CN1958792A - 一种获得内吗啡肽的方法及其在疼痛治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，涉及一种对慢性疼痛有治疗作用的蛋白寡肽－内吗啡肽的生产方法，以及经由基因转导载体可在体内表达该多肽，从而作用于局部而产生对慢性疼痛的治疗作用。通过蛋白产物的氨基酸序列与其相应DNA表达序列之间的关系，获得假设性的表达基因，实现该蛋白寡肽的生物产生方法，并将该基因(方法)应用于基因转导载体介导的疼痛的基因治疗中，为疼痛的治疗提供了一种可靠有效的方案。且其类似的方法也可用于其它疾病的基因治疗中。
Description
一、技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种对慢性疼痛有治疗作用的蛋白多肽-内吗啡肽的生产方法，以及经由基因转导载体可在体内表达该多肽，从而作用于局部而产生对慢性疼痛的治疗作用。
二、背景技术
疼痛是一种见的可由多种病因引起的给病人带来极大痛苦的症状，但随着慢性疼痛发生率的逐步升高，目前疼痛已不仅仅是一个医学问题，它已经成为一个严重的社会问题。现有的镇痛药物，如阿片肽类物质，虽可在短时间内产生止痛效果，但反复用药后易产生抗药性及成瘾性。由于脊髓蛛网膜下腔内存在的某些与镇痛作用有关的物质，如甲啡肽、亮啡肽及单胺类物质等，可以产生一定的镇痛作用。如果将介导疼痛相关基因表达的基因转导载体导入脊髓软脊膜细胞内，就可以使该群细胞成为天然的“微型生物泵”，可以长期分泌镇痛物质作用于脊髓局部产生镇痛作用，并且不会产生抗药性及成瘾性，或其它不良的副作用。上世纪八十年代，国外工作小组曾尝试将人或小鼠的肾上腺髓质组织或嗜铬细胞(ChromaffinCell)移植到实验动物的脊髓蛛网膜下腔中，利用该组织或细胞在局部产生的镇痛物质寻求对疼痛的治疗作用，实验获得了成功。但是由于人类肾上腺髓质组织或嗜铬细胞的来源不丰，必须寻找另外的同(或异)种组织细胞加以利用。故上世纪九十年代，美国的研究小组利用异种的牛的肾上腺髓质嗜铬细胞植入癌症病人的脊髓蛛网膜下腔以治疗疼痛。同期，美国的Finegold小组在获得了内啡肽的可分泌性表达基因序列后，利用人类5型腺病毒载体将该治疗性基因转导入大鼠脊髓腰段蛛网膜下腔，该病毒载体在转染了该部位的软膜细胞后表达并分泌具有生物活性的内啡肽到脑脊液内，并作用到该段脊髓后角的相应的阿片肽受体(OR)，实验证实此种方法对慢性疼痛具有较好的治疗效果。除此之外，随后的多个小组都利用各种不同的病毒载体将不同的疼痛治疗性基因导入实验动物体内，所产生的治疗物质均作用于脊髓后角，且都观察到了相应的疼痛治疗效果。这些都说明(1)利用病毒载体将治疗性基因导入体内可以产生确实的治疗作用(2)机体的内源性镇痛系统所包含的各类阿片肽物质及其表达基因通过手段利用是可以为慢性疼痛的长期治疗作出贡献的。
内吗啡肽-1/2(Endomorphin-1/2，EM-1/2)是上世纪未发现的人类体内的内源性的对μ-阿片受体(MOR)具有高亲和力和高选择性的阿片肽，被公认为是MOR的内源性配体。化学合成的内吗啡肽被众多的国内外学者证实，其确实具有疼痛的治疗作用。内吗啡肽可以专一性地作用于体内的MOR，产生一定的疼痛治疗作用，而不会作用于其他类型的阿片受体产生副作用。但是，虽然经过了多年的尝试，由于Endomorphin-1/2是一个含有四个氨基酸残基的寡肽，其相应的eDNA序列仍然隐藏在人类基因组的某处未被发现，这显然阻碍了Endomorphin-1/2在生物技术中的利用。
二十世纪生命科学的进步人类在一定程度上掌握了利用生物信息的手段。人类遗传密码的解密也为我们利用基因技术提供了有力的武器。按照人类基因遗传密码的内容，我们甚至可以从已经测得的蛋白质(多肽)链中氨基酸残基的序列推测得到在理论上成立的基因的eDNA序列，这样我们就有了构建Endomorphin-1/2表达基因的能力。这样不仅可以进一步验证人类对于基因表达的理论内容，同时也为在现实中的应用提供了一种可行的手段。我们的实验已经证实，通过推测并构建得到的内吗啡肽表达基因确实能产生内吗啡肽，而目前在国内外尚未可见利用Endomorphin-1/2的基因表达技术进行疼痛治疗的相关报道。
三、发明内容
本发明的目的是提供一种获得内吗啡肽的方法，利用内吗啡肽能产生效果明确、无副作用的疼痛治疗作用特点，而生产用于治疗疼痛的腺病毒疫苗的方法。
本发明是按以下方法实现的：按照人类的基因遗传密码表，推理得到Endomorphin-2(Endomorphin-1可同样进行)的cDNA序列，之后将其与某一基因的信号引导肽序列(本发明中使用的是人神经生长因子的信号引导肽序列)相连接，形成可在上皮细胞内表达并被分泌到细胞外环境中去的序列-即得到EM-2的表达基因；通过生物基因工程手段，将EM-2的基因与缺陷型腺病毒载体重组结合，产生一种能在移植到脊髓蛛网膜下腔后可治疗疼痛的腺病毒基因疫苗。
目前已经公认的EM-2的氨基酸残基顺序为(Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2)，推测DNA序列所使用的遗传密码数据是《分子克隆》第三版()第1674页的表A7-1(用于人类的编码)以及第1675页的图A7-1(遗传密码)提供。根据表A7-1得到在人类中相应氨基酸残基概率最高的一个密码子，列出四个氨基酸残基相对应的mRNA(DNA)序列(例如)为：UACCCCUUCUUC(DNA序列为：TACCCCTTCTTC)。
用PCR的方法获得人神经生长因子的信号引导肽的序列：(1)收集志愿者外周血中的中性粒细胞，用常规操作提取中性粒细胞的基因组；(2)以(1)中取得的基因组为模板进行PCR反应，PCR反应的引物序列如下：引物DG-1为5’-GTCCGAATTCCAGGTGCATAGCGTAACCATGTCCATGTTGTTCTACAC-3’，引物DG-2为5’-AGTGGATCCTCATTAGAAGAAGGGGTAGCGCTTGCTCTTGTGAGTCCTGTTGAAGG-3’。用PCR方法将信号引导肽序列与前面所得到的EM-2序列合并，序列中有部位位点为满足基因表达并分泌的需要进行了突变，最终得到全长的eDNA序列。在测序正确后将上述DNA片段克隆到带有启动子和终止子的载体内，以得到完整的基因表达盒。
腺病毒基因疫苗的制备：
首先，将EM-2的完整的基因表达盒克隆到腺病毒穿梭质粒pDC315中得到正确的克隆体，再将其与腺病毒骨架质粒pBHGLoxP△E1，3Cre(其中pDC315、pBHGLoxP△E1，3Cre均可由CLONTECH Laboratory，Inc，USA购得)共转染HEK293细胞，进行重组后得到目的病毒。经进一步的纯化鉴定后，用HEK293细胞大量扩增，收集病毒液，分离纯化即得到腺病毒EM-2疫苗。
本发明是得到可以表达EM-2的基因表达序列，以及应用其表达的基因工程疫苗，后者即使用缺陷型腺病毒作为基因转导载体的基因工程疫苗。后者利用容易感染脊髓软膜上皮细胞的腺病毒作为载体，使内吗啡肽-2在上皮细胞内表达，并通过信号引导肽的作用使其分泌到蛛网膜下腔，再作用到脊髓后角而产生对疼痛的治疗作用。与移植嗜铬细胞或其载体比较，作用明确、使用方便、没有相关的副作用，不受机体对外源物质产生的排斥反应的限制。
