照，除不加入双探针孵育处理之外，采用同样的实验方式和条件，将溶菌酶加入适量的上样缓冲液(上海生工生物，C508320)，95℃加热10min，SDS‐PAGE表征(对应为泳道2)。
结果如图4所示。
从图中可以看出，泳道2和3在相同位置出现接近等量的银染条带，说明加入体系的识别探针结合了几乎全部的溶菌酶，并通过捕捉探针的富集作用将这些溶菌酶成功富集，证明实施例1的识别探针和捕捉探针CP5有效。对含有细胞裂解液的混合样品经过生物素‐亲和素富集处理后(泳道5)在相应的位置也出现了银染显色的蛋白条带，说明加入体系的双探针识别并结合了溶菌酶，通过生物素‐亲和素的相互作用，实现了从复杂体系中选择性地富集目标蛋白溶菌酶的效果。
实施例5：对实际样品进行溶菌酶检测
本实施例所用的蛋清从鸡蛋中提取得到，新鲜的蛋清用PBS缓冲溶液(137mMNaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4)稀释一倍后，冰水浴下均质匀浆化，然后4℃下10000rpm离心10min，收集上清溶液即为实验所用测定溶菌酶的样品。
将识别探针(20μM)与样品4℃孵育过夜，加入捕捉探针CP2(20μM)后室温继续孵育1h，在紫外灯下光照8min，引发光交联反应。最后将样品真空浓缩成粉末，向粉末中加入适量的上样缓冲液(上海生工生物，C508320)，95℃加热10min，SDS‐PAGE分离，并通过银染显色和荧光(365nm波长)分别进行表征。
结果如图5所示。
从图中可以看出，银染图A中溶菌酶的条带在蛋清各种蛋白条带中不易区分，荧光显色图B中只有溶菌酶对应条带处出现荧光标记。这说明溶菌酶在蛋清中的含量很低，蛋清中其他高丰度蛋白存在很强干扰，用常规的SDS‐PAGE银染的方式无法实现对蛋清中溶菌酶的检测。采用实施例1的识别探针和捕捉探针CP2可以有效地对蛋清中低丰度的溶菌酶进行标记，并结合SDS‐PAGE电泳法，实现对溶菌酶的检测。
上述实施例充分说明了利用本发明的分析方法可以实现在细胞裂解液为背景的环境下，对目标蛋白溶菌酶的特异性荧光标记，可以用于复杂体系中适配子结合蛋白的标记和发现。此外，本发明的分析方法还可以用于适配子结合蛋白的富集分离，即使在复杂体系中，仍然可以高特异性地检测或富集目标蛋白，可用于较低丰度的适配子结合蛋白的检测。

Claims (10)

1.一种双探针，包括识别探针和捕捉探针，其特征在于：所述识别探针是单链寡核苷酸，包括串联连接的适配子序列和被捕捉序列；所述捕捉探针包括捕捉序列以及修饰在捕捉探针上的光交联基团和报告基团，所述捕捉序列是单链寡核苷酸；识别探针上的适配子序列用于识别并结合适配子结合蛋白，捕捉探针的捕捉序列用于识别识别探针上的被捕捉序列，并通过碱基互补作用与识别探针的被捕捉序列结合；
所述识别探针的被捕捉序列位于适配子序列的3’端，并且光交联基团位于捕捉探针的3’端，报告基团位于捕捉探针的5’端；或者所述识别探针的被捕捉序列位于适配子序列的5’端，并且光交联基团位于捕捉探针的5’端，报告基团位于捕捉探针的3’端。
2.如权利要求1所述的双探针，其特征在于，所述识别探针的被捕捉序列为5’‐ATG TCGCTG TAG‐3’；所述捕捉探针的捕捉序列为5’‐CTA CAG CGA CAT‐3’。优选所述的适配子序列为5’‐ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG‐3’。
3.如权利要求1或2所述的双探针，其特征在于，所述识别探针为：5’‐ATC AGGGCT AAAGAG TGC AGA GTT ACT TAG ATG TCG CTG TAG‐3’。
4.如权利要求1‐3任一项所述的双探针，其特征在于，所述捕捉探针的捕捉序列和光交联基团之间具有延长臂序列，延长臂序列用于将捕捉探针上的光交联基团“悬挂”在识别探针被捕捉序列和捕捉探针捕捉序列形成的双链结构之外，使光交联基团从空间上接近被识别探针结合的适配子结合蛋白。优选延长臂序列为‐Y‐(CH2)6‐，其中Y为含有n个碱基的短序列，n为0‐12的整数，‐Y‐与捕捉序列相连，‐(CH2)6‐与光交联基团连接。优选n为0‐9，更优选n为3。优选所述延长臂序列为‐TTG‐(CH2)6‐。
5.如权利要求1‐4任一项所述的双探针，其特征在于，所述捕捉探针的捕捉序列和报告基团之间具有悬臂序列，悬臂序列用于将捕捉探针上的报告基团“悬挂”在识别探针被捕捉序列和捕捉探针捕捉序列形成的双链结构之外，以提供充足空间使报告基团伸展。优选所述悬臂序列为‐Z‐，其中Z为含有m个碱基的序列，m为大于等于0的任意整数。优选m为3‐9，更优选为6。优选所述悬臂序列为TTT TTT。
6.如权利要求1‐5任一项所述的双探针，其特征在于，所述捕捉探针为5’‐报告基团‐TTT TTT CTA CAG CGA CAT TTG‐(CH2)6‐X‐光交联基团，X为酰胺键或由叠氮炔点击化学反应所形成的五元环。
优选所述的报告基团选自生物素或荧光化合物。优选所述的荧光化合物是荧光素类、罗丹明类、菁染料、二苯乙烯类、萘酰亚胺类、香豆素类、吖啶类或芘类。优选所述的荧光化合物为异硫氰酸荧光素、羧基荧光素、四氯荧光素、六氯荧光素、四乙基罗丹明、四甲‐6‐羧罗丹明、羧基四甲基异硫氰酸酯、四甲基异硫氰酸罗丹明、噻唑橙、Cy3、Cy5、噁唑橙或藻红蛋白。
优选所述的光交联基团是双吖丙啶、二苯甲酮或芳香叠氮类化合物。优选所述芳香叠氮类化合物是叠氮苯。
7.如权利要求1‐6任一项所述的双探针，其特征在于，所述捕捉探针为5’‐荧光化合物‐TTT TTT CTA CAG CGA CAT TTG‐(CH2)6‐X‐光交联基团，或者5’Biotin‐TTT TTT CTA CAGCGA CAT TTG‐(CH2)6‐X‐光交联基团。
优选所述捕捉探针为5’FAM‐TTT TTT CTA CAG CGA CAT TTG‐(CH2)6‐NH‐CO‐双吖丙啶，或5’Biotin‐TTT TTT CTA CAG CGA CAT TTG‐(CH2)6‐NH‐CO‐双吖丙啶。
8.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1‐7任一项所述的双探针。
9.一种适配子结合蛋白的检测或富集方法，其特征在于：使用权利要求1‐7任一项所述的双探针或者权利要求8所述的试剂盒；
优选所述方法包括以下步骤：
1)将识别探针加入样品中，孵育；
2)将捕捉探针加入步骤1)得到的样品中，孵育；
3)将步骤2)得到的样品进行光照；
4)通过报告基团检测或富集适配子结合蛋白；
优选所述的适配子结合蛋白是核蛋白、胞浆蛋白、膜蛋白或分泌蛋白，更优选为组蛋白、激酶蛋白、骨架蛋白、转录因子、胰岛素、G蛋白或溶菌酶；
优选所述的检测或富集方法是非疾病诊断目的的检测或富集方法。
10.权利要求1‐7任一项所述的双探针在制备检测或富集适配子结合蛋白的试剂或试剂盒中的用途；优选所述的适配子结合蛋白是核蛋白、胞浆蛋白、膜蛋白或分泌蛋白，更优选为组蛋白、激酶蛋白、骨架蛋白、转录因子、胰岛素、G蛋白或溶菌酶。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111004329A (zh) * 2019-12-06 2020-04-14 南京师范大学 一种基于光亲和共价连接的蛋白质分子弱相互作用捕获磁珠及其制备方法和应用
CN115436622A (zh) * 2022-09-26 2022-12-06 重庆医科大学国际体外诊断研究院 一种单分子蛋白的检测方法及其试剂盒和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103361353A (zh) * 2013-07-19 2013-10-23 暨南大学 四环素适配体与检测四环素的适配体电化学生物传感器

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103361353A (zh) * 2013-07-19 2013-10-23 暨南大学 四环素适配体与检测四环素的适配体电化学生物传感器

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAI，X等: "Development of a DNA‐Templated Peptide Probe for Photoaffinity Labeling and Enrichment of the Histone Modification Reader Proteins", 《ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION》 *
COX，JC等: "Automated selection of anti-Protein aptamers", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY》 *
LU，CC等: "Probing the Binding Interfaces of Histone-Aptamer by Photo Cross-Linking Mass Spectrometry", 《ACS CHEMICAL BIOLOGY》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111004329A (zh) * 2019-12-06 2020-04-14 南京师范大学 一种基于光亲和共价连接的蛋白质分子弱相互作用捕获磁珠及其制备方法和应用
CN111004329B (zh) * 2019-12-06 2023-04-21 南京师范大学 一种基于光亲和共价连接的蛋白质分子弱相互作用捕获磁珠及其制备方法和应用
CN115436622A (zh) * 2022-09-26 2022-12-06 重庆医科大学国际体外诊断研究院 一种单分子蛋白的检测方法及其试剂盒和应用
CN115436622B (zh) * 2022-09-26 2024-03-08 重庆医科大学国际体外诊断研究院 一种单分子蛋白的检测方法及其试剂盒和应用

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