CN1946388B - 一氧化氮前体在药物制备中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了使用分离的多核苷酸分子和这些分子编码的肽分析人氨甲酰磷酸合成酶I表型，以及涉及人氨甲酰磷酸合成酶I多态性的诊断和治疗性应用。通过分析基因组DNA或者扩增的基因组DNA或者衍生自mRNA的扩增的cDNA，可以定型关于人氨甲酰磷酸合成酶I多态性的人氨甲酰磷酸合成酶I，例如用于诊断和治疗与骨髓移植相关的肝静脉梗阻症(HVOD)。

Description

一氧化氮前体在药物制备中的应用
相关申请的交叉参考
本申请是2004年2月24日提交的美国专利申请No.10/785,374的部分继续申请并要求其优先权，其是2000年6月1日提交的美国专利申请No.09/585,077的部分继续申请，其是1999年6月1日提交的美国专利申请No.09/323,472、现为美国专利No.6,346,382的部分继续申请，其全文都并入本文参考。 
基金声明
本工作由NIH基金R29-DK46965、NIH HL 55198、NIH ES 09915和NIH 1 P30 CA 68485资助。因此，美国政府对本发明享有某些权利。 
技术领域
本发明涉及用于分析氨甲酰磷酸合成酶I表型的分离的多核苷酸分子，这些分子编码的肽，及其关于新鉴别的氨甲酰磷酸合成酶I多态性的诊断和治疗应用。这种应用是确定对象对于高氨血症、精氨酸产生降低及骨髓移植物毒性(bone marrow transplant toxicity)的易感性的方法，所述方法基于分析分离自所述对象活检组织的核酸样品。 
缩写表
ABG—动脉血气 
ALI—急性肺损伤 
ASO—等位基因特异性寡核苷酸 
ATP—腺苷三磷酸 
BCAA—支链氨基酸 
BMT—骨髓移植(物) 
BSA—牛血清白蛋白 
BuCy—白消安，环磷酰胺 
BUN—血液尿素氮 
CBVP16—环磷酰胺，亚硝脲氮芥，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷 
cc—立方厘米 
CPSI—氨甲酰磷酸合成酶I 
CTC—环磷酰胺，三胺硫磷，碳铂 
CVP16TBI—环磷酰胺，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷，整体放射 
ECMO—体外膜氧合(extracorpreal membrane oxygenation) 
fl—全长 
GSHosc—谷胱甘肽合成酶 
HAT—次黄嘌呤，氨基蝶呤，胸苷 
HVOD—肝静脉梗阻症 
iNO—吸入的一氧化氮 
KDa—千道尔顿 
KLH—匙孔血蓝蛋白 
l—升 
LAT—连接激活的翻译 
LCR—连接酶链反应 
MAS—胎粪吸入综合征 
NAG-n-乙酰谷氨酸 
NASDATM—基于核酸序列的扩增 
NO或NOx—一氧化氮 
NOS—一氧化氮合成酶 
O/C—鸟氨酸/瓜氨酸 
PBSCT—外周血干细胞移植 
PPHN—新生儿持续性肺动脉高压 
PCR—聚合酶链反应 
RCR—修复链反应 
RDS—呼吸窘迫综合征 
REF—限制性核酸内切酶指纹分析 
RT—逆转录酶 
SSCP—单链构象多态性 
SDA—链置换激活 
SNP—单核苷酸多态性 
TC—三胺硫磷，环磷酰胺 
TEAA—全部必需氨基酸 
UC—尿素循环 
UCF—尿素循环功能 
VPA—丙戊酸 
背景技术
精氨酸的体内合成途径从鸟氨酸开始。鸟氨酸组合氨甲酰磷酸盐产生瓜氨酸，瓜氨酸与天冬氨酸组合，在存在腺苷三磷酸(ATP)的条件下产生精氨酸代琥珀酸(argininosuccinate)。最后，从精氨酸代琥珀酸中分裂出反丁烯二酸产生精氨酸。精氨酸的降解途径是通过精氨酸酶的水解作用产生鸟氨酸和尿素。这些反应形成尿素循环。尿素循环是除去内源和外源蛋白质代谢产生的废物氮的主要途径，示于图1。 
化疗的一个常见的副作用是破坏代谢过程。事实上，高剂量化疗中使用的药剂影响许多细胞过程。位于化学敏感组织如肝和胃肠道中的代谢过程面临特别大的破坏危险。 
氮的持续周转和加工涉及机体的所有组织，但是尿素循环的首要步骤限于肝和肠道。与骨髓移植(BMT)相关的高剂量化疗干扰肝功能并且对肠道有毒性。提示尿素循环功能失调的特发性高氨血症据报道与经历骨髓移植的患者高死亡率相关。Davies et al.，Bone MarrowTransplantation，17：1119-1125(1996)；Tse et al.，American Journal ofHematology，38：140-141(1991)；及Mitchell et al.，American JournalofMedicine，85：662-667(1988)。 
BMT的一个常见并发症是肝静脉梗阻症(HVOD)。HVOD与黄疸、肝大小增加和正常的肝血流破坏相关。HVOD在将近20-40％的患者中出现，并且与严重的发病率和死亡率相关。 
在高剂量化疗后，一氧化氮(NO)在调节血管紧张度及维持肝和肺小静脉开放中起作用。完整的尿素循环功能功能不仅对于氨的排泄是重要的，对于维持足够的精氨酸(NO的前体)的组织水平也是重要的。 
氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)是通过尿素循环催化尿素产生的首要步骤的限速酶。CPSI是高度组织特异性的，其功能和产生基本上限于肝和肠道。基因组编码的CPSI在胞质中产生并且被转运到线粒体中，在此其被分裂成其成熟的160kD单体形式。所述酶组合氨和碳酸氢盐形成氨甲酰，消耗两个ATP分子及使用辅因子N-乙酰-谷氨酸(NAG)。 
降低尿素循环功能的任何遗传诱因均导致高氨血症，并且很可能是造成与包括BMT相关的毒性在内的亚最佳(sub-optimal)的尿素循环功能相关疾病的严重性的因素。因此，本领域需要鉴定患有与亚最佳的尿素循环功能相关疾病、经历BMT或者面临暴露于环境或药理学肝毒素的群体中存在的等位基因。考虑到尿素循环中CPSI的作用，因此需要鉴定这种群体中存在的CPSI等位基因。 
概述
本发明揭示了筛选对象亚最佳尿素循环功能的易感性的方法。所述方法包括如下步骤：(a)从对象获得核酸样品；及(b)检测所述对象核酸样品中氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)基因的多态性，多态性的存在表明对象对于亚最佳尿素循环功能的易感性。根据本发明，关于确定对象对于骨髓移植物毒性的易感性而特别提供了多态性的检测。 
在一些实施方案中，氨甲酰磷酸合成酶多肽的多态性包含CPSI基因的外显子36中C颠换为A，在一些实施方案中相应于CPSI基因的cDNA的第4340位核苷酸C颠换为A。在一些实施方案中，在相应于CPSI基因的cDNA的第4340位核苷酸的C颠换为A进一步包含三联体密码子AAC转变为ACC，其编码在第1405位氨基酸具有苏氨酸部分的CPSI多肽。 
本发明还提供了分离的和纯化的生物学活性CPSI多肽。在一些实施方案中，本发明的多肽是一种重组多肽。在一些实施方案中，本发明的多肽包含在第1405位氨基酸具有天冬酰胺部分的人CPSI。 
本发明还提供了一种分离的和纯化的多核苷酸，其编码生物学活性CPSI多肽。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸包含人DNA分子。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸包含相应于CPSI基因的cDNA，其包括第4340位核苷酸由C颠换为A。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸进一步包含相应于CPSI基因的cDNA，其包括在4340位核苷酸的三联体密码子ACC转变为AAC，及编码在第1405位氨基酸具有天冬酰胺部分的CPSI多肽。 
本发明还提供了适用于进行本发明的方法及用于检测本发明的多肽和多核苷酸的试剂盒和试剂，包括寡核苷酸、核酸探针和抗体。本发明还揭示了制备本发明的多核苷酸和多肽的方法。 
在一些实施方案中，本发明涉及基于本发明所述氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)基因的多态性的治疗方法。这种治疗方法包括施用一氧化氮前体治疗和预防亚最佳尿素循环功能介导或调节的疾病(例如骨髓 移植物毒性)及使用本发明分离的和纯化的多核苷酸的基因治疗方案。 
因此，本发明的一个目的是提供多核苷酸分子，其可用于分析脊椎动物对象中氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)。 
本发明的另一个目的是基于通过分析得自对象组织的核酸包括基因组DNA和cDNA而获得的信息，确定脊椎动物对象、特别是人对象中CPSI表型。 
本发明的再一个目的是提供确定CPSI表型的简便技术。 
本发明的另一个目的是提供用于产生抗体的多肽和多核苷酸分子，所述抗体可以区分组成CPSI多态性的不同形式的CPSI。 
本发明的另一个目的是提供诊断和治疗与CPSI多态性相关的临床病症的方法。 
上文阐述了本发明的一些目的，结合如下附图和实施例可以显而易见本发明的其它目的。 
附图简述 
图1是尿素循环示意图； 
图2是未反映被识别的突变的共有CPSI蛋白的示意图； 
图3是描述蛋白质中一些已知突变及描述本发明T1405N多态性的共有CPSI蛋白的示意图； 
图4是公认的CPSI转录后修饰的示意图； 
图5是CPSI的人基因组基因座的示意图； 
图6是全长CPSI cDNA的克隆方案示意图； 
图7是全长CPSI cDNA的另一种克隆方案示意图； 
图8是在COS-7细胞中表达的CPSI蛋白的代谢活性的示意图； 
图9是CPSI cDNA中内含子的大小和位置的示意图； 
图10是外显子36(SEQ ID NO：5)的图示，示出本发明的代表性寡核苷酸引物的位置； 
图11示出T1405 CPSI的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)(终止密码子翻译为“X”，165049 MW，1.163602e+07 CN)，起始氨基酸甲硫氨酸被认为是在-1位； 
图12示出N1405 CPSI的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)(终止密码子翻译为“X”，165062 MW，1.161634E+07 CN)，起始氨基酸甲硫氨酸被认为在-1位； 
图13是血浆精氨酸水平的浓度曲线图； 
图14是接受瓜氨酸与安慰剂的患者之间在48小时研究期间的平均血压无显著不同(P＝0.53，多变量ANCOVA)的图示。对于治疗组和安慰剂组示出了平均值+/-SD。 
图15是示出在手术后立即接受或者手术后12小时接受瓜氨酸的患者中血清瓜氨酸水平中位数显著较高的条形图(P＝0.012，P＝0.015)，而在接受安慰剂的患者中分流手术后瓜氨酸浓度在手术后即刻或者手术后12小时均显著低于基线(P＝0.020，P＝0.001)。 
图16是示出在手术后12小时接受瓜氨酸的患者中平均血清精氨酸水平显著较高的条形图(P＝0.037)，而在接受安慰剂的患者中分流手术后精氨酸浓度在手术后12小时显著低于基线(P<0.001)。 
详细描述
本发明揭示了令人惊奇的发现，即氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)的多态性，所述酶催化尿素循环的第一个限速步骤。特别地，所述多态性特征在于CPSI中的氨基酸取代，即第1405位氨基酸的苏氨酸/天冬酰胺取代(杂合性＝.44)。 
本发明还揭示了令人惊奇地观测到CPSI基因中单核苷酸改变是CPSI多态性的原因。特别地，CPSI基因的外显子36的C颠换为A使得 三联体密码子ACC改变为AAC，导致编码的CPSI多肽中T1405N的改变。 
根据这些发现，可以对衍生自脊椎动物对象的组织的核酸分子进行操作，以用于分析CPSI表型，产生这种核酸分子编码的肽及用于关于CPSI多态性的诊断和治疗方法。这些核酸分子可以如下述扩增，所述分子通常包括RNA、基因组DNA和衍生自RNA的cDNA。 
A．总则
目前大多数可利用的CPSI结构信息得自对大鼠CPSI酶的研究。大鼠CPSI酶和人CPSI酶均包含1500个残基的单个多肽，并且呈现大约95％的序列相同性。大鼠CPSI多肽和核酸序列信息由Nyunoya，H.，et al.，Journal of Biological Chemistry 260：9346-9356(1985)揭示，在 
Figure S05812693520061025D000081
登记号为AH005315、M12335、M12328、M12327、M12326、M12325、M12324、M12323、M12322、M12321、M12320、M12319、M12318和M11710，在此并入参考。大鼠CPSI的结构信息得自序列同源性和底物与辅因子结合研究；然而，无晶体学数据可利用。 
成熟CPSI实际上是含有2个主要区域的模块。第一个区域(残基39-406)与大肠杆菌(Escherichia coli)的异源二聚体CPS的小亚基同源。细菌和酵母CPSI多肽和核酸序列信息在 
Figure S05812693520061025D000082
登记号AB005063、X67573、M27174、P07258、P03965、BAA21088、SYBYCP、SYBYCS和SYECCS中揭示，在此并入参考。 
另一个区域(残基417-l500，后文称作CPS结构域)与大肠杆菌CPS的大亚基同源。Meister，A.，Adv.Enzymol．Relat．Areas Mol．Biol.62：315-374(，1989)。这个亚基负责从氨合成氨甲酰磷酸及底物与辅因子的结合。Meister，A.，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.62：315-374 (1989、)。CPS结构域通过基因复制而产生并且在原基因组 (pro-genome)中串联融合，如图2所示，其自身由两个磷酸化结构域和参与结合n-乙酰-谷氨酸(NAG)的一个C末端调节结构域组成。Nyunoya，H.，et al.，Journal of Biological Chemistry 260：9346-9356(1985)。 
如图2所示，残基407-416是两个主要亚基之间的桥梁，残基1-38组成在被除去之前将未成熟的CPSI定向于线粒体的前导肽。图2还示出所述小亚基样区域由两个大约相等的亚结构域组成。相互作用亚结构域(残基39-212)相应于大肠杆菌CPS的小亚基中的与大亚基缔合必需的区域。谷氨酰胺酶亚基(残基213-406)与一些谷氨酰胺酰胺转移酶同源，及与从具有相当谷氨酰胺酶活性的其它成分中产生的CPSI区域同源，如Guillou，F.，et al.Proc Natl Acad Sci 86：8304-8308(1989)；Nyunoya，H.，et al.，Journal of BiologicalChemistry 260：9346-9356(1985)；和Guy，H.I.et al.，Journal ofBiological Chemistry 270：2190-2197(1995)所述。由于CPSI缺少分裂谷氨酰胺需要的半胱氨酸残基，因此谷氨酰胺酶亚结构域在这种酶中的功能还不确定。 
确信CPS结构域(相应于大肠杆菌中大亚基)催化从氨中合成氨甲酰磷酸盐，反应式如下： 
2 ATP+碳酸氢盐+氨→2 ADP+磷酸盐+氨甲酰磷酸盐 
如图1和2所示，这个反应包括三个步骤：碳酸氢盐由在此称作ATPA的ATP分子磷酸化，产生羧基磷酸盐；从羧基磷酸盐和氨合成氨甲酰；及由另一ATP分子(ATPB)磷酸化氨甲酰，产生氨甲酰磷酸盐，如Rubio，V.and Grisolia，S.，Enzyme 26：233-239(1981)所述。 
如图4所示，CPS结构域看起来是通过复制及复制成分的串联融合而产生的；因此，其氨基端一半和COOH-端一半是同源的，如Nyunoya，H.，et al.，Journal of Biological Chemistry 260：9346-9356(1985))所述。每个同源一半均分别包含大约40和20kD的氨基-和 COOH-末端结构域，其中确信40kD的氨基一半结构域参与碳酸氢盐磷酸化(碳酸氢盐磷酸化结构域，残基417-788)(图2)。COOH-一半的相应结构域通过氨基甲酸磷酸化结构域(残基969-1329)参与氨基甲酸磷酸化(图2)，如Alonso，E.and Rubio，V.，European JournalofBiochemistry 229：377-384(1995))所述。 
这些磷酸化结构域与磷酸化碳酸氢盐的、已知三维结构的生物素羧化酶(Toh，H.et al.，European Journal of Biochemistry 215：687-696(1993))以及催化相似反应的两种酶，DD-连接酶和谷胱甘肽合成酶(GSHase)同源(Artymiuk，P.J.et al.，Nature Struct.Biol.3：128-132(1996))。因此，关于这些酶的信息有助于解释在CPSI缺陷患者中同源结构域中发现的突变。 
再次参考图2，确定大亚基样区域的20kDa结构域，氨基末端一半的结构域(残基789-968)的功能。相反，相应COOH-末端结构域(残基1330-1500)称作变构结构域，因为CPSI的激活物n-乙酰-谷氨酸(NAG)和大肠杆菌酶的核苷酸效应物UMP和IMP结合在这个结构域中，如Rodriguez-Aparicio，L.B.et al.，Biochemistry 28：3070-3074(1989)和Cervera，J.et al.，Biochemistry 35：7247-7255(1996)所述。 
A.1. 酶加工
人CPSI mRNA编码165kD的、1500个氨基酸的前蛋白质。这种前体的氨基末端含有38个残基，包括8个碱性残基，1个酸性残基，在成熟酶起始点4个残基前具有Pro-Gly序列(Nyunoya，H.et al.，Journal ofBiological Chemistry 260：9346-9356(1985)；Lagace，M.et al.，JournalofBiological Chemistry 262：10415-10418(1987)。这个高度保守的信号序列促进酶进入线粒体基质，在此其被除去以产生160kD成熟酶。 
A.2. CPSI的正常表达
CPSI酶活性首先在妊娠5-10周的人胎儿肝脏中检测到(Moorman，A.F.et al.Histochemical Journal 22：457-468(1990))。在妊娠20周时，CPSI的水平达到将近50％的正常成人水平，该水平保持直至出生，之后在20岁逐步升高至成人水平(Raiha，N.C.R.andSuihkonen，J.Acta Paediatrica Scand 57：121-127(1968))。CPSI的组织表达基本限于肝，在肠道和肾中有微量活性。当在成人期肝脏产生其成熟腺泡结构时，CPSI被区室化(compartmentalized)在末端门小静脉(terminal portal venules)周围的实质细胞中(Moorman，A.F.et al.Histochemical Journal 22：457-468(1990))。 
除了被区室化之外，还已知一些因素对于调节CPSI活性和表达是重要的。例如，鸟氨酸水平低下或者缺少使得CPSI活性降低，大概是由于积聚的氨甲酰磷酸盐(CP)的抑制作用所致，如Jackson，M.J.etal.，Annual Review of Genetics 20：431-464(1986)；和Rubio，V.，Biochemical Society Transactions 21：198-202(1993))所述。CPSI mRNA和酶的水平均随着高蛋白饮食而增加，并且应答胰高血糖素和糖皮质激素(Jackson，M.J.et al.，Annual Review of Genetics 20：43 1-464(1986)；de Groot，C.J.，et al.，Biochemical&Biophysical ResearchCommunications 124：882-888(1984))。在检验的正常未受刺激的肝组织中，观测到丰富的CPSI mRNA。 
B. 筛选技术
根据本发明，提供了一种筛选导致对象中氨清除率下降和精氨酸产生降低的亚最佳尿素循环功能易感性的方法。所述方法包括：(a)获得对象核酸样品；及(b)检测对象核酸样品中氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)基因的多态性，所述多态性的存在表明对象对于导致氨清除率下降和精氨酸产生降低的亚最佳尿素循环功能的易感性。根据本发 明，特别提供了多态性的检测以确定对象对于骨髓移植物毒性的易感性。 
进一步注意到本发明的多态性可用于在除了BMT或者施用丙戊酸之外的许多情形中预测毒性，如本文及在实施例中揭示。所述多态性还涉及在如成人肝硬化、其它药物毒性、新生儿肝功能削弱等情形中介导或调节被破坏的氨清除率和精氨酸产生。 
如本文及权利要求书中所用，术语“多态性”是指群体中出现两或多个经遗传确定的替代序列或等位基因。多态性标记是出现分歧的基因座。所述标记例如具有至少两个等位基因，每个等位基因的出现频率均高于1％。多态性基因座可以是小如一个碱基对。 
本发明有用的核酸分子包括与第4340位碱基和外显子36内C颠换为A将三联体密码子从ACC转变为AAC的区域中CPSI序列特异性杂交的那些分子。这种颠换导致所编码的CPSI多肽中T1405N改变。典型地，这些核酸长度为至少大约20个核苷酸，并且具有相应于在共有CPSI cDNA序列(EC6.3.4.16)第4340位碱基C颠换为A的区域的核苷酸序列，所述颠换将三联体密码子从ACC转变为AAC。本文所用术语“共有序列”是指CPSI的核酸或蛋白质序列，已知其核酸或氨基酸序列在携带编码正常功能蛋白质或其核酸自身具有正常功能的基因的个体群体中高频率出现。 
本发明提供的核酸分子可以根据本领域已知的任何技术标记，如放射性标记、荧光标记、酶标记、序列标记等等。根据本发明的另一方面，所述核酸分子在第4340位碱基C颠换为A。这种分子可用作等位基因特异性寡核苷酸探针以追踪例如对象家族中的特殊突变。 
可以对机体样品进行测试以确定CPSI基因在第4340位碱基是否含有C颠换为A。进行测试的合适机体样品包括包含得自活检组织的DNA、RNA或蛋白质的那些样品，包括肝和肠道活检组织；或者得自血液、出生前样品；或者胚胎组织。 
在本发明的一些实施方案中，提供了一对分离的寡核苷酸引物：5′-AGCTGTTTGCCACGGAAGCC-3′(SEQ ID NO：6)  和5′-CCCAGCCTCTCTTCCATCAGAAAGTAAG-3′(SEQ ID NO：7)。这些引物衍生自CPSI外显子36(本发明多态性的位置)和相关的内含子序列(SEQ ID NO：5)，产生119个碱基对的片段。衍生自CPSI外显子36(本发明多态性的位置)和相关内含子序列(SEQ ID NO：5)的其它引物在图10中SEQ ID NO：8-10及实施例2(SEQ ID NO：15和16)中示出。 
所述寡核苷酸引物用于诊断对象处于高氨血症危险，如可以是BMT并发症或毒性的结果。所述引物在测序之前指导靶多核苷酸扩增。这些独特的CPSI外显子36寡核苷酸引物基于鉴别外显子36中C颠换为A而设计和生产。 
在本发明的一些实施方案中，提供了分离的等位基因特异性寡核苷酸。根据本发明还提供了与其基本相似的序列。所述等位基因特异性寡核苷酸用于诊断对象处于高氨血症危险，如可以是BMT并发症或毒性的结果。这些独特的CPSI外显子36寡核苷酸引物基于鉴别外显子36中C颠换为A而设计和生产。 
术语“基本上互补”或者“基本序列”是指在严格条件下与提供的序列(例如SEQ ID NO：5-10)和/或与任一SEQ ID NO：5-10具有足够同源性的序列杂交的序列，由此本发明的等位基因特异性寡核苷酸与所述序列杂交。本文所用术语“分离的”包括基本上没有其它核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或其它与其相缔合的物质的寡核苷酸，所述缔合是在细胞材料或者在合成培养基中。“靶多核苷酸”或者“靶核酸”是指感兴趣的核酸序列，例如CPSI编码多核苷酸。可用于引物杂交的其它引物基于本发明对CPSI多态性的揭示而易于为本领域技术人员所获知。 
本发明的引物包含足够长度的寡核苷酸和适当的序列，以对多态性基因座中大量核酸开始聚合化。CPSI基因座示于图5。特别地，本 文所用术语“引物”在一些实施方案中是指包含CPSI基因的两或多个脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的序列，在一些实施方案中包含三个以上、在一些实施方案中包含八个以上、及在一些实施方案中包含至少大约20个核苷酸，其中所述DNA序列相对于SEQ ID NO：1和3中包含的CPSI在第4340位碱基C颠换为A。相对于CPSI在第4340位碱基包含胞嘧啶(C)的等位基因在此称作“CPSIa等位基因”、“T1405等位基因”或者“苏氨酸编码等位基因”。相对于CPSI在第4340位碱基包含腺苷(A)的等位基因在此称作“CPSIb等位基因”、“N1405等位基因”或者“精氨酸编码等位基因”。 
本发明还提供了区别CPSI基因的CPSIa和CPSIb等位基因的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与所述CPSI基因的一部分(当所述第4340位核苷酸是腺苷时，其包括相应于所述CPSI基因的cDNA的第4340位核苷酸)杂交，但当所述第4340位核苷酸是胞嘧啶时与所述CPSI基因的所述部分不杂交。本发明还提供了区别CPSI基因的CPSIa和CPSIb等位基因的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与所述CPSI基因的一部分(当所述第4340位核苷酸是胞嘧啶时，其包括相应于所述CPSI基因的cDNA的第4340位核苷酸)杂交，但当所述第4340位核苷酸是腺苷时与所述CPSI基因的所述部分不杂交。这种寡核苷酸在一些实施方案中的长度为10-30个碱基。这种寡核苷酸可任选进一步包含可检测的标记。 
有益于合成的环境条件包括存在三磷酸核苷及进行聚合的制剂，如DNA聚合酶，及合适的温度和pH。在一些实施方案中，所述引物是扩增效力最大的单链引物，但也可以是双链的。如果是双链的，首先将引物进行处理以使其链分离，之后用于制备延伸产物。所述引物必须足够长以在存在聚合诱导剂的条件下引发延伸产物的合成。引物的实际长度依赖于许多因素，包括温度、缓冲液及核苷酸组成。所述 寡核苷酸引物典型含有12-20或更多个核苷酸，但也可以含有较少的核苷酸。 
本发明的引物被设计为与被扩增的基因组基因座的每个链均“基本上”互补。这意味着所述引物必须是充分互补的以与其各自的链在使得所述制剂进行聚合的条件下杂交。换句话说，所述引物应与颠换两侧的5’和3’序列充分互补，以与其杂交并使得基因组基因座扩增。 
本发明的寡核苷酸引物用于扩增方法中，所述方法是一种酶促链反应，产生与反应步骤数目相关的指数值的多态性基因座。典型地，一个引物与多态性基因座的负链互补，另一引物与正链互补。退火引物，变性核酸，随后用酶和核苷酸延伸，酶如DNA聚合酶I的大片段(Klenow)，产生含有靶多态性基因座序列的新合成的正链和负链。由于这些新合成的序列也是模板，因此重复变性、引物退火和延伸步骤循环导致所述引物限定的区域(即靶多态性基因座序列)以指数值产生。所述链反应的产物是一种discreet核酸双链体，具有相应于所用特异性引物的末端的末端。 
本发明的寡核苷酸引物可以使用任何合适方法制备，如常规的磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自动化方案。在一些这种自动化方案中，二乙基亚磷酰胺(diethylphosphoramidites)用作起始物，其可以通过Beaucage et al.，Tetrahedron Letters 22：1859-1862(1981)所述方法合成。一种在修饰的固体支持物上合成寡核苷酸的方法在美国专利No.4,458,066中描述。 
任何核酸样品，纯化或非纯化形式，倘若其含有或者怀疑含有包含多态性基因座的核酸序列，则均可用作起始核酸或酸。因此，所述方法可以扩增例如DNA或RNA，包括信使RNA，其中DNA或RNA可以是单链或者双链的。在RNA用作模板的情况中，利用将模板逆转录为DNA的最佳酶和/或条件。另外，可以利用含有每一个链的DNA-RNA杂种。也可以应用核酸的混合物，或者在先前使用相同或 不同引物的扩增反应中产生的核酸。被扩增的特异性核酸序列，即多态性基因座，可以是较大分子的一部分或者最初可以作为分立的分子存在，由此所述特异性序列组成全部的核酸。扩增的序列最初非必须以纯化形式存在；其可以是复合物混合物的一小部分，如包含于整个人DNA中。 
本发明利用的DNA可以从机体样品如血液、组织材料(在一些实施方案中是肝组织)等中提取，通过多种技术如Maniatis et.al.inMolecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.，p 280-281(1982)所述技术进行。如果提取的样品是不纯的，则在扩增之前使用有效量的试剂进行处理，所述试剂使得样品细胞或者动物细胞膜开放，并暴露和/或分离核酸的链。这种暴露和分离链的裂解和核酸变性步骤使得可以更容易地进行扩增。 
三磷酸脱氧核糖核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP单独或者与引物一起以足够量加入合成混合物中，将所得溶液加热至大约90-100℃大约1-10分钟，在一些实施方案中1-4分钟。在这个加热阶段之后，使溶液冷却以进行引物杂交。向该冷却的混合物中加入实现引物延伸反应的合适制剂(在此称作聚合剂)，所述反应在本领域技术人员已知的条件下进行。如果聚合剂是热稳定的，则其也可以与其它试剂一起加入。这种合成(或者扩增)反应可以在室温直至一定温度下进行，高于此一定温度则此聚合剂不再起作用。因此，例如如果使用DNA聚合酶，则温度通常不高于大约40℃。所述反应通常在室温下进行。 
聚合剂可以是实现引物延伸产物合成的任何化合物或者系统，包括酶。为此合适的酶包括例如大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段、聚合酶突变蛋白、逆转录酶，其它酶包括热稳定酶(即在温度足够高以引起变性之后进行引物延伸的那些酶)，如Taq聚合酶。合适的酶促进核苷酸以正确方式组合形成与每个多态性 基因座核酸链互补的引物延伸产物。通常，所述合成从每个引物的3’末端开始，以5’方向沿着模板链行进，直至合成终止，产生不同长度的分子。 
新合成的链及其互补核酸链在上述杂交条件下形成双链分子，这个杂种在所述方法的随后步骤中使用。在接下来的步骤中，将新合成的双链分子使用上述任何方法进行变性，提供单链分子。 
所述变性、退火和延伸产物合成的步骤可以重复进行，以扩增靶多态性基因座核酸序列达到检测需要的程度。产生的特异性核酸序列的量以指数方式积聚。PCR.A Practical Approach，ILR Press，Eds.McPherson et al.(1992)。 
扩增产物可以通过Southern印迹分析检测，使用或不使用放射性探针。在一个这样的方法中，例如扩增含有极低水平多态性基因座核酸序列的DNA小样品，通过Southern印迹技术或相似地使用斑点印迹分析进行分析。高水平的扩增信号使得可便利地使用非放射性探针或标记。或者，用于检测扩增产物的探针可以直接或者间接可检测地标记，例如使用放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或者酶进行标记。本领域技术人员已知与探针结合的其它合适标记，或者使用常规实验能确定这种标记。 
通过本发明方法扩增的序列可以在溶液中或者与固体支持物结合之后进一步评价、检测、克隆、测序等等，通过通常用于检测特异性DNA序列的方法进行，如双脱氧测序、PCR、寡聚体限制(Saiki etal.，Bio/Technology 3：1008-1012(1985)、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针分析(Conner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：278(1983)、寡核苷酸连接分析(OLAs)(Landgren et.al.，Science 241：1007，1988)等等。关于DNA分析的分子技术已经加以综述(Landgrenet.al.，Science 242：229-237，1988)。 
在一些实施方案中，扩增方法是PCR，如本发明及美国专利No.4,683,195、4,683,202和4,965,188所述，所述文献在此均并入参考，这些是本领域技术人员通常使用的方法。已经描述了另外的扩增方法，只要使用本发明的引物通过PCR扩增的CPSI基因座通过另外的方式能被相似地扩增。这种另外的扩增系统包括但不限于自动维持序列复制(self-sustained sequence replication)，其从感兴趣的短RNA序列和T7启动子开始。逆转录酶将所述RNA拷贝进cDNA并降解RNA，随后逆转录酶聚合DNA的第二条链。 
另一种核酸扩增技术是基于核酸序列的扩增(NASBATM)，其使用逆转录和T7 RNA聚合酶，并掺入两个引物以靶定其循环方案。NASBATM扩增可以用DNA或RNA开始并以任一个结束，在60-90分钟内扩增大约108拷贝。 
或者，核酸可以通过连接激活的转录(LAT)而扩增。LAT从单链模板和单一引物开始运转，所述引物部分是单链的，部分是双链的。扩增通过cDNA与启动子寡核苷酸的连接而起始，在几小时内扩增大约108至大约109倍。可以利用QB复制酶系统，将称作MDV-1的RNA序列附着于与感兴趣DNA序列互补的RNA上。在与样品混合的基础上，杂种RNA在样品的mRNA中发现其互补体并结合，激活所述复制酶拷贝感兴趣的尾随(tag-along)序列。 
另一种核酸扩增技术连接酶链反应(LCR)是使用感兴趣序列的两个不同标记的部分，在样品存在连续序列的条件下通过连接酶共价键合，形成新靶。修复链反应(RCR)核酸扩增技术使用两种互补和靶特异性寡核苷酸探针对、耐热聚合酶和连接酶、及DNA核苷酸，以几何学扩增靶序列。2-碱基缺口分隔寡聚探针对，所述RCR填补并接合该缺口，模拟正常的DNA修复。 
通过链置换激活(SDA)的核酸扩增技术利用短的引物，其含有Hinc II的识别位点及在5’末端具有结合靶DNA的短突出端。DNA聚合 酶填补与具有含硫腺嘌呤类似物的突出端相对的引物部分。加入HincII但只切割未修饰的DNA链。缺少5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶进入缺口部位并开始聚合，置换初始引物链下游并构建新的引物以作为更多的引物。 
SDA在37℃在2小时内产生高于大约107倍扩增。与PCR和LCR不同，SDA不需要仪表化温度循环。本发明方法使用的另一种扩增系统是QB复制酶系统。尽管本发明使用PCR作为扩增方法的实例，但是也可以使用这些其它方法扩增CPSI基因座。因此，本文及权利要求书中所用术语“扩增技术”涵盖了所有前述方法。 
在本发明的一些实施方案中，提供了一种诊断或鉴别具有高氨血症倾向或者较高易感性(处于患病危险中)的对象的方法，包括通过双脱氧测序对对象样品的靶核酸进行测序，在一些实施方案中，随后扩增所述靶核酸。 
在本发明的一些实施方案中，提供了一种诊断具有高氨血症倾向或者较高易感性(处于患病危险中)的对象的方法，包括将对象样品的靶核酸与检测CPSI多态性存在的试剂接触，并检测所述试剂。 
另一种方法包括将对象样品的靶核酸与检测在第4340位碱基(即外显子36)存在C颠换为A的试剂接触，并检测所述颠换。本领域技术人员熟知许多杂交方法。其中许多方法用于进行本发明。 
肝静脉梗阻症(HVOD)是骨髓移植(BMT)的一种常见毒性作用。其在大约20-40％的患者中发生，并且与严重的发病率和死亡率相关。根据本发明，在试图鉴别不均衡性迹象中，检测了两种CPSI等位基因在经历BMT的HVOD和非HVOD组中的频率。结果表明本发明揭示的CPSI多态性导致对BMT毒性的易感性。因此，本发明提供了一种筛选对BMT毒性、特别是对HVOD具有易感性的对象的方法，通过检测CPSI多态性进行。 
本发明方法中使用的材料非常适于制备诊断试剂盒。这种试剂盒可包含一个载体，其被区室化为包含密闭的一或多个容器，如小瓶、试管等等，每个容器均包含所述方法中使用的单独的元件。例如，一个容器中可包含扩增CPSI DNA的材料，包括扩增来自对象的所述靶DNA必需的酶和寡核苷酸引物。 
所述寡核苷酸引物包括具有选自包括但不限于SEQ ID NO：6-10序列的引物，或者与其基本上互补或者基本上同源的引物序列。5’和3’多核苷酸序列两侧的靶基本上具有SEQ ID NO：5所示序列，或者与其基本上互补或者同源的序列。根据本发明的揭示，扩增CPSI的其它寡核苷酸引物为本领域技术人员所已知或者易于为其所知。 
本发明的试剂盒可进一步包含用于从得自对象的生物学样品中提取核酸样品的一或多种试剂。本领域技术人员显而易见的任何这种试剂均涵盖在本发明的范围内。例如，一种合适的组织裂解缓冲液以及捕获核酸样品的玻璃珠悬浮液及从玻璃珠上洗脱核酸样品的洗脱缓冲液包含用于从得自对象的生物学样品中提取核酸样品的试剂。 
