CN1974771A - 一种受化学物质烯丙异噻唑诱导的顺式元件及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种分离和利用核酸的顺式元件，该元件来源于马铃薯中具抗病抗逆作用的基因上游的启动子序列。将编码所希望的目的产物基因的核苷酸序列和单元件或其顺式串连重复后融合得到重组DNA，用这种重组DNA转化植物，将得到新的转基因植物。在新的植物中该重组DNA中的目的基因的表达受烯丙异噻唑probenazole(3－allyloxy－1，2－benzisothiazole－1，1－dioxide，PBZ)或其活性代谢物1，2－benzisothiazole－1，1－dioxide(BIT)的化学诱导物调控。

Description

一种受化学物质烯丙异噻唑诱导的顺式元件及其应用

技术领域

本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种受化学物质烯丙异噻唑或其活性代谢物诱导的顺式元件，该顺式元件来源于马铃薯中具抗病抗逆作用的基因上游的启动子序列。将编码所希望的目的产物基因的核酸序列和单元件或其顺式串连重复后融合得到重组DNA，用这种重组DNA转化植物，将得到新的转基因植物。在这种转基因植物中，该重组DNA中的目的基因的表达受烯丙异噻唑probenazole(3-allyloxy-1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide，PBZ)或其活性代谢物1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide(BIT)的化学诱导物调控。

背景技术

在植物领域，转基因技术已成为解决多细胞有机体生物所遇问题的强有力的工具，这包括将内源或外源基因引进植物以修饰某种功能或改变基因的表达模式。转基因技术的成功往往依赖于有效的启动子来控制转入基因的表达，而随着人们研究的积累，反向遗传生物学的研究也成为可能。

基因表达是基因经过转录、翻译、产生有活性的蛋白质的过程，转录是基因表达调控的重要环节。在真核体系中，基因的表达是受一段称为启动子的DNA调控的。真核生物的顺式作用元件是基因周围能与特异转录因子结合而影响转录的DNA序列。其中主要是起正调控作用的顺式元件，包括启动子和增强子。启动子是RNA聚合酶结合并启动转录的DNA序列，决定了基因转录的时间、空间和转录水平。启动子中的元件又可分为核心启动子元件和上游启动子元件。核心启动子元件指RNA聚合酶启动转录所必需的最小的DNA序列，包括转录起始位点及其上游-25/-30bp处的TATA盒。上游启动子元件包括通常位于-70bp附近的CAAT盒、GC盒以及距转录起始位点更远的上游元件。启动子中包含的其他调控元件可以感应诸如光、营养条件、热、缺氧、重金属等环境因素而对基因表达进行调控。启动子内的其他DNA顺序也许与发育的时序或基因表达的组织特异性有关。而且，真核体系中类似于增强子的顺序可以大大提高附近基因的表达水平，且与其所处的位置和方向没有多大关系。植物中也存在类似于增强子的序列。基本上，启动子可分为组成型表达和诱导型表达两种类型。对启动子结构和顺式作用元件的分析是启动子研究的主要内容。克隆、分析和应用各种类型的启动子，例如可诱导表达、组织特异性表达和发育阶段特异性表达的启动子，有利于分析基因功能和改良植物性状。真核生物启动子功能上的多样性为分离受严谨调控的启动子用于在转基因植物中适时调控基因的表达提供了条件。

利用合适的外源性化学物质调控大田生长作物中某些基因的表达，对于农业生产和粮食生产相当关键，尤其是对于以下几类在转基因植物中有较高应用价值的基因：(1)延长目的营养物质在种子、根、茎中的积累；(2)在植物生长发育周期内某一时段产生某产物并集聚于某一植物组织内以便于收集或/和分离；(3)在病原攻击的位置启动对于某一虫害有特异毒性的毒素的表达。第二点可使生物反应器具有更高的效率，而最后一点也许能提供一种避免有毒物质对食品的污染以及通过对毒素的选择性或组织特异表达而非组成型表达来降低虫害对毒素产生抗性的几率。由于至今没有较成熟的在大田中可操作的外源控制植物基因表达的手段，以上及其他优点至今尚未很好地体现。

现今已有多种目的基因的利用途径。这些基因或是在植物的生命周期内持续表达(受控于组成型启动子)，或是受控于器官、组织、细胞固有的发育程序(时序或组织特异的启动子)而使目的基因得到表达。持续表达无法控制基因在特定的生长阶段、在特定的组织或是感应环境变化后表达。再者，如此组成型的表达会对产量产生不利的影响，因为这样长期高表达单个基因的产物会大大增加对能量的消耗。组织特异性或时序特异性的表达虽然有利于在特定的时间和空间积累特定的产物，但它亦受到不同植物各自内在的发育和时空调控程序的影响。因此，若要应用于实际生产，需要分离到各种在不同植物的不同组织或不同生长阶段特异发挥作用的启动子，尤其是我们感兴趣的农作物品种。

理想的条件下，人们希望通过可诱导信号来刺激目的基因在植物生命周期中的任意时刻及任何组织内的表达，以获得对转基因植物中目的基因表达的外源性调控。这一调控作用可以通过对诱导信号感应灵敏的启动子控制结构基因表达的方式实现。理想的诱导物和启动子的组合可适用于广泛的植物种类，并且诱导物对植物正常的生长、发育和形态没有太大的影响。符合以上要求的化学物质可在已有条件下方便地应用于大田农业生产。例如，化学诱导物可以由在种植者中广泛应用的设备喷洒。理想的诱导物/启动子组合可适用于转基因植物的任何生长阶段或任何组织，以调控各种目的基因的表达。

在细菌和动物系统中已有不少能调控外源基因表达的诱导物/启动子组合。许多细菌内的诱导体系是基于能够响应代谢物或其类似物的启动子的。用包含相关启动子的目的基因转化细菌后，在其培养基中加入合适的诱导物，便可以引起目的产物的表达。这些诱导物/启动子组合的例子有3-β-吲哚乙酸/色氨酸启动子，IPTG/lac启动子，磷酸盐/磷酸盐饥饿诱导的启动子，以及L-阿拉伯糖/ara B启动子等。类似的，重金属/metallothionine启动子，热/热休克等启动子已应用于动物细胞的培养系统中，调控外源基因的表达。

现在已知有不少源于植物的诱导物/启动子组合。这些启动子的活化大多通过环境因子，比如光、热击和缺氧等。这些可诱导基因的启动子被深入地研究过。然而，利用受环境因素调控的启动子调控外源基因难以实际应用，因为这些诱导信号在农业生产的条件下难以控制。其他有一些植物基因据报道可以为病原侵染和/或伤害时所产生的寡糖所诱导。例如，在大豆中由葡聚糖受体诱导产生的苯丙氨酸脱氨酶和查尔酮合成酶(Ebel，J.，etal.，Arch.Biochem.Biophys.232，240-248，1984)，以及在土豆中受伤害诱导的抑制剂基因(Cleveland，T.E.et al.，Plant Mol.Biol.8，199-2081987)等。只是这些启动子在转化的植物中对调控外源基因的表达没有多大作用，原因或是因为缺乏可操作的诱导方法(伤害)，或是因为在植物生长过程中需要分散能量来合成大量对抗病原侵染所造成不利影响的物质(寡糖诱导物)。

有许多化合物，包括天然化合物与合成化合物，都具有调控植物基因表达的潜力。然而，任何能够作为诱导物用于大田的化合物必须对环境无害，对植物的生长发育及形态没有很大影响，并便于以现有的手段用于农业生产。

有一些天然产物已知可以影响基因的表达。这些化合物大多是植物生长调节因子，比如生长素，细胞激动素，赤霉酸，乙烯和脱落酸等(c.f.，Davies，P.(Ed.)Plant Hormonesand Their roles in Plant Growth and Development，Martinus Nijhoff Publ.1987)，其他如水杨酸等的化合物也有很强的作用(Hooft Vanhuijsduijnen et al.，J.Gen.Virol.，67：235-2143，1986)。当上述这些生长调节因子用于不同植物的细胞、组织或器官后，可以观察到代谢状态的变化，这至少在一定程度上与新的基因表达有关。一些基因产物以及基因本身已经得到分离和鉴定。然而，鉴于这些化合物诱导的基因通常是与调节植物生长和发育相关的，它们难以用作为转基因植物中化学可诱导基因的诱导剂。其直接原因是这一类物质会同时激活不必需的植物内源性对激素敏感的发育程序，从而造成不必要的多效性。例如，对在发育过程中的植物用脱落酸激活外源基因的表达会同时激活不必需的激素效应，影响植物的代谢(Milborrow，B.V.An.Rev.Plant Physiol.25，259-2071974)，造成生长大大迟缓以及在成熟前嫩叶和果实的脱落。其他植物激素也有类似的对植物生长发育不利的影响，因此也无法应用于调控转基因植物中外源基因的表达。更综合的有关诸如脱落酸、乙烯、细胞激动素和生长素之类的植物激素对食用植物影响的综述可见Phytohormones and Related compounds：A Comprehensive Treatise Vols I & II(Letham，D.S.，Goodwin，P.S.，and Higgis，T.G.V.eds.Elsevier/North Holland，1978)。

烯丙异噻唑probenazole(3-allyloxy-1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide，PBZ)，是防治稻瘟病的优良药剂，是目前日本杀菌剂中产量最大的品种之一。PBZ本身或其代谢物不影响稻瘟病菌的生长和对植物的侵染能力，它可能是通过激活植物自身的抗病机制而使植物产生抗病性(Michiaki lwata，The Royal Society of Chemistry Pesticide Outlook，28-31，2001)。PBZ可诱导拟南芥和烟草等双子叶植物产生系统获得抗性，在水稻等单子叶植物中可通过类似系统获得抗性的途径诱导植物产生抗病性。

在二十世纪八十年代，随着玉米中解除除草剂毒性谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione S-Transferase，GST，EC 2.5.1.18)基因的克隆，发现GST基因普遍存在于动植物中，其序列于动植物中存在明显差异，到目前为止，拟南芥中已发现48个GST基因。谷胱甘肽-S-转移酶，是由GST基因家族编码的一类变异范围广，具有多功能的酶。植物GST酶可分为Phi、Tau、Therta、和Zeta、四类；其中Theta和Zeta是植物和动物中共有，Phi和Tau为植物所特有。GST酶的功能主要表现在以下几个方面：(a)解除外界毒素以及内源有毒代谢物的侵害；(b)具有过氧化物酶活性，能解除羟基过氧化物的毒性；(c)抑制细胞程序化死亡功能；(d)在激素的稳定和液胞花色素苷的汇集中以非催化载体起作用；(e)在Tyr代谢中催化异构化作用；(f)胁迫信号蛋白的角色。在植物组织中有GST的表达，但不同物种、不同组织和不同细胞中所含的GST同工酶种类各异，各种同工酶的表达水平不同，即GST基因的表达具有组织特异性，在植物中，除草剂、病原微生物、重金属离子、盐胁迫、高温、冷害、机械损伤等都会诱导一些GST基因的表达，表明其启动子上元件诱导活性的多样性，但其与PBZ的关系尚无任何报道。

本发明集中在来源于植物中受PBZ诱导的DNA启动子片段。这些启动子片段被用于建立一套PBZ/PBZ诱导基因的系统，并在转基因植物中调控外源基因的表达。这一体系可用于在大田中生长的转基因植物中外源性调控目的基因的表达。它的优势包括这些启动子片段在用PBZ处理后表现出的高活性，在所有实验的植物组织中都有明显的表达，以及没有用化学物质处理后产生的多效性等。

化学诱导启动子在转基因植物系统中应用的可行性方面，许多工作从不同角度进行了研究。

Ebert等人开始了对包含nopaline合成酶启动子的DNA片段的研究(Ebert et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5745-5749，1987)。该启动子源于细菌，为组成型而非诱导型，且广泛地用于植物组织中。构建载体，使该启动子调控下游报告基因CAT。作者发现一段33bp的DNA片段(-97--130)对CAT的表达是必需的。同时他们发现2个该片段可以使CAT表达水平上升3倍。这一在烟草组织中稳定转化的结果在烟草原生质体中的瞬间表达分析得到了重复。比较稳定转化和瞬间表达的CAT在烟草组织和原生质体中受该33bp片段调控的表达水平情况，两者表现相同。作者无疑是想表明瞬间表达分析对于研究启动子在稳定转化体系的表现是很有帮助的。

已有对缺氧诱导的玉米乙醇脱氢酶Adh I基因的研究，通过电穿孔的方法将Adh I基因片段转化源于悬浮培养的玉米原生质体(Howard，et al.，Planta，170：535-450 1987)。转化后的原生质体置于低氧含量处，并于20小时后分析Adh I的表达。为便于测量缺氧诱导的Adh I表达，将天然Adh I基因5’调控片段(1096bp)与CAT相连。他们的结果显示，在源于同源的培养细胞的原生质体中，标准的缺氧条件可以调控单子叶植物玉米的Adh I启动子/CAT基因。同时，他们又发现，在玉米原生质体中，单单Adh I的启动子片段足以受缺氧条件诱导而调控外源基因表达，而无需编码区和3’区的存在。

其他一些研究者(Lee et al.，Plant Physiology 85：327-330 1987)进一步确定了玉米Adh I基因与缺氧诱导相关的DNA片段。这些研究者在玉米原生质体中转入包含CAT编码顺序和Adh I启动子的重组基因，并于24小时后检测CAT活性。通过改变启动子片段的长度，Lee等人确定从转录起始位点上游146bp的启动子顺序足以在缺氧状态下启动CAT的表达。然而启动子顺序向5’端继续延伸到266或955bp后，CAT表达量上升了5或8倍。

Walker等人继续用瞬间表达方法研究玉米Adh I基因上游受缺氧诱导启动基因表达的顺序(Walker et al.，proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：6624-66281987)。他们确定了启动子中与缺氧诱导的基因表达相关的2段顺序：-133--124和-113--99(转录起始位点上游)。这2段顺序对于诱导是必须的。在一无关联的病毒启动子前添加这段40bp的元件后可以受缺氧诱导。

另外有人发现在稳定转化的烟草细胞内，如果用玉米Adh I基因-1094-+106这一段调控CAT基因，在合适的缺氧条件下，有非常低的CAT基因表达(Ellis et al.，EMBOJournal 6：11-161987)。事实上，只检测到CAT的mRNA。然而，将octopine合成酶基因或花椰菜镶嵌病毒(CaMV)的启动子元件接在Adh I启动子的5’端，可刺激CAT的表达，并在缺氧诱导后检测到CAT。包含与Adh I基因转录起始位点5’相邻顺序247bp的片段，足以将CAT基因的表达置于缺氧调控之下。因此，即使在有组成型的octopine合成酶或CaMV 35S启动子片段存在的条件下，这段247bp的顺序的存在仍使基因的表达受缺氧调控。Howard、Lee以及Walker等人通过瞬间表达分析获得的受缺氧诱导调控的Adh I启动子区域与Ellis等人通过稳定转化植物所获得的一致或类似。

已有在动物和微生物体系中化学诱导目的基因表达的专利获得批准。美国专利号为4579821的专利授予Palmiter和Brinster，他们分离了小鼠金属硫因-1(metallothionein-1)基因的调控序列并将其与特定的DNA序列连接，在有重金属或胆固醇的条件下控制基因表达。在分化后的成年鼠细胞用钙离子或地塞米松处理后，受金属硫因-1启动子调控的胸苷激酶表达。美国专利号4703005的专利授予Nakata和Shinagawa，他们分离了一个磷酸盐结合蛋白的基因phoS，在其3’端连上一个外源基因。在培养基上，该外源基因可由磷酸盐调控。以上这些发明都难以应用于大田作物。可激活金属硫因启动子的重金属离子不仅对植物有毒，而且会对土地造成巨大的污染。类似的，受如磷酸盐等营养物调控的启动子也无法用于大田，因为大田中难以维持营养物水平的稳定。

有些报道试图在转基因植物中调控基因的表达。欧洲专利申请号85302593.0的专利从大豆中分离到4个热休克基因的启动子并声称它们可以促使转基因植物中外源基因的表达。在申请书中，作者声称使用这些启动子可以暂时活化外源基因的表达，比如Basillusthuringenesis的crystalline毒素蛋白的结构基因，或是在体内对热击响应而表达的抗除草剂基因。然而，如此将基因表达与热休克启动子相联系的办法难以适用于大田中每天温度的变化。

Marcotte和Quatrano(J.Cellular Biochem.Supplement 12C，1988；Marcotte，W.R.，Bayley，C.C.，and Quatrano，R.S.，Nature 335，454-457 1988)报道了对一融合基因的可诱导性研究的最初数据。该融合基因的转录受来源于2个小麦中ABA诱导的基因Em和7S球蛋白的基因启动子调控。在用ABA诱导后，整个植株都有该基因的表达。看来诱导性至少是部分地发生在转录水平上。将包含不同长度的Em基因的5’区域的启动子片段和GUS基因编码区以及CaMV 35S转录子的poly A信号相连，通过在单子叶植物(水稻)和双子叶植物(烟草)原生质体内的瞬间表达检测ABA诱导的GUS活性。他们发现Em编码区上游的一段区域(650bp)和7S球蛋白编码区上游的区域(1800bp)足以在水稻原生质体中受ABA诱导后控制GUS的表达。Em启动子在双子叶植物的瞬间表达体系中对ABA没有任何响应，暗示这一启动子在双子叶植物中没有功能。然而，我们前面已经详细讨论过包括ABA在内的植物激素的诱导作用具有多效性，这样就排除了利用其在大田生长的转基因植物中调控基因表达的可能性。

欧洲对De Danske Sukkerfab A/B批准的专利(CC87-106623)宣称找到一种用根/节特异性基因启动子调控目的基因表达，以在豆科植物中改进固氮系统。发明者特别指出氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)受源于大豆豆血红蛋白基因的启动子调控，在转基因植物的根中表达的诱导性与其它根特异基因表达类似，都受生节作用(nodulation)的影响。这个方法的局限性是明显的，基因的表达只能通过生节作用诱导，而且诱导是根特异性的。它无法在任何时候或任何组织中通过外源调节的方法对大田生长的转基因植物的基因表达进行调控。

美国曾批准一个除草剂安全剂诱导的启动子的专利(美国专利号：5364780)，研究者以第一个“适用于大田生产的化学物质诱导而在转基因植物中调控目的基因表达的启动子”得到了专利(1991年)。在进一步的应用中，他们将In2-2启动子与报告基因GUS相连，转化拟南芥植物，通过组织化学的方法分析发现对于不同类型的除草剂安全剂，GUS分别表达于根、苗等不同组织(De Veylder L etc.，Plant Cell Physiology，1997，Vol38，No.5：568-577)。但磺酰脲类除草剂诱导系统的研究方面未见有专利申请。

适用于大田生产的化学物质诱导而在转基因植物中调控目的基因表达的启动子，其表达的特异性必须便于对植物的外源性调节，所用的化学物质应当能有多种使用的方法，且能诱导特异目的基因的表达。而PBZ在大田中的应用已很普遍。有关PBZ诱导的启动子应用于转基因植物方面的工作还未见报道。PBZ诱导启动子的应用，将使人们能有效调控具有农业价值的基因在转基因植物中适时表达。

发明内容

本发明的目的在于提供一种受化学物质烯丙异噻唑诱导的顺式元件及其应用。从而实现应用化学物质控制转基因植物或植物组织中基因的选择性表达。

本发明提出的顺式元件，是一个源于马铃薯、且对PBZ的诱导作出应答的一个顺式作用元件，记为Gst1-box，其核苷酸序列为SEQ ID No.1。这一顺式元件已构建到含有非植物来源基因的重组载体中，转化植物后发现结构基因的表达水平受化学物质的调控。

特别地，本发明提供一核酸启动子。该核酸启动子片段受化合物烯丙异噻唑probenazole(3-allyloxy-1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide，PBZ)或其活性代谢物1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide(BIT)等诱导。因此在用化合物诱导后，带有所述元件的转基因植物会引起连接在所述启动子3’末端的一个编码特定基因产物的DNA顺序表达升高。

本发明的另一方面提供一重组DNA载体。该载体含有上述顺式元件(Gst1-box)或其顺式串连构成(即多个Gst1-box顺序串连)的启动子。该载体转化后的植物中，包含所述核酸启动子片段、与该启动子相连的编码特定基因的DNA顺序及合适的3’下游序列，使转化该重组载体后的植物在化合物烯丙异噻唑(PBZ)或其活性代谢物BIT的作用下，特定基因产物水平上升。实施例中选择的特定基因为编码GUS的基因。

本发明还包括用本发明的重组DNA结构转化植物，这种转基因植物用化合物烯丙异噻唑(PBZ)或其活性代谢物BIT处理引起编码选择的基因产物的DNA顺序表达增高，该DNA序列经操作连接在所述启动子片段的3’端。这样的转基因植物的种子同样认定为该发明的体现。

本发明最后还包括在植物中引起所选择的基因产物表达增高的方法，它有几个步骤组成：a)用上述描述的重组DNA结构转化植物；b)用化合物PBZ处理转基因植物；c)使转基因植物在期望的时候增加所选择的基因产物的表达。

具体实施方式

实施例1：GST1顺式元件片段的获得

根据现有研究中对PBZ诱导基因的搜索、总结和生物信息学分析，PBZ诱导植物的SAR可能涉及到植物体内多种信号转导途径，其中在植物抗逆抗病中均有重要作用的GST基因可能在PBZ诱导信号通路中具有重要作用；另外核苷酸序列分析也表明马铃薯GST1基因上游的启动子中包含有可能的PBZ诱导元件(Gst1-box，SEQ ID No.1)。因此根据马铃薯GST1基因上游启动子的序列(SEQ ID No.6)设计了人工合成核苷酸片断：

5’CTAGATTCTAGCCACCAGATTTGACCAAACACTAGTAAGCTTCTGCA 3’(SEQID No.2)

5’GAAGCTTACTAGTGTTTGGTCAAATCTGGTGGCTAGAAT 3’(SEQ ID No.3)

将人工合成的正义和反义核苷酸序列分别溶解，混匀后在PGR仪上退火，反应条件为94℃变性5min，再按94℃60s，55℃ 30s，最后4℃保温10min，形成双链产物。电泳检测并回收双链产物。

将上述双链产物作为插入片段与T-载体连接得到质粒，并转化大肠杆菌DH5α，在涂有IPTG和X-gal的含有氨苄抗生素的LB固体培养基上进行蓝白斑筛选，获得含有Gst1-box的重组子。以该质粒为模板，以相应的引物对做PCR，验证是否有正确片段插入。将确实含有正确插入片段的克隆进行测序，进一步确认Gst1-box的正确性。

实施例2：带启动子片段的植物转基因载体的构建

将经测序验证的质粒用XbaI和SpeI双酶切，电泳，回收得到GST1-box顺式元件序列。将该序列以1X、2X和4X的三种组合方式，克隆到pCAMBIA 1301双元转化载体上的基本启动子(mini promoter)的上游，驱动GUS基因的表达，相应获得三种载体：pCGST1、pCGST2(SEQ ID No.4)、pCGST3(SEQ ID No.5)，经PCR验证后用电击法分别转化农杆菌菌株LBA4404。在含利福平、链霉素和卡那三种抗生素的LB固体培养基上筛选，挑单菌落，小管摇菌。以菌液为模板，以各片段相应的引物对为引物做菌落PCR，验证各质粒是否已转入农杆菌，阴性对照各反应不加模板。

实施例3：转基因植物受PBZ诱导驱动报告基因表达的研究

将带有pCGST1、pCGST2、pCGST3的农杆菌转化拟南芥。28℃、120rpm转速下培养农杆菌菌株，浓度至OD600＝1.2；5000rpm(所用离心机为Hitachi CR22E，转头为R22A2，24号)、4℃下离心10min，多次离心收集菌体。5％蔗糖溶液悬浮菌体至OD600＝0.8，菌体均匀悬浮成混浊液；加入Silwet L-77(0.03％)。将植株倒浸在菌液中3s；隐蔽保湿24小时，转到正常条件下培养。

经转化的T₀代拟南芥所结种子(T₁代)在4℃冰箱黑暗条件下春化一个星期后，开始筛选。种子分装于1.5ml的Ep管，每管约100ul体积，加升汞(0.1％ HgCl₂)1ml灭菌6分钟，用无菌水清洗5次，最后用无菌水重悬后，转移到潮霉素30mg/L的MS培养基上，使种子在培养基上均匀分布，吸去多余水分，封口膜封口。在拟南芥培养室中，筛选7天。挑选明显为深绿色、根系长、植株高的拟南芥植株移栽到土中。移栽之前先浇水，移栽后保鲜膜覆盖四天。植株生长到一定时期，取叶片提取DNA，以之为模板，以转化入片段的相应引物对为引物做PCR，验证是否为转基因植株。

T1代植株单株收种(T2代)，在4℃冰箱黑暗条件下春化一个星期后，开始筛选。种子分装于1.5ml的Ep管，每管约100ul体积，加升汞(0.1％ HgCl₂)1ml灭菌6分钟，用无菌水清洗5次，最后用无菌水重悬后，转移到潮霉素30mg/L的MS培养基上，使种子在培养基上均匀分布，吸去多余水分，封口膜封口。在拟南芥培养室中，筛选7天。挑选潮霉素抗性分离比为3∶1的株系，用Southern杂交手段挑选单拷贝插入的株系，将单拷贝插入株系的抗性植株移栽到土中。将收到的种子(T3代)通过潮霉素筛选来确定其是否是纯合株系，将经过鉴定为纯合的株系的种子即T3代在土中播种，以其4-6周正常生长植株为材料，检测启动子片段驱动GUS基因表达的情况。

作为拟南芥转化和GUS表达的阳性对照，以含35S启动子驱动GUS基因表达的pCAMBIA1301载体转化拟南芥，得到10株转基因植株，其中四株用于T₃代分析。这四个生长发育正常的株系的植株，在培育室中正常生长四周后从土中拔出，尽量不损坏根部。用水将植株清洗干净，并用滤纸吸去多余水分，然后将整株植物放于小培养皿中，用X-Gluc染液染色，检测GUS表达。该四个株系的植株中均检测到了GUS的表达，且蓝色出现在植株的各个部位，包括叶片、叶柄、叶原基、根等。

GUS染色的阴性对照一，即经PBZ处理的处于相同生长时期的野生型拟南芥植株，未检测到GUS基因的表达。

这些结果表明，拟南芥转化以及GUS基因表达的检测系统是可靠、有效的。

以pCGST1、pCGST2、pCGST3转化拟南芥，分别得到11、9、12株转基因植株，相应地命名为pCGST1(1)-pCGST1(10)、pCGST2(1)-pCGST2(9)、pCGST3(1)-pCGST3(12)。

对上述转基因植株株系后代进行PBZ处理3天(水处理作为对照)，然后对整株植株进行GUS表达分析，检测GUS基因的表达。pCGST1转化的四个株系中，有3个显示GUS表达，表达只出现在整个叶片和部分根部。pCGST2、pCGST3转化得到的部分转基因株系表现出的组织定位类似，但表达强度明显不同。

用PBZ处理pCGST1、pCGST2、pCGST3转化得到的转基因株系后代植株，以水处理作为对照，3天后取充分展开叶片进行GUS酶活性的定量分析。结果显示，不同的串连元件重复表现出酶活的梯度，但酶活的大小与元件的多少并不呈现正线性相关，且其本底表达量随元件串连的数目增加也同时表现出增加的趋势，其中pCGST2表现出最佳的PBZ诱导活性。

在阴性对照二中，即转含基本启动子驱动GUS表达的载体的转基因植株，能检测到GUS基因的微量表达，集中于叶柄基部，且其表达不受PBZ处理的影响。

上述结果表明，GST1序列在转基因拟南芥中可响应PBZ的诱导，并驱动GUS基因的表达，具有可诱导的启动活性。其整体活性和诱导活性均可通过技术手段进行调节，其中pCGST2表现出较强的整体活性和较低的本底表达，具有最佳的PBZ诱导活性。

本发明涉及的序列

SEQ ID No：1的信息

长度：25碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：寡核苷酸

序列描述：SEQ ID No：1

TTCTAGCCACCAGATTTGACCAAAC

SEQ ID No：2的信息

长度：47碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：寡核苷酸

序列描述：SEQ ID No：2

CTAGATTCTAGCCACCAGATTTGACCAAACACTAGTAAGCTTCTGCA

SEQ ID No：3的信息

长度：39碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：寡核苷酸

序列描述：SEQ ID No：3

GAAGCTTACTAGTGTTTGGTCAAATCTGGTGGCTAGAAT

SEQ ID No：4的信息

长度：71碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：寡核苷酸

序列描述：SEQ ID No：4

TAGTGTTTGGTCAAATCTGGTGGCTAGAATCTAGTGTTTGGTCAAATCTGGTGGCTAGAATCTAGTGTTTG

SEQ ID No：5的信息

长度：132碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

序列描述：SEQ ID No：5

TAGTGTTTGGTCAAATCTGGTGGCTAGAATCTAGTGTTTGGTCAAATCTGGTGGCTAGAATCTAGTGTTTGGTCAAATCTGGTGGCTAGAATCTAGTGTTTGGTCAAATCTGGTGGCTAGAATCTAGAGGAT

SEQ ID No：6的信息

长度：1520碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

序列描述：SEQ ID No：6

1 AAGCTTACAT TCAACGTGTT GCTGCTTCAA AATAAGGGTC TTTACAAAAT TTAAAAAATA

61 TAAAGAAGAA TTTTGAATTT TATAATTAAA GCCGTCAGAA AGGACTTGAC CTTTGAAGCC

121 AACCCAACTC AATATTAGAA AATCAAAAAT TTTAGTGCAT TCATTTATAAAAAAAAAAAA

181 AATTACTTAT GCAGTTCTTG AACCCTTTGT GAGACGAGAG GGAGTTGCTC GGATGGTAAG

241 CACCCTTCAC TTTCAACCCG AAGGTTGCGA GTTTGAGTCA CCAACGGAGC AAAAGGGTA

301 GGAGCTCCTA GAAAGGGTAA AAAAAAAAAA AAAAATTAAT AAAAAAATAC

    CCTTTATGAA

361 ATTTCTCATT CCGCTACTGC ACTTCTCCCC TGATCTTCCT CGTGTTTTCA ATTATTAATT

421 CTATATTCAT GACACCATGT GATGTTTCTC TGGGTAGTCC TAAAAATAGA GGTATTGAAA

481 ATTATGTTGT TTCTCTCTGG TCTATTTACT TTTCTTGTGT ACTTTATTGT ATTTCATATT

541 GTTAATTTTT GGCTTCGTTT TATAACATGT TATTAGCACA AAACTTTAAT CATATCGAGT

601 TAAACTTTTA ATTTTGCTTA TCAACGTAAA AGACAAGATA TGTGATCGGC ATGTATAACT

661 ATGTTTTAAT TAGGTATAAT ACATAAATAT TTCCTTTAAT TTTATCTCAT TTTATATTTA

721 TGTCGTTTAA CTTTGGAGCG TACAAGTGTC TACTTGTGAT CCAGTAGGTT ATCAAAGCTG

781 GCATGCTTAG TTTTACTTTC CAAATTGAAA TTTATATTAG AATTGAATTC AGGAAGAATT

841 TTGTAGGTTC AACTAAATTA TATATATATA TATAAAAAAA TAAAAATTAT TAGACGCTTC

901 GACTATTTAC TTACTTTAAA ATTTGAATTT TCGTACGAAT AAAATTATTT GTCAGAGAAA

961 AGTCTTTTAG CTATTCACAT GCTAGGAAGT TTCACTTTTG GTGGATCAGT GATTGTATAT

1021 TATTTAATAT ATATCAATTT TCTCATCAAA CTGAAAATGA AAGATAAAAT

     TAATATTAAA

1081 AACTCCATTC ATTTTAATTT ATTGTCATGT TTTGACTTGA TCCAAAATCT AACAATTTAA

1141 AAGGTTTTAA ATTTTTGTGC TTTTTTTTAA ATTAAAAATA TGTCAAATAT ATTAAAATAT

1201 ATTTTTTAAA TTTTATACTA AAAAACATGT CACATGAATA TTTGAAATTA TAAAATTATC

1261 AAAAATAAAA AAAGAATATT TCTTTAACAA ATTAAAAATG AAAATATGAT

     AAATAAATTA

1321 AACTATTCTA TCATTGATTT TTCTAGCCAC CAGATTTGAC CAAACAGTGG

     GTGACATGAG

1381 CACATAAGTC ATCTTTATTG TATTTTATTA CTCACTCCAA AAATATAGGG AATATGTTTA

1441 CTACTTAATT TAGTCAAATA TAATTTTATA TTAGAATAAT TGAATAGTCA

     AACAAGAAAC

1501 TTTAATGCAT CCTTATTTTT

Claims (5)

1、一种受化合物烯丙异噻唑诱导的顺式元件，其特征在于是一个源于马铃薯、且对PBZ的诱导作出应答的顺式作用元件，其核苷酸序列为SEQ ID No.1，记为Gst1-box。

2、一重组载体，其特征在于该载体含有权利要求1所述的顺式元件Gst1-box或其顺式串连构成的启动子，该载体转化后的植物中，包含所述核酸启动子片段、与该启动子相连的编码特定基因的DNA顺序及合适的3’下游序列，使转化该重组载体后的植物在有化合物烯丙异噻唑或其活性代谢物的作用下，特定基因产物水平上升；其中所选择的基因为编码GUS的基因。

3、一种用权利要求2所述的DNA结构转化的植物，这种转基因植物用化合物烯丙异噻唑或其活性代谢物处理引起编码选择的基因产物的DNA顺序表达增高，该DNA顺序经操作连接在所述启动子片段的3’端。

4、一种由权利要求3所述的转基因植物的种子。

5、一种在植物中引起所选择的基因产物表达增高的方法，其特征在于具体如步骤如下：

a)用上述描述的重组DNA结构转化植物；

b)用化合物烯丙异噻唑或其活性代谢物处理转基因植物；

c)使转基因植物在期望的时候增加所选择的基因产物的表达。