目前，全世界约有三分之一的人群患有疼痛，疼痛不仅是一个严重的医学问题，也已经成为一个日益严重的社会问题，每年用于治疗疼痛的费用大大增加，使社会的经济负担更加突显。如此，有效地治疗疼痛是一迫切需要解决的问题，所以载有EM-2的腺病毒疫苗将有极大的市场应用前景。
四、具体实施方式
下面将以具体的实施来进一步说明本发明。
具体实施1：含有EM-2基因表达盒的克隆载体的构建
含有EM-2基因表达盒的克隆载体的构建分为基因序列的获得和基因克隆二部分：
基因序列的获得：
根据推测得到的EM-2的序列和人神经生长因子信号引导肽的序列设计如前述的引物，PCR方法得到表达分泌型的EM-2表达序列，连接到中间克隆载体测序正确后备用。
基因克隆到腺病毒穿梭载体：
EcoRI+BamHI于37℃条件下酶切前面测序正确的克隆载体，同时用相同的酶切pDC315，连接后转化大肠杆菌DH5a，利用氨苄青霉素(AmpR)抗性筛选阳性克隆，鉴定正确后培养并纯化后可得到pDC315-EM2穿梭质粒，并继续培养获得足够转染HEK293细胞的量的pDC315-EM2。
具体实施2：腺病毒基因疫苗的生产
前述得到的腺病毒穿梭质粒载体pDC315-EM2和骨架质粒pBHGLoxP△E1，3Cre得到足够转染量后共转染腺病毒包装细胞如HEK293。经过空斑筛选，并行PCR鉴定正确后称为Ad-EM2。大量培养HEK293细胞，用Ad-EM2感染HEK293细胞，经分离纯化制剂等步骤后，即可得到腺病毒EM-2基因疫苗。
EM-2基因疫苗包含内吗啡肽-2(EM-2)的表达基因和缺陷型腺病毒。缺陷型腺病毒为E1区完全缺失的C亚类的5型腺病毒，即Ad5，该缺陷型腺病毒的E3区也是完全缺失的，并且缺陷型腺病毒内装有MCMV启动子和SV40PolyA。
具体实施3：完善的EM-2表达基因的获得
通过PCR方法获得一作用、结构及序列已经明确的人类基因的内含子，并将其嵌入到具体实施1中所获得的DNA序列中的某一位点处，使表达基因的结构完善并能在获得基因疫苗的实施中提高产量。其他同具体实施1，3。
Claims (5)
1.一种获得内吗啡肽的方法，该方法通过蛋白产物的氨基酸序列与其相应DNA表达序列之间的关系，获得假设性的表达基因，实现该物质的生产。
2.根据权利要求1所述的方法得到的寡肽-内吗啡肽相对应的DNA序列，其特点是可能的DNA序列有多种。
3.根据权利要求1所述的方法得到的表达可分泌型内吗啡肽的基因序列，特点是(1)包含了人类某基因的信号引导肽的部分序列；(2)包含了权利要求2中得到的DNA序列。
4.利用权利要求1中所述的方法产生的基因序列构建基因转导载体，如病毒载体，其特点是该载体中包含了表达内吗啡肽的基因序列。
5.根据权利要求4所述的基因转导载体用于疼痛的治疗，特点是(1)基因转导载体中包含了内吗啡肽的表达基因；(2)该基因转导载体用于疼痛的基因治疗。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7825231B2 (en) | 2005-06-01 | 2010-11-02 | Darren P. Wolfe | Method of amidated peptide biosynthesis and delivery in vivo: endomorphin-2 for pain therapy |
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2005
- 2005-10-31 CN CN 200510118974 patent/CN1958792A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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