其它例子包括可商购的，如GENOMIC ISOLATION KIT A.S.A.P. TM(Boehringer Mannheim，Indianapolis，Ind.)、基因组DNA分离系统(GIBCO BRL，Gaithersburg，Md.)、ELU-QUIKTM DNA纯化试剂盒(Schleicher & Schuell，Keene，N.H.)、DNA提取试剂盒(Stratagene，La Jolla，Calif.)、TURBOGENTM分离试剂盒(Invitrogen，San Diego，Calif.)等等。根据厂商指导使用这些试剂盒通常可以纯化DNA，之后进行本发明的方法。 
C. 影响CPSI编码多核苷酸及其编码的CPSI多肽的定义
根据本发明，提供了纯化和分离的CPSI编码多核苷酸及其编码的CPSI多肽。本发明特别提供了CPSI编码多核苷酸，其包含在CPSI基因的第4340碱基位(即在外显子36内)C颠换为A的CPSI编码多核苷 酸，这样将三联体密码子从ACC改变为AAC，导致所编码的CPSI多肽中T1405N改变。本发明还特别提供了包含T1405N改变的编码的CPSI多肽。因此，根据本发明还提供了等位基因变体多核苷酸及其编码的多肽。另外，根据本发明还提供了生物学活性的CPSI多肽，及编码这种CPSI多肽的CPSI编码多核苷酸。生物学活性的例子包括介导尿素循环的第一个步骤的生物学活性及与抗CPSI抗体交叉反应的生物学活性。 
本发明提供的CPSI编码多核苷酸和多肽在尿素循环的生物学重要性中具有的广泛用途，这为本领域所已知。例如，所述CPSI编码多核苷酸和多肽用于制备检测生物学样品中本发明的蛋白质和核酸存在的筛选分析和分析试剂盒。另外，技术人员熟知分离的和纯化的多肽可用作家畜的饲料添加剂，编码所述多肽的多核苷酸因此用于生产所述多肽。 
在一些实施方案中，本发明提供的CPSI多核苷酸和多肽分离自脊椎动物和非脊椎动物。因此，本发明提供了CPSI的同系物，包括但不限于哺乳动物、酵母和细菌同系物。CPSI的哺乳动物同系物成员包括例如但不限于大鼠和人同系物。 
术语“CPSI基因产物”、“CPSI蛋白质”和“CPSI多肽”是指具有与CPSI天然氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的蛋白质，并且具有介导尿素循环中氨甲酰磷酸盐合成或者与针对CPSI多肽的抗CPSI抗体交叉反应的生物学活性。 
术语“CPSI基因产物”、“CPSI蛋白质”和“CPSI多肽”还包括与天然CPSI基因产物具有至少一些共有生物学活性的CPSI分子的类似物。另外，诱变领域的技术人员意识到至今未揭示或未发现的其它类似物也可用于构建CPSI类似物。“CPSI基因产物”、“CPSI蛋白质”或“CPSI多肽”非必需包含天然CPSI基因产物的所有或者基本上所有氨基酸序列。本发明可使用较短或较长的序列。因此，术语 “CPSI基因产物”还包括融合或重组CPSI多肽和蛋白质。本发明还揭示了制备这种蛋白质的方法。 
术语“CPSI编码多核苷酸”、“CPSI基因”和“CPSI基因序列”和“CPSI基因节段”是指与编码上述CPSI基因产物、CPSI蛋白质或CPSI多肽的多核苷酸序列基本上相同的任何DNA序列。该术语也是指与这种DNA序列相容的RNA或者反义序列。“CPSI编码多核苷酸”、“CPSI基因”、“CPSI基因序列”和“CPSI基因节段”也包含相关控制序列的任意组合。 
术语“基本上相同”当用于限定CPSI基因产物或者CPSI氨基酸序列或者CPSI基因或者CPSI核酸序列时，是指由于一或多个缺失、取代或者添加而与天然CPSI序列不同但仍保留至少一些CPSI生物学活性的特殊序列，例如突变序列。或者，如果符合下列条件，则DNA类似物序列与本发明揭示的特异DNA序列是“基本上相同”的：(a)所述DNA类似物序列衍生自天然CPSI基因的编码区；或者(b)所述DNA类似物序列能与(a)的DNA序列在中等严格条件下杂交，并且编码生物学活性的CPSI基因产物；或者(c)所述DNA序列是(a)和/或(b)所述DNA类似物序列遗传密码简并的结果。基本上相同的类似物蛋白质与天然蛋白质的相应序列大约60％以上相同。相似性程度较低但是生物学活性相当的序列认为是等价物。在确定核酸序列中，能编码基本上相似的氨基酸序列的所有对象核酸序列被认为是与参考核酸序列基本上相似的，不论密码子序列中的差异如何。 
C.1 相似性百分比
相似性百分比可例如通过使用得自University of WisconsinGeneticist Computer Group的GAP计算机程序对比序列信息而确定。所述GAP程序利用经Smith et al.，Adv.Appl.Math.2：482(1981)修改的Needleman et al.，J.Mol.Biol.48：443(1970)的排列对比方法。简而言 之，GAP程序定义相似性为相似的排列符号(即核苷酸或者氨基酸)的数目除以两个序列中较短序列的符号总数。GAP程序的代表性默认参数包括：(1)核苷酸的一元(unitary)对比矩阵(包括相同时值为1，不同时值为0)和Gribskov et al.，Nucl.Acids.Res.14：6745(1986)的加权对比矩阵，如Schwartz et al.，eds.，Atlas of Protein Sequence andStructure，National B iomedical Research Foundation，pp.357-358(1979)所述；(2)对每个缺口罚值为3.0及对每个符号和每个缺口另外罚值0.01；及(3)对末端缺口没有罚值。其它对比技术在实施例中描述。 
术语“同源性”描述了用于鉴别具有相似功能或者基序的基因或者蛋白质的基于数学的序列相似性对比。因此，术语“同源性”与上述术语“相似性”和“相似性百分比”同义。因此，短语“基本上同源”或者“基本上相似”具有相似含义。 
C.2. 核酸序列
在某些实施方案中，本发明涉及CPSI基因和基因产物的应用，所述CPSI基因和基因产物在其各自序列内包含基本上是CPSI基因序列的或相应蛋白质的序列。术语“基本CPSI基因序列”是指基本上相应于CPSI多肽或者CPSI编码多核苷酸的一部分并且具有相对较少的与CPSI蛋白或者CPSI基因(或者蛋白质的生物学功能等价物)不同的碱基或者氨基酸(DNA或者蛋白质)的序列。术语“生物学功能等价物”为本领域所熟知，在此进一步描述。因此，与CPSI蛋白质的氨基酸或者CPSI基因在一些实施方案中大约70％-80％、在一些实施方案中大约81％-90％、及在一些实施方案中大约91％-99％相同或者功能等价的序列是“基本上相同”的序列。 
本发明还包括CPSI基因产物和具有功能等价密码子的CPSI基因。本文所用术语“功能等价密码子”是指编码相同氨基酸的密码子， 如精氨酸或丝氨酸的6个密码子，也是指编码生物学等价氨基酸的密码子(见表1)。 
表1：遗传密码子表
也应理解氨基酸和核酸序列可包括额外的残基，如额外的N-或C-末端氨基酸或者5’或3’序列，基本如本文揭示的序列之一所示，只要所述序列符合上述标准，包括在蛋白质表达时保持蛋白质生物学活性。添加末端序列特别用于核酸序列，例如可包括编码区5’或3’部分两侧的不同非编码序列或者可包括不同内在序列，即已知在基因内发生的内含子。 
本发明还涵盖了与说明书中所示序列互补或者基本上互补的DNA节段的应用。“互补”的核酸序列是根据标准Watson-Crick互补规则碱基配对的那些序列。如本文所用，术语“互补序列”是指基本上互补的核酸序列，可以通过上述相同核苷酸对比确定，或者定义为在本文所述相对严格的条件下能与质询核酸节段杂交。所述互补核酸节段的特别例子是反义寡核苷酸。 
核酸杂交除了受碱基成分、互补链长度及杂交核酸之间核苷酸碱基错配数的影响之外，还受到如盐浓度、温度或者有机溶剂这样条件的影响，这些易于为本领域技术人员所意识到。严格温度条件通常包括超过30℃，典型超过37℃，在一些实施方案中超过45℃的温度。严格盐浓度通常低于1000mM，典型低于500mM，在一些实施方案中低于200mM。然而，参数的组合比任何单一参数的测定更重要(见例如Wetmur & Davidson，J.Mol.Biol.31：349-370(1968))。 
探针序列也可以与双链DNA在一定条件下特异性杂交，形成三链体或者更高等级的DNA复合物。本领域熟知这种探针的制备及合适的杂交条件。 
如本文所用，术语“DNA节段”是指已经分离的没有特殊物种全部基因组DNA的DNA分子。另外，编码CPSI多肽的DNA节段是指含有CPSI编码序列的DNA节段，分离自或者纯化自源物种如人(Homo sapiens)的全部基因组DNA。术语“DNA节段”包括DNA 节段及这种节段的较小片段，及重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等等。 
相似地，包含分离的或纯化的CPSI基因的DNA节段是指包括基本上分离自其它天然存在的基因或者蛋白质编码序列的CPSI编码序列的DNA节段。在这方面，术语“基因”用于简单地描述功能蛋白质、多肽或者肽编码单位。如本领域技术人员所已知，这个功能术语包括基因组序列和cDNA序列。“基本上分离自其它编码序列”是指在这种情况中，感兴趣的基因，CPSI基因形成DNA节段编码区的主要部分，该DNA节段不含有大部分天然存在的编码DNA，如大的染色体片段及其它功能基因或者cDNA编码区。当然，这个术语是指最初分离的DNA节段，并不排除后来通过人工加入所述节段的基因或者编码区。 
在特殊的实施方案中，本发明涉及分离的DNA节段和掺入编码CPSI多肽的DNA序列的重组载体，所述CPSI多肽在其氨基酸序列中包括SEQ ID NO：2、4、12和14任一所示氨基酸序列。在其它特殊的实施方案中，本发明涉及分离的DNA节段和掺入编码一种蛋白质的DNA序列的重组载体，所述蛋白质在其氨基酸序列中包括相应于人体组织的CPSI多肽的氨基酸序列。 
也应理解本发明不限于SEQ ID NO：1-4和11-14所示特定的核酸和氨基酸序列。重组载体和分离的DNA节段因此可不同地包括CPSI多肽编码区自身，包括在基本编码区中具有选择的改变或者修饰的编码区，或者包括编码的较大的多肽，其仍然包括CPSI多肽编码区或者可编码具有改变的氨基酸序列的生物学功能等价蛋白质或者肽。 
在某些实施方案中，本发明涉及分离的DNA节段和编码在其氨基酸序列中包括基本如SEQ ID NO：2、4、12和14任一所示氨基酸序列的蛋白质或肽的重组载体。天然地，在所述DNA节段或载体编码全长CPSI基因产物时，核酸序列的例子是基本如SEQ ID NO：1、3、 11和13任一所示的序列，并且编码在尿素循环中具有活性的蛋白质，所述活性例如可通过比色分析检测从氨产生的羰基磷酸盐而确定，如实施例3所述。 
术语“基本如SEQ ID NO：2、4、12和14任一所示的序列”是指基本上相应于SEQ ID NO：2、4、12和14任一氨基酸序列一部分的序列，并且具有相对极少的与SEQ ID NO：2、4、12和14任一氨基酸序列的氨基酸不同的氨基酸或者具有是SEQ ID NO：2、4、12和14任一氨基酸序列的氨基酸的生物学功能等价物的氨基酸。术语“生物学功能等价物”为本领域所熟知并在本文进一步阐述。因此，在一些实施方案中与SEQ ID NO：2、4、12和14任一个的氨基酸具有大约70-80％、在一些实施方案中大约81％-90％、及在一些实施方案中大约91％-99％相同或者功能等价的序列是“基本如SEQ ID NO：2、4、12和14所示的序列”。 
在特殊的实施方案中，本发明涉及基因治疗方法，该方法使用分离的DNA节段和掺入编码一种蛋白质的DNA序列的重组载体，所述蛋白质在其氨基酸序列中包括SEQ ID NO：2、4、12和14所示任一氨基酸序列，SEQ ID NO：2、4、12和14包括衍生自人体组织的序列。在其它特殊的实施方案中，本发明涉及分离的DNA序列和掺入编码一种蛋白质的DNA序列的重组DNA载体，所述蛋白质在其氨基酸序列中包括人肝脏组织的CPSI蛋白质的氨基酸序列。 
在某些其它的实施方案中，本发明涉及分离的DNA节段和重组载体，在其序列中包括基本如SEQ ID NO：1、3、11和13任一所示的核酸序列。术语“基本如SEQ ID NO：1、3、11和1 3任一所示的序列”以如上述相同含义应用，是指所述核酸序列分别基本上相应于SEQID NO：1、3、11和13任一所示的一部分，并且具有相对极少的分别与SEQ ID NO：1、3、11和13任一的密码子不相同的密码子或者具有是SEQ ID NO：1、3、11和13任一的密码子的功能等价物的密码子。再 者，可以应用编码在尿素循环中具有活性、与抗CPSI抗体交叉反应或者具有CPSI基因产物其它生物学活性的基因产物的DNA节段。本文所用术语“功能等价密码子”是指编码相同氨基酸的密码子，如精氨酸或者丝氨酸的6个密码子，也是指编码生物学等价氨基酸的密码子(见表1)。 
本发明的核酸节段无论其自身编码序列的长度如何，均可以与其它DNA序列组合，如与启动子、增强子、多腺苷酸化信号、额外的限制酶位点、多克隆位点、其它编码节段等组合，由此其全长可明显变化。因此推测几乎可以应用任何长度的核酸片段，在一些实施方案中总长度限制于制备方法和在指定重组DNA方案的应用。例如，可以制备这样的核酸片段，其包括分别与SEQ ID NO：1、3、11和13所示核酸序列互补的一段短序列，如长度为大约10个核苷酸，直至1 0000或者5000个碱基对，在某些情况中优选3000个碱基对的节段。也可以使用总长度为大约1000、500、200、100和大约50个碱基对的DNA节段。 
本发明的DNA节段涵盖了生物学功能等价CPSI蛋白质和肽。这种序列可以是已知在核酸序列及编码的蛋白质中天然发生的密码子冗余和功能等价的结果而产生的。或者，功能等价蛋白质或肽可以通过应用重组DNA技术产生，其中蛋白质结构的改变可以基于置换的氨基酸的性质而工程化，例如在第4和第5位氨基酸Ile和Leu的取代是SEQ ID NO：11-14。人工设计的改变可以是通过应用定向诱变技术实现的，例如对蛋白质的抗原性或者测试CPSI突变体以检测在尿素循环中的活性或者分子水平的其它活性进行改良。 
如果需要，也可以制备融合蛋白和肽，例如其中CPSI编码区与具有所需功能的其它蛋白质或肽在同一表达单位内排列，如为了进行纯化或者免疫检测(例如蛋白质分别可以通过亲和层析和酶标记编码区而纯化)。 
本发明另外的重要方面是重组载体。特别有用的载体是其中DNA节段的编码部分位于启动子的控制下的那些载体。启动子可以是与CPSI基因天然相关的形式，例如在哺乳动物组织中，可以通过分离位于编码节段或者外显子上游的5’非编码序列而获得，例如使用重组克隆和/或PCR技术，结合本发明揭示的组合物。 
在其它实施方案中，预期通过将编码DNA节段定位于重组或者异源启动子控制下而获得一定的优势。如本文所用，重组或者异源启动子是指与CPSI基因在其天然环境中非正常相关的启动子。这种启动子可包括分离自细菌、病毒、真核细胞或者哺乳动物细胞的启动子。自然，应用有效指导DNA节段在选择的细胞类型中表达的启动子是重要的。用于蛋白质表达的启动子及细胞类型组合为分子生物学领域技术人员所熟知，见例如Sambrook et al.，1989所述，所述内容在此并入参考。应用的启动子可以是组成型或者可诱导型启动子，并且可以在适当条件下使用以指导导入的DNA节段的高水平表达，这在大规模生产重组蛋白质或肽中是有益的。用于高水平表达的合适启动子系统包括但不限于痘苗病毒启动子和杆状病毒启动子。 
在一些实施方案中，本发明提供了一种表达载体，其包含编码CPSI多肽的多核苷酸，所述多肽在尿素循环中具有活性、与抗CPSI抗体交叉反应或者具有本发明的其它生物学活性。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含编码人CPSI基因产物的多核苷酸。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含编码一种多肽的多核苷酸，所述多肽包含SEQ ID NO：2、4、12和14任一所示氨基酸残基序列。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含一种多核苷酸，其包含SEQ IDNO：1、3、11和13任一所示核苷酸碱基序列。 
在一些实施方案中，本发明的表达载体包含与增强子—启动子可操纵地连接的多核苷酸。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含与原核细胞启动子可操纵地连接的多核苷酸。或者，本发明的表达载 体包含与增强子—启动子(真核细胞启动子)可操纵地连接的多核苷酸，所述表达载体进一步包含一个多腺苷酸化信号，其位于3’羧基末端氨基酸及编码的多肽的转录单位中。 
在一些实施方案中，本发明提供了一种用编码CPSI多肽的多核苷酸转染的重组宿主细胞，所述CPSI多肽在调节尿素循环中具有活性、与抗CPSI抗体交叉反应或者具有本发明的其它生物学活性。SEQ IDNO：1-4和11-14示出来自示例的脊椎动物，人的核苷酸和氨基酸序列。本发明还提供了在其它脊椎动物包括大鼠中发现的同源或者生物学等价多核苷酸和CPSI多肽。本发明还提供了在无脊椎动物包括细菌和酵母中发现的同源或者生物学等价的多核苷酸和CPSI多肽。 
在一些实施方案中，本发明的重组宿主细胞用编码人CPSI多肽的多核苷酸转染。在一些实施方案中，本发明的重组宿主细胞用SEQ IDNO：1、3、11和13任一所示多核苷酸序列转染。在一些实施方案中，本发明的宿主细胞是一种真核宿主细胞。在一些实施方案中，本发明的重组宿主细胞是脊椎动物细胞。在一些实施方案中，本发明的重组宿主细胞是哺乳动物细胞。 
另一方面，本发明的重组宿主细胞是原核宿主细胞。在一些实施方案中，本发明的重组宿主细胞是细菌细胞，在一些实施方案中是大肠杆菌菌株。在一些实施方案中，重组宿主细胞包含在重组宿主细胞中起作用的调节信号的转录控制下的多核苷酸，其中所述调节信号适当地控制CPSI多肽以可以进行所有必需的转录和转录后修饰的方式表达。 
在一些实施方案中，本发明提供了一种制备CPSI多肽的方法，包括将细胞用编码CPSI多肽的多核苷酸转染以产生转化的宿主细胞，所述CPSI多肽在尿素循环中具有活性、与抗CPSI抗体交叉反应或者具有本发明的其它生物学活性；将转化的宿主细胞在足以使得多肽表达的条件下维持。在一些实施方案中，所述转化的宿主细胞是真核细胞。 在一些实施方案中，所述真核细胞是脊椎动物细胞。或者，所述宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，所述原核细胞是大肠杆菌细菌细胞。在一些实施方案中，转染进转化的细胞中的多核苷酸包含SEQID NO：1、3、11和13任一所示核苷酸碱基序列。SEQ ID NO：1-4和11-14描述了示例的脊椎动物，人的核苷酸和氨基酸序列。本发明还提供了在其它脊椎动物、特别是温血脊椎动物、更特别是在大鼠中发现的同源或生物学等价CPSI多核苷酸和多肽。本发明还提供了在无脊椎动物包括细菌和酵母中发现的同源或者生物学等价多核苷酸和CPSI多肽。 
如上所述，结合制备重组CPSI蛋白质和肽的表达实施方案，通常使用较长的DNA节段，在一些实施方案中使用编码完整CPSI蛋白质或其功能结构域或裂解产物的DNA节段。然而，应意识到使用较短的DNA节段以指导CPSI肽或表位核心区域(epitope core regions)表达也在本发明的范围内，如可用于产生抗CPSI抗体。 
预期特别有用的DNA节段是在一些实施方案中编码长度为大约15-50个氨基酸、在一些实施方案中编码长度为大约15-30个氨基酸的肽抗原的节段。编码肽的DNA节段通常具有长度为大约45-150、或者大约45-90个核苷酸的最小编码长度。编码全长蛋白质的DNA节段对于SEQ ID NO：2、4、12和14任一所示蛋白质可具有大约4500-4600个核苷酸的最小编码长度。 
自然，本发明还涵盖了与SEQ ID NO：1、3、11和13任一所示序列互补或者基本上互补的DNA节段。术语“互补”和“基本上互补”的含义如上述。除了内含子或者侧翼区域之外(其详细描述在图9中示出)，在遗传密码简并后，一些实施方案中，与SEQ ID NO：1、3、11和13任一序列的核苷酸大约70％-80％、在一些实施方案中大约81％-90％及在一些实施方案中大约91％-99％相同或者功能等价(即编码相同的氨基酸)的序列是“基本如SEQ ID NO：1、3、11和13任 一所示的序列”。与SEQ ID NO：1、3、11和13任一所示序列基本上相同的序列也可以功能性定义为是在相对严格条件下能与含有SEQID NO：1、3、11和13任一序列的互补体的核酸节段杂交的序列。本文描述了合适的相对严格杂交条件，这些为本领域技术人员所熟知。 
C.2.生物学功能等价物
如上所述，可以在本文描述的CPSI蛋白质和肽的结构中进行修饰和改变，并且仍获得具有相同或者另外所需特性的分子。例如，蛋白质结构中的某些氨基酸可以取代为其它氨基酸而不明显丧失例如细胞核中结构的相互活性(interactive)能力。既然蛋白质的相互活性能力和性质限定了蛋白质的生物学功能活性，因此在蛋白质序列(或者其基本的DNA编码序列)中可以进行某些氨基酸序列取代，仍能获得具有相同或者甚至相反性质的蛋白质(例如拮抗剂，激动剂)。因此期待在CPSI蛋白质和肽(或者基本DNA)的序列中可以进行多种变化而不明显丧失其生物学用途或活性。 
本领域技术人员也熟知在阐述生物学功能等价蛋白质或肽中根本的是这样的观点，即限制在分子的指定部分中可以进行改变的数目及仍可获得具有可接受水平的等价生物学活性的分子。因此在本文生物学功能等价肽是其中一些(非大多数或全部)氨基酸可以被取代的那些肽。当然，根据本发明可以容易地进行并使用具有不同取代的许多独特的蛋白质/肽。 
技术人员也熟知某些残基示出对于蛋白质或肽的生物学或者结构性质特别重要，例如活性位点中的残基，这种残基通常不可被置换。在本发明中即是如此，其中如果在例如CPSI多肽的磷酸化结构域中的任何改变均可导致所得肽丧失其在本发明中某一方面的用途。 
氨基酸取代，例如可用于修饰本文所述CPSI蛋白质和肽的那些氨基酸取代，通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、 亲水性、电荷、大小等等。对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析表明精氨酸、赖氨酸和组氨酸是正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的大小相似；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。因此基于这些因素，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是生物学功能等价物。 
在产生这种改变中，可以考虑氨基酸的亲水指数。对每个氨基酸基于其疏水性和电荷特性确定亲水指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；精氨酸(-4.5)。 
本领域已知亲水氨基酸指数在授予蛋白质相互作用生物学功能方面的重要性(Kyte & Doolittle，J.Mol.Biol.157：105-132(1982)，并入本文作参考)。已知某些氨基酸可以由具有相似亲水指数或分值的其它氨基酸取代，并仍保留相似的生物学活性。其亲水指数在一些实施方案中为原始值的±2内、在一些实施方案中为原始值的±1内及在一些实施方案中为原始值的±0.5内的氨基酸取代可用于基于亲水指数产生改变。 
本领域也已知可以基于亲水性有效地产生同样的氨基酸取代。并入本文作参考的美国专利No.4,554,101阐述了蛋白质的最大局部平均亲水性，由其相邻氨基酸的亲水性决定，与其免疫原性和抗原性即蛋白质的生物学性质相关。已知氨基酸可以由具有相似亲水性数值的另一个氨基酸取代，并且仍获得生物学等价蛋白质。 
如美国专利No.4,554,101所述，对如下氨基酸残基确定了亲水性数值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)； 苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。 
其亲水性数值在一些实施方案中为原始值的±2内、在一些实施方案中为原始值的±1内及在一些实施方案中为原始值的±0.5内的氨基酸取代可用于基于相似的亲水性数值产生改变。 
讨论集中在从氨基酸改变中产生功能等价多肽，应意识到这些改变可以通过改变编码DNA而实现，也要考虑的是遗传密码简并及两或多个密码子可以编码同一氨基酸。 
C.3. 序列修饰技术
对本发明所述CPSI蛋白质和肽的修饰可以使用如定点诱变技术进行。位点特异性诱变是通过对基本DNA的特异性诱变来制备各个肽或者生物学功能等价的蛋白质或肽。该技术进一步提供了(例如根据前述的一或多个考虑)通过在DNA中导入一或多个核苷酸序列改变而易于制备和测试序列变体的能力。位点特异性诱变可以产生突变体，通过使用编码所需突变的DNA序列的特异性寡核苷酸序列及足够数目的相邻核苷酸，提供足够大小的引物序列和序列复杂性以在横跨缺失接合处的两侧形成稳定的双链体。典型地，在一些实施方案中可以应用长度为大约17-30个核苷酸的引物，在被改变的序列的接合处的两侧有大约5-10个残基。 
通常，通过一些出版物的例证，本领域熟知位点特异性诱变技术(例如Adelman et al.，1983)。正如所意识到的，该技术典型应用以单链和双链两种形式存在的噬菌体载体。定点诱变中使用的典型载体包括如M13噬菌体载体(Messing et al.，1981)。这些噬菌体可易于商购，其应用为本领域技术人员所熟知。双链质粒也通常用于定点诱变中，消除了将感兴趣的基因从质粒移至噬菌体的步骤。 
通常，定点诱变是通过首先获得单链载体或者使双链载体的两个链解链而进行，所述双链载体在其序列中包括编码例如人CPSI多肽的DNA序列。制备具有所需突变序列的寡核苷酸引物，通常例如通过Crea等(1978)的方法合成。然后将这个引物与单链载体退火，进行DNA聚合酶处理如大肠杆菌聚合酶I Klenow片段，以完成具有突变的链的合成。因此，形成异源双链体，其中一个链编码原始未突变的序列，另一个链具有所需的突变。然后将这种异源双链体载体用于转化合适的细胞，如大肠杆菌细胞，选择包括具有突变序列排列的重组载体的克隆。 
本发明还提供了使用定点诱变制备选择的基因的序列变体，作为生产在尿素循环中具有活性的潜在有用的CPSI多肽或者其它物种的手段，但不限于这种方法，还有可获得这些肽的序列变体的其它方式。例如，编码所需基因的重组载体可以用诱变剂处理以获得序列变体(见例如Eichenlaub，1979所述方法)，使用羟胺诱变质粒DNA。 
C.4. 其它结构等价物
除了本文描述的CPSI肽基化合物之外，本发明还涉及可以配制其它空间排列相似化合物以模拟肽结构的关键部分。这种化合物可以与本发明的肽以相同的方式使用，并因此也是功能等价物。结构功能等价物的产生可以通过本领域技术人员已知的建模和化学设计技术实现。应理解所有这种空间排列相似的构建体均在本发明的范围内。 
D. 基因产物的导入
在应用基因自身导入基因产物时，常规的导入方法是通过使用重组载体掺入所需基因及相关的控制序列。重组载体的制备为本领域技术人员所熟知，在许多参考文献中有描述，例如Sambrook等(1989)所述，在此特别并入作参考。 
在载体中，应理解被表达的DNA编码序列(在这种情况中是编码CPSI基因产物的那些DNA序列)位于启动子邻近并在其控制下。本领域理解为了使得编码序列在这种启动子的控制下，通常将被表达的基因产物的转录读框的转录起始位点的5’末端位于所选择启动子下游(即3’末端)的大约1-50个核苷酸之间。也可以在载体的转录单位中掺入一个合适的多腺苷酸化位点(例如5′-AATAAA-3′)，如果其未包含在原始插入的DNA中。典型地，这些polyA添加位点被置于编码序列下游大约30-2000个核苷酸之间，在转录终止之前的位置。 
可以使用特异基因的控制序列(即CPSI基因的CPSI启动子)，只要其它控制序列与处理的细胞基因型相容即可应用所述其它控制序列。因此，可以提及的其它启动子例如包括SV40早期启动子、逆转录病毒的长末端重复启动子、肌动蛋白启动子、热激启动子、金属硫蛋白启动子等等。 
如本领域所已知，启动子是在转录开始处(即转录起始位点)之前(上游)典型地大约100个核苷酸对内的DNA分子的一个区域。该区域典型含有位于不同基因中相似位置的一些类型的DNA序列元件。如本文所用，术语“启动子”包括在本领域中称为上游启动子区域，启动子区域或者一般化的真核细胞RNA聚合酶II转录单位的启动子。 
另一类型的分立的转录调节序列元件是增强子。增强子提供特定编码区(例如基因)的时间、位置和表达水平的特异性。增强子的主要功能是在含有与增强子结合的一或多个转录因子的细胞中提高编码序列的转录水平。与启动子不同，只要启动子存在，增强子位于与转录起始位点不同距离时均可发挥作用。 
如本文所用，短语“增强子—启动子”是指既含有增强子又含有启动子元件的一个复合单位。增强子—启动子与编码至少一种基因产物的编码序列可操纵地连接。如本文所用，短语“可操纵地连接”是 指增强子—启动子与编码序列以该编码序列的转录在增强子—启动子的控制和调节下的方式连接。本领域熟知将增强子—启动子与编码序列可操纵地连接的手段。如本领域所熟知，相对于转录被控制的编码序列的精确方向和位置依赖于增强子—启动子的特异性性质。因此，TATA框最小启动子典型地位于转录起始位点上游大约25-30碱基对，上游启动子元件典型地位于转录起始位点上游大约100-200碱基对。相反，增强子可位于起始位点下游，与该位点的距离可以相当的大。 
本发明载体构建体中使用的增强子—启动子可以是驱动在被转染的细胞中表达的任何增强子—启动子。通过应用具有熟知性质的增强子—启动子，基因产物表达的水平和模式可以最佳化。 
对于导入例如人CPSI基因(包括其等位基因变体)，提议应用将所需基因输送至受影响的细胞的载体构建体。当然，这通常需要将该构建体输送至靶细胞，例如哺乳动物肝细胞。提议在一些实施方案中这个目的可以通过使用携带CPSI序列的病毒载体有效感染细胞而导入所需的基因。这些载体在一些实施方案中可以是腺病毒、逆转录病毒、痘苗病毒载体，或者腺伴随病毒。优选这些载体，因为已经将其成功用于将所需序列输送至细胞并且趋于具有高感染效力。调试合适的载体—CPSI基因构建体，以作为药物组合物施用，如下文所述。 
通常使用的表达载体的病毒启动子衍生自多形瘤、巨细胞病毒、腺病毒2和猿猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期启动子特别有益，因为其均易于作为也含有SV40病毒复制起点的片段而得自该病毒。也可以使用较小或者较大的SV40片段，只要包括位于病毒复制起点的从Hind III位点至Bgl I位点的大约250bp序列即可。另外，也可以及通常希望利用与所需基因序列正常相关的启动子或者控制序列，只要这种控制序列与宿主细胞系统相容即可。 
复制起点可以通过构建包括外源起点的载体而提供，所述外源起点如可以衍生自SV40或者其它病毒(例如多形瘤、Adeno、VSV、BPV)，或者可以通过宿主细胞染色体复制机制提供。如果载体整合进宿主细胞染色体中，则后者通常是足够的。 
在应用CPSI基因自身时，最便利的是直接简单应用野生型CPSI基因。所述CPSI基因可因此包含苏氨酸编码等位基因，由此编码的多肽的第1405位氨基酸包含苏氨酸。或者，所述CPSI基因包含精氨酸编码等位基因，由此编码的多肽的第1405位氨基酸包含精氨酸。另外，设想可以专门应用CPSI基因的某些区域，而不应用完整的野生型CPSI基因或其完整的等位基因变体。在一些实施方案中，应用调节尿素循环需要的最小区域，以便不将非必需DNA导入接收CPSI基因构建体的细胞中。本领域技术人员熟知的技术如限制酶的使用，可以产生示例的CPSI基因的小区域。这些区域调节尿素循环的能力可易于通过实施例中报道的分析而确定。通常，本领域已知评估调节尿素循环的技术。 
D.1. 转基因动物
本发明还提供了制备转基因非人动物，所述动物表达本发明的CPSI基因或者其中CPSI基因的表达被“敲除”。本发明提供的转基因非人动物表达CPSI的T1405形式或者CPSI的N1405形式。转基因动物的例子是小鼠。 
制备转基因动物的技术为本领域所已知。例如美国专利No.5,489,742(转基因大鼠)；美国专利No.4,736,866、5,550,3 16、5,614,396、5,625,125和5,648,061(转基因小鼠)；美国专利No.5,573,933(转基因猪)；美国专利No.5,162,21 5(转基因鸟类)和美国专利No.5,741,957(转基因牛类)，所述专利均并入本文作参考。 
关于制备转基因小鼠的示例方法，是将克隆的重组或合成的编码CPSI基因产物的DNA序列或者DNA节段注入小鼠受精卵中。将经注射的受精卵植入假孕雌性小鼠中，使之生长一段时间以提供其细胞表达CPSI基因产物的转基因小鼠。在一些实施方案中，注入的序列构建为具有连接的启动子序列，以在转基因小鼠的肝细胞中表达所需的蛋白质。 
D.2. 基因治疗
根据本发明，CPSI基因可用于基因治疗。基因治疗的方法的例子包括核酸经脂质体转染进宿主细胞，在美国专利No.5,279,833；5,286,634；5,399,346；5,646,008；5,65 1,964；5,641,484和5,643,567中描述，所述专利均并入本文作参考。 
简而言之，本发明描述了针对调节靶细胞中尿素循环的CPSI基因治疗方法。靶细胞包括但不限于肝细胞和肠细胞。在一些实施方案中，本发明的治疗方法提供了一种调节细胞中尿素循环的方法，包括如下步骤：(a)给予细胞有效量的DNA分子，所述DNA分子包含编码调节尿素循环的CPSI多肽的多核苷酸；及(b)在足以表达所述多肽的条件下维持细胞。 
在一些实施方案中通过将DNA分子注射进细胞中而实现输送。细胞在对象中时，在一些实施方案中将DNA分子施用给对象的循环系统实现输送。在一些实施方案中，施用包括如下步骤：(a)提供含有所述DNA分子的载体；及(b)将所述载体施用给对象。 
在一些实施方案中，载体是用DNA分子转化或转染的细胞或者衍生自这种转化或转染细胞的转染细胞。转化或转染的细胞例子是肝细胞。用本发明的DNA分子转化或转染细胞的手段如上所述。 
或者，所述载体是与肿瘤抗原特异性感染或者免疫反应的病毒或者抗体。用于输送构建体给宿主靶组织的逆转录病毒通常是其中 3′-LTR(线性转移区)已经失活的病毒。即这些是增强子较低3′-LTR，通常称作SIN(自失活病毒(self-inactivating virus))，因为在感染进宿主细胞后，3′-LTR移至5’末端，病毒的两个LTR的转录活性均失活。为本领域技术人员所熟知的这些病毒的应用是克隆基因，以将克隆基因的调节元件插入两个LTR之间的间隔中。病毒感染系统的优势是可以非常高水平地感染进合适的受体细胞中。 
抗体已经用于靶定和输送DNA分子。N-末端修饰的聚L-赖氨酸(NPLL)抗体缀合物易于与质粒DNA形成复合物。与NPLL缀合的细胞表面凝血调节蛋白的单克隆抗体复合物用于将外源质粒DNA靶定表达抗原的小鼠肺内皮细胞系和小鼠肺。这些靶定的内皮细胞表达该外源DNA编码的产物。 
也设想本发明的这个实施方案可以使用另外的病毒或噬菌体载体进行，包括其基因组已经通过另外方式操纵以使得所述病毒是非病原性的逆转录病毒和痘苗病毒。产生这种病毒突变的方法在美国专利No.4,769,331中详细描述，所述专利并入本文作参考。 
例如，将人CPSI编码多核苷酸或者来另外的温血脊椎动物的CPSI编码多核苷酸同系物或者来自无脊椎动物(如细菌或酵母)的CPSI编码多核苷酸同系物导入分离的肝细胞或者其它相关细胞中。将携带转基因的细胞再次注射进肝脏或其它相关组织中提供了对于人和动物中高氨血症或者其它相关疾病的易感性的治疗。 
E. 补充治疗方法
除了其在氮清除中的作用之外，尿素循环还是机体的精氨酸内在来源，精氨酸是有效的血管扩张剂一氧化氮(NO)的前体。本发明提供了治疗亚最佳尿素循环功能的方法，包括通过施用一氧化氮前体如瓜氨酸进行治疗。典型地，亚最佳尿素循环功能与本发明揭示的多态性 相关。亚最佳尿素循环功能可进一步包含高氨血症或者降低的瓜氨酸和/或精氨酸产生。 
治疗对象可患有与亚最佳尿素循环功能相关的疾病，例如但不限于与一氧化氮前体产生损伤相关的疾病。这种疾病包括但不限于肝和/或肠道组织损害或损伤的疾病。代表性疾病包括但不限于肝炎(包括甲型、乙型和丙型肝炎)、硬化、哮喘、肺动脉高压(包括初级和二级)、经历骨髓移植对象中的骨髓移植物毒性及这些病变的组合。 
治疗对象也可以暴露或者要暴露于与亚最佳尿素循环功能相关的环境刺激。这种环境刺激包括但不限于参与损害或者损伤肝和/或肠道组织的刺激。代表性的环境刺激包括但不限于化疗或者其它药物治疗、心脏手术(在一些情况中表现为手术后肺部血管紧张度增加)、增加的氧化应激、骨髓移植、败血症、急性哮喘发作、缺氧、肝毒素暴露及这些刺激的组合。代表性心脏手术包括修复先天性心脏缺损，进一步包括用于校正先天性心脏缺损的心肺转流术。代表性心脏缺损是与肺血流过量相关的心脏缺损，如房室隔缺损(AVSD)或者大的无限制性室间隔缺损(VSD)。持续的肺部过度循环可导致肺血管平滑肌肥大和高反应性。在手术前，这些患者通常具有充血性心力衰竭及体重增长缓慢。需要尽可能早地手术修复以降低这种术后并发症。 
另外的心脏缺损校正方法是双向Glenn和改良的Fontan方法。在这种方法中，具有单心室损伤的患者需要手术治疗，手术的成功与否依赖于保持较低的术后肺血管紧张度。单心室损伤的阶段性校正需要分离肺循环和体循环的一系列3个手术方法。此过程中的第一个手术通常在新生儿期进行，是对患有右心室发育不全的患者进行Blalock-Taussig分流或者对患有左心发育不全综合征的患者进行Norwood I方法。第二个手术是双向Glenn分流，其中将上腔静脉血流直接转向至肺动脉。第三个也是最后的阶段是修改的Fontan方法，其中将下腔静脉血流转向至肺动脉，从而完全分离肺循环和体循环。使 用Glenn和Fontan方法，肺部血流完全被动并且依赖于静脉系统(SVC和IVC压力)与PA压力之间足够的压力梯度。在术后即刻肺血管紧张度的任何增高均可导致肺血流减少及随后心输出量降低。在这些方法之后较长时期的肺血管紧张度增高可导致持续的胸膜渗出，延长胸膜或纵隔引流管的需要，延长通气及延长ICU监护时间。 
另外的心脏缺损校正方法是Norwood I方法。经历了Norwood I方法的左心发育不全综合征(HLHS)婴儿的术后照顾很大程度上依赖于肺循环和体循环血流的平衡。肺血管阻力的突然增加可导致明显的低氧血症和去饱和作用。在罕见的情况下，低肺血管阻力是有害的，因为血流分流于肺部，以至于使得体循环和冠状血管循环受损。通过精确的手术技术和最佳的中央分流，这种并发症比不足的肺血流的问题更少见。 
另外的心脏缺损校正方法是动脉转接方法。大动脉的转位(TGA)是一种复杂的心脏损伤，需要在新生儿期立即手术校正。确定TGA校正的动脉转接方法的时间特别要考虑到肺血管紧张度的问题。通常，当围产期肺血管紧张度部分降低时不进行手术，直至出生后5-7天。因为在手术校正之前右心室是体循环心室，因此通常良好耐受术后肺血管阻力增加，肺动脉压力通常未测定。然而，如果术后肺血管紧张度增加，这可以部分解释为什么一些具有满意的解剖结构和短分流时间的婴儿仍具有复杂的术后进程。 
本发明提供了一种治疗或预防对象中与亚最佳尿素循环功能相关疾病的方法。所述方法包括给对象施用治疗有效量的一氧化氮前体，从而实现治疗或预防所述疾病。一氧化氮前体可包括但不限于瓜氨酸、精氨酸及其组合。在一些实施方案中，可以治疗得自亚最佳尿素循环功能的亚最佳一氧化氮形成。 
本发明还揭示了一种治疗或预防对象中选自如下疾病的方法：肝炎、硬化、肺动脉高压(初级和二级)、坏死性小肠结肠炎(NEC)、急 性呼吸窘迫综合征、人种特异性内皮细胞功能失调、勃起功能障碍、哮喘及这些疾病的组合。在一些实施方案中，所述方法包括给需要治疗的对象施用治疗有效量的一氧化氮前体。所述施用可以是静脉内或者口服施用。一氧化氮前体可选自瓜氨酸、精氨酸及其组合。在一些实施方案中，所述疾病是坏死性小肠结肠炎(NEC)，所述对象是早产儿。 
本发明还揭示了一种提高需要其的对象中硝酸前体水平的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给对象施用治疗有效量的一氧化氮前体，从而提高对象中一氧化氮前体的水平。所述施用可以是静脉内或者口服施用。所述一氧化氮前体可选自瓜氨酸、精氨酸及其组合。 
任选地，本发明的补充治疗方法进一步包括最初检测对象中氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)基因的多态性的步骤。氨甲酰磷酸合成酶多肽的多态性包括在一些实施方案中CPSI外显子36中C颠换为A，包括在一些实施方案中相应于CPSI基因的cDNA的第4340位核苷酸C颠换为A，及在一些实施方案中相应于CPSI基因的cDNA的第4340位核苷酸的C颠换为A进一步包括三联体密码子AAC改变为ACC，所述密码子编码在第1405位氨基酸具有苏氨酸部分的CPSI多肽。 
在经历于本发明揭示的T1405N CPSI多态性相关的BMT的对象中观测到尿素循环中间体(瓜氨酸，精氨酸)明显降低。根据本发明，提供了一种治疗或者预防BMT毒性(如HVOD和/或急性肺损伤)的方法，包括给需要治疗的对象施用治疗有效量的NO前体，如瓜氨酸和/或精氨酸。在一些实施方案中，本发明揭示的T1405N CPSI多态性存在于对象中。在一些实施方案中，给对象施用治疗有效量的瓜氨酸。 
根据本发明，因此提供了一种降低经历BMT的对象中HVOD毒性和/或发生的方法。这种方法包括给BMT对象施用有效量的精氨酸和/或瓜氨酸，在一些实施方案中为瓜氨酸，以支持对象中精氨酸和NO合成。支持对象中精氨酸和NO的合成将降低和/或基本上防止与BMT 相关的HVOD发生。瓜氨酸是更易于转变为NO的一种代表性补充剂。另外，预期具有本发明揭示的CPSI多态性的对象是根据这种方法补充的候选者。 
本发明治疗的对象在许多实施方案中是人，但应理解本发明原则上对于所有脊椎动物物种均有效，包括温血脊椎动物如哺乳动物和鸟类，其包括在术语“对象”的范畴内。在本文中，哺乳动物包括需要治疗其高血氨症、BMT毒性和与受损的尿素循环功能相关的其它疾病的任何哺乳动物物种，特别是农业和家养哺乳动物物种。 
因此，预期本发明用于治疗哺乳动物如人，以及那些重要的濒危哺乳动物(如东北虎(Siberian tigers))，经济学重要的哺乳动物(用于人类消费的农场饲养动物)和/或社会重要的动物(宠物或者动物园中的动物)，例如除了人之外的食肉动物(如猫和狗)、猪(家猪，公猪和野猪)、反刍动物(如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼)和马。预期本发明也可以治疗鸟类，包括治疗那些濒危的、动物园中的那些种类的鸟类，以及禽类，更特别是驯养的禽类即家禽，如火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等等，它们对于人类也是经济学重要的。因此，预期本发明用于治疗家畜，包括但不限于驯养的猪(家猪和公猪)、反刍动物、马、家禽等等。 
可以与载体材料组合产生单一剂量形式的活性成分的量根据治疗的宿主和施用的特殊模式而变化。例如，施用给人的制剂可含有0.5mg-5g活性剂，及适当及常规量的载体材料，其占总组合物的大约5％-95％。例如，在成人，每人每次施用的剂量通常为1mg-500mg，直至每天多次。因此，剂量单位形式通常含有大约1mg-500mg活性成分，典型为25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、800mg或者1000mg。 
一氧化氮前体在一些实施方案中施用的剂量范围是大约0.01mg-1000mg，在一些实施方案中为大约0.5mg-500mg，在一些实施方 案中为大约1.0mg-250mg。一氧化氮前体在一些实施方案中施用的剂量范围也可以是大约100mg-30000mg，在一些实施方案中为大约250mg-1000mg。代表性的剂量为3.8g/m2/天精氨酸或者瓜氨酸(摩尔当量，MW L-瓜氨酸175.2，MW L-精氨酸174.2)。 
代表性静脉内瓜氨酸溶液可包含100mg/ml(10％)溶液。代表性静脉内瓜氨酸剂量可包含200mg/kg、400mg/kg、600mg/kg和800mg/kg。在一些实施方案中，例如但不限于600或800mg/kg剂量，该剂量可减少50mg/kg-100mg/kg以减轻观测到的对体循环血压的非所需作用。 
在一些实施方案中，在暴露于环境刺激之前(例如在开始心脏手术如心肺转流术之前30分钟施用一个剂量和/或围术期期间施用直至1、2、3、4、5、6或更多个剂量，如在手术之前每12小时施用一次)在暴露于环境刺激之后给对象施用剂量(例如在达到术后监护室时施用、和/或在术后期间施用直至1、2、3、4、5、6或更多个剂量，如术后每12小时施用一次)。 
然而，应理解对于任何特定对象的特异剂量水平根据许多因素而定，包括年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度、药物组合及治疗的特定疾病的严重程度。 
F. 药物组合物
在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明的多肽或多核苷酸及生理学可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含编码生物学活性CPSI多肽的多核苷酸。或者，本发明提供了包含如上述剂量的瓜氨酸或精氨酸的药物组合物。 
本发明的组合物典型以含有标准的、熟知的无毒性生理可接受的所需载体(carrier)、佐剂和载体(vehicle)的剂量单位制剂形式口服或胃肠外施用。如本文所用，术语“胃肠外施用”包括静脉内、肌内、动脉内注射或者灌注技术。 
可注射的制品，例如无菌可注射的含水或含油悬浮液，是根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或者增湿剂和悬浮剂配制的。无菌可注射制品也可以是于无毒性胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，如于1，3-丁二醇中的溶液。 
可以应用的可接受的载体和溶剂是水、Ringer’s溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌、固定油通常用作溶剂或者悬浮介质。为此，可以应用任何无刺激性的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，在制备可注射的制品时使用脂肪酸如油酸。 
载体的例子包括中性磷酸盐、乳酸盐、Tris等缓冲盐溶液。当然，在用于基因治疗的药物组合物的情况中，将所述载体纯化以足以使其基本上没有非所需的污染物，如缺陷的干扰腺病毒颗粒或者内毒素及其它致热原，由此在接受该载体构建体的个体中不引起任何不利的反应。纯化载体的代表性方法包括使用浮力密度梯度，如氯化铯梯度离心。 
转染的细胞也可以作为载体。例如，可以从机体中移出肝细胞，使用上述方法用本发明的多核苷酸转染，然后将转染的细胞再回输机体(例如经血管内注射)。 
G. 抗体的产生
在一些实施方案中，本发明提供了与本发明的多肽或多核苷酸免疫反应的抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。制备和鉴定抗体的方法为本领域所熟知(见例如Antibodies A LaboratoryManual，E.Howell and D.Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。在一些实施方案中，抗体区别包含CPSI多态性的不同形式的CPSI。 
简而言之，多克隆抗体是通过用包含本发明的多肽或多核苷酸的免疫原免疫动物，从免疫的动物中收集抗血清而制备。许多动物物种均可用于产生抗血清。典型地，用于产生抗血清的动物是兔、小鼠、 大鼠、仓鼠或者豚鼠。由于兔的血液体积相对较大，因此例如选择兔生产多克隆抗体。 
如本领域所熟知，本发明提供的多肽或多核苷酸的免疫原性可以不同。因此通常必需将本发明的免疫原(例如本发明的多肽或多核苷酸)与载体偶联。载体的例子是匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其它白蛋白如卵清蛋白、小鼠血清白蛋白或者兔血清白蛋白也可以用作载体。 
将多肽或多核苷酸与载体蛋白缀合的方法为本领域所熟知，包括使用戊二醛、m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、碳二亚胺和bis-biazotized benzidine。 
也如本领域所熟知，对特定免疫原的免疫原性可以通过使用称作佐剂的免疫应答的非特异性刺激剂而增强。佐剂的例子包括完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。 
用于产生多克隆抗体的免疫原的量根据免疫原的性质以及用于免疫的动物而有所不同。许多途径可用于施用免疫原，例如皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内。多克隆抗体的产生通过在免疫后的不同时间点取免疫动物的血样进行监测。当获得所需水平的免疫原性时，给免疫动物放血，分离血清并贮存。 
另一方面，本发明提供了一种产生与CPSI多肽免疫反应的抗体的方法，所述方法包括如下步骤：(a)用编码所述多肽的多核苷酸转染重组宿主细胞；(b)在足以使得所述多肽表达的条件下培养宿主细胞；(c)回收所述多肽；及(d)制备该多肽的抗体。在一些实施方案中，CPSI多肽能介导尿素循环的第一个步骤，与抗CPSI抗体交叉反应，或者具有本发明揭示的其它生物学活性。在一些实施方案中，本发明提供了根据上述方法制备的抗体。 
本发明的单克隆抗体可易于通过使用熟知的技术制备，所述技术如美国专利No 4,196,265所例证那些技术，该专利并入本文作参考。典型地，一种技术包括首先用选择的抗原(例如本发明的多肽或多核苷酸)以足以提供免疫应答的方式免疫合适的动物。所述动物的例子如啮齿动物如小鼠和大鼠。然后将免疫动物的脾细胞与无限增殖化的骨髓瘤细胞融合。免疫动物是小鼠时，代表性的骨髓瘤细胞是小鼠NS-1骨髓瘤细胞。     
将融合的脾/骨髓瘤细胞在选择性培养基中培养，以从亲代细胞中选择融合的脾/骨髓瘤细胞。从未融合的亲代细胞混合物中分离融合的细胞，例如通过加入阻断核苷酸在组织培养基中从头合成的制剂而分离。所述制剂的例子是氨基蝶呤、氨甲蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和氨甲蝶呤既阻断嘌呤和嘧啶的从头合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。使用氨基蝶呤或氨甲蝶呤时，培养基补加次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸源。使用重氮丝氨酸时，培养基补加次黄嘌呤。 
这种培养提供了一群杂交瘤，从中选择特异性杂交瘤。典型地，通过在微滴定平板中单一克隆稀释培养细胞，随后测试各个克隆上清与抗原多肽的反应性，从而选择杂交瘤。然后将选择的克隆无限期增殖，以提供单克隆抗体。 
例如，为了产生本发明的抗体，为小鼠腹膜内注射大约1-200μg的包含本发明多肽的抗原。通过注射与佐剂缔合的抗原刺激B淋巴细胞生长，所述佐剂例如是完全弗氏佐剂(含有灭活的结核分枝杆菌(Mvcobacteriumtuberculosis)的免疫应答非特异性刺激剂)。在第一次注射后一定时间(例如至少两周)，为小鼠注射第二次剂量的与不完全弗氏佐剂混合的抗原以加强免疫。 
在第二次注射几周后，将小鼠尾部放血，通过针对放射标记的抗原进行免疫沉淀而滴定血清。在一些实施方案中，重复加强和滴定步骤直至达到合适效价。移出最高效价小鼠脾，并将脾用注射器均质获 得脾淋巴细胞。典型地，来自免疫小鼠的脾含有大约5×107至2×108个淋巴细胞。 
已知为骨髓瘤细胞的突变淋巴细胞得自实验动物，其中这种细胞已经通过许多熟知的方法诱导生长。骨髓瘤细胞缺少核苷酸生物合成的挽救途径。由于骨髓瘤细胞是肿瘤细胞，因此它们可以在组织培养中无限增殖，并因此称为无限增殖化。已经从小鼠和大鼠中建立了骨髓瘤细胞的许多培养细胞系，如鼠NS-1骨髓瘤细胞。 
将骨髓瘤细胞在适于促进融合的条件下与来自注射了本发明的抗原/多肽的小鼠或大鼠脾的正常抗体产生细胞组合。融合条件包括例如存在聚乙二醇。所得融合的细胞是杂交瘤细胞。与骨髓瘤细胞同样，杂交瘤细胞在培养物中无限生长。 
杂交瘤细胞通过在选择培养基如HAT培养基(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)中培养而与未融合的骨髓瘤细胞分离。未融合的骨髓瘤细胞缺少从挽救途径中合成核苷酸必需的酶，因为其在存在氨基蝶呤、氨甲蝶呤或者重氮丝氨酸的条件下被失活。未融合的淋巴细胞在组织培养物中也不持续生长。因此，只有成功融合的细胞(杂交瘤细胞)才可以在选择培养基中生长。 
每个存活的杂交瘤细胞均产生单一抗体。然后筛选这些细胞产生与本发明的抗原/多肽免疫反应的特异性抗体。单一细胞杂交瘤通过限制性稀释杂交瘤而分离。将杂交瘤系列稀释多次，在使得所述稀释物生长之后，测试上清中单克隆抗体的存在情况。然后将产生抗体的克隆大量培养以产生所需数量的本发明的抗体。 
通过使用本发明的单克隆抗体，可以将本发明的特异性多肽和多核苷酸识别作抗原，并因此鉴别。一旦鉴别，则那些多肽和多核苷酸可以通过如抗体亲和层析技术而分离和纯化。在抗体亲和层析技术中，将单克隆抗体与固体底物结合并暴露于含有所需抗原的溶液。通 过与结合抗体的免疫特异性反应从溶液中除去抗原。然后易于从底物中除去所述多肽或多核苷酸并纯化。 
H. 检测本发明的多核苷酸或多肽
另外，本发明提供了一种检测本发明的多肽的方法，其中所述方法包括将多肽与根据上述方法制备的抗体免疫反应以形成抗体-多肽缀合物，及检测所述缀合物。 
在一些实施方案中，本发明提供了一种检测编码本发明多肽的信使RNA转录物的方法，其中所述方法包括将所述信使RNA转录物与编码所述多肽的多核苷酸序列杂交形成双链体，及检测所述双链体。或者，本发明提供了一种检测编码本发明多肽的DNA分子的方法，其中所述方法包括将DNA分子与编码所述多肽的多核苷酸杂交形成双链体，及检测所述双链体。 
本文揭示的检测和筛选方法可用作预后工具。人CPSI编码多核苷酸以及其蛋白质产物可易于用于临床中作为预后指示剂，以在人中筛选对于高氨血症及对于其它遗传的CPSI相关疾病的易感性。 
本文揭示的检测和筛选方法也可以用作诊断方法的一部分。人CPSI编码多核苷酸以及其蛋白质产物可易于用于临床中以在人中诊断对于高氨血症及对于其它遗传的CPSI相关疾病的易感性。 
H.1. 本发明多肽的筛选分析
本发明提供了一种筛选生物学样品中CPSI多肽存在情况的方法。在一些实施方案中，CPSI多肽在尿素循环中具有活性，与抗CPSI抗体交叉反应，或者具有本发明的其它生物学活性。筛选的生物学样品可以是生物学体液如细胞外或者细胞内体液或者细胞或者组织提取液或匀浆。生物学样品也可以是分离的细胞(例如于培养物中)或者细胞集合如在组织样品或者组织学样品中。组织样品可以悬浮于液体培 养基中或者固定在固体支持物如显微镜载玻片上。特别期望的组织是肝组织。 
在一些实施方案中，提供了区分N1405 CPSI多肽和T1405 CPSI多肽的抗体。这种抗体可包含多克隆抗体，但在一些实施方案中包含如上所述制备的单克隆抗体。 
根据筛选分析方法，将生物学样品暴露于与要分析其存在情况的多肽免疫反应的抗体。典型地，暴露是通过在含有抗体和候选多肽的液体培养基中形成混合物而实现的。抗体或者具有所述多肽的样品可以固定在固体支持物上(例如柱或者微滴定平板)。 
将生物学样品在生物学反应条件下暴露于所述抗体并持续足够的时间以使得抗体—多肽缀合物形成。生物学反应条件包括离子成分和浓度、温度、pH等等。 
离子成分和浓度的范围是蒸馏水至2摩尔NaCl溶液。在一些实施方案中，重量摩尔渗透压浓度范围是大约100mosmols/l至大约400mosmols/l，在一些实施方案中为大约200mosmols/l至大约300mosmols/l。温度在一些实施方案中为大约4℃至大约100℃，在一些实施方案中为大约1 5℃至大约50℃，在一些实施方案中为大约25℃至大约40℃。pH在一些实施方案中为大约4.0-9.0，在一些实施方案中为大约6.5-8.5，在一些实施方案中为大约7.0-7.5。对生物学反应条件的唯一限制是选择使得抗体—多肽缀合形成的条件，及所述条件对所述抗体或多肽无不利影响。 
暴露时间随着使用的生物学条件、抗体和多肽的浓度及样品的性质(例如体液或者组织样品)而变化。确定暴露时间的方法为本领域技术人员所熟知。典型地，在样品是体液及样品中多肽的浓度为大约10 -10M的情况中，暴露时间为大约10分钟至大约200分钟。 
样品中多肽的存在通过检测抗体—多肽缀合物的形成及存在情况而检测。检测这种抗体—抗原(例如受体多肽)缀合物或者复合物 的方法为本领域所熟知，包括离心、亲和层析等、二级抗体与抗体—候选受体复合物的结合等方法。 
在一些实施方案中，检测是通过检测固定于抗体的指示剂而实现。例如熟知的这种指示剂包括放射性标记(例如32P、125I、14C)、另一种抗体或者酶如辣根过氧化物酶。将指示剂固定于抗体的方法为本领域所熟知。可利用商业试剂盒。 
H.2. 抗多肽抗体的筛选分析
另一方面，本发明提供了一种筛选生物学样品中与CPSI多肽免疫反应的抗体存在情况的方法。在一些实施方案中，CPSI多肽在尿素循环中具有活性，与抗CPSI抗体具有交叉反应性，或者具有本发明揭示的其它生物学活性。根据这种方法，将生物学样品在生物学条件下暴露于CPSI多肽，并持续足够的时间以使得抗体—多肽缀合物形成，并检测形成的缀合物。 
H.3. 编码本发明的CPSI多肽的多核苷酸的筛选分析
核酸分子、特别是探针分子可用作寡核苷酸探针以与怀疑编码本发明的CPSI多肽的核酸源杂交。最佳地，所述CPSI多肽在尿素循环中具有活性，与抗CPSI抗体具有交叉反应性，或者具有本发明揭示的其它生物学活性。所述探查通常是通过将所述寡核苷酸与怀疑具有CPSI基因的DNA源杂交而实现。在一些情况中，所述探针仅是一种单一探针，在其它情况中所述探针基于某一氨基酸序列或者多肽序列并考虑其由于遗传密码固有的冗余性而有的多样性而是探针集合。 
以这种方式探查的合适DNA源能表达本发明的多肽，并且可以是感兴趣细胞系的基因组文库。或者，DNA源包括感兴趣细胞系的全部DNA。一旦本发明的杂交方法鉴别了一个候选DNA节段，则证 实通过进一步杂交、限制酶作图、测序和/或表达及测试获得阳性克隆。 
或者，这种DNA分子可用于许多技术中，包括用作：(1)诊断工具以检测衍生自对象细胞的DNA中正常和异常的DNA序列，如本文所述的CPSI多态性；(2)检测和分离所述多肽家族的其它成员和潜在含有这种序列的DNA文库的相关多肽的工具；(3)与相关序列杂交以扩增这些序列的引物；(4)改变天然CPSI DNA序列的引物；以及用于依赖于DNA序列与本文揭示的那些DNA节段的相似性的其它技术中。 
如上所示，在某些方面，本发明提供的DNA序列信息可以制备与选择的CPSI基因编码序列特异性杂交的相对短的DNA(或RNA)序列(例如探针)。在这些方面，基于本发明多肽的编码序列制备合适长度的核酸探针。这种核酸探针与其它编码序列特异性杂交的能力使得其可特别用于多种实施方案中。最重要的是所述探针可用于许多分析中以检测给定样品中互补序列的存在。然而，所述探针还具有其它方面的应用，包括使用该序列信息制备突变物种引物，或者用于制备其它遗传构建体的引物。 
为了提供本发明的某些优势，用于杂交研究或者分析的代表性核酸序列包括探针序列，其与本发明的核酸序列(例如SEQ ID NO：1、3、11和13任一所示序列)的至少14-40个或者这样长的一段核苷酸序列互补。长度为至少14个核苷酸的大小有助于保证该片段足够长以形成既稳定又具有选择性的双链体分子。在一些实施方案中可使用具有长度为14个碱基以上的互补序列的分子，以提高杂种的稳定性和选择性，从而改良获得的特异性杂种分子的性质和程度。在一些实施方案中，可以应用具有14-20个核苷酸或者更长的基因互补序列的核酸分子。这种片段可易于制备，例如通过化学方法直接合成该片段、通 过应用核酸再生技术如美国专利No.4,683,202所述的PCR技术、或者通过将选择的序列导入重组载体中重组产生。 
因此，本发明的核苷酸序列具有与所述基因的互补序列选择性形成双链体分子的能力，故可用于本发明。根据预期的应用，可以利用不同的杂交条件以达到探针对于靶序列的不同程度选择性。对于需要高度选择性的应用，典型地应用相对严格的条件以形成杂种。例如，选择相对低的盐浓度和/或高温条件，如0.02M-0.15M盐浓度和大约50-70℃的温度，特别是大约55℃、大约60℃和大约65℃的温度。这种条件是特别选择性的，并且几乎不耐受探针和模板或者靶链之间的错配(如果有)。 
当然，对于一些应用而言，例如希望应用与基本模板杂交的突变引物链制备突变体的情况中，或者在试图从相关物种、功能等价物等中分离多肽编码序列的情况中，典型需要较低严格杂交条件，以使得异源双链体形成。在这种情况中，应用的条件例如是0.15M-0.9M盐浓度，温度为大约20℃至大约55℃，特别是大约25℃、大约37℃、大约45℃及大约50℃。交叉杂交物种可因此易于鉴别为就对照杂交而言是阳性杂交信号。在任何情况中，通常意识到所述条件可以通过加入增加量的甲酰胺而使其更加严格，其使得杂种双链体以如升高温度同样的方式去稳定。因此，杂交条件可易于操纵，并因此通常根据所需结果加以选择。 
在一些实施方案中，应用组合适当手段如标记的本发明的核酸序列确定杂交是有利的。本领域已知众多的适当的指示剂手段，包括放射性标记、酶标记或其它配体，如抗生物素蛋白/生物素，其能提供可检测的信号。在一些实施方案中，可以应用酶标记，如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶，代替放射性或者其它不合环境需要的试剂。在酶标记的情况中，已知量热指示剂底物可用于提供人肉眼或者分光光度法可观测到的手段，以鉴别与含有互补核酸的样品的特异性杂交。 
通常，预期本文所述的杂交探针可在溶液杂交中作为试剂，在一些实施方案中也可以应用固相。在包含固相的一些实施方案中，含有测试DNA(或RNA)的样品附着于或另外固定于选择的基质或表面上。然后将这个固定的、单链核酸与选择的探针在所需条件下进行特异性杂交。选择的条件依赖于特定的环境，基于特定的需要标准(例如依赖于G+C含量、靶核酸类型、核酸来源、杂交探针大小等等)。在洗涤杂交表面以除去非特异性结合的探针分子之后，检测特异性杂交，或者利用标记进行量化。 
H.4. 分析试剂盒
另一方面，本发明提供了一种诊断试剂盒以检测生物学样品中本发明多肽的存在，其中所述试剂盒包含第一个容器，其含有能与所述多肽免疫反应的第一种抗体，所述第一种抗体的量足以进行至少一次分析。在一些实施方案中，本发明的分析试剂盒进一步包含第二个容器，其含有与第一种抗体免疫反应的第二种抗体。在一些实施方案中，本发明的分析试剂盒中使用的抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，第一种抗体固定于固体支持物上。在一些实施方案中，所述第一种和第二种抗体包含一种指示剂，及在一些实施方案中，所示指示剂是一种放射性标记或者酶。 
本发明还提供了一种诊断试剂盒以筛选制剂。这种试剂盒含有本发明的多肽。所述试剂盒可含有检测制剂与本发明的受体之间相互作用的试剂。提供的试剂可以是放射性标记的。所述试剂盒可含有能结合或者与本发明的受体相互作用的一种已知放射性标记的制剂。 
另一方面，本发明提供了检测生物学样品中编码本发明多肽的多核苷酸的存在的诊断分析试剂盒，所述试剂盒包含第一个容器，在一些实施方案中其含有与SEQ ID NO：1、3、11和13任一所示序列的至少10个连续核苷酸碱基的节段相同或互补的第二种多核苷酸。 
在一些实施方案中，本发明提供了检测生物学样品中与本发明多肽免疫反应的抗体的存在的诊断分析试剂盒，所述试剂盒包含第一个容器，其中含有与所述抗体免疫反应的CPSI多肽，所述多肽的量足以进行至少一次分析。在一些实施方案中，所述CPSI多肽在尿素循环中具有活性，与抗CPSI抗体具有交叉反应性，或者具有本发明揭示的其它生物学活性。所述试剂盒的试剂可以是液体溶液形式、附着于固体支持物或者是干燥的粉末形式。在一些实施方案中，当所述试剂是液体溶液形式时，所述液体溶液是含水溶液。在一些实施方案中，当所述试剂附着于固体支持物时，所述固体支持物可以是层析介质或者显微镜载玻片。当所述试剂是干燥的粉末时，所述粉末可以通过加入合适的溶剂而重建的(reconstituted)。可以提供所述溶剂。 
实施例
如下实施例例证了本发明的代表模式。如下实施例的某些方面描述了本发明的技术和方法以更好地实践本发明。这些实施例通过使用本发明人的标准实验室操作得以例证。根据本发明的揭示及本领域的技术水平，技术人员意识到如下实施例只是例证了本发明，在不偏离本发明精神和范围的前提下可对本发明进行各种变化、修改和改变。 
实施例1-3中使用的材料和方法
如下材料和方法用于实施例1-3中。在每个实施例中还描述了另外的材料和方法。 
临床/患者募集：在Vanderbilt University Medical Center，Nashville，Tennessee进行BMT的200多名患者登记在BMT-Lung InjuryFollowing Engraftment(LIFE)研究中，以研究移植后急性肺损伤和多脏器衰竭的机制。从经历BMT或者PBSCT治疗恶性肿瘤的患者中得到同意。脏器衰竭(包括HVOD)及逆转的定义是预先确定的，在住 院治疗期间同时收集数据。在进行研究登记时(接受化疗之前)及在完成烧蚀化疗—放疗(ablative chemo-radiotherapy)之后进行移植当天(在灌注骨髓之前)收集血浆、细胞沉淀和尿液。 
氨基酸分析：在收集血液和尿液后将其立即离心。所有样品均置于冰上，然后在—70℃贮存直至进行分析。在这些贮存条件下，已知谷氨酰胺、半胱氨酸和高半胱氨酸减少，因此这些氨基酸不用于分析中。血浆氨基酸在Vanderbilt Diagnostic Laboratories，VanderbiltUniversity，Nashville，Tennessee测定。简而言之，血浆的无蛋白质提取物通过使用磺基水杨酸沉淀蛋白质及经过0.45μm ACRODISCTM 4滤膜(Gelman Sciences，Ann Arbor，Michigan)过滤而制备。氨基酸通过阳离子交换层析使用4-成分(four-component)ph-和离子强度-梯度的柠檬酸锂缓冲系统于Beckmann 7300氨基酸分析仪(Beckmann，Palo Alto，California)上分离。氨基酸与茚三酮的柱后衍生化可以在570nm检测伯胺氨基酸，在440nm检测仲胺。通过标准参考物质设备标准进行量化(Sigma，St.Louis，Missouri)。 
统计学：血浆氨基酸值以平均值±SEM表示。基线与化疗后氨基酸值之间的对比使用Student’s t-Test进行。使用卡方分析(Chi squareanalysis)对比有和无HVOD患者之间的等位基因出现频率。 
患者：患者是从在Vanderbilt University的BMT Lift研究中登记的那些患者中确定的。从移植前血液或离心尿液样品中分离DNA。HVOD状态使用Baltimore标准确定： 
-胆红素>2.0 mg/dl 
-肝肿大 
-2％突然体重增加 
基因定型：使用QIAMPTM血液试剂盒(Qiagen)分离DNA。如下所示，T1405N多态性改变DNA序列： 
CCT-GCC-ACC-CCA-GTG    正常 
CCT-GCC-AAC-CCA-GTG    改变 
C颠换为A是嘌呤A置换嘧啶C，这样破坏了Msl1位点。使用CPSI的第35内含子中的引物和CPSI基因的外显子36的外来引物通过PCR扩增了包括含有所述改变的区域的387bp片段。这种组合提供了有力的扩增。PCR Ready-to-GoTM珠也用于扩增中(Pharmacia)。 
使用非变性凝胶，利用通过C颠换为A产生的二级结构检测多态性。这种改变产生足够的二级结构以防止限制酶(Msl I)的可信消化以检测多态性。这种改变还干扰直接的序列分析，除非在反应中用ITP代替GTP。非变性凝胶利用通过这种改变产生的二级结构。通过这种方法和序列分析对比15个个体。 
为了检测凝胶中的DNA片段，采用银染技术。这种便宜的快速方法可以在电泳后立刻观测条带。 
统计学分析：获得足够的样品大小以对结果进行卡方分析。使用Hardy-Weinburg等式计算基因型的预期频率(p2+2pq+q2)。从标准卡方表中使用2度自由度获得P值。 
实施例1
在有或无HVOD的情况中CPSI外显子多态性(T1405N)的等位基因不在Hardy-Weinburg平衡中
根据本发明，已经鉴别了在CPSI mRNA的3’末端附近的共同多态性(大约.44杂合性)。对这种改变进行的序列分析表明在4340位碱基C颠换为A将三联体密码子ACC改变为AAC。这样导致了第1405位氨基酸由天冬酰胺取代苏氨酸(在本文称作T1405N)。苏氨酸在变构结构域中，在特征序列PV(A/S)WP(T/S)(A/Q)E之前，所述特征序列对于辅因子n-乙酰-谷氨酸(NAG)的结合是重要的。 
在所有已知的由NAG激活的CPSI中，苏氨酸残基在特征序列之前的两个残基之中(Rubio，Biochemical Society Transactions 21： 198-202(1998))。基于结构—功能研究，感觉与NAG的乙酰氨基基团的羰基氧形成的氢键在这种激活物的结合中起作用(Stapleton et al.，Biochemistry 35：14352-14361(1996)；Javid-Majd et al.，Biochemistry 35：14362-14369(1996))。预期天冬酰胺对苏氨酸侧链的取代改变与NAG形成氢键，导致CPSI酶功能及对NAG可利用集合的敏感性在性质上的改变。尽管申请人不希望受到任何特定实施理论的约束，基于其它异生素作用的先例，在逐步增高剂量化疗之后NAG的有限可利用性是促进尿素循环功能失调的机制之一。 
从BMT Life Study研究组中对126个个体确定基因型。这个组中30个个体出现HVOD迹象(24％)。70名患者通过血液样品确定基因型，56名患者通过尿液细胞沉淀中确定基因型。将15名患者的样品通过PCR再次扩增及测序，以证实结果的一致性。 
表2和3示出了HVOD+和HVOD-患者之间T1405N多态性的基因型分析结果。C等位基因，在本文也称作CPSIa等位基因或者苏氨酸编码等位基因，在检测的群体中的出现频率为0.62；A等位基因，在本文也称作CPSIb等位基因或者天冬酰胺编码等位基因，出现频率为0.38。该表的卡方值为4.3(P＝0.1)，表明多态性在存在HVOD的情况中可能不在Hardy-Weinburg平衡中。因此，这些结果提供了具有HVOD的BMT患者中T1405N等位基因分布的不平衡迹象，表明所述多态性可用于鉴别对BMT毒性易感的对象。 
表2
基因型          HVOD+                  HVOD- 
CC           13(预期11.4)           32(预期36.5) 
AC           16(预期14.1)           50(预期45.1) 
AA           1(预期4.5)             14(预期14.4) 
表3
全部等位基因    预期频率： 
   A：96        AA：0.1 5 
   C：62        AC：0.47 
                CC：0.38 
从对大约200名患者进行的研究中收集的另外的数据提供了另外的统计学证据，支持了可以使用多态性检测对亚最佳尿素循环功能的易感性。将这个数据进行上述统计学方法分析。 
骨髓移植物毒性导致明显的发病率和死亡率。HVOD与BMT患者预后不佳相关。进行这项研究以评定CPSI酶与HVOD的发生之间的联系。T1405N多态性影响CPSI功能。其在群体中的广泛分布提示这两种形式在正常条件下均提供足够的尿素循环功能。加入代谢应激物(如高剂量化疗)以使CPSI效力降低于有效阈值之下。因此数据分析提示HVOD更可能出现在具有苏氨酸而不是天冬酰胺编码等位基因的患者中。苏氨酸编码等位基因是啮齿动物CPSI形式共有的。 
实施例2
骨髓移植后并发症患者中氨甲酰磷酸合成酶I的生物化学和遗传改变
骨髓移植(BMT)和外周血干细胞移植(PBSCT)越来越多地用作治疗经选择的恶性肿瘤的主要治疗方法。干细胞的使用支持造血重建，可以实质增加化疗剂量以尝试根除潜在的致死癌症。尽管感染的预防和移植物抗宿主病的预防均有改观，但化疗诱导的脏器障碍仍是这种治疗方法更广泛应用的明显障碍。 
肝静脉梗阻症(HVOD)，一种在BMT后早期出现高胆红素血症(血清胆红素>2.0 mg/dL)、肝肿大及体液滞留(fluid retention)的临床综合征是在BMT后一种主要的剂量限制毒性，使得接近54％的患者处于痛苦之中。许多患者在BMT后产生HVOD也符合急性肺损伤(ALI) 的标准。接近一半的具有严重HVOD的患者需要机械性换气，护理死亡率(attendant mortality)超过90％。这种数据强调了对相继的脏器障碍、甚至在年轻患者群中引起的死亡率的重大影响，并且强化了患者急性肺损伤后预后不佳与肝功能损害之间的临床重要联系。造成这种器官相互作用的机制还不完全了解。 
在这个实施例中，分析了在BMT之前施用的条件化化疗是否可以影响UC中的早期酶及其次使患者倾向于肝功能损害和多脏器衰竭。血浆氨基酸分析支持了受损的UC功能和降低的一氧化氮(NOx)产生的观点。根据这些发现，筛选患者本发明揭示的CPSI中的外显子单核苷酸多态性(SNP)。发现SNP纯合性与BMT后HVOD降低及早期存活力增强相关，与明显的药物遗传学相互作用一致。 
方法
临床/患者募集：在过去的三年里，将200名在Vanderbilt UniversityMedical Center接受BMT的患者相继登记在Marrow Transplant-LungInjury Following Engraftment (BMT-LIFE)研究中，这项研究是针对于了解移植后急性肺损伤和多脏器衰竭机制的一种临床—生物化学配合研究。关于脏器衰竭和逆转的定义如预先所定义，在住院期间和直至BMT后60天同时收集数据。除外标准包括活性病毒和先前增加剂量的造血干细胞支持治疗(PBSCT或BMT)。 
肝静脉梗阻症(HVOD)在移植后21天之前胆红素>2mg/dL的患者中鉴别，相对于基线患者体重增加>5％或者新发生轻度肝肿大。急性肺损伤(ALI)定义为在无临床心脏功能障碍的情况中，连续3天在胸部X射线发现双侧浸润，并且动脉血中氧分压与吸入的氧浓度分数的比率(PaO2/FiO2)低于300。在移植后存活60天的患者定义为存活者。在登记研究时(接受化疗之前)和在BMT当天及在完成高剂量化疗后 几天但在骨髓灌注之前收集血浆、循环细胞沉淀和尿液。将样品等分，立即置于冰上，之后在—80℃贮存直至进行分析。 
氨基酸分析：对60名患者的在前8天和0天(处理前和移植当天)的冷藏血浆样品进行氨基酸分析。首先随机选择患者样品进行试验性研究；随后特异富集分析样品以包括额外的具有CPS-I的SNP AA基因型的患者(如下所示)及额外的具有BMT后HVOD和ALI并发症的患者。无蛋白质的血浆提取物通过用磺基水杨酸进行蛋白质沉淀及通过0.45μm Acrodisc 4(Gelman Sciences，Ann Arbor，Michigan)过滤而制备。 
氨基酸通过阳离子交换层析分离，使用4-成分pH-和离子强度-梯度的柠檬酸锂缓冲系统在Beckmann 7300氨基酸分析仪(Beckmann，Palo Alto，California)上进行。与茚三酮的氨基酸柱后衍生化可以在570nm检测伯胺及在440nm检测仲胺氨基酸。通过标准参考物质的设备标准进行量化(Sigma，St.Louis，Missouri)。瓜氨酸、精氨酸和鸟氨酸作为尿素循环中间体的流量的可测定指数。 
血浆一氧化氮代谢物(NOx)的测定：在对样品进行去蛋白质及与镉珠保温以将硝酸盐转变为亚硝酸盐之后，在患者小组中使用修改的Griess试剂测定血浆NOx。 
T1405N多态性的检测：CPSI的第36外显子寡核苷酸引物(CGGAAGCCACATCAGACTGG(SEQ ID NO：15)和内含子寡核苷酸引物(GGAGAGTGAAACTTGACAATCATC(SEQ ID NO：16))及聚合酶链式反应(PCR)可靠地扩增一个251bp的片段，该片段包括含有得自淡黄色层制品(buffycoat preparation)或者尿液沉淀物的基因组DNA改变的区域。这种引物组合提供了可再生的扩增，使用PCRReady-to-Go珠(Pharmacia)进行，PCR循环条件如下：35次循环：55℃1分钟退火，72℃1分钟延伸，及94℃1分钟变性。 
在经甲酰胺处理后，将样品在4℃在非变性MDETM凝胶(FMC，Rockland，Maine)中电泳4小时，然后用硝酸银染色以检测DNA片段。使用非变性凝胶电泳和直接序列分析，对17个个体确定基因型产生相同的结果。将患者分类为具有纯合SNP基因型CC或AA，或者是杂合基因型(AC)。为对比，使用相同方法分析一群100名阿尔茨海默氏病患者以评估CPSI SNP基因型的分布。 
统计学分析：使用Student’s T-test或者Wilcoxon’s Rank SumTest(如果数据非正态分布)比较在化疗之前和之后的血浆氨基酸水平及患者组间的水平。通过使用P2分析计算所有组的等位基因频率及搜索特别选择的组中Hardy-Weinberg不均衡迹象，对比组间的CPSI基因型的分布。敏感性、特异性、推测值及相对危险估定从使用通过特异性临床结果(例如HVOD、ALI和死亡)的存在与否而分开的患者组中特异的氨基酸数值构建的2*2列联表(two-by-two contingency table)中产生。 
结果
BMT-LIFE研究中登记了200名患者。52％的患者经历自体移植(平均年龄46+1岁)；48％的患者接受同种异体移植(平均年龄40+1岁)。经历同种异体移植的患者中24％接受HLA匹配的不相关供体的移植物。自体移植组中接近2/3的患者是女性，反映出这个群体中乳腺癌流行增加。移植迹象是多样的，但79％的患者是由于乳腺癌、白血病或者非何杰金氏淋巴瘤而进行移植。在BMT之前使用的不同准备方案包括CTC(环磷酰胺、三胺硫磷、碳铂)、BuCy(白消安、环磷酰胺)、CVP16TBI(环磷酰胺、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷、整体放射)、CBVP16(环磷酰胺、亚硝脲氮芥、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷)和TC(三胺硫磷、环磷酰胺)。 
在BMT后，发病率和死亡率均非同寻常。这项研究中全部60天死亡率为14％，接受同种异体移植的患者中是20％。并发症急性肺损伤(ALI)和肝静脉梗阻症(HVOD)均在19％的患者中发生。这些并发症是接受同种异体移植的患者中发生的2倍以上。在发生HVOD的患者组中，62％(24/38)的患者在住院期间也符合ALI标准。出现ALI的患者中只有38％(14/38)从未符合HVOD标准。 
对具有CPS-I AA SNP基因型的额外患者及具有移植后并发症的额外患者在选择样品期间特别聚集的一小组患者(60/200)，在施用化疗之前及在移植当天确定血浆氨基酸。参与UC(瓜氨酸、鸟氨酸和精氨酸)的选择的氨基酸水平的对比在化疗之前和之后表明显著差异。瓜氨酸水平在所有患者中均降低，平均从23.4+1.3μM降至9.1+0.7μM(P<0.05)。精氨酸水平提高大约35％(P<0.05)，鸟氨酸水平提高21％(P<0.05)。 
鸟氨酸/瓜氨酸的比率(O/C比率)、UC早期步骤的流量指数(即较低数值表示较好的循环流量)从研究登记时的3.9+0.7提高至诱导化疗后的11.8+1.8(P<0.05)。也在不是UC的一部分的氨基酸中发生转变。甘氨酸和丙氨酸这两种脂肪族氨基酸分别显著降低11％和19％，这与仅仅是由于蛋白质摄取(急性或慢性)减少而导致的循环中间体流量降低是不一致的。苯丙氨酸和甲硫氨酸水平分别提高43％和23％，提示亚临床肝功能损伤。 
瓜氨酸的基线血浆水平和O/C比率具有预后重要性。BMT的60天存活者与未存活者相比具有较高的瓜氨酸基线水平(24.4+1.3对17.7+2.9μM，P<0.05)。登记时瓜氨酸水平低于20的患者在BMT后60天之前死亡的相对危险性为2.92。血浆瓜氨酸水平高于20μM的死亡阴性预测值为90％。在登记时O/C比率显著较低的患者当与随后产生这些并发症的患者(分别为5.8+1.9和6.5+2.7，P<0.05)相比时，从不发生HVOD(2.8+0.2)或者ALI(2.9+0.2)。对比在研究登记时BMT的60天 存活者和非存活者之间的O/C比率示出存活者中数值较低的倾向(3.3+0.2对6.9+3.9；P＝0.06)。基线O/C比率低于2.5的BMT后60天中死亡的阴性预测值为92％。 
一些尿素循环氨基酸中间体水平在准备治疗后、在BMT当天也有重要性。血浆精氨酸水平在存活者(114.5+5.9 μM)中高于未存活者(92.3+10.4μM)(P<0.05)。在与从未发生严重肺功能障碍的那些患者相比较晚发生ALI(18.4+5.9对9.5+0.7；P<0.05)的患者中，O/C比率显著较高，提示更受损的UCF。尽管化疗后O/C比率低于10产生ALI的阴性预测值高(86％)，但是与这个阈值相关的死亡率的相对危险仅为1.44。在随后产生HVOD的患者中，在BMT当天患者的O/C比率倾向于更高(P＝0.09)。 
在62名患者中测定血浆中一氧化氮代谢物(NOx)的水平。血浆NOx水平在诱导治疗后降低20％，从研究登记时的40±2μM至BMT当天的32±2μM(P<0.05)。在产生HVOD或ALI的20名患者中在BMT当天NOx中位数为28μM；没有这种并发症的患者的血浆NOx为35μM。当对比不同CPSI SNP基因型的患者时，血浆NOx之间无明显差异。 
为了评定某些患者在进行诱导治疗和BMT后是否具有产生疾病并发症的遗传倾向，对研究的所有患者均针对CPSI SNP确定基因型。在200名患者中，分析了196名患者(即2名患者临床排除，2名患者未成功PCR扩增)的数据，以确定CPS-I C4340A SNP是否在HVOD产生的Hardy-Weinberg平衡中。CPSI SNP基因型在经历BMT的患者中的分布与对照组(患有阿尔茨海默氏病的100名患者)相同：44％CC(野生型)、45％AC(杂合的)及11％AA(纯合颠换)。具有CC或者AC基因型的那些患者中HVOD的发生率分别为18％和24％。在具有AA基因型的患者中无HVOD情况。 
发现这种等位基因分布不在HVOD发生的Hardy-Weinburg平衡中(P2＝5.06，P<0.05)，提示SNP AA基因型改变了在诱导化疗后对于 肝毒性的易感性。在SNP基因型之间在BMT后60天死亡率也趋于不同。AC和CC基因型组分别有15％和20％的未存活者。令人感兴趣地，所有AA基因型患者在BMT后60天均存活(P2＝3.36；P＝0.06)。注意，几乎所有P2分值均来自AA/存活者细胞。具有不同SNP C4340A基因型的患者中在ALI发生率方面无显著差异(在AA、AC和CC组中分别为16％、15％和25％)。尽管在AC或者CC基因型患者中，ALI与显著死亡率相关(分别为71％和66％)，但所有产生ALI的AA基因型患者的CXR上的双侧肺侵润和削弱的气体交换最终均缓解，及在BMT后存活60天。 
讨论
这个实施例中的数据反映了BMT后患者中HVOD和ALI之间的密切关联，接近2/3的HVOD患者符合ALI标准。在这项研究中，68％(26/38)的产生ALI的患者需要机械性换气。Rubenfelt和Crawford已经报道了有意义的存活，阐述了拔管后出院存活30天，只有6％的患者在BMT后需要机械性换气。见Rubenfeld，G.D.and Crawford，S.W.，Annals ofInternal Medicine(1996)125：625-33所述。 
HVOD是逐步增加剂量化疗的主要剂量限制毒性。其临床特征在于在BMT后3周内发生的体液滞留、黄疸、腹水和疼痛性肝肿大。对那些未存活的患者进行尸检研究证实这些临床标准，在>80％的情况中提供了组织学确认，并且与增强的局部血栓形成也许是HVOD发病机理的始发事件的观点一致。 
经历BMT的患者中瓜氨酸水平显著降低及血浆鸟氨酸水平升高，这一点提示在诱导化疗后的患者中经过肝UC的碳中间体的流量存在明显紊乱。对其它氨基酸模式进行分析论证了这种作用不单纯是由于蛋白质摄取降低所致。与在饥饿患者中观测到的甘氨酸和支链氨基酸(BCAA)水平通常明显升高的模式相反，我们观测到甘氨酸降低， BCAA水平无显著变化。另外，饥饿趋于增加肝脏中CPSI活性，不应引起血浆鸟氨酸增加。 
经历BMT的患者治疗前保持UC中间体流的能力对预后具有特别重要的意义。在BMT后60天未存活者及那些产生HVOD或者ALI的患者与未产生这些并发症的患者相比具有显著较低水平的瓜氨酸及较高的O/C比率。令人感兴趣的是观测到在诱导治疗后，与存活患者相比，BMT的未存活者具有较低水平的血浆精氨酸。根据末端肝小静脉附近含有早期UC酶的细胞簇，精氨酸和一氧化氮(NO)的局部浓度可以更高并且在保持这些血管开放和调节区域性肝血流中起重要作用。示出在诱导化疗后血浆NOx水平显著降低的研究支持了在BMT期间NO产生被改变的观点。 
在移植当天精氨酸的明显正常血浆水平与明显降低的血浆NOx 之间的明显差异强调了精氨酸和瓜氨酸流经不同器官床(organ bed)的体内动力学的复杂性。对整体精氨酸稳态的稳定同位素研究表明仅大约15％的血浆精氨酸转换与尿素形成相关，仅1.2％的血浆精氨酸转换与NO形成相关。另外，体外研究论证了尿素循环中间体从瓜氨酸至精氨酸的实际流通，其不受外源提供底物的影响。在诱导化疗刺激期间各个患者保持尿素循环功能及肝NO产生的能力可部分影响其对BMT后并发症的抗性。 
由于在HVOD的发生中无性别差异，我们专注于常染色体编码基因，CPSI相关的潜在药物遗传学问题，而不是X-连锁的鸟氨酸转氨甲酰酶基因。当鉴别导致新生儿和晚期发作的CPSI缺陷的分子学改变时，鉴别了CPSI mRNA(0.44杂合性)的3’末端附近的一个共有SNP。这个C4340A颠换编码在第1405位氨基酸一个预定的天冬酰胺(AAC)取代苏氨酸(ACC)(T1405N)。这个苏氨酸在变构结构域中，在结合增加酶活性的辅因子n-乙酰-谷氨酸(NAG)中是重要的序列PV(A/S)WP(T/S)(A/Q)E之前。尽管申请人不希望受到任何特定运行理 论的约束，基于其它异生素作用的先例，推测在逐步提高剂量的化疗之后NAG有限的可利用性是促进尿素循环功能失调的机制之一。虽然如此，看起来CPS-I SNP AA基因型的存在与针对HVOD产生的保护作用相关，解决了如果发生ALI的问题，并且改良了在BMT后60天存活力。因此，数据提示UC功能的改变在败血症和急性肺损伤期间修饰肝—肺相互作用中起作用。 
概括而言，这个实施例论证了在BMT之前接受逐步增高剂量的化疗的患者中肝UC功能明显损害。循环功能更严重扰乱的患者在BMT后更可能产生疾病并发症。另外，已经发现了CPS-I C4340A SNP与BMT后并发症和短期存活力之间的明显关联。这种数据用于评估患者进行BMT的危险性，并提供了一种试图在高剂量化疗期间支持UC功能的治疗的基本原理。 
实施例3
精氨酸/瓜氨酸补充治疗
得自多态性的尿素循环产物(精氨酸和瓜氨酸)减少及前体(氨、谷氨酰胺等等)增加有助于BMT相关毒性。作为BMT Life研究的一部分，在经历BMT的10名患者中测定瓜氨酸和精氨酸水平。 
用于BMT中的高剂量化疗破坏了尿素循环酶的正常功能，并且导致HVOD发生或者与之相关的毒性。为了进一步评价这种信息，对经历BMT的10名患者在治疗之前和完成诱导化疗之后的贮存的血浆进行分析。从所有样品中确定氨基酸图谱(profile)。特别注意尿素循环中间体瓜氨酸、精氨酸和鸟氨酸。如表4所示，所有患者的瓜氨酸水平均从处理前的基线平均值24±3μmol/L明显降低至治疗后平均值8±1μmol./L(P<0.00 1)。血浆精氨酸水平从平均值91±6μmol./L降低至70±6μmol./L(P<0.05)，尽管在一些患者中使用了含有精氨酸的胃肠外营养物： 
表4
氨基酸    化疗前.      化疗后      P值 
瓜氨酸    24±3μM     8±1μM     <0.001 
精氨酸    91±6μM     70±6μM    0.03 
瓜氨酸和精氨酸的降低在接受和未接受全部胃肠外营养物的患者中是相似的，在男性和女性中是相同的。瓜氨酸的降低提示尿素循环第一个步骤的流量降低(图1)。 
因此，本发明提供了一种降低经历BMT的患者中HVOD毒性和/或发生的方法。这种方法包括给BMT患者施用有效量的精氨酸和/或瓜氨酸，在一些实施方案中施用瓜氨酸，以支持患者中精氨酸和NO合成。支持患者中精氨酸和NO合成降低和/或基本上预防与BMT相关的HVOD的发生。瓜氨酸是更容易转变为NO的一种示例性补充剂。 
实施例4
功能性全长CPSI表达克隆的构建
在尝试许多策略后，构建了含有完整编码区的人CPSI cDNA表达克隆。图6和7示出用于构建所述表达克隆的示意图。这个克隆已经被完全测序，不含有本领域已经鉴别的共有CPSI序列的任何改变。 
在COS-7细胞中测试所述克隆产生CPSI蛋白质的能力。选择没有天然CPSI活性或者产生的COS-7细胞。对用flCPSI-PCDNA3.1构建体转染的COS-7细胞进行Western印迹分析。HepG2细胞提取物用作对照，因为这些衍生自肝脏的细胞保留CPSI活性。未转染的COS-7细胞用作阴性对照。与未转染的COS-7细胞不同，使用兔抗大鼠CPSI抗体证实了HepG2和COS-7-flCPSI细胞具有预期的160kD条带。另外，进行比色分析以检测从氨中氨甲酰磷酸盐的产生。如图8所示，表明转 染的细胞具有与HepG2细胞相似的活性，而未转染的COS-7细胞则没有。 
对含有CPSI插入体的T1405进行定点诱变，产生具有N1405多态性密码子的拷贝。对N1405多态性密码子全长测序，未检测到其它改变。QUIKCHANGETM(Stratagene)系统利用通过宿主细菌在DNA中导入甲基化，使用该系统制备这个构建体。 
这些构建体用于稳定提供这两种等位基因(T1405，N1405)编码的重组CPSI蛋白质，使用COS细胞和各自的CPSI/PC DNA 3.1构建体作为表达系统。使用这个系统产生酶活性的CPSI，如图8所示。 
这些实验用于确定T1405N多态性对于CPSI功能的体外作用。如实施例1和2所述，这种改变影响酶对于NAG浓度的敏感性。对20个个体针对C-A变化进行筛选示出50％的杂合性及组25％是纯合AA。这提示大部分一般群体在CPSI功能方面具有潜在性质异常性。这种异常性在正常条件下沉默，通过应激条件和毒素如高剂量化疗或者施用丙戊酸而揭示。 
然后分阶段进行蛋白质产物对比。第一阶段检验表达的mRNA和蛋白质的物理特性。使用flCPSI插入体作为探针，对从表达的COS-7细胞系中制备的信息进行Northern印迹探查。阳性对照包括HepG2和人肝脏信息。阴性对照使用空白盒pcDNA3.1转染的COS-7细胞。表达的flCPSI衍生的信息有时小于天然CPSI(4.9kb对5.7kb)，因为该克隆不含有1kb的3’未翻译区。 
使用相同对照，通过SDS-PAGE对细胞裂解物进行Western印迹分析。使用考马斯蓝染色以检测全部的蛋白质产生。对于特异性CPSI检测，使用多克隆兔抗大鼠CPSI抗体。这个抗体检测从COS-7细胞以及对照样本中表达的CPSI。最后，蛋白质结构中的变化通过2-D电泳检测迁移率模式而确定，所述2-D电泳是检测构象变化的一种有用工具。构象中任何大的变化可以解释由于突变而改变的CPSI功能。 
下一阶段包括测定表达的酶的功能特征。为此对一种敏感性比色分析进行修改(Pierson，D.L.，J.Biochem.Biophys.Methods，3：31-37(1980))。经修改的分析方法可以分析来自20-50mg组织或细胞的4-5种分析物。首先将组织在0.75M KCl中均质化。通过SEPHADEXTM G25柱(Boehringer)除去小分子，包括ATP和NAG。所述反应混合物含有碳酸氢铵、ATP、镁DTT、n-乙酰谷氨酸(NAG)和三乙醇胺。任何试剂的浓度均可以变化，对HepG2细胞进行的实验示出低和高浓度的NAG (0.50 mM)均降低活性。初步的COS-7细胞表达实验中没有NAG不产生可测量的酶活性。 
由于CPSI是一种变构酶，因此其在变化的NAG浓度下不符合米-曼动力学；然而当NAG的量是固定的，则氨甲酰磷酸盐的产生是稳定的。如图8所示，氨甲酰磷酸盐的产生通过向溶液中加入羟胺在37℃保温不同时间(0、5、10、20、25、30分钟)后测定。这个步骤在95℃进行，也可以使所述酶失活及防止氨甲酰磷酸盐的进一步产生。羟胺将氨甲酰磷酸盐转变为羟基脲，随后用具有丁二酮的硫酸/乙酸溶液处理以产生在458nm具有峰吸收的化合物。然后将反应在12,000×g离心15分钟以除去沉淀的蛋白质。接下来，测定每个反应的458nm吸收。在反应20-30分钟后，活性典型开始降低。 
集合许多表达细胞沉淀以进行分析。为保证活性测定基于一致量的酶，将表达的CPSI通过对集合样本进行Western印迹分析而量化，使用CPSI抗体如上述兔抗大鼠CPSI抗体。首先使用固定量的底物和辅因子及时程分析测定基本活性。然后使用不同量的碳酸氢铵、ATP和NAG确定这些元件的结合效力。这些元件在正常量的0-10倍之间变化。在对匀浆进行热处理后也测定酶活性。进行蛋白质标记(脉冲追踪)实验以确定蛋白质随时间的稳定性。 
使用上述方法获得稳定的CPSI蛋白质表达。稳定转染的细胞系的确立可以产生足够量的两种CPSI变体以进行这些研究。在活性研究 中，注意到与T1405类型CPSI相比较的N1405活性中的改变。也注意到不同浓度的NAG下酶活性的改变。这些结果支持了本发明揭示的多态性在预测对于亚最佳尿素循环功能和与之相关的高氨血症的易感性及降低的精氨酸产生中的作用。 
实施例5
T1405N多态性和尿素循环中间体与在丙戊酸治疗的患患者中观测到的
氨增高之间的关系
丙戊酸(VPA)是一种常用的癫痫药物，特别用于治疗癫痫小发作或者作为其它癫痫疾病的辅助治疗。VPA治疗的毒性是一种复杂的多变量过程，可能反映出一些代谢破坏。高血氨症和肝微泡脂肪变性(hepatic micro-vesicular steatosis)和坏死是最常报道的严重并发症。 
尽管毒性高血氨症的产生仅涉及少数患者，但是其导致显著的发病率和死亡率，一些死亡规因于这种并发症。然而，相对常见的是无症状高氨血症(血浆氨水平高于60μmol/L)产生在施用VPA后1小时内。 
VPA诱导的高氨血症的机制：VPA导致高氨血症的机制有一些争论，在本领域中有许多不同的理论。肾脏模型提出谷氨酰胺代谢的变化导致肝脏荷载的氨增加，而大多数理论专注于尿素循环功能的不同方面。见例如Warter et al.，Revue Neurologique，139：753-757(1983)所述。由于尿素循环是除去人体中氨的主要机制，因此认为高血氨症是由于VPA和/或其代谢物与尿素循环功能和能力的抑制性相互作用而产生的。 
VPA治疗中尿素循环功能失调的迹象来自于除了上述血浆氨升高之外的许多实验和临床观测。例如Marrini等测定了未进行肾切除手术的动物在给予氨基酸和VPA后基础的和经刺激的CPSI活性均降低(Marrini et al.，Neurology 38：365-371(1988))。Marrini等还观测到为进行肾切除手术的大鼠注射氨基酸和VPA也产生高血氨症。另一研究小 组Castro-Gago等测定了用VPA治疗的22名癫痫儿童中血清氨基酸水平，发现天冬氨酸和鸟氨酸降低，提示尿素循环效力降低而不是前体增加(Castro-Gago et al.，Childs Neurons System 6：434-436(1990))。 
氨甲酰磷酸合成酶I的意义：VPA诱导的尿素循环缺陷的机制典型以线粒体氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)为中心。发现过量服用VPA而具有严重毒性的患者具有50％正常CPSI活性(Bourrier et al.，PreseMedicale 17：2063-2066(1988))。本申请人已经观测到一些轻微CPSI缺陷患者当给予丙戊酸时恶化，当停止给予后迅速逆转。 
NAG的作用：N-乙酰谷氨酸(NAG)是CPSI必需的一种变构辅因子。NAGA在线粒体中从谷氨酸和乙酰CoA合成，细胞分布反映了CPSI的分布(Shigesada et al.，Journal of Biological Chemistry 246：5588-5595(1971))。其从谷氨酸(氨基酸分解代谢)和乙酰CoA合成。有一些其中NAG可利用度改变降低CPSI活性的方式。已经观测到NAG合成酶中的遗传缺陷，已知这种酶被另外的底物如丙酰CoA或者琥珀酸盐竞争性抑制(Bachmann et al.，New England Journal of Medicine304：543(1981)；Kamoun et al.，Lancet 48(1987)；Coude et al.，J.Clin.Invest.64：1544-1551(1979)；Rabier et al.，Biochem.And Biophys.Research Comm.91：456-460(1979)；Rabier et al.，Biochimie 68：639-647(1986))。通过实验示出CPSI通过存在增加量的丙酰CoA而被竞争性抑制，VPA治疗导致血液丙酸盐浓度提高(Coulter et al.，Lancet1(8181)：1310-1311(1980)；Gruskay et al.，Ped.Res.15：475(1981)；Schmidt，R.D.，Clin.Chim.Acta.74：39-42(1977))。已经示出VPA暴露通过降低乙酰CoA和谷氨酰胺浓度而降低完整肝细胞中NAG浓度(Coude et al.，Biochem.J.216：233-236(1983))。谷氨酰胺浓度的降低的原因在于丙酮酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的抑制。 
或者，已经有提示在VPA治疗中由于CoA被转向产生valproylCoA而出现线粒体乙酰CoA的损耗(Becker et al.，Archives of Biochemistry&Biophysics 223：381-392(1983))。本领域熟知由于乙酰CoA的减少而引起VPA也破坏脂肪酸β-氧化(Eadie et al.，Med.Toxicol.3：85-106(1998))。所有这些机制均可导致NAG不足，因为其是从乙酰CoA中合成的。鉴于VPA对NAG可利用度的作用，CPSI对于NAG的结合性质中的任何改变均影响其活性。 
因此，这个实施例阐述了确定CPSI基因中本发明的多态性存在与否与对于高氨血症的易感性之间关系的实验，使用VPA作为模型制剂以产生高氨血症。首先，从开始丙戊酸治疗的患者中分离基因组DNA，根据本发明所述方法对T1405N多态性确定基因型，如通过PCR扩增和使用非变性凝胶。在对这些患者确定基因型之后，对这些患者进行治疗前和治疗后氨基酸和氨水平确定。特别地，使用实施例1所述的QIAmpTM(Qiagen)试剂盒从全血中分离DNA。 
接着，通过酶介导的免疫吸附技术(EMITTMSyva-Behring，SanJose，California，Syva 30RTM分析仪)确定血浆总VPA浓度。这种技术利用竞争性结合患者血浆中VPA及与酶G6PDH复合的VPA之间VPA抗体结合位点。VPA酶复合物从抗体中的释放使所述酶恢复活性，其活性通过在加入底物的基础上NADH的形成速度而评定。通过在340nm通过分光术监测NADH产生。使用离心微间隔过滤设备(centrifugal micro partition filter device)从血浆中分离游离(未结合蛋白质的)VPA，截断值为3000道尔顿(CENTRIFREE，Amicon，Beverley，Massachusetts)。如对于总VPA所述测定血浆超滤物中VPA浓度。 
对从VPA患者中收集的数据分析基因型与表型之间的关系。另外，比较游离的和缀合的VPA级分以评价对NAG产生和可利用度的作用。后者的比较提供了VPA对于NAG可利用度的已知作用。例如，已经示出VPA暴露通过降低乙酰CoA和谷氨酰胺的浓度而降低完整肝细胞中NAG浓度。见Coude et al.，Biochem.J.，216：233-236(1983) 所述。因此，这种比较反映了CPSI对于NAG的结合性质中的变化影响CPSI的活性。 
实施例6
CPSI中另外的多态性的检测
使用针对CPSI信息突变分析产生的技术，对10名非CPSI缺陷的不相关患者筛选编码区中另外的多态性。这是使用来自类淋巴母细胞和成纤维细胞系的“不正常的”转录物进行的。对于群体具有普遍作用的多态性在这个大小的样本中应该是明显的。如本文和权利要求书中所用，术语“多态性”是指群体中发生两或多个经遗传学确定的可选择的序列或等位基因。多态性标记是出现趋异的基因座。标记的例子如具有至少两个等位基因，每个出现频率均高于1％。多态性基因座可小至只有一个碱基对。因此多态性标记包括限制片段长度多态性、可变数目的串联重复(VNTR′s)、高可变区、小卫星、二核苷酸重复和四核苷酸重复。 
已经进行了许多“突变”检测技术，所有这些技术均基于非变性单链DNA的迁移率中可检测的改变，如Summar，M.，J.InheritedMetabolic Disease 21：30-39(1998)所述。通过这些技术鉴别的CPSI突变实例在图3中揭示。由于CPSI信息较大(大约5,700个碱基)，可以应用一种在一些反应中筛选大量DNA的方法。限制性核酸内切酶指纹法(REF)可以筛选大DNA片段，直至大约2000bp，具有极佳的灵敏性。 
使用1μg总RNA和寡-dT引物或者来自CPSI信息中点的反义引物进行逆转录酶反应(RT)。使用RT产物作为模板进行PCR反应，使用4种不同的引物组产生跨越4600碱基编码区的4个重叠片段。对每个实验组进行对照PCR反应，以保证污染模板未被扩增。因为基因的大小(80000+bp)、内含子数目(36)及对CPSI内含子外显子边界的测序还未 完善，这项研究非优选基因组DNA。然而，内含子位置在图9中绘图表示。 
上述4个重叠RT/PCR产物用于突变筛选。认真分析限制图可以针对每个片段选择3种限制酶，将其切割为100-250bp的片段。这个大小的片段对于单链构象多态性(SSCP)分析是理想的。选择酶，由此每个片段均可以均匀长度被评价。 
消化前，将PCR产物通过凝胶电泳纯化并从琼脂糖玻片中分离。在3小时后，将消化的片段乙醇沉淀。将这些片段在6％非变性聚丙烯酰胺凝胶中在4℃在恒定35瓦特运行分离。这些条件可以最大程度检测单链片段中的构象变化，如Liu，Q.and Sommer，S.S.，Biotechniques18(3)：470-477(1995)所述。通过银染进行DNA检测及对凝胶迁移率变化赋分。基于任何移动片段的位置，使用循环测序方案对RT/PCR产物进行直接序列分析。为了消除得自Taq聚合酶误差的突变的可能性，扩增新鲜的RT产物并在每种情况中测序。以这种方式迅速筛选全部4600个碱基的编码信息。对含有不清楚区域的任何区域均进行测序，寻找期望序列中的变化。 
分离每个RT/PCR片段的限制消化产物。然后将这些片段在如上述非变性凝胶中针对组合消化运行。通过以这种方式鉴定片段模式，易于鉴别参与任何观测到的迁移率改变的CPSI信息部分。 
在这些实验中检测到的多态性针对Centre d′Etude PolymorphsimHumanise (CEPH)亲代组(panel)确定基因型以确定频率。检测所有变化对密码子使用的作用及使用本文揭示的CPSI鉴定数据检测导致错义突变的那些变化。 
使用实施例3中描述的技术表达含有这些变化的定点突变体。使用这个系统观测所述变化对于CPSI产生和活性的体外作用。 
在CPSI中检测到T344A多态性。使用来自第10外显子的寡核苷酸引物(U1119：tactgctcagaatcatggc-SEQ ID NO：17)和来自内含子的引物 (LI10+37：tcatcaccaactgaacagg-SEQ ID NO：18)扩增含有所述变化的一个91bp的片段。PCR循环条件如下：35次循环：在59℃退火1分钟，在72℃延伸1分钟，及在94℃变性1分钟。将患者分类为具有纯合SNP基因型AA或TT，或者是杂合基因型(AT)。这种多态性在成人群体中的分布为35％AA，44％AT和21％TT。 
在CPSI中还检测到118-CTT多态性。使用来自5′未翻译区的寡核苷酸引物(U5′-74：ggttaagagaaggaggagctg-SEQ ID NO：19)和来自内含子的引物(L175：aaccagtcttcagtgtcctca-SEQ ID NO：20)扩增含有所述变化的一个249bp的片段。PCR循环条件如下：35次循环：在59℃退火1分钟，在72℃延伸1分钟，及在94℃变性1分钟。将患者分类为在第118位具有三核苷酸插入或者缺失的纯合基因型，或者是杂合的。这种多态性在成人群体中的分布是34％CTT-，43％杂合及23％CTT+。 
实施例7
在具有持续性肺动脉高压的新生儿患者中氨甲酰磷酸合成酶I中的生
物化学和遗传学改变
这个实施例研究了在新生儿持续性肺动脉高压(PPHN)发病机制中限制内源NO产生的作用。内源NO是尿素循环中间体精氨酸的产物。精氨酸的产生依赖于尿素循环的限速酶，氨甲酰磷酸合成酶(CPSI)。新生儿具有低于一半的正常尿素循环功能，使其对酶形式和功能中的微小变化特别易感。在CPSI中已经观测到一种普遍的外显子多态性(T1405N)，其影响尿素循环第一个步骤的流量。 
在这个实施例中，测试了产生PPHN的新生儿与匹配对照相比是否具有较低的NO前体(精氨酸和瓜氨酸)。还分析了PPHN患者是否主要具有CC(苏氨酸/苏氨酸)或者AC(天冬酰胺/苏氨酸)CPSI基因型， 这种基因型与AA(天冬酰胺/天冬酰胺)CPSI基因型相比具有较低的功能。 
方法：登记在Vanderbilt Neonatal Intensive Care Unit有(n＝22)和无(n＝25)经超声心动描记术证明肺动脉高压的40名>2kg、>35周及<72小时新生儿。记录呼吸窘迫严重程度的临床重要测量值。获得氨水平和血浆氨基酸图。通过在非变性MDETM凝胶上进行PCR扩增DNA确定基因型。 
结果：产生PPHN的患者平均精氨酸水平为21.5μmol/l，而未产生PPHN的患者平均水平为38.3μmol/l(p＝0.0004)。瓜氨酸平均水平分别为6.1 μmol/l和10.3μmol/l(p＝0.02)。精氨酸和瓜氨酸的水平与低氧血症的严重程度成反比，这是通过氧合指数、机械性换气天数及需要补充O2的天数而测定的。对PPHN患者对于T1405N的基因型分析示出5CC、17AC和0AA，而对照组具有7CC、16AC和2AA(卡方p＝0.005，使用期望的群体等位基因频率)。具有CC基因型的婴儿的精氨酸和瓜氨酸平均值(21.5μmol/l和5.8μmol/l)低于具有AA基因型的婴儿(31.5μmol/l和13.5μmol/l)，与两种形式酶之间的功能差异一致。 
结论：这个实施例示出新生儿中发生PPHN与尿素循环中间体精氨酸和瓜氨酸的不充分可用利度相关。CPSI DNA中T1405N多态性导致酶功能被降低及随后降低NO前体的水平。 
讨论：氨甲酰磷酸合成酶(CPS I)催化尿素循环中限速步骤，从而决定了尿素循环中间体包括精氨酸和瓜氨酸的组织水平。如本文所揭示，CPSI基因中广泛分布的C-A外显子多态性将邻近关键的N-乙酰谷氨酸结合结构域的第1405位保守的苏氨酸转变为天冬酰胺。数据表明含有天冬酰胺形式的CPSI在酶功能研究中显示更有效的动力学。 
T1405N等位基因呈现50％的杂合性，并且看起来在正常健康成人中是沉默变体。然而，性质改变的结果可以通过应激条件而揭示。如实施例1-3所述，在预备骨髓移植时成人暴露于高剂量化疗的情况 中，含有苏氨酸的酶产生不足水平的精氨酸和瓜氨酸，并且与肝静脉梗阻症、急性肺损伤和死亡的增加相关。因为一氧化氮(NO)是在内皮细胞中通过一氧化氮合成酶(NOS)从L-精氨酸产生的，因此尿素循环中间体水平降低可通过限制内源NO产生而导致血管紧张度紊乱。 
在这个实施例的前瞻性群组研究中，研究了一种相似过程可参与新生儿持续性肺动脉高压(PPHN)发病机制的可能性。内源产生的NO在调节肺血管阻力和从胎儿转变为新生儿血液循环中起作用。Lipsitz，E.C.，et al.J Pediatr Surg(1996)3 1：137-140；Abman，S.H.，et al.Am J Physiol(1990)259：H1921-H1927。在妊娠20周和足月分娩之间，CPSI产生和功能低于50％成人水平。这种生理缺陷可以揭示T1405N基因突变的作用，特别是如果结合其它影响肝功能的新生儿应激例如窒息或者败血症则更明显。 
符合这项研究条件的患者包括妊娠≥35周及出生体重≥2kg的适当生长的新生儿，其是Vanderbilt University Medical Center新生儿监护室(NICU)在1999年7月1日至2000年2月29日之间收治的呼吸窘迫综合征患者。除外具有多发性先天性异常、已知的遗传综合病症及解剖学因素导致肺动脉高压(先天性膈疝、Potter’s综合征、窒息性胸腔营养不良等等)的婴儿。对所有进行研究的患者均获得其双亲同意。对51名新生儿在出生后最初的72小时抽取3cc血液绘制血浆氨基酸图、确定氨和BUN水平、一氧化氮代谢物和确定CPSI基因型。在输血、肠道或胃肠外蛋白质摄取、给予吸入一氧化氮或者插入ECMO套管之前抽取血液。 
对研究组中登记的人员收集的数据包括：(1)基本特征(出生体重、孕龄、性别、种族、Apgar得分、初步诊断、任何肺部并发症、及在抽取血液时的出生后年龄)及(2)测定呼吸支持(FiO2，MAP，iNO，ECMO)和临床反应(ABGs，机械通气和补充O2的持续时间，存活)。最大氧合指数[OI＝FiO2 x MAP/PaO2]用作呼吸窘迫严重程度的测 量指标。主要的初步诊断包括：(1)出生窒息，5分钟Apgar得分<5，第一次ABG或者脐带血气分析呈现混合的酸中毒或者神经功能失调及其它终末器官损伤，(2)呼吸窘迫综合征(RDS)，呼吸窘迫临床症状及胸部X光毛玻璃肺部区域和空气支气管相加上ABG上合并高碳酸血症/低氧血症(注意：考虑到这些新生儿的妊娠年龄，具有这一照片的婴儿可能患有表面活性剂缺陷或先天性肺炎；然而，在任一情况下均没有获得气管抽吸物的阳性培养物)，及(3)胎粪吸入综合征(MAS)，分娩时有胎粪沾染史加上呼吸窘迫临床症状、低氧血症和粗大浸润胸部X-光。 
如果婴儿产生明显的低氧血症(100％O2>6小时基础上PaO2<100)且其心脏解剖学是正常的，而具有肺动脉压增高的超声心动图表现，则认为其具有肺动脉高压(PPHN)。后者的定义为：(1)从右至左或者卵圆孔双向导管血液流动或者(2)基于不知情的第三者读取的三尖瓣反流的Doppler评估增高的(>35mmHg)肺动脉压。 
对47名患者的新鲜血浆样本进行氨基酸分析。无蛋白质的血浆提取物通过用磺基水杨酸沉淀蛋白质并通过0.45μm Acrodisc4(GelmanSciences，Ann Arbor，Michigan)过滤而制备。氨基酸通过阳离子交换层析而分离，使用4-成分pH-和离子强度-梯度柠檬酸锂缓冲系统在Beckmann 7300氨基酸分析仪(Beckmann，Palo Alto，California)上进行。与茚三酮的氨基酸柱后衍生化可以在570nm检测伯胺氨基酸，在440nm检测仲胺氨基酸。通过具有标准参考物质(Sigma，St.Louis，Missouri)的设备标准进行量化。瓜氨酸和精氨酸作为尿素循环中间体流量的测定指数进行检测。 
血浆一氧化氮代谢物(NOx)的测定：在将样本除去蛋白质并与镉珠保温以将硝酸盐转变为亚硝酸盐之后，在一亚组患者中使用修饰的Griess试剂测定血浆NOx。 
SNP检测：来自CPSI的36th外显子寡核苷酸引物(U4295-SEQ IDNO：15)和内含子寡核苷酸引物(LI36-SEQ ID NO：16)及聚合酶链反应(PCR)可靠地扩增包含含有得自全血制品基因组DNA中变化的区域的一个251bp的片段。这种引物组合提供了可再生的扩增，使用Taq聚合酶(Promega)，PCR循环条件如下：35次循环，在67℃退火1分钟，在72℃延伸1分钟，在94℃变性1分钟。在经甲酰胺处理后，将样本在4℃在非变性MDETM凝胶(FMC，Rockland，Maine)中电泳5小时，然后用硝酸银染色以检测DNA片段。将患者分类为具有纯合SNP基因型CC或者AA，或者是杂合基因型(AC)。使用非变性凝胶电泳和直接序列分析确定基因型产生与上述那些相同的结果。因此，确定T1405N多态性在成人群体中的分布是：45％CC，44％AC，及11％AA。 
使用与上述相同的技术检测T344A多态性。使用来自10th外显子的寡核苷酸引物(U11 19：tactgctcagaatcatggc-SEQ ID NO：17)和内含子的寡核苷酸引物(LI10+37：tcatcaccaactgaacagg-SEQ ID NO：18)扩增含有所述变化的一个91bp片段。PCR循环条件是：35次循环，在59℃退火1分钟，在72℃延伸1分钟及在94℃变性1分钟。将患者分类为具有纯合SNP基因型AA或者TT，或者是杂合基因型(AT)。这个多态性在成人群体中的分布是35％AA，44％AT和21％TT。 
使用与上述相同的技术检测118-CTT多态性。使用来自5’未翻译区的寡核苷酸引物(U5′-74：ggttaagagaaggaggagctg-SEQ ID NO：19)和内含子的寡核苷酸引物(L175：aaccagtcttcagtgtcctca-SEQ ID NO：20)扩增含有所述变化的一个249bp片段。PCR循环条件是：35次循环，在59℃退火1分钟，在72℃延伸1分钟，在94℃变性1分钟。将患者分类为在第118位具有三核苷酸插入或者缺失的纯合基因型，或者是杂合的。这种多态性在成人群体中的分布是34％CTT-，43％杂合的及23％CTT+。 
使用Student’s T-test对比患者群间的氨和血浆氨基酸水平。比较组间CPSI的基因型分布，通过计算全部群的等位基因频率及使用卡方分析在特别选择的亚组中搜索Hardy-Weinberg不平衡迹象。在51名最初登记的新生儿中，有25名产生PPHN，26名未产生。这两组的基本特征无统计学显著差异，包括产生体重、孕龄、种族或者在登记时婴儿的出生后年龄。然而，对照组中男性略占优势。 
初步诊断的分布是均匀的。在PPHN组中，5名婴儿具有出生窒息，9名婴儿具有RDS，5名婴儿具有胎粪吸入综合征，6名婴儿具有其它诊断，包括4名婴儿具有原发PPHN。在对照组中，4名婴儿具有出生窒息，8名婴儿具有RDS，3名婴儿具有MAS，11名婴儿具有其它诊断。其它诊断包括室上性心动过速、贫血、产伤及病毒性败血症。研究中没有婴儿具有细菌血液培养阳性。 
正如所期望的，具有PPHN的婴儿使其原来的病理学更加复杂，与对照组相比在一些临床标准方面产生更严重的疾病。8名具有PPHN的婴儿需要吸入NO(iNO)治疗，2名需要ECMO，2名死亡(一名婴儿在iNO上窒息及多系统衰竭；另一名肺泡毛细管发育异常的婴儿取消ECMO)。显然，对照组无一用iNO或者ECMO治疗；对照组中无死亡率。 
PPHN组中有三名婴儿从分析中除外。在肺组织活检发现具有肺泡毛细管发育异常的婴儿被认为具有肺动脉高压的解剖学病因。另一名婴儿错误地登记具有先天性膈疝，第三名婴儿在已经开始TPN之后119小时年龄登记。对照组中有一名婴儿在核型分析后从分析中除外，核型分析表明其张力过低的病因是Prader-Willi综合征。 
对产生PPHN的婴儿进行氨基酸分析示出具有其明显较低的血清精氨酸和瓜氨酸水平。在PPHN情况中平均精氨酸水平为21.5+9.2μmol/l，而对照组的平均精氨酸水平为38.3+18.4μmol/l(p＝0.0004)。在PPHN情况中平均瓜氨酸水平为6.1+3.6μmol/l，在对照组中为10.3+7 μmol/l(p＝0.02)。这两个组的其它氨基酸水平无明显差异，包括谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、缬氨酸、鸟氨酸和亮氨酸。全部必需氨基酸(TEAA)的水平在PPHN情况中略低，为大约537μmol/l对大约654μmol/l，但这个差异无统计学意义(p＝0.08)。通过出生体重、孕龄或者出生后小时数。发现TEAA的水平在其血液是在出生后6小时之前抽取的4名婴儿中明显较高(大约1021.5μmol/l对大约542μmol/l，p＝0.0026)。推测这种差异反映了这些婴儿中通过胎盘循环而来的胃肠外蛋白质注入的近期停止。 
当单独分析窒息、RDS、MAS、及其它诊断时，发现精氨酸和瓜氨酸水平无差异。每组中，具有肺动脉高压的婴儿趋于具有较低数值，但是每组中少数婴儿提供的结果无统计学意义。例如，具有PPHN的窒息婴儿的平均精氨酸为大约1 8.5μmol/l，窒息对照组为大约52.7μmol/l(p＝0.06)，平均瓜氨酸水平为大约6.8μmol/l，对照组为大约14.3μmol/l(p＝0.04)。 
血清精氨酸和瓜氨酸的水平与低氧血症的严重程度成反比。精氨酸和瓜氨酸值随着氧合指数的提高、机械性换气天数增加、需要补充氧以增加出生体重的天数、孕龄、或者出生后小时数而逐渐降低。具有PPHN的婴儿中NH3水平趋于略高于对照组(54+18.1μmol/l对45.6+12μmol/l)，但这些数值无统计学意义(p＝0.08)。在CPS1 T1405N基因型分析中，发生PPHN的22名婴儿中有5名是CC，17名是AC。在PPHN情况中无AA。在25名对照婴儿中，有7名是CC，16名AC，2名AA。然后比较基因型的这些分布，通过计算全部群的预期等位基因频率而进行，表明PPHN组中的Hardy-Weinberg不均衡迹象。在卡方分析中，这两组彼此显著不同，p值＝0.005。在具有AA基因型的两名婴儿中，一名具有RDS，另一名经历了出生窒息。无一婴儿达到OI≥15；使用呼吸机<1周及<10天供氧。 
具有CC基因型的婴儿平均精氨酸水平为21.9+7μμmol/l，瓜氨酸水平为5.8+1.8μmol/l，而具有AA基因型的婴儿平均精氨酸水平为31.5 +3.5μmol/l，平均瓜氨酸水平为13.5+6.4μmol/l。再次，有少数AA提供的这个数据难以达到统计学意义，p值分别为0.1和0.006。 
实施例8
在仔猪中静脉内瓜氨酸补充提高血浆精氨酸水平
在临床模型中未预先使用静脉内瓜氨酸。这个实施例在仔猪中评估了IV瓜氨酸的安全性及其对血清精氨酸水平的作用。总共用9只Duroc猪，年龄为5-21天，最小体重为4kg。对所有仔猪均进行麻醉诱导和气管造口术。中央管路置于股动脉和股静脉中，持续监测血流动力学。给5只仔猪施用瓜氨酸(600mg/kg，IV)。给予对照动物盐水。在施用瓜氨酸之前及之后每小时抽取血清氨基酸。 
血清精氨酸水平在IV施用瓜氨酸之后1-2小时达到峰值，随后在基础水平之上持续保持3小时，在所有时间点于对照组比较均达到统计学意义(p<0.001)。未观测到血流动力学不稳定。 
IV瓜氨酸之后的精氨酸水平(μmol/L) 
  治疗组(n＝5)   基础水平   1小时后   2小时后   3小时后
  瓜氨酸(600mg/kg)   131.5   535.0   559.8   498.4
  对照(盐水)   89.6   103.0   11 8.1   136.7
  p-值   0.1582   <0.001   <0.001   <0.001
IV瓜氨酸后的平均动脉血压(mmHg) 
  治疗组(n＝4)   给予前   1小时后   2小时后   3小时后
  瓜氨酸(600mg/kg)   67.0   67.4   64.8   62.2
  对照(盐水)   53.2   58.7   55.7   54.7
在所有时间点p>0.05 
药动学：基于上述数据，在IV一剂瓜氨酸之后针对血浆瓜氨酸和精氨酸水平计算药动学。药动学数据包括血浆半衰期(t1/2)，清除常数(Kel)，分布体积(Vd)，和血浆清除率(CLp)。 
血浆瓜氨酸水平迅速增加，表明t1/2＝1.5小时，Kel＝0.462/小时，Vd＝2.25L，CLp＝1.05L/小时。然而，感兴趣的是瓜氨酸对血浆精氨酸的作用，因为其是NO合成酶的底物。血浆精氨酸水平的浓度曲线示于图13。基于这个曲线，血浆精氨酸的药动学如下：t1/2＝18小时；Kel＝0.039/小时；Vd＝2.85L；CLp＝0.11L/小时。较长的半衰期和较低的清除率表明IV单一剂量的瓜氨酸即可有效保持血浆精氨酸提高相当长的时间，而对血流动力学无不利作用。 
实施例9
在先天性心脏病手术中口服补充瓜氨酸
这个实施例是关于评定补充瓜氨酸是否提高血清瓜氨酸水平，通过内源NO出生而降低术后肺动脉高压的风险。更特别地，这个实施例关于确定围术期间口服补充瓜氨酸是否提高血清瓜氨酸水平，导致通过尿素循环产生更多的一氧化氮，从而降低术后肺动脉高压的风险。 
进行随机安慰剂对照双盲研究。经历手术修复其先天性心脏病及处于发生术后肺动脉高压危险中的40名婴儿/儿童接受口服瓜氨酸或者安慰剂。在术前、术后即刻施用5剂量的瓜氨酸或者安慰剂(1.9g/m2 /剂)，之后每12小时给予一次共三剂量。在5个时间点测定血清瓜氨酸的初步终点。获得全身血压、血清精氨酸和一氧化氮代谢物、CPSI基因型、及肺动脉高压存在与否的二级测定结果。 
成功登记40名患者，随机分成相等的两组(20人/组)，给予瓜氨酸或者安慰剂。在48小时研究期间，在瓜氨酸和安慰剂组之间重复测定平均血压无差异(P＝0.53)。在术后即刻(36umol/L IQR 28-48 umol/L对26umol/L IQR 24-35umol/L，P＝0.012)及12小时后(37umol/LIQR 18-83 umol/L对20umol/L IQR 15-29umol/L，P＝0.015)，瓜氨酸中位数水平在谷氨酸组中与安慰剂组比较明显较高。在安慰剂组中，术后阶段瓜氨酸水平明显降低(P＝0.001)，而补充瓜氨酸后则明显升高(P＝0.014)。平均血清精氨酸水平在术后12小时在瓜氨酸组中明显较高(36 umol/L+/-24 umol/L对23 umol/L+/-13 umol/L，P＝0.037)。精氨酸水平在安慰剂组中在术后阶段明显降低(P<0.001)，而补充瓜氨酸后水平保持在基础水平(P＝0.533)。9名患者产生术后肺动脉高压(6名安慰剂，3名瓜氨酸)，其血清瓜氨酸水平均低于补充瓜氨酸获得的中位数水平(37 umol/L)(P＝0.036)。具有肺动脉高压的患者无一具有CPSI多态性的AA基因型(P＝0.743)。 
耐受瓜氨酸施用的患者无明显副作用迹象。在心肺转流术后口服补充瓜氨酸明显提高血清瓜氨酸和精氨酸。高于正常的血清瓜氨酸水平与降低术后肺动脉高压风险相关。 
方法 
患者登记：在这项随机对照双盲研究中登记40名患者。所有婴儿或儿童均小于6岁，经历6种手术方法之一以修复其先天性心脏缺损。合适的手术方法包括：1)针对左心发育不全综合征(HLHS)或者异型HLHS的Norwood I方法，2)双向Glenn，3)修改的Fontan方法，4)房室隔缺损(AVSD)修补，5)室间隔缺损(VSD)修补，或者6)动脉转接方法。除外的标准包括：1)明显的肺动脉狭窄不能进行手术，2)先前置放肺动脉支架，3)先前肺动脉血管成形术，4)明显的左侧AV瓣膜反流，5)肺静脉回流异常，或者6)肺静脉狭窄。 
在心胸外科门诊(门诊病人)或者Vanderbilt Children’s Hospital(住院病人)手术评估期间从登记的患者双亲获得书面同意。VanderbiltChildren’s Hospital的3名心脏外科医生之一使用相同的心肺分流术和 心脏麻痹准备进行手术。 
肺动脉高压定义为平均肺压力为至少1/2体循环平均血压，高于25mmHg。直接肺动脉血压测量得自在经过双向Glenn或者修改的Fontan方法处理后患者上腔静脉中央管路，或者得自所有患者(除了经历I期Norwood方法处理的患者)经胸廓肺动脉导管。中央管路由心脏麻醉专家放置，肺部管路直接由心胸外科医生放置。 
除了直接测量之外，在具有两心室解剖的所有患者中肺动脉压还可以通过超声心动描记术而评估。在回声上证实存在肺动脉高压的迹象包括：1)明显的三尖瓣反流，2)扩大或肥大的右心室而无肺血管狭窄的迹象，和/或3)心室内隔膜扁平。所有超声心动描记术均由Vanderbilt Children’s Hospital的小儿科心脏病专家解释。 
所有医生(外科医生、心脏病专家、进修人员和PI)、调查护士、PCCU护理人员和患者对随机方案和治疗任务均不知情。临床数据和患者特性在了解研究结果之前得自病历。 
不利事件：施用瓜氨酸在理论上具有体循环血压过低的危险。在48小时研究期间监测体循环血压。不利事件定义为平均血压与基础水平相比下降25％以上。根据症状用补充血容量和/或收缩性/血管加压剂治疗患者。除非患者血压过低而对干预无反应，否则不用从研究中排除该患者。 
研究方案：将40名患者在进行手术之前即刻随机化为接受安慰剂或者瓜氨酸。通过Vanderbilt Hospital Clinical Pharmacy的Investigational Drug Service进行随机化，使用计算机产生的随机号码，根据先前产生的4个随机交换模块。患者登记为意向治疗(ITT)模型。 
施用使用蒸馏水作为悬浮剂的100mg/ml(10％)溶液的瓜氨酸。由Investigational Drug Service将药物与安慰剂混合及分布。瓜氨酸和安慰剂的体积和颜色相称。瓜氨酸施用剂量为每12小时5剂量1.9 g/m2，每日剂量为3.8g/m2，总剂量为9.5g/m2。这个剂量通过目前施用给尿 素循环缺陷的婴儿/儿童的瓜氨酸替代治疗而确定，与施用给正在进行临床实验的处于产生急性肺损伤危险中的成人骨髓移植患者的剂量相同(Vanderbilt University Medical Center，Brian Christman MD)。 
第一次剂量的安慰剂/瓜氨酸是通过由调查护士或者医生放置的口胃饲管(orogastric feeding tube)施用的，随后进行麻醉及在手术室中插管。第二次剂量是在到达Pediatric Critical Care Unit(PCCU)立即给予的。第三、四和第五次剂量是分别在PCCU中手术后12小时、24小时和36小时施用的。手术后剂量是通过由PCCU中病房护士放置的鼻饲管(nasogastric feeding tube)经肠道给予，或者一旦患者拔管则经口服给予。 
样品收集：从每个患者在5个时间点获得3ml血液：在手术前及手术后即刻，手术后12小时，24小时和48小时。手术前血样在麻醉诱导和放置动脉或者中央静脉导管后，但在手术切开之前收集。手术后即刻血样在达到儿科重症监护室(PCCU)时收集，随后的样本分别在达到PCCU之后各自的时间收集。将样本收集在含有柠檬酸盐的试管中，置于冰上并在4℃贮存直至进行处理。在收集3小时内将样本离心以分离血浆和细胞成分。血浆样本在—70℃冷冻直至进行进一步实验室分析。 
确定结果数据的关键因素是中央静脉(CVL)或者动脉管路(AL)的可达性。向登记患者的双亲保证血样得自手术必需的管路，一旦中央血管路径不再是医疗必需的，则不额外抽取血液。一旦难以获得结果变量的测定，则不再继续施用研究药物。 实验室测定：血清瓜氨酸、精氨酸及所有其它氨基酸的浓度通过对无蛋白质提取物进行氨基酸分析而确定。氨基酸通过阳离子交换层析分离，使用7300氨基酸分析仪(Beckmann，Palo Alto，California，United States of America)进行。在测试患者样本之前完成分析仪的标度。 
一氧化氮代谢物浓度通过非酶比色分析进行分析(OxfordBiomedical Research，Oxford，Michigan，United States of America)。血浆样本首先用硫酸锌溶液除去蛋白质。然后通过与镉珠保温而将硝酸盐还原为亚硝酸盐。在离心后，向上清中相继加入Griess试剂磺胺和N-(1-萘基)乙二胺(14)。然后测定每个样本在540nm的吸收，一氧化氮代谢物浓度利用稀释的亚硝酸钠标准曲线作为对照确定。 
如上文所述针对T1405N多态性确定CPSI基因型。通过将手术前经柠檬酸盐化的血样在1000g离心5分钟分离淡黄色表层，然后在—70℃贮存。利用基因组DNA分离试剂盒从全血细胞中提取DNA(Promega Corp，Madison，Wisconsin，United States of America)。然后使用如上文所述T1405N引物对分离的DNA样本进行PCR扩增。将PCR产物通过突变检测增强(MDE)电泳加以分类，利用MDE异源双链体试剂盒(AT Biochem，Malvern，Pennsylvania，United States ofAmerica)。利用这种方法可以与对照精确比较观测到单一碱基取代。 
统计学分析：先前报道了婴儿和儿童在心肺转流术后12小时平均瓜氨酸水平为20.7+/-13.0 umol/L。40名患者的样本大小具有87％的power(1-β)检测到瓜氨酸(20人)和安慰剂(20人)组之间13umol/L(1 SD)的差异，使用双侧显著性及α＝0.05。{样本大小使用PS power和样本大小程序计算(Dupont WDand Plummer WD：PS power and samplesize program available for free on the Internet.Controlled Clin Trials，1997；18：274；Version 2.1.30)。 
由在48小时研究期间平均血压的多次连续测量结果说明的药物安全性，通过多元ANCOVA确定。持续的结果变量，氨基酸水平和一氧化氮代谢物水平以对于非正态分布的四分位数间距(IQR)中位数或者在合适时以平均值+/-SD表示。使用Mann-Whitney U检验比较组间的持续变量以说明无关数值，另外使用Student’s T-test。成对持续值分析使用Wilcoxon signed-rank检验进行。随机化的成功及肺动脉高 压的存在与否的分歧结果以百分比报导，并使用Fisher’s精确检验确定。所有分析都是双侧的，p值<0.05时认为具有统计学意义。使用统计学软件STATA(version 6.0，STATA Corporation，College Station，Texas)和SPSS( 
Figure S05812693520061025D000901
2004，SPSS Inc.)进行数据分析，由Centerfor Human Genetics Research的Jeff Canter，MD领导。 
结果 
患者登记：顺利登记40名患者并随机为接受瓜氨酸(n=20)或安慰剂(n=20)。随机化达到瓜氨酸和安慰剂组之间在基础水平无明显差异(表1)。 
研究人群(n=40)的年龄中位数是8.5月(IQR 4-29 mo)，55％男性，90％是高加索人。外科手术干预包括Norwood stage I(8％)，BDG或者Fontan(53％)，VSD或者AVSD修复(25％)和动脉转接修复(15％)。在研究组中CPSI基因型对于T1405N多态性的分布(5 AA(12.5％)23 AC(57.5％)12 CC(30％))与普通群体所期望的相似。 
安全性：在瓜氨酸组和安慰剂组中平均血压无差异(P=O.530)(图14、)。尽管在48小时研究期间无死亡发生，但是3名患者在手术修复30天内死于术后并发症，瓜氨酸和安慰剂组无显著差异(2对1，P＝0.487)。发现所有死亡与施用研究药物不相关。随机接受瓜氨酸的一名患者在手术后立即排除，因为其具有明显的手术并发症，需要通过体外膜氧合(ECMO、)并送回OR以在48小时研究期间进一步修复。保持意向治疗。该患者属于瓜氨酸组，具有数据分析中的手术前测量结果，然而由于没有患者数据而不能进行手术后结果分析。 
血清瓜氨酸：接受口服瓜氨酸的患者当与安慰剂组比较时，在手术后即刻(36umol/L IQR28-48umol/L对26umol/L IQR24-35umol/L，P＝0.012)和手术后12小时(37umol/L IQR 18-83umol/L对20umol/L IQR 15-29umol/L，P＝0.015)的血清瓜氨酸中位数水平显著较高(图15、)。安慰剂组中血清瓜氨酸水平在手术后即刻和手术后12小时 均显著从基础水平下降(32 umol/L IQR 25-44 umol/L对26 umol/L IQR24-35 umol/L及20 umol/L IQR 15-29 umol/L，P值分别为P＝0.020，P<0.001)。然而，在手术后即刻补充瓜氨酸则血清瓜氨酸水平从基础水平显著升高，并在手术后12小时保持升高水平(29 umol/L IQR 25-34umol/L对36 umol/L IQR 28-48 umol/L及37 umol/L IQR 18-83 umol/L，P值分别为P＝0.014及P＝0.184)。 
手术后12小时外的测量结果通过错过数据点而不明确。手术后24小时，9名患者恢复并移至普通儿科病房。 
精氨酸和一氧化氮代谢物：在手术后12小时，接受口服瓜氨酸患者的平均血清精氨酸水平显著高于接受安慰剂的患者(36+/-24umol/L对23+/-13 umol/L，P＝0.037)(图16)。在手术后12小时，安慰剂组的血清精氨酸水平从基础水平显著下降(38 umol/L IQR 30-52umol/L对34 umol/L IQR 15-45 umol/L及22 umol/L IQR 13-33 umol/L，P值分别为P＝0.077和P<0.001)。然而，瓜氨酸组的血清精氨酸水平不从基础水平明显下降(33 umol/L IQR 25-54 umol/L对33 umol/L IQR22-41 umol/L及30 umol/L IQR 15-56 umol/L，P值分别为P＝0.533和P＝0.533)。 
在手术后即刻(42 umol/L IQR 27-72对40 umol/L IQR 27-55umol/L，P＝0.430)或者手术后12小时(45 umol/L IQR 28-81对43umol/L IQR 20-68 umol/L，P＝0.518)，一氧化氮代谢物的浓度在瓜氨酸和安慰剂组之间无差异。 
在手术后期间给5名患者施用吸入的一氧化氮，所有患者在手术后即刻均出现不饱和状态和血压过低。5名患者中有3名通过直接肺压力测定而确定具有肺动脉高压。5名患者有2名(1 fontan，1 Norwood)进行iNO实验。经历fontan手术程序的患者在手术后立即探查两次以缓解严重的血胸和心包压塞，之后返回OR以进行穿孔扩大。在由于心肌抑制导致多次尝试失败后，给经历Norwood手术程序的患者进行 iNO，以试图在OR中使其自分流术中苏醒。所有患者均在手术后12小时内经方案断掉iNO。 
肺动脉高压：9名患者产生术后肺动脉高压，安慰剂组有6名(67％)，治疗组有3名(33％)(P＝0.451)。所有具有肺动脉高压的患者的血清瓜氨酸水平均低于先前报道的6岁以下儿童瓜氨酸浓度标准(30umol/LIQR 23-37 umol/L)，并且低于由补充瓜氨酸而获得的中位数浓度(37 umol/L，P＝0.036)。具有肺动脉高压的患者对于T1405N多态性不具有预期的CPSI基因型分布，0 AA(0％)6 AC(67％)3 CC(33％)，但是由于具有肺动脉高压的患者数量少而不是显著的(P＝0.743)。 
随着瓜氨酸的施用，防止了NO前体中这一显著下降。已表明安慰剂组在分流术后继续显示明显的瓜氨酸和精氨酸浓度降低。相反，在接受口服瓜氨酸的患者中，瓜氨酸浓度显著升高并保持术前精氨酸浓度。如果采用内源性NO产生来预防肺动脉高压，则逆转心肺转流术对NO前体浓度的效应的能力是不相干的。 
产生手术后肺动脉高压的患者的瓜氨酸浓度低于预期的标准值，并且低于补充瓜氨酸获得的中位数浓度37umol/L。肺动脉高压的产生依赖于通过补充瓜氨酸或者通过其它诱导因素(遗传、手术、环境)而获得的血清瓜氨酸浓度。总之，安慰剂组中20名患者中有18名患者(90％)的瓜氨酸水平低于37umol/L，治疗组中20名患者中有9名患者如此(47％)。在瓜氨酸水平低的那些患者中，27名患者中有9名患者(33％)产生肺动脉高压。具有肺动脉高压的患者当与研究组手术后即刻相比较时具有最低水平的瓜氨酸(P＝0.03)。因此，影响瓜氨酸吸收或者内源NO产生的因素增加产生肺动脉高压的危险。 
特殊基因中的多态性可以在保留NO前体可利用度中起作用。一种这样的酶，氨甲酰磷酸合成酶I，是尿素循环限速酶，并因此决定瓜氨酸和精氨酸的产生。尿素循环功能失调与新生儿持续性肺动脉高压(PPHN)和上述婴幼儿/儿童分流术后肺动脉高压相关。CPSI的 T1405N多态性与PPHN新生儿及先天性心脏病分流术后患者中较低的精氨酸和一氧化氮水平明显相关。这种多态性的AA基因型在产生肺动脉高压的这两种儿科疾病患者群中未被充分代表。我们再次示出在这项研究中在产生肺动脉高压的9名患者中无AA基因型。 
结论：患者耐受瓜氨酸施用而无明显副作用。与接受安慰剂的患者中NO前体显著降低相比较，口服瓜氨酸补充剂显著增加瓜氨酸浓度及保持手术前精氨酸浓度。通过施用瓜氨酸或者诱导因素(predisposed factors)而保持血清瓜氨酸浓度高于正常水平的患者，不发生手术后肺动脉高压。 
表1.瓜氨酸和安慰剂组特征的比较 
Figure S05812693520061025D000931
表2.当血清瓜氨酸升高时肺动脉高压风险低 
参考文献
如下列出的参考文献以及说明书中引用的参考文献在此均并入作参考，提供了本发明应用的背景或教导方法学，技术和/或组合物。 
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应理解本发明的许多细节在不偏离本发明范围的情况下可以被改变。而且，上述描述仅是说明的目的，不是为了限制本发明，本发 明由权利要求书所限定。 
序列表
<110>范德比尔特大学
<120>应用一氧化氮前体的治疗方法
<130>1242-58PCT
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<222>(124)..(4626)
<400>1
gtcagcctta aacactgact gcacccctcc cagatttctt ttacattaac taaaaagtct    60
tatcacacaa tctcataaaa tttatgtaat ttcatttaat tttagccaca aatcatcttc  120
aaa atg acg agg att ttg aca gct ttc aaa gtg gtg agg aca ctg aag    168
    Met Thr Arg Ile Leu Thr Ala Phe Lys Val Val Arg Thr Leu Lys
    1               5                   10                  15
act ggt ttt ggc ttt acc aat gtg act gca cac caa aaa tgg aaa ttt    216
Thr Gly Phe Gly Phe Thr Asn Val Thr Ala His Gln Lys Trp Lys Phe
                20                  25                  30
tca aga cct ggc atc agg ctc ctt tct gtc aag gca cag aca gca cac    264
Ser Arg Pro Gly Ile Arg Leu Leu Ser Val Lys Ala Gln Thr Ala His
            35                  40                  45
att gtc ctg gaa gat gga act aag atg aaa ggt tac tcc ttt ggc cat    312
Ile Val Leu Glu Asp Gly Thr Lys Met Lys Gly Tyr Ser Phe Gly His
        50                  55                  60
cca tcc tct gtt gct ggt gaa gtg gtt ttt aat act ggc ctg gga ggg    360
Pro Ser Set Val Ala Gly Glu Val Val Phe Asn Thr Gly Leu Gly Gly
    65                  70                  75
tac cca gaa gct att act gac cct gcc tac aaa gga cag att ctc aca    408
Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Asp Pro Ala Tyr Lys Gly Gln Ile Leu Thr
80                  85                  90                  95
atg gcc aac cct att att ggg aat ggt gga gct cct gat act act gct    456
Met Ala Asn Pro Ile Ile Gly Asn Gly Gly Ala Pro Asp Thr Thr Ala
                100                 105                 110
ctg gat gaa ctg gga ctt agc aaa tat ttg gag tct aat gga atc aag    504
Leu Asp Glu Leu Gly Leu Ser Lys Tyr Leu Glu Ser Asn Gly Ile Lys
            115                 120                 125
gtt tca ggt ttg ctg gtg ctg gat tat agt aaa gac tac aac cac tgg    552
Val Ser Gly Leu Leu Val Leu Asp Tyr Ser Lys Asp Tyr Asn His Trp
        130                 135                 140
ctg gct acc aag agt tta ggg caa tgg cta cag gaa gaa aag gtt cct    600
Leu Ala Thr Lys Ser Leu Gly Gln Trp Leu Gln Glu Glu Lys Val Pro
    145                 150                 155
gca att tat gga gtg gac aca aga atg ctg act aaa ata att cgg gat    648
Ala Ile Tyr Gly Val Asp Thr Arg Met Leu Thr Lys Ile Ile Arg Asp
160                 165                 170                 175
aag ggt acc atg ctt ggg aag att gaa ttt gaa ggt cag cct gtg gat    696
Lys Gly Thr Met Leu Gly Lys Ile Glu Phe Glu Gly Gln Pro Val Asp
                180                 185                 190
ttt gtg gat cca aat aaa cag aat ttg att gct gag gtt tca acc aag    744
Phe Val Asp Pro Asn Lys Gln Asn Leu Ile Ala Glu Val Ser Thr Lys
           195                 200                 205
gat gtc aaa gtg tac ggc aaa gga aac ccc aca aaa gtg gta gct gta    792
Asp Val Lys Val Tyr Gly Lys Gly Asn Pro Thr Lys Val Val Ala Val
        210                 215                 220
gac tgt ggg att aaa aac aat gta atc cgc ctg cta gta aag cga gga    840
Asp Cys Gly Ile Lys Asn Asn Val Ile Arg Leu Leu Val Lys Arg Gly
    225                 230                 235
gct gaa gtg cac tta gtt ccc tgg aac cat gat ttc acc aag atg gag    888
Ala Glu Val His Leu Val Pro Trp Asn His Asp Phe Thr Lys Met Glu
240                 245                 250                 255
tat gat ggg att ttg atc gcg gga gga ccg ggg aac cca gct ctt gca    936
Tyr Asp Gly Ile Leu Ile Ala Gly Gly Pro Gly Asn Pro Ala Leu Ala
                260                 265                 270
gaa cca cta att cag aat gtc aga aag att ttg gag agt gat cgc aag    984
Glu Pro Leu Ile Gln Asn Val Arg Lys Ile Leu Glu Ser Asp Arg Lys
            275                 280                 285
gag cca ttg ttt gga atc agt aca gga aac tta ata aca gga ttg gct    1032
Glu Pro Leu Phe Gly Ile Ser Thr Gly Asn Leu Ile Thr Gly Leu Ala
        290                 295                 300
gct ggt gcc aaa acc tac aag atg tcc atg gcc aac aga ggg cag aat    1080
Ala Gly Ala Lys Thr Tyr Lys Met Ser Met Ala Asn Arg Gly Gln Asn
    305                 310                 315
cag cct gtt ttg aat atc aca aac aaa cag gct ttc att act gct cag    1128
Gln Pro Val Leu Asn Ile Thr Asn Lys Gln Ala Phe Ile Thr Ala Gln
320                 325                 330                 335
aat cat ggc tat gcc ttg gac aac acc ctc cct gct ggc tgg aaa cca    1176
Asn His Gly Tyr Ala Leu Asp Asn Thr Leu Pro Ala Gly Trp Lys Pro
                340                 345                 350
ctt ttt gtg aat gtc aac gat caa aca aat gag ggg att atg cat gag    1224
Leu Phe Val Asn Val Asn Asp Gln Thr Asn Glu Gly Ile Met His Glu
            355                 360                 365
agc aaa ccc ttc ttc gct gtg cag ttc cac cca gag gtc acc ccg ggg    1272
Ser Lys Pro Phe Phe Ala Val Gln Phe His Pro Glu Val Thr Pro Gly
        370                 375                 380
cca ata gac act gag tac ctg ttt gat tcc ttt ttc tca ctg ata aag    1320
Pro Ile Asp Thr Glu Tyr Leu Phe Asp Ser Phe Phe Ser Leu Ile Lys
    385                 390                 395
aaa gga aaa gct acc acc att aca tca gtc tta ccg aag cca gca cta    1368
Lys Gly Lys Ala Thr Thr Ile Thr Ser Val Leu Pro Lys Pro Ala Leu
400                 405                 410                 415
gtt gca tct cgg gtt gag gtt tcc aaa gtc ctt att cta gga tca gga    1416
Val Ala Ser Arg Val Glu Val Ser Lys Val Leu Ile Leu Gly Ser Gly
                420                 425                 430
ggt ctg tcc att ggt cag gct gga gaa ttt gat tac tca gga tct caa    1464
Gly Leu Ser Ile Gly Gln Ala Gly Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Ser Gln
            435                 440                 445
gct gta aaa gcc atg aag gaa gaa aat gtc aaa act gtt ctg atg aac    1512
Ala Val Lys Ala Met Lys Glu Glu Asn Val Lys Thr Val Leu Met Asn
        450                 455                 460
cca aac att gca tca gtc cag acc aat gag gtg ggc tta aag caa gcg    1560
Pro Asn Ile Ala Ser Val Gln Thr Asn Glu Val Gly Leu Lys Gln Ala
    465                 470                 475
gat act gtc tac ttt ctt ccc atc acc cct cag ttt gtc aca gag gtc    1608
Asp Thr Val Tyr Phe Leu Pro Ile Thr Pro Gln Phe Val Thr Glu Val
480                 485                 490                 495
atc aag gca gaa cag cca gat ggg tta att ctg ggc atg ggt ggc cag    1656
Ile Lys Ala Glu Gln Pro Asp Gly Leu Ile Leu Gly Met Gly Gly Gln
                500                 505                 510
aca gct ctg aac tgt gga gtg gaa cta ttc aag aga ggt gtg ctc aag    1704
Thr Ala Leu Asn Cys Gly Val Glu Leu Phe Lys Arg Gly Val Leu Lys
            515                 520                 525
gaa tat ggt gtg aaa gtc ctg gga act tca gtt gag tcc att atg gct    1752
Glu Tyr Gly Val Lys Val Leu Gly Thr Ser Val Glu Ser Ile Met Ala
        530                 535                 540
acg gaa gac agg cag ctg ttt tca gat aaa cta aat gag atc aat gaa    1800
Thr Glu Asp Arg Gln Leu Phe Ser Asp Lys Leu Asn Glu Ile Asn Glu
    545                 550                 555
aag att gct cca agt ttt gca gtg gaa tcg att gag gat gca ctg aag    1848
Lys Ile Ala Pro Ser Phe Ala Val Glu Ser Ile Glu Asp Ala Leu Lys
560                 565                 570                 575
gca gca gac acc att ggc tac cca gtg atg atc cgt tcc gcc tat gca    1896
Ala Ala Asp Thr Ile Gly Tyr Pro Val Met Ile Arg Ser Ala Tyr Ala
                580                 585                 590
ctg ggt ggg tta ggc tca ggc atc tgt ccc aac aga gag act ttg atg    1944
Leu Gly Gly Leu Gly Ser Gly Ile Cys Pro Asn Arg Glu Thr Leu Met
            595                 600                 605
gac ctc agc aca aag gcc ttt gct atg acc aac caa att ctg gtg gag    1992
Asp Leu Ser Thr Lys Ala Phe Ala Met Thr Asn Gln Ile Leu Val Glu
        610                 615                 620
aag tca gtg aca ggt tgg aaa gaa ata gaa tat gaa gtg gtt cga gat    2040
Lys Ser Val Thr Gly Trp Lys Glu Ile Glu Tyr Glu Val Val Arg Asp
    625                 630                 635
gct gat gac aat tgt gtc act gtc tgt aac atg gaa aat gtt gat gcc    2088
Ala Asp Asp Asn Cys Val Thr Val Cys Asn Met Glu Asn Val Asp Ala
640                 645                 650                 655
atg ggt gtt cac aca ggt gac tca gtt gtt gtg gct cct gcc cag aca    2136
Met Gly Val His Thr Gly Asp Ser Val Val Val Ala Pro Ala Gln Thr
                660                 665                 670
ctc tcc aat gcc gag ttt cag atg ttg aga cgt act tca atc aat gtt    2184
Leu Ser Asn Ala Glu Phe Gln Met Leu Arg Arg Thr Ser Ile Asn Val
            675                 680                 685
gtt cgc cac ttg ggc att gtg ggt gaa tgc aac att cag ttt gcc ctt    2232
Val Arg His Leu Gly Ile Val Gly Glu Cys Asn Ile Gln Phe Ala Leu
        690                 695                 700
cat cct acc tca atg gaa tac tgc atc att gaa gtg aat gcc aga ctg    2280
His Pro Thr Ser Met Glu Tyr Cys Ile Ile Glu Val Asn Ala Arg Leu
    705                 710                 715
tcc cga agc tct gct ctg gcc tca aaa gcc act ggc tac cca ttg gca    2328
Ser Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala
720                 725                 730                 735
ttc att gct gca aag att gcc cta gga atc cca ctt cca gaa att aag    2376
Phe Ile Ala Ala Lys Ile Ala Leu Gly Ile Pro Leu Pro Glu Ile Lys
                740                 745                 750
aac gtc gta tcc ggg aag aca tca gcc tgt ttt gaa cct agc ctg gat    2424
Asn Val Val Ser Gly Lys Thr Ser Ala Cys Phe Glu Pro Ser Leu Asp
            755                 760                 765
tac atg gtc acc aag att ccc cgc tgg gat ctt gac cgt ttt cat gga    2472
Tyr Met Val Thr Lys Ile Pro Arg Trp Asp Leu Asp Arg Phe His Gly
        770                 775                 780
aca tct agc cga att ggt agc tct atg aaa agt gta gga gag gtc atg    2520
Thr Ser Ser Arg Ile Gly Ser Ser Met Lys Ser Val Gly Glu Val Met
    785                 790                 795
gct att ggt cgt acc ttt gag gag agt ttc cag aaa gct tta cgg atg    2568
Ala Ile Gly Arg Thr Phe Glu Glu Ser Phe Gln Lys Ala Leu Arg Met
800                 805                 810                 815
tgc cac cca tct ata gaa ggt ttc act ccc cgt ctc cca atg aac aaa    2616
Cys His Pro Ser Ile Glu Gly Phe Thr Pro Arg Leu Pro Met Asn Lys
                820                 825                 830
gaa tgg cca tct aat tta gat ctt aga aaa gag ttg tct gaa cca agc    2664
Glu Trp Pro Ser Asn Leu Asp Leu Arg Lys Glu Leu Ser Glu Pro Ser
            835                 840                 845
agc acg cgt atc tat gcc att gcc aag gcc att gat gac aac atg tcc    2712
Ser Thr Arg Ile Tyr Ala Ile Ala Lys Ala Ile Asp Asp Asn Met Ser
        850                 855                 860
ctt gat gag att gag aag ctc aca tac att gac aag tgg ttt ttg tat    2760
Leu Asp Glu Ile Glu Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Lys Trp Phe Leu Tyr
    865                 870                 875
aag atg cgt gat att tta aac atg gaa aag aca ctg aaa ggg ctc aac    2808
Lys Met Arg Asp Ile Leu Asn Met Glu Lys Thr Leu Lys Gly Leu Asn
880                 885                 890                 895
agt gag tcc atg aca gaa gaa acc ctg aaa agg gca aag gag att ggg    2856
Ser Glu Ser Met Thr Glu Glu Thr Leu Lys Arg Ala Lys Glu Ile Gly
                900                 905                 910
ttc tca gat aag cag att tca aaa tgc ctt ggg ctc act gag gcc cag    2904
Phe Ser Asp Lys Gln Ile Ser Lys Cys Leu Gly Leu Thr Glu Ala Gln
            915                 920                 925
aca agg gag ctg agg tta aag aaa aac atc cac cct tgg gtt aaa cag    2952
Thr Arg Glu Leu Arg Leu Lys Lys Asn Ile His Pro Trp Val Lys Gln
        930                 935                 940
att gat aca ctg gct gca gaa tac cca tca gta aca aac tat ctc tat    3000
Ile Asp Thr Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ser Val Thr Asn Tyr Leu Tyr
    945                 950                 955
gtt acc tac aat ggt cag gag cat gat gtc aat ttt gat gac cat gga    3048
Val Thr Tyr Asn Gly Gln Glu His Asp Val Asn Phe Asp Asp His Gly
960                 965                 970                 975
atg atg gtg cta ggc tgt ggt cca tat cac att ggc agc agt gtg gaa    3096
Met Met Val Leu Gly Cys Gly Pro Tyr His Ile Gly Ser Ser Val Glu
                980                 985                 990
ttt gat tgg tgt gct gtc tct agt atc cgc aca ctg cgt caa ctt ggc    3144
Phe Asp Trp Cys Ala Val Ser Ser Ile Arg Thr Leu Arg Gln Leu Gly
            995                1000                1005
aag aag acg gtg gtg gtg aat tgc aat cct gag act gtg agc aca    3189
Lys Lys Thr Val Val Val Asn Cys Asn Pro Glu Thr Val Ser Thr
        1010                1015                1020
gac ttt gat gag tgt gac aaa ctg tac ttt gaa gag ttg tcc ttg    3234
Asp Phe Asp Glu Cys Asp Lys Leu Tyr Phe Glu Glu Leu Ser Leu
        1025                1030                1035
gag aga atc cta gac atc tac cat cag gag gca tgt ggt ggc tgc    3279
Glu Arg Ile Leu Asp Ile Tyr His Gln Glu Ala Cys Gly Gly Cys
        1040                1045                1050
atc ata tca gtt gga ggc cag att cca aac aac ctg gca gtt cct    3324
Ile Ile Ser Val Gly Gly Gln Ile Pro Asn Asn Leu Ala Val Pro
        1055                1060                1065
cta tac aag aat ggt gtc aag atc atg ggc aca agc ccc ctg cag    3369
Leu Tyr Lys Asn Gly Val Lys Ile Met Gly Thr Ser Pro Leu Gln
        1070                1075                1080
atc gac agg gct gag gat cgc tcc atc ttc tca gct gtc ttg gat    3414
Ile Asp Arg Ala Glu Asp Arg Ser Ile Phe Ser Ala Val Leu Asp
        1085                1090                1095
gag ctg aag gtg gct cag gca cct tgg aaa gct gtt aat act ttg    3459
Glu Leu Lys Val Ala Gln Ala Pro Trp Lys Ala Val Asn Thr Leu
        1100                1105                1110
aat gaa gca ctg gaa ttt gca aag tct gtg gac tac ccc tgc ttg    3504
Asn Glu Ala Leu Glu Phe Ala Lys Ser Val Asp Tyr Pro Cys Leu
        1115                1120                1125
ttg agg cct tcc tat gtt ttg agt ggg tct gct atg aat gtg gta    3549
Leu Arg Pro Ser Tyr Val Leu Ser Gly Ser Ala Met Asn Val Val
        1130                1135                1140
ttc tct gag gat gag atg aaa aaa ttc cta gaa gag gcg act aga    3594
Phe Ser Glu Asp Glu Met Lys Lys Phe Leu Glu Glu Ala Thr Arg
        1145                1150                1155
gtt tct cag gag cac cca gtg gtc ctg aca aaa ttt gtt gaa ggg    3639
Val Ser Gln Glu His Pro Val Val Leu Thr Lys Phe Val Glu Gly
        1160                1165                1170
gcc cga gaa gta gaa atg gac gct gtt ggc aaa gat gga agg gtt    3684
Ala Arg Glu Val Glu Met Asp Ala Val Gly Lys Asp Gly Arg Val
        1175                1180                1185
atc tct cat gcc atc tct gaa cat gtt gaa gat gca ggt gtc cac    3729
Ile Ser His Ala Ile Ser Glu His Val Glu Asp Ala Gly Val His
        1190                1195                1200
tcg gga gat gcc act ctg atg ctg ccc aca caa acc atc agc caa    3774
Ser Gly Asp Ala Thr Leu Met Leu Pro Thr Gln Thr Ile Ser Gln
        1205                1210                1215
ggg gcc att gaa aag gtg aag gat gct acc cgg aag att gca aag    3819
Gly Ala Ile Glu Lys Val Lys Asp Ala Thr Arg Lys Ile Ala Lys
        1220                1225                1230
gct ttt gcc atc tct ggt cca ttc aac gtc caa ttt ctt gtc aaa    3864
Ala Phe Ala Ile Ser Gly Pro Phe Asn Val Gln Phe Leu Val Lys
        1235                1240                1245
gga aat gat gtc ttg gtg att gag tgt aac ttg aga gct tct cga    3909
Gly Asn Asp Val Leu Val Ile Glu Cys Asn Leu Arg Ala Ser Arg
        1250                1255                1260
tcc ttc ccc ttt gtt tcc aag act ctt ggg gtt gac ttc att gat    3954
Ser Phe Pro Phe Val Ser Lys Thr Leu Gly Val Asp Phe Ile Asp
        1265                1270                1275
gtg gcc acc aag gtg atg att gga gag aat gtt gat gag aaa cat    3999
Val Ala Thr Lys Val Met Ile Gly Glu Asn Val Asp Glu Lys His
        1280                1285                1290
ctt cca aca ttg gac cat ccc ata att cct gct gac tat gtt gca    4044
Leu Pro Thr Leu Asp His Pro Ile Ile Pro Ala Asp Tyr Val Ala
        1295                1300                1305
att aag gct ccc atg ttt tcc tgg ccc cgg ttg agg gat gct gac    4089
Ile Lys Ala Pro Met Phe Ser Trp Pro Arg Leu Arg Asp Ala Asp
        1310                1315                1320
ccc att ctg aga tgt gag atg gct tcc act gga gag gtg gct tgc    4134
Pro Ile Leu Arg Cys Glu Met Ala Ser Thr Gly Glu Val Ala Cys
        1325                1330                1335
ttt ggt gaa ggt att cat aca gcc ttc cta aag gca atg ctt tcc    4179
Phe Gly Glu Gly Ile His Thr Ala Phe Leu Lys Ala Met Leu Ser
        1340                1345                1350
aca gga ttt aag ata ccc cag aaa ggc atc ctg ata ggc atc cag    4224
Thr Gly Phe Lys Ile Pro Gln Lys Gly Ile Leu Ile Gly Ile Gln
        1355                1360                1365
caa tca ttc cgg cca aga ttc ctt ggt gtg gct gaa caa tta cac    4269
Gln Ser Phe Arg Pro Arg Phe Leu Gly Val Ala Glu Gln Leu His
        1370                1375                1380
aat gaa ggt ttc aag ctg ttt gcc acg gaa gcc aca tca gac tgg    4314
Asn Glu Gly Phe Lys Leu Phe Ala Thr Glu Ala Thr Ser Asp Trp
        1385                1390                1395
ctc aac gcc aac aat gtc cct gcc aac cca gtg gca tgg ccg tct    4359
Leu Asn Ala Asn Asn Val Pro Ala Asn Pro Val Ala Trp Pro Ser
        1400                1405                1410
caa gaa gga cag aat ccc agc ctc tct tcc atc aga aaa ttg att    4404
Gln Glu Gly Gln Asn Pro Ser Leu Ser Ser Ile Arg Lys Leu Ile
        1415                1420                1425
aga gat ggc agc att gac cta gtg att aac ctt ccc aac aac aac    4449
Arg Asp Gly Ser Ile Asp Leu Val Ile Asn Leu Pro Asn Asn Asn
        1430                1435                1440
act aaa ttt gtc cat gat aat tat gtg att cgg agg aca gct gtt    4494
Thr Lys Phe Val His Asp Asn Tyr Val Ile Arg Arg Thr Ala Val
        1445                1450                1455
gat agt gga atc cct ctc ctc act aat ttt cag gtg acc aaa ctt    4539
Asp Ser Gly Ile Pro Leu Leu Thr Asn Phe Gln Val Thr Lys Leu
        1460                1465                1470
ttt gct gaa gct gtg cag aaa tct cgc aag gtg gac tcc aag agt    4584
Phe Ala Glu Ala Val Gln Lys Ser Arg Lys Val Asp Ser Lys Ser
        1475                1480                1485
ctt ttc cac tac agg cag tac agt gct gga aaa gca gca tag    4626
Leu Phe His Tyr Arg Gln Tyr Ser Ala Gly Lys Ala Ala
        1490                1495                1500
agatgcagac accccagccc cattattaaa tcaacctgag ccacatgtta tctaaaggaa    4686
ctgattcaca actttctcag agatgaatat tgataactaa acttcatttc agtttacttt    4746
gttatgcctt aatattctgt gtcttttgca attaaattgt cagtcacttc ttcaaaacct    4806
tacagtcctt cctaagttac tcttcatgag atttcatcca tttactaata ctgtattttt    4866
ggtggactag gcttgcctat gtgcttatgt gtagcttttt actttttatg gtgctgatta    4926
atggtgatca aggtaggaaa agttgctgtt ctattttctg aactctttct atactttaag    4986
atactctatt tttaaaacac tatctgcaaa ctcaggacac tttaacaggg cagaatactc    5046
taaaaacttg ataaaatgaa atatagattt aatttatgaa ccttccatca tgatgtttgt    5106
gtattgcttc tttttggatc ctcattctca cccatttggc taatccagga atattgttat    5166
cccttcccat tatattgaag ttgagaaatg tgacagaggc atttagagta tggacttttc    5226
ttttcttttt ctttttcttt ttttcttttt gagatggagt cacactctcc aggctggagt    5286
gcagtggcac aatctcggct cactgcaatt tgcgtctccc aagttcaagc gattctcctg    5346
ctttagacta tggatttctt taaggaatac tggtttgcag ttttgttttc tggactatat    5406
cagcagatgg tagacagtgt ttatgtagat gtgttgttgt ttttatcatt ggattttaac    5466
ttggcccgag tgaaataatc agatttttgt cattcacact ctcccccagt tttggaataa    5526
cttggaagta aggttcattc ccttaagacg atggattctg ttgaactatg gggtcccaca    5586
ctgcactatt aattccaccc actgtaaggg caaggacacc attccttcta catataagaa    5646
aaaagtctct ccccaagggc agcctttgtt acttttaaat attttctgtt attacaagtg    5706
ctctaattgt  gaacttttaa ataaaatact attaagaggt aaaaaaaaaa aaaaa    5761
<210>2
<211>1500
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
Met Thr Arg Ile Leu Thr Ala Phe Lys Val Val Arg Thr Leu Lys Thr
1               5                   10                  15
Gly Phe Gly Phe Thr Asn Val Thr Ala His Gln Lys Trp Lys Phe Ser
            20                  25                  30
Arg Pro Gly Ile Arg Leu Leu Ser Val Lys Ala Gln Thr Ala His Ile
        35                  40                  45
Val Leu Glu Asp Gly Thr Lys Met Lys Gly Tyr Ser Phe Gly His Pro
    50                  55                  60
Ser Ser Val Ala Gly Glu Val Val Phe Asn Thr Gly Leu Gly Gly Tyr
65                  70                  75                  80
Pro Glu Ala Ile Thr Asp Pro Ala Tyr Lys Gly Gln Ile Leu Thr Met
                85                  90                  95
Ala Asn Pro Ile Ile Gly Asn Gly Gly Ala Pro Asp Thr Thr Ala Leu
            100                 105                 110
Asp Glu Leu Gly Leu Ser Lys Tyr Leu Glu Ser Asn Gly Ile Lys Val
        115                 120                 125
Ser Gly Leu Leu Val Leu Asp Tyr Ser Lys Asp Tyr Asn His Trp Leu
    130                 135                 140
Ala Thr Lys Ser Leu Gly Gln Trp Leu Gln Glu Glu Lys Val Pro Ala
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Gly Val Asp Thr Arg Met Leu Thr Lys Ile Ile Arg Asp Lys
                165                 170                 175
Gly Thr Met Leu Gly Lys Ile Glu Phe Glu Gly Gln Pro Val Asp Phe
            180                 185                 190
Val Asp Pro Asn Lys Gln Asn Leu Ile Ala Glu Val Ser Thr Lys Asp
        195                 200                 205
Val Lys Val Tyr Gly Lys Gly Asn Pro Thr Lys Val Val Ala Val Asp
     210                 215                 220
Cys Gly Ile Lys Asn Asn Val Ile Arg Leu Leu Val Lys Arg Gly Ala
225                 230                 235                 240
Glu Val His Leu Val Pro Trp Asn His Asp Phe Thr Lys Met Glu Tyr
                245                 250                 255
Asp Gly Ile Leu Ile Ala Gly Gly Pro Gly Asn Pro Ala Leu Ala Glu
            260                 265                 270
Pro Leu Ile Gln Asn Val Arg Lys Ile Leu Glu Ser Asp Arg Lys Glu
        275                 280                 285
Pro Leu Phe Gly Ile Ser Thr Gly Asn Leu Ile Thr Gly Leu Ala Ala
    290                 295                 300
Gly Ala Lys Thr Tyr Lys Met Ser Met Ala Asn Arg Gly Gln Asn Gln
305                 310                 315                 320
Pro Val Leu Asn Ile Thr Asn Lys Gln Ala Phe Ile Thr Ala Gln Asn
                325                 330                 335
His Gly Tyr Ala Leu Asp Asn Thr Leu Pro Ala Gly Trp Lys Pro Leu
            340                 345                 350
Phe Val Asn Val Asn Asp Gln Thr Asn Glu Gly Ile Met His Glu Ser
        355                 360                 365
Lys Pro Phe Phe Ala Val Gln Phe His Pro Glu Val Thr Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Ile Asp Thr Glu Tyr Leu Phe Asp Ser Phe Phe Ser Leu Ile Lys Lys
385                 390                 395                 400
Gly Lys Ala Thr Thr Ile Thr Ser Val Leu Pro Lys Pro Ala Leu Val
                405                 410                 415
Ala Ser Arg Val Glu Val Ser Lys Val Leu Ile Leu Gly Ser Gly Gly
            420                 425                 430
Leu Ser Ile Gly Gln Ala Gly Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Ser Gln Ala
        435                 440                 445
Val Lys Ala Met Lys Glu Glu Asn Val Lys Thr Val Leu Met Asn Pro
    450                 455                 460
Asn Ile Ala Ser Val Gln Thr Asn Glu Val Gly Leu Lys Gln Ala Asp
465                 470                 475                 480
Thr Val Tyr Phe Leu Pro Ile Thr Pro Gln Phe Val Thr Glu Val Ile
                485                 490                 495
Lys Ala Glu Gln Pro Asp Gly Leu Ile Leu Gly Met Gly Gly Gln Thr
            500                 505                 510
Ala Leu Asn Cys Gly Val Glu Leu Phe Lys Arg Gly Val Leu Lys Glu
        515                 520                 525
Tyr Gly Val Lys Val Leu Gly Thr Ser yal Glu Ser Ile Met Ala Thr
    530                 535                 540
Glu Asp Arg Gln Leu Phe Ser Asp Lys Leu Asn Glu Ile Asn Glu Lys
545                 550                 555                 560
Ile Ala Pro Ser Phe Ala Val Glu Ser Ile Glu Asp Ala Leu Lys Ala
                565                 570                 575
Ala Asp Thr Ile Gly Tyr Pro Val Met Ile Arg Ser Ala Tyr Ala Leu
            580                 585                 590
Gly Gly Leu Gly Ser Gly Ile Cys Pro Asn Arg Glu Thr Leu Met Asp
        595                 600                 605
Leu Ser Thr Lys Ala Phe Ala Met Thr Asn Gln Ile Leu Val Glu Lys
    610                 615                 620
Ser Val Thr Gly Trp Lys Glu Ile Glu Tyr Glu Val Val Arg Asp Ala
625                 630                 635                 640
Asp Asp Asn Cys Val Thr Val Cys Asn Met Glu Asn Val Asp Ala Met
                645                 650                 655
Gly Val His Thr Gly Asp Ser Val Val Val Ala Pro Ala Gln Thr Leu
            660                 665                 670
Ser Asn Ala Glu Phe Gln Met Leu Arg Arg Thr Ser Ile Asn Val Val
        675                 680                 685
Arg His Leu Gly Ile Val Gly Glu Cys Asn Ile Gln Phe Ala Leu His
    690                 695                 700
Pro Thr Ser Met Glu Tyr Cys Ile Ile Glu Val Asn Ala Arg Leu Ser
705                 710                 715                 720
Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Phe
                725                 730                 735
Ile Ala Ala Lys Ile Ala Leu Gly Ile Pro Leu Pro Glu Ile Lys Asn
            740                 745                 750
Val Val Ser Gly Lys Thr Ser Ala Cys Phe Glu Pro Ser Leu Asp Tyr
        755                 760                 765
Met Val Thr Lys Ile Pro Arg Trp Asp Leu Asp Arg Phe His Gly Thr
    770                 775                 780
Ser Ser Arg Ile Gly Ser Ser Met Lys Ser Val Gly Glu Val Met Ala
785                 790                 795                 800
Ile Gly Arg Thr Phe Glu Glu Ser Phe Gln Lys Ala Leu Arg Met Cys
                805                 810                 815
His Pro Ser Ile Glu Gly Phe Thr Pro Arg Leu Pro Met Asn Lys Glu
            820                 825                 830
Trp Pro Ser Asn Leu Asp Leu Arg Lys Glu Leu Ser Glu Pro Ser Ser
        835                 840                 845
Thr Arg Ile Tyr Ala Ile Ala Lys Ala Ile Asp Asp Asn Met Ser Leu
    850                 855                 860
Asp Glu Ile Glu Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Lys Trp Phe Leu Tyr Lys
865                 870                 875                 880
Met Arg Asp Ile Leu Asn Met Glu Lys Thr Leu Lys Gly Leu Asn Ser
                885                 890                 895
Glu Ser Met Thr Glu Glu Thr Leu Lys Arg Ala Lys Glu Ile Gly Phe
            900                 905                 910
Ser Asp Lys Gln Ile Ser Lys Cys Leu Gly Leu Thr Glu Ala Gln Thr
        915                 920                 925
Arg Glu Leu Arg Leu Lys Lys Asn Ile His Pro Trp Val Lys Gln Ile
    930                 935                 940
Asp Thr Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ser Val Thr Asn Tyr Leu Tyr Val
945                 950                 955                 960
Thr Tyr Asn Gly Gln Glu His Asp Val Asn Phe Asp Asp His Gly Met
                965                 970                 975
Met Val Leu Gly Cys Gly Pro Tyr His Ile Gly Ser Ser Val Glu Phe
            980                 985                 990
Asp Trp Cys Ala Val Ser Ser Ile Arg Thr Leu Arg Gln Leu Gly Lys
        995                1000                1005
Lys Thr Val Val Val Asn Cys Asn Pro Glu Thr Val Ser Thr Asp
    1010                1015                1020
Phe Asp  Glu Cys Asp Lys Leu Tyr Phe Glu Glu Leu Ser Leu Glu
    1025                1030                1035
Arg Ile Leu Asp Ile Tyr His Gln Glu Ala Cys Gly Gly Cys Ile
    1040                1045                1050
Ile Ser Val Gly Gly Gln Ile Pro Asn Asn Leu Ala Val Pro Leu
    1055                1060                1065
Tyr Lys Asn Gly Val Lys Ile Met Gly Thr Ser Pro Leu Gln Ile
    1070                1075                1080
Asp Arg Ala Glu Asp Arg Ser Ile Phe Ser Ala Val Leu Asp Glu
    1085                1090                1095
Leu Lys Val Ala Gln Ala Pro Trp Lys Ala Val Asn Thr Leu Asn
    1100                1105                1110
Glu Ala Leu Glu Phe Ala Lys Ser Val Asp Tyr Pro Cys Leu Leu
    1115                1120                1125
Arg Pro Ser Tyr Val Leu Ser Gly Ser Ala Met Asn Val Val Phe
    1130                1135                1140
Ser Glu Asp Glu Met Lys Lys Phe Leu Glu Glu Ala Thr Arg Val
    1145                1150                1155
Ser Gln Glu His Pro Val Val Leu Thr Lys Phe Val Glu Gly Ala
    1160                1165                1170
Arg Glu Val Glu Met Asp Ala Val Gly Lys Asp Gly Arg Val Ile
    1175                1180                1185
Ser His Ala Ile Ser Glu His Val Glu Asp Ala Gly Val His Ser
    1190                1195                1200
Gly Asp Ala Thr Leu Met Leu Pro Thr Gln Thr Ile Ser Gln Gly
    1205                1210                1215
Ala Ile Glu Lys Val Lys Asp Ala Thr Arg Lys Ile Ala Lys Ala
    1220                1225                1230
Phe Ala Ile Ser Gly Pro Phe Asn Val Gln Phe Leu Val Lys Gly
    1235                1240                1245
Asn Asp Val Leu Val Ile Glu Cys Asn Leu Arg Ala Ser Arg Ser
    1250                1255                1260
Phe Pro Phe Val Ser Lys Thr Leu Gly Val Asp Phe Ile Asp Val
    1265                1270                1275
Ala Thr Lys Val Met Ile Gly Glu Asn Val Asp Glu Lys His Leu
    1280                1285                1290
Pro Thr Leu Asp His Pro Ile Ile Pro Ala Asp Tyr Val Ala Ile
    1295                1300                1305
Lys Ala Pro Met Phe Ser Trp Pro Arg Leu Arg Asp Ala Asp Pro
    1310                1315                1320
Ile Leu Arg Cys Glu Met Ala Ser Thr Gly Glu Val Ala Cys Phe
    1325                1330                1335
Gly Glu Gly Ile His Thr Ala Phe Leu Lys Ala Met Leu Ser Thr
    1340                1345                1350
Gly Phe Lys Ile Pro Gln Lys Gly Ile Leu Ile Gly Ile Gln Gln
    1355                1360                1365
Ser Phe Arg Pro Arg Phe Leu Gly Val Ala Glu Gln Leu His Asn
    1370                1375                1380
Glu Gly Phe Lys Leu Phe Ala Thr Glu Ala Thr Ser Asp Trp Leu
    1385                1390                1395
Asn Ala Asn Asn Val Pro Ala Asn Pro Val Ala Trp Pro Ser Gln
    1400                1405                1410
Glu Gly Gln Asn Pro Ser Leu Ser SerIle Arg Lys Leu Ile Arg
    1415                1420                1425
Asp Gly Ser Ile Asp Leu Val Ile Asn Leu Pro Asn Asn Asn Thr
    1430                1435                1440
Lys Phe Val His Asp Asn Tyr Val Ile Arg Arg Thr Ala Val Asp
    1445                1450                1455
Ser Gly Ile Pro Leu Leu Thr Asn Phe Gln Val Thr Lys Leu Phe
    1460                1465                1470
Ala Glu Ala Val Gln Lys Ser Arg Lys Val Asp Ser Lys Ser Leu
    1475                1480                1485
Phe His Tyr Arg Gln Tyr Ser Ala Gly Lys Ala Ala
    1490                1495                1500
<210>3
<211>5761
<212>DNA
<213>Homc sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(124)..(4626)
<400>3
gtcagcctta aacactgact gcacccctcc cagatttctt ttacattaac taaaaagtct    60
tatcacacaa tctcataaaa tttatgtaat ttcatttaat tttagccaca aatcatcttc   120
aaa atg acg agg att ttg aca gct ttc aaa gtg gtg agg aca ctg aag    168
    Met Thr Arg Ile Leu Thr Ala Phe Lys Val Val Arg Thr Leu Lys
    1               5                   10                  15
act ggt ttt ggc ttt acc aat gtg act gca cac caa aaa tgg aaa ttt    216
Thr Gly Phe Gly Phe Thr Asn Val Thr Ala His Gln Lys Trp Lys Phe
                20                  25                  30
tca aga cct ggc atc agg ctc ctt tct gtc aag gca cag aca gca cac    264
Ser Arg Pro Gly Ile Arg Leu Leu Ser Val Lys Ala Gln Thr Ala His
            35                  40                  45
att gtc ctg gaa gat gga act aag atg aaa ggt tac tcc ttt ggc cat    312
Ile Val Leu Glu Asp Gly Thr Lys Met Lys Gly Tyr Ser Phe Gly His
        50                  55                  60
cca tcc tct gtt gct ggt gaa gtg gtt ttt aat act ggc ctg gga ggg    360
Pro Ser Ser Val Ala Gly Glu Val Val Phe Asn Thr Gly Leu Gly Gly
    65                  70                  75
tac cca gaa gct att act gac cct gcc tac aaa gga cag att ctc aca    408
Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Asp Pro Ala Tyr Lys Gly Gln Ile Leu Thr
80                  85                  90                  95
atg gcc aac cct att att ggg aat ggt gga gct cct gat act act gct    456
Met Ala Asn Pro Ile Ile Gly Asn Gly Gly Ala Pro Asp Thr Thr Ala
                100                 105                 110
ctg gat gaa ctg gga ctt agc aaa tat ttg gag tct aat gga atc aag    504
Leu Asp Glu Leu Gly Leu Ser Lys Tyr Leu Glu Ser Asn Gly Ile Lys
            115                 120                 125
gtt tca ggt ttg ctg gtg ctg gat tat agt aaa gac tac aac cac tgg    552
Val Ser Gly Leu Leu Val Leu Asp Tyr Ser Lys Asp Tyr Asn His Trp
        130                 135                 140
ctg gct acc aag agt tta ggg caa tgg cta cag gaa gaa aag gtt cct    600
Leu Ala Thr Lys Ser Leu Gly Gln Trp Leu Gln Glu Glu Lys Val Pro
    145                 150                 155
gca att tat gga gtg gac aca aga atg ctg act aaa ata att cgg gat    648
Ala Ile Tyr Gly Val Asp Thr Arg Met Leu Thr Lys Ile Ile Arg Asp
160                 165                 170                 175
aag ggt acc atg ctt ggg aag att gaa ttt gaa ggt cag cct gtg gat    696
Lys Gly Thr Met Leu Gly Lys Ile Glu Phe Glu Gly Gln Pro Val Asp
                180                 185                 190
ttt gtg gat cca aat aaa cag aat ttg att gct gag gtt tca acc aag    744
Phe Val Asp Pro Asn Lys Gln Asn Leu Ile Ala Glu Val Ser Thr Lys
            195                 200                 205
gat gtc aaa gtg tac ggc aaa gga aac ccc aca aaa gtg gta gct gta    792
Asp Val Lys Val Tyr Gly Lys Gly Asn Pro Thr Lys Val Val Ala Val
        210                 215                 220
gac tgt ggg att aaa aac aat gta atc cgc ctg cta gta aag cga gga    840
Asp Cys Gly Ile Lys Asn Asn Val Ile Arg Leu Leu Val Lys Arg Gly
    225                 230                 235
gct gaa gtg cac tta gtt ccc tgg aac cat gat ttc acc aag atg gag    888
Ala Glu Val His Leu Val Pro Trp Asn His Asp Phe Thr Lys Met Glu
240                 245                 250                 255
tat gat ggg att ttg atc gcg gga gga ccg ggg aac cca gct ctt gca    936
Tyr Asp Gly Ile Leu Ile Ala Gly Gly Pro Gly Asn Pro Ala Leu Ala
                260                 265                 270
gaa cca cta att cag aat gtc aga aag att ttg gag agt gat cgc aag    984
Glu Pro Leu Ile Gln Asn Val Arg Lys Ile Leu Glu Ser Asp Arg Lys
             275                 280                 285
gag cca ttg ttt gga atc agt aca gga aac tta ata aca gga ttg gct    1032
Glu Pro Leu Phe Gly Ile Ser Thr Gly Asn Leu Ile Thr Gly Leu Ala
        290                 295                 300
gct ggt gcc aaa acc tac aag atg tcc atg gcc aac aga ggg cag aat    1080
Ala Gly Ala Lys Thr Tyr Lys Met Ser Met Ala Asn Arg Gly Gln Asn
    305                 310                 315
cag cct gtt ttg aat atc aca aac aaa cag gct ttc att act gct cag    1128
Gln Pro Val Leu Asn Ile Thr Asn Lys Gln Ala Phe Ile Thr Ala Gln
320                 325                 330                 335
aat cat ggc tat gcc ttg gac aac acc ctc cct gct ggc tgg aaa cca    1176
Asn His Gly Tyr Ala Leu Asp Asn Thr Leu Pro Ala Gly Trp Lys Pro
                340                 345                 350
ctt ttt gtg aat gtc aac gat caa aca aat gag ggg att atg cat gag    1224
Leu Phe Val Asn Val Asn Asp Gln Thr Asn Glu Gly Ile Met His Glu
            355                 360                 365
agc aaa ccc ttc ttc gct gtg cag ttc cac cca gag gtc acc ccg ggg    1272
Ser Lys Pro Phe Phe Ala Val Gln Phe His Pro Glu Val Thr Pro Gly
        370                 375                 380
cca ata gac act gag tac ctg ttt gat tcc ttt ttc tca ctg ata aag    1320
Pro Ile Asp Thr Glu Tyr Leu Phe Asp Ser Phe Phe Ser Leu Ile Lys
    385                 390                 395
aaa gga aaa gct acc acc att aca tca gtc tta ccg aag cca gca cta    1368
Lys Gly Lys Ala Thr Thr Ile Thr Ser Val Leu Pro Lys Pro Ala Leu
400                 405                 410                 415
gtt gca tct cgg gtt gag gtt tcc aaa gtc ctt att cta gga tca gga    1416
Val Ala Ser Arg Val Glu Val Ser Lys Val Leu Ile Leu Gly Ser Gly
                420                 425                 430
ggt ctg tcc att ggt cag gct gga gaa ttt gat tac tca gga tct caa    1464
Gly Leu Ser Ile Gly Gln Ala Gly Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Ser Gln
            435                 440                 445
gct gta aaa gcc atg aag gaa gaa aat gtc aaa act gtt ctg atg aac    1512
Ala Val Lys Ala Met Lys Glu Glu Asn Val Lys Thr Val Leu Met Asn
        450                 455                 460
cca aac att gca tca gtc cag acc aat gag gtg ggc tta aag caa gcg    1560
Pro Asn Ile Ala Ser Val Gln Thr Asn Glu Val Gly Leu Lys Gln Ala
    465                 470                 475
gat act gtc tac ttt ctt ccc atc acc cct cag ttt gtc aca gag gtc    1608
Asp Thr Val Tyr Phe Leu Pro Ile Thr Pro Gln Phe Val Thr Glu Val
48                 0485                 490                 495
atc aag gca gaa cag cca gat ggg tta att ctg ggc atg ggt ggc cag    1656
Ile Lys Ala Glu Gln Pro Asp Gly Leu Ile Leu Gly Met Gly Gly Gln
                500                 505                 510
aca gct ctg aac tgt gga gtg gaa cta ttc aag aga ggt gtg ctc aag    1704
Thr Ala Leu Asn Cys Gly Val Glu Leu Phe Lys Arg Gly Val Leu Lys
            515                 520                 525
gaa tat ggt gtg aaa gtc ctg gga act tca gtt gag tcc att atg gct    1752
Glu Tyr Gly Val Lys Val Leu Gly Thr Ser Val Glu Ser Ile Met Ala
        530                 535                 540
acg gaa gac agg cag ctg ttt  tca gat aaa cta aat gag atc aat gaa    1800
Thr Glu Asp Arg Gln Leu Phe Ser Asp Lys Leu Asn Glu Ile Asn Glu
    545                 550                 555
aag att gct cca agt ttt gca gtg gaa tcg att gag gat gca ctg aag    1848
Lys Ile Ala Pro Ser Phe Ala Val Glu Ser Ile Glu Asp Ala Leu Lys
560                 565                 570                 575
gca gca gac acc att ggc tac cca gtg atg atc cgt tcc gcc tat gca    1896
Ala Ala Asp Thr Ile Gly Tyr Pro Val Met Ile Arg Ser Ala Tyr Ala
                580                 585                 590
ctg ggt ggg tta ggc tca ggc atc tgt ccc aac aga gag act ttg atg    1944
Leu Gly Gly Leu Gly Ser Gly Ile Cys Pro Asn Arg Glu Thr Leu Met
            595                 600                 605
gac ctc agc aca aag gcc ttt gct atg acc aac caa att ctg gtg gag    1992
Asp Leu Ser Thr Lys Ala Phe Ala Met Thr Asn Gln Ile Leu Val Glu
        610                 615                 620
aag tca gtg aca ggt tgg aaa gaa ata gaa tat gaa gtg gtt cga gat    2040
Lys Ser Val Thr Gly Trp Lys Glu Ile Glu Tyr Glu Val Val Arg Asp
    625                 630                 635
gct gat gac aat tgt gtc act gtc tgt aac atg gaa aat gtt gat gcc    2088
Ala Asp Asp Asn Cys Val Thr Val Cys Asn Met Glu Asn Val Asp Ala
640                 645                 650                 655
atg ggt gtt cac aca ggt gac tca gtt gtt gtg gct cct gcc cag aca    2136
Met Gly Val His Thr Gly Asp Ser Val Val Val Ala Pro Ala Gln Thr
                660                 665                 670
ctc tcc aat gcc gag ttt cag atg ttg aga cgt act tca atc aat gtt    2184
Leu Ser Asn Ala Glu Phe Gln Met Leu Arg Arg Thr Ser Ile Asn Val
            675                 680                 685
gtt cgc cac ttg ggc att gtg ggt gaa tgc aac att cag ttt gcc ctt    2232
Val Arg His Leu Gly Ile Val Gly Glu Cys Asn Ile Gln Phe Ala Leu
        690                 695                 700
cat cct acc tca atg gaa tac tgc atc att gaa gtg aat gcc aga ctg    2280
His Pro Thr Ser Met Glu Tyr Cys Ile Ile Glu Val Asn Ala Arg Leu
    705                 710                 715
tcc cga agc tct gct ctg gcc tca aaa gcc act ggc tac cca ttg gca    2328
Ser Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala
720                 725                 730                 735
ttc att gct gca aag att gcc cta gga atc cca ctt cca gaa att aag    2376
Phe Ile Ala Ala Lys Ile Ala Leu Gly Ile Pro Leu Pro Glu Ile Lys
                740                 745                 750
aac gtc gta tcc ggg aag aca tca gcc tgt ttt gaa cct agc ctg gat    2424
Asn Val Val Ser Gly Lys Thr Ser Ala Cys Phe Glu Pro Ser Leu Asp
            755                 760                 765
tac atg gtc acc aag att ccc cgc tgg gat ctt gac cgt ttt cat gga    2472
Tyr Met Val Thr Lys Ile Pro Arg Trp Asp Leu Asp Arg Phe His Gly
        770                 775                 780
aca tct agc cga att ggt agc tct atg aaa agt gta gga gag gtc atg    2520
Thr Ser Ser Arg Ile Gly Ser Ser Met Lys Ser Val Gly Glu Val Met
    785                 790                 795
gct att ggt cgt acc ttt gag gag agt ttc cag aaa gct tta cgg atg    2568
Ala Ile Gly Arg Thr Phe Glu Glu Ser Phe Gln Lys Ala Leu Arg Met
800                 805                 810                 815
tgc cac cca tct ata gaa ggt ttc act ccc cgt ctc cca atg aac aaa    2616
Cys His Pro Ser Ile Glu Gly Phe Thr Pro Arg Leu Pro Met Asn Lys
                820                 825                 830
gaa tgg cca tct aat tta gat ctt aga aaa gag ttg tct gaa cca agc    2664
Glu Trp Pro Ser Asn Leu Asp Leu Arg Lys Glu Leu Ser Glu Pro Ser
            835                 840                 845
agc acg cgt atc tat gcc att gcc aag gcc att gat gac aac atg tcc    2712
Ser Thr Arg Ile Tyr Ala Ile Ala Lys Ala Ile Asp Asp Asn Met Ser
        850                 855                 860
ctt gat gag att gag aag ctc aca tac att gac aag tgg ttt ttg tat    2760
Leu Asp Glu Ile Glu Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Lys Trp Phe Leu Tyr
    865                 870                 875
aag atg cgt gat att tta aac atg gaa aag aca ctg aaa ggg ctc aac    2808
Lys Met Arg Asp Ile Leu Asn Met Glu Lys Thr Leu Lys Gly Leu Asn
880                 885                 890                 895
agt gag tcc atg aca gaa gaa acc ctg aaa agg gca aag gag att ggg    2856
Ser Glu Ser Met Thr Glu Glu Thr Leu Lys Arg Ala Lys Glu Ile Gly
                900                 905                 910
ttc tca gat aag cag att tca aaa tgc ctt ggg ctc act gag gcc cag    2904
Phe Ser Asp Lys Gln Ile Ser Lys Cys Leu Gly Leu Thr Glu Ala Gln
            915                 920                 925
aca agg gag ctg agg tta aag aaa aac atc cac cct tgg gtt aaa cag    2952
Thr Arg Glu Leu Arg Leu Lys Lys Asn Ile His Pro Trp Val Lys Gln
        930                 935                 940
att gat acactg gct gca gaa tac cca t ca gta aca aac tat ctc tat    3000
Ile Asp Thr Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ser Val Thr Asn Tyr Leu Tyr
    945                 950                 955
gtt acc tac aat ggt cag gag cat gat gtc aat ttt gat gac cat gga    3048
Val Thr Tyr Asn Gly Gln Glu His Asp Val Asn Phe Asp Asp His Gly
960                 965                 970                 975
atg atg gtg cta ggc tgt ggt cca tat cac att ggc agc agt gtg gaa    3096
Met Met Val Leu Gly Cys Gly Pro Tyr His Ile Gly Ser Ser Val Glu
                980                 985                 990
ttt gat tgg tgt gct gtc tct agt atc cgc aca ctg cgt caa ctt ggc    3144
Phe Asp Trp Cys Ala Val Ser Ser Ile Arg Thr Leu Arg Gln Leu Gly
            995                 1000                1005
aag aag acg gtg gtg gtg aat tgc aat cct gag act gtg agc aca    3189
Lys Lys Thr Val Val Val Asn Cys Asn Pro Glu Thr Val Ser Thr
        1010                1015                1020
gac ttt gat gag tgt gac aaa ctg tac ttt gaa gag ttg tcc ttg    3234
Asp Phe Asp Glu Cys Asp Lys Leu Tyr Phe Glu Glu Leu Ser Leu
        1025                1030                1035
gag aga atc cta gac atc tac cat cag gag gca tgt ggt ggc tgc    3279
Glu Arg Ile Leu Asp Ile Tyr His Gln Glu Ala Cys Gly Gly Cys
        1040                1045                1050
atc ata tca gtt gga ggc cag att cca aac aac ctg gca gtt cct    3324
Ile Ile Ser Val Gly Gly Gln Ile Pro Asn Asn Leu Ala Val Pro
        1055                1060                1065
cta tac aag aat ggt gtc aag atc atg ggc aca agc ccc ctg cag    3369
Leu Tyr Lys Asn Gly Val Lys Ile Met Gly Thr Ser Pro Leu Gln
        1070                1075                1080
atc gac agg gct gag gat cgc tcc atc ttc tca gct gtc ttg gat    3414
Ile Asp Arg Ala Glu Asp Arg Ser Ile Phe Ser Ala Val Leu Asp
        1085                1090                1095
gag ctg aag gtg gct cag gca cct tgg aaa gct gtt aat act ttg    3459
Glu Leu Lys Val Ala Gln Ala Pro Trp Lys Ala Val Asn Thr Leu
        1100                1105               1110
aat gaa gca ctg gaa ttt gca aag tct gtg gac tac ccc tgc ttg    3504
Asn Glu Ala Leu Glu Phe Ala Lys Ser Val Asp Tyr Pro Cys Leu
        1115                1120                1125
ttg agg cct tcc tat gtt ttg agt ggg tct gct atg aat gtg gta    3549
Leu Arg Pro Ser Tyr Val Leu Ser Gly Ser Ala Met Asn Val Val
        1130                1135                1140
ttc tct gag gat gag atg aaa aaa ttc cta gaa gag gcg act aga    3594
Phe Ser Glu Asp Glu Met Lys Lys Phe Leu Glu Glu Ala Thr Arg
        1145                1150                1155
gtt tct cag gag cac cca gtg gtc ctg aca aaa ttt gtt gaa ggg    3639
Val Ser Gln Glu His Pro Val Val Leu Thr Lys Phe Val Glu Gly
        1160                1165                1170
gcc cga gaa gta gaa atg gac gct gtt ggc aaa gat gga agg gtt    3684
Ala Arg Glu Val Glu Met Asp Ala Val Gly Lys Asp Gly Arg Val
       1175                 1180                1185
atc tct cat gcc atc tct gaa cat gtt gaa gat gca ggt gtc cac    3729
Ile Ser His Ala Ile Ser Glu His Val Glu Asp Ala Gly Val His
        1190                1195                1200
tcg gga gat gcc act ctg atg ctg ccc aca caa acc atc agc caa    3774
Ser Gly Asp Ala Thr Leu Met Leu Pro Thr Gln Thr Ile Ser Gln
        1205                1210                1215
ggg gcc att gaa aag gtg aag gat gct acc cgg aag att gca aag    3819
Gly Ala Ile Glu Lys Val Lys Asp Ala Thr Arg Lys Ile Ala Lys
        1220                1225                1230
gct ttt gcc atc tct ggt cca ttc aac gtc caa ttt ctt gtc aaa    3864
Ala Phe Ala Ile Ser Gly Pro Phe Asn Val Gln Phe Leu Val Lys
       1235                 1240                1245
gga aat gat gtc ttg gtg att gag tgt aac ttg aga gct tct cga    3909
Gly Asn Asp Val Leu Val Ile Glu Cys Asn Leu Arg Ala Ser Arg
        1250                1255                1260
tcc ttc ccc ttt gtt tcc aag act ctt ggg gtt gac ttc att gat    3954
Ser Phe Pro Phe Val Ser Lys Thr Leu Gly Val Asp Phe Ile Asp
        1265                1270                1275
gtg gcc acc aag gtg atg att gga gag aat gtt gat gag aaa cat    3999
Val Ala Thr Lys Val Met Ile Gly Glu Asn Val Asp Glu Lys His
        1280                1285                1290
ctt cca aca ttg gac cat ccc ata att cct gct gac tat gtt gca    4044
Leu Pro Thr Leu Asp His Pro Ile Ile Pro Ala Asp Tyr Val Ala
        1295                1300                1305
att aag gct ccc atg ttt tcc tgg ccc cgg ttg agg gat gct gac    4089
Ile Lys Ala Pro Met Phe Ser Trp Pro Arg Leu Arg Asp Ala Asp
        13l0                1315                1320
ccc att ctg aga tgt gag atg gct tcc act gga gag gtg gct tgc    4134
Pro Ile Leu Arg Cys Glu Met Ala Ser Thr Gly Glu Val Ala Cys
        1325                1330                1335
ttt ggt gaa ggt att cat aca gcc ttc cta aag gca atg ctt tcc    4179
Phe Gly Glu Gly Ile His Thr Ala Phe Leu Lys Ala Met Leu Ser
        1340                1345                1350
aca gga ttt aag ata ccc cag aaa ggc atc ctg ata ggc atc cag    4224
Thr Gly Phe Lys Ile Pro Gln Lys Gly Ile Leu Ile Gly Ile Gln
        1355                1360                1365
caa tca ttc cgg cca aga ttc ctt ggt gtg gct gaa caa tta cac    4269
Gln Ser Phe Arg Pro Arg Phe Leu Gly Val Ala Glu Gln Leu His
        1370                1375                1380
aat gaa ggt ttc aag ctg ttt gcc acg gaa gcc aca tca gac tgg    4314
Asn Glu Gly Phe Lys Leu Phe Ala Thr Glu Ala Thr Ser Asp Trp
        1385                1390                1395
ctc aac gcc aac aat gtc cct gcc acc cca gtg gca tgg ccg tct    4359
Leu Asn Ala Asn Asn Val Pro Ala Thr Pro Val Ala Trp Pro Ser
        1400                1405                1410
caa gaa gga cag aat ccc agc ctc tct tcc atc aga aaa ttg att    4404
Gln Glu Gly Gln Asn Pro Ser Leu Ser Ser Ile Arg Lys Leu Ile
        1415                1420                1425
aga gat ggc agc att gac cta gtg att aac ctt ccc aac aac aac    4449
Arg Asp Gly Ser Ile Asp Leu Val Ile Asn Leu Pro Asn Asn Asn
        1430                1435                1440
act aaa ttt gtc cat gat aat tat gtg att cgg agg aca gct gtt    4494
Thr Lys Phe Val His Asp Asn Tyr Val Ile Arg Arg Thr Ala Val
        1445                1450                1455
gat agt gga atc cct ctc ctc act aat ttt cag gtg acc aaa ctt    4539
Asp Ser Gly Ile Pro Leu Leu Thr Asn Phe Gln Val Thr Lys Leu
        1460                1465                1470
ttt gct gaa gct gtg cag aaa tct cgc aag gtg gac tcc aag agt    4584
Phe Ala Glu Ala Val Gln Lys Ser Arg Lys Val Asp Ser Lys Ser
        1475                1480                1485
ctt ttc cac tac agg cag tac agt gct gga aaa gca gca tag       4626
Leu Phe His Tyr Arg Gln Tyr Ser Ala Gly Lys Ala Ala
        1490                1495                1500
agatgcagac accccagccc cattattaaa tcaacctgag ccacatgtta tctaaaggaa    4686
ctgattcaca actttctcag agatgaatat tgataactaa acttcatttc agtttacttt    4746
gttatgcctt aatattctgt gtcttttgca attaaattgt cagtcacttc ttcaaaacct    4806
tacagtcctt cctaagttac tcttcatgag atttcatcca tttactaata ctgtattttt    4866
ggtggactag gcttgcctat gtgcttatgt gtagcttttt actttttatg gtgctgatta    4926
atggtgatca aggtaggaaa agttgctgtt ctattttctg aactctttct atactttaag    4986
atactctatt tttaaaacac tatctgcaaa ctcaggacac tttaacaggg cagaatactc    5046
taaaaacttg ataaaatgaa atatagattt aatttatgaa ccttccatca tgatgtttgt    5106
gtattgcttc tttttggatc ctcattctca cccatttggc taatccagga atattgttat    5166
cccttcccat tatattgaag ttgagaaatg tgacagaggc atttagagta tggacttttc    5226
ttttcttttt ctttttcttt ttttcttttt gagatggagt cacactctcc aggctggagt    5286
gcagtggcac aatctcggct cactgcaatt tgcgtctccc aagttcaagc gattctcctg    5346
ctttagacta tggatttctt taaggaatac tggtttgcag ttttgttttc tggactatat    5406
cagcagatgg tagacagtgt ttatgtagat gtgttgttgt ttttatcatt ggattttaac    5466
ttggcccgag tgaaataatc agatttttgt cattcacact ctcccccagt tttggaataa    5526
cttggaagta aggttcattc ccttaagacg atggattctg ttgaactatg gggtcccaca    5586
ctgcactatt aattccaccc actgtaaggg caaggacacc attccttcta catataagaa    5646
aaaagtctct ccccaagggc agcctttgtt acttttaaat attttctgtt attacaagtg    5706
ctctaattgt gaacttttaa ataaaatact attaagaggt aaaaaaaaaa aaaaa         5761
<210>4
<211>1500
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>4
Met Thr Arg Ile Leu Thr Ala Phe Lys Val Val Arg Thr Leu Lys Thr
1               5                   10                  15
Gly Phe Gly Phe Thr Asn Val Thr Ala His Gln Lys Trp Lys Phe Ser
            20                  25                  30
Arg Pro Gly Ile Arg Leu Leu Ser Val Lys Ala Gln Thr Ala His Ile
        35                  40                  45
Val Leu Glu Asp Gly Thr Lys Met Lys Gly Tyr Ser Phe Gly His Pro
    50                  55                  60
Ser Ser Val Ala Gly Glu Val Val Phe Asn Thr Gly Leu Gly Gly Tyr
65                  70                  75                  80
Pro Glu Ala Ile Thr Asp Pro Ala Tyr Lys Gly Gln Ile Leu Thr Met
                85                  90                  95
Ala Asn Pro Ile Ile Gly Asn Gly Gly Ala Pro Asp Thr Thr Ala Leu
            100                 105                 110
Asp Glu Leu Gly Leu Ser Lys Tyr Leu Glu Ser Asn Gly Ile Lys Val
        115                 120                 125
Ser Gly Leu Leu Val Leu Asp Tyr Ser Lys Asp Tyr Asn His Trp Leu
    130                 135                 140
Ala Thr Lys Ser Leu Gly Gln Trp Leu Gln Glu Glu Lys Val Pro Ala
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Gly Val Asp Thr Arg Met Leu Thr Lys Ile Ile Arg Asp Lys
                165                 170                 175
Gly Thr Met Leu Gly Lys Ile Glu Phe Glu Gly Gln Pro Val Asp Phe
            180                 185                 190
Val Asp Pro Asn Lys Gln Asn Leu Ile Ala Glu Val Ser Thr Lys Asp
        195                 200                 205
Val Lys Val Tyr Gly Lys Gly Asn Pro Thr Lys Val Val Ala Val Asp
    210                 215                 220
Cys Gly Ile Lys Asn Asn Val Ile Arg Leu Leu Val Lys Arg Gly Ala
225                 230                 235                 240
Glu Val His Leu Val Pro Trp Asn His Asp Phe Thr Lys Met Glu Tyr
                245                 250                 255
Asp Gly Ile Leu Ile Ala Gly Gly Pro Gly Asn Pro Ala Leu Ala Glu
            260                 265                 270
Pro Leu Ile Gln Asn Val Arg Lys Ile Leu Glu Ser Asp Arg Lys Glu
        275                 280                 285
Pro Leu Phe Gly Ile Ser Thr Gly Asn Leu Ile Thr Gly Leu Ala Ala
    290                 295                 300
Gly Ala Lys Thr Tyr Lys Met Ser Met Ala Asn Arg Gly Gln Asn Gln
305                 310                 315                 320
Pro Val Leu Asn Ile Thr Asn Lys Gln Ala PheIle Thr Ala Gln Asn
                325                 330                 335
His Gly Tyr Ala Leu Asp Asn Thr Leu Pro Ala Gly Trp Lys Pro Leu
            340                 345                 350
Phe Val Asn Val Asn Asp Gln Thr Asn Glu Gly Ile Met His Glu Ser
        355                 360                 365
Lys Pro Phe Phe Ala Val Gln Phe His Pro Glu Val Thr Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Ile Asp Thr Glu Tