CN1966663A - 一种复合微生物叶面肥菌剂及其生产方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种复合微生物叶面肥菌剂及其生产方法和用途。该菌剂包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、总状毛霉(Mucor racemosus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)，经过斜面培养、一级种子、二级种子以及混合培养发酵，实现了复合菌生物量及其不同菌种配比的最优化，复合菌剂有效活菌数大于3×109cfu/mL。本发明提供的复合微生物叶面肥菌剂，能够促进植物根、叶生长和改良种植土壤，促进农作物增产。
Description
技术领域
本发明涉及一种复合微生物叶面肥菌剂，特别涉及一种用于作物叶面喷施和灌根用的复合微生物叶面肥菌剂。本发明还涉及所述复合微生物叶面肥菌剂的生产方法以及其用途。
技术背景
进入九十年代后，叶面肥的作用已被广泛重视，发展也非常迅速。目前市场上叶面肥的种类越来越多，其范围已超出最初的定义，与植物生长调节剂、农药的界限越来越模糊，并且有渗透融合趋势。按所含主要成分可将叶面肥粗略划分为：1.矿质营养型：主要成分为氮、磷、钾及微量元素的无机形态，如植物动力2003、绿旺、高乐等；2.有机营养型：主要成分含有氨基酸、腐殖酸等有机形态的营养元素或生理活性物质，如高美施、惠满丰、叶面宝等；3.植物生长调节剂型：主要成分含有植物生长调节剂，如增产灵、丰产素、植物营养素等；4.复合型：主要成分含有有机、无机形态的养分或还含有植物生长调节剂、农药等其它成分，如喷施宝等；5.其它：主要成分含有微生物代谢产物或稀土元素等。
最近几年出现的一些微生物制剂产品，有的属微生物发酵液体产物，有的为微生物活体叶面肥料，效果比较显著，并有替代传统叶面肥的趋势。
国内目前在复合微生物制剂筛选培养过程中，由于缺乏基本的理论指导以及成熟的生产工艺，对复合培养的发酵过程及其各菌群之间的相互作用及其机理较为生疏，导致产品活菌总数不能保持一定水平，产品质量不稳定，影响了其在使用过程中的效果。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，公开了一种复合微生物叶面肥菌剂，用于植物叶面的喷施或灌溉。本发明还公开了该菌剂的生产方法和用途。
(二)技术方案
本发明从30个不同属、种中筛选出最佳稳定共生菌种组合，通过单独培养筛选高产菌种。筛选出的菌种为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、总状毛霉(Mucorracemosus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)。
根据上述筛选结果，本发明设计了一种复合微生物叶面肥菌剂，包括酿酒酵母5.0×108～1.0×1010cfu/mL、植物乳杆菌5.0×108～1.0×1010cfu/mL、总状毛霉1.0×102～5.0×104cfu/mL、米曲霉1.0×103～5.0×104cfu/mL；
优选地，酿酒酵母1.0×109～6.0×109cfu/mL、植物乳杆菌1.0×109～6.0×109cfu/mL、总状毛霉5.0×102～5.0×103cfu/mL、米曲霉4.0×103～1.0×104cfu/mL。
本发明所述的复合微生物叶面肥菌剂的生产方法，包括如下步骤：
1).斜面培养：将酿酒酵母、植物乳杆菌、总状毛霉、米曲霉原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，将酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉15～38℃条件下培养2～6天，植物乳杆菌15～42℃条件下培养1～3天，使菌种活化；
2).一级种子培养：将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基，酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉15～38℃条件下，100～200r/min摇床培养2～6天，植物乳杆菌15～42℃条件下静止培养1～3天，单菌种液体培养OD600值3.0-4.0之间时停止培养，制得一级种子；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为5～20％的接种量，将一级种子分别接种于发酵罐中，酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉15～38℃条件下，搅拌速度为100～200r/min，通气量为1∶0.5～1.5，培养2～6天，植物乳杆菌15～42℃条件下培养1～3天，制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为5～20％的接种量，将二级种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂。
其中，步骤1)、2)、3)中酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉所用的培养基是PDA培养基，植物乳杆菌所用的培养基是MRS培养基。固态培养基与液态培养基的区别在于固态培养基在制备过程中添加了适量的琼脂。
其中，步骤4)所用的培养基的配方按质量百分比为：糖蜜3～20％、硫酸铵0.5～10％、蛋白胨0.5～5％、碳酸钙0.5～3％，余量为水；
所述的高密度发酵培养可以采用补料分批培养(FBC)方式，其中补料碳源为：葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜其中任一种或其混合物；氮源为：硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨其中任一种或其混合物。
并且，培养过程分阶段调控发酵pH、溶解氧、搅拌转速和温度等条件。具体地说发酵培养过程包括：a、有氧培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1∶1～1.5，调控发酵溶解氧5～15％，搅拌转速150～200r/min，搅拌间隔时间1～3小时，搅拌1～3分钟，温度25～35℃；b、微溶氧和厌氧培养阶段：24～96小时，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，搅拌间隔时间3～5小时，搅拌3～5分钟，使用碳酸钙调节pH保持稳定在3.8～4.5之间，温度25～35℃。
本发明所述复合微生物叶面肥菌剂可作为肥料用于植物叶面喷施或灌溉。
(三)有益效果
本发明用于植物叶面的喷施或灌溉，能够促进植物根、叶生长和改良种植土壤，能促进农作物增产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明所要保护的范围。
实施例1 复合微生物叶面肥菌剂的构成
总菌数为 3.1×109cfu/mL
酿酒酵母 1.6×109cfu/mL
植物乳杆菌 1.5×109cfu/mL
总状毛霉 4.1×102cfu/mL
米曲霉 6.2×103cfu/mL
实施例2 复合微生物叶面肥菌剂的构成
总菌数为 1.0×1010cfu/mL
酿酒酵母 1.0×1010cfu/mL
植物乳杆菌 5.0×108cfu/mL
总状毛霉 5.0×104cfu/mL
米曲霉 1.0×103cfu/mL
实施例3 复合微生物叶面肥菌剂的构成
总菌数为 1.0×1010cfu/mL
酿酒酵母 5.0×108cfu/mL
植物乳杆菌 1.0×1010cfu/mL
总状毛霉 1.0×102cfu/mL
米曲霉 5.0×104cfu/mL
实施例4 复合微生物叶面肥菌剂的构成
总菌数为 6.0×109cfu/mL
酿酒酵母 1.0×109cfu/mL
植物乳杆菌 5.0×109cfu/mL
总状毛霉 5.0×102cfu/mL
米曲霉 4.0×103cfu/mL
实施例5 复合微生物叶面肥菌剂的构成
总菌数为 6.0×109cfu/mL
酿酒酵母 5.0×109cfu/mL
植物乳杆菌 1.0×109cfu/mL
总状毛霉 5.0×103cfu/mL
米曲霉 1.0×104cfu/mL
实施例6 复合微生物叶面肥菌剂的生产方法
1).斜面培养：将酿酒酵母、植物乳杆菌、总状毛霉、米曲霉原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，将酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉30℃条件下培养3天，植物乳杆菌37℃条件下培养2天；
2).一级种子培养：将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基，酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉30℃条件下，150r/min摇床培养3天，植物乳杆菌37℃条件下静止培养2天，制得一级种子，结束培养时酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉以及植物乳杆菌各菌悬液光密度OD600值均达到4.0；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为10％的接种量，将一级种子分别接种到100L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为60L，酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉30℃条件下，搅拌速度为150r/min，通气量为1∶1，培养3天，植物乳杆菌37℃条件下培养2天，制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为15％的接种量，将二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为700L，进行高密度发酵培养，获得菌剂，
其中，步骤1)、2)、3)中酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉所用的培养基是PDA培养基，植物乳杆菌所用的培养基是MRS培养基。
其中，步骤4)所用的培养基的配方按质量百分比为：糖蜜10％、硫酸铵5％、蛋白胨2.5％、碳酸钙2％，余量为水；
高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜；氮源为：硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨。
发酵培养过程包括：a、有氧培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1∶1.2，调控发酵溶解氧10％，搅拌转速180r/min，搅拌间隔时间2小时，搅拌2分钟，温度30℃；b、微溶氧和厌氧培养阶段：60小时，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，搅拌间隔时间4小时，搅拌4分钟，使用碳酸钙调节稳定pH4.0，温度30℃。
实施例7 复合微生物叶面肥菌剂的生产方法
1).斜面培养：将酿酒酵母、植物乳杆菌、总状毛霉、米曲霉原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，将酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉15℃条件下培养6天，植物乳杆菌42℃条件下培养1天；
2).一级种子培养：将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基，酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉15℃条件下，200r/min摇床培养6天，植物乳杆菌15℃条件下静止培养3天，制得一级种子，结束培养时酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉以及植物乳杆菌各菌悬液光密度OD600值均达到3.0；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为5％的接种量，将一级种子分别接种到100L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为60L，酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉15℃条件下，搅拌速度为200r/min，通气量为1∶0.5，培养6天，植物乳杆菌42℃条件下培养1天，制得二级种子。
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为20％的接种量，将二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为700L，进行高密度发酵培养，获得菌剂。
其中，步骤1)、2)、3)中酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉所用的培养基是PDA培养基，植物乳杆菌所用的培养基是MRS培养基。
其中，步骤4)所用的培养基的配方按质量百分比为：糖蜜3％、硫酸铵10％、蛋白胨5％、碳酸钙0.5％，余量为水；
高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、甘油；氮源为：牛肉膏、蛋白胨。
发酵培养过程包括：a、有氧培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1∶1，调控发酵溶解氧5％，搅拌转速200r/min，搅拌间隔时间3小时，搅拌3分钟，温度35℃；b、微溶氧和厌氧培养阶段：96小时，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，搅拌间隔时间3小时，搅拌3分钟，使用碳酸钙调节稳定pH4.5，温度35℃。
实施例8 复合微生物叶面肥菌剂的生产方法
1).斜面培养：将酿酒酵母、植物乳杆菌、总状毛霉、米曲霉原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，将酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉38℃条件下培养3天，植物乳杆菌15℃条件下培养3天；
2).一级种子培养：将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基，酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉38℃条件下，100r/min摇床培养2天，植物乳杆菌42℃条件下静止培养1天，制得一级种子，结束培养时酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉以及植物乳杆菌各菌悬液光密度OD600值均达到3.0；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为20％的接种量，将一级种子分别接种到100L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为60L，酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉38℃条件下，搅拌速度为100r/min，通气量为1∶1.5，培养2天，植物乳杆菌15℃条件下培养3天，制得二级种子。
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为5％的接种量，将二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为700L，进行高密度发酵培养，获得菌剂。
其中，步骤1)、2)、3)中酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉所用的培养基是PDA培养基，植物乳杆菌所用的培养基是MRS培养基。
其中，步骤4)所用的培养基的配方按质量百分比为：糖蜜20％、硫酸铵0.5％、蛋白胨0.5％、碳酸钙3％，余量为水；
高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：蔗糖、糖蜜；氮源为：硫酸铵、牛肉膏。
发酵培养过程包括：a、有氧培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1∶1.5，调控发酵溶解氧15％，搅拌转速150r/min，搅拌间隔时间1小时，搅拌1分钟，温度25℃；b、微溶氧和厌氧培养阶段：24小时，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，搅拌间隔时间5小时，搅拌5分钟，使用碳酸钙调节稳定pH3.8，温度25℃。
实施例9 大豆
供试大豆品种：九三95-144，保苗2万株/亩
施肥方案：
A、大豆分枝期+初花期，喷施本叶面肥菌剂各100ml/亩叶面；
B、大豆分枝期，喷施本叶面肥菌剂100ml/亩叶面；
C、大豆分枝期，喷施本叶面肥菌剂200ml/亩叶面；
D、对照不喷施本叶面肥菌剂
种植时间：5月4日机械播种，9月14日收获
结果：本叶面肥菌剂能增加大豆产量，对大豆增产有较好的效果。
表1 大豆使用本叶面肥菌剂效果
| 施肥方案 | 实际产量 | 增产量 | 增产(％) |
| A | 154.7 | 16.7 | 12.1 |
| B | 158.2 | 20.2 | 14.6 |
| C | 158.2 | 20.2 | 14.6 |
| D | 138.0 | - | - |
实施例10 水稻
供试水稻品种：空育131
施肥方案：
A、本叶面肥菌剂于水稻孕穗期、抽穗期100ml/亩各喷一次；
B、本叶面肥菌剂于水稻孕穗期、抽穗期200ml/亩各喷一次；
C、相同时期等量清水。
种植时间：5月17日机械插秧，10月14日收获
结果：本叶面肥菌剂在水稻上应用有较明显的增产作用
表2 水稻使用本叶面肥菌剂效果
| 施肥方案 | 实际产量 | 增产(kg/亩) | 增产(％) |
| A | 528.3 | 54.7 | 11.5 |
| B | 508.1 | 34.5 | 7.3 |
| C | 473.6 | - | - |
实施例11 棉花
棉花品种：美国33B
使用方法：本叶面肥菌剂施用采取浸种、喷洒、滴灌的方法，以植株喷洒为主。
结果：
从9月15日到11月6日下苦霜期间，试验田棉叶浓绿不掉叶，而对照田棉叶到10月25日掉完。
表3、2001年9月15日田间单株调查
试验田伏前桃为18个占47％，对照田10个占37％，试验田伏桃明显高于对照田10％，试验总产315斤，对照田为265斤，试验棉絮洁白度高对照田，棉花纤维比对照田长0.5CM。
表4、2002年9月15日田间单株调查
2002年又发现施用本叶面肥菌剂地块桃大，有五分之一桃开五瓣花，霜前花每瓣9粒籽，比对照田多2粒籽，霜后花每瓣多1粒籽。试验田亩产730斤，对照田亩产410斤，增产320斤，增效620元。
实施例12 生菜
使用方法：在植物生长期，用本叶面肥菌剂稀释液(100倍)进行叶面喷施，一般10～15一次。浸种处理时，浓度为稀释100倍。
结果：试验结束时，使用本叶面肥菌剂的生菜株均鲜重为3.6克，干重为0.2克；而对照株均鲜重为1.7克，干重为0.1克。
实施例13 甘蓝
使用方法：在植物生长期，用本叶面肥菌剂稀释液(100倍)进行叶面喷施，一般10～15天一次。浸种处理时，浓度为稀释100倍。
结果：试验结束时，使用本叶面肥菌剂的甘蓝株均鲜重为7.2克，干重为0.5克；而对照株均鲜重为5.3克，干重为0.4克。
Claims (6)
1、一种复合微生物叶面肥菌剂，其特征在于该菌剂包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)5.0×108～1.0×1010cfu/mL、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)5.0×108～1.0×1010cfu/mL、总状毛霉(Mucorracemosus)1.0×102～5.0×104cfu/mL、米曲霉(Aspergillus oryzae)1.0×103～5.0×104cfu/mL。
2、根据权利要求1所述的复合微生物叶面肥菌剂，其特征在于该菌剂包括酿酒酵母1.0×109～6.0×109cfu/mL、植物乳杆菌1.0×109～6.0×109cfu/mL、总状毛霉5.0×102～5.0×103cfu/mL、米曲霉4.0×103～1.0×104cfu/mL。
3、根据权利要求1所述的复合微生物叶面肥菌剂，其特征在于该菌剂包括酿酒酵母1.6×109cfu/mL、植物乳杆菌1.5×109cfu/mL、总状毛霉4.1×102cfu/mL、米曲霉6.2×103cfu/mL。
4、一种如权利要求1～3任一项所述的复合微生物叶面肥菌剂的生产方法，其特征是包含如下步骤：
1).斜面培养：将酿酒酵母、植物乳杆菌、总状毛霉、米曲霉原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，将酿酒酵母、总状毛霉米曲霉15～38℃条件下培养2～6天，植物乳杆菌15～42℃条件下培养1～3天；
2).一级种子培养：将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基，酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉15～38℃条件下，100～200r/min摇床培养2～6天，植物乳杆菌15～42℃条件下静止培养1～3天，单菌种液体培养OD600值3.0-4.0之间时停止培养，制得一级种子；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为5～20％的接种量，将一级种子分别接种于发酵罐中，酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉15～38℃条件下，搅拌速度为100～200r/min，通气量为1∶0.5～1.5，培养2～6天，植物乳杆菌15～42℃条件下培养1～3天，制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为5～20％的接种量，将二级种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂，
其中，所述的高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜其中任一种或其混合物；氮源为：硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨其中任一种或其混合物，
发酵培养过程包括：a、有氧培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1∶1～1.5，调控发酵溶解氧5～15％，搅拌转速150-200r/min，搅拌间隔时间1～3小时，搅拌1～3分钟，温度25～35℃；b、微溶氧和厌氧培养阶段：24～96小时，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，搅拌间隔时间3～5小时，搅拌3～5分钟，使用碳酸钙调节pH保持稳定在3.8～4.5之间，温度25～35℃。
5、一种如权利要求4所述的复合微生物叶面肥菌剂的生产方法，其特征在于：
1).斜面培养：将酿酒酵母、植物乳杆菌、总状毛霉、米曲霉原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，将酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉30℃条件下培养3天，植物乳杆菌37℃条件下培养2天；
2).一级种子培养：将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基，酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉30℃条件下，150r/min摇床培养3天，植物乳杆菌37℃条件下静止培养2天，单菌种液体培养OD600值3.0-4.0之间时停止培养，制得一级种子；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为10％的接种量，将一级种子分别接种于发酵罐中，酿酒酵母、总状毛霉、米曲霉30℃条件下，搅拌速度为150r/min，通气量为1∶1，培养3天，植物乳杆菌37℃条件下培养2天，制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为15％的接种量，将二级种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂，
其中所述的高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：糖蜜；氮源为：蛋白胨，
发酵培养过程包括：a、有氧培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1∶1.2，调控发酵溶解氧10％，搅拌转速180r/min，搅拌间隔时间2小时，搅拌2分钟，温度30℃；b、微溶氧和厌氧培养阶段：60小时，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，搅拌间隔时间4小时，搅拌4分钟，使用碳酸钙调节pH保持稳定在4.0，温度30℃。
6、一种如权利要求1～3任一项所述的复合微生物叶面肥菌剂在作为植物叶面肥中的用途。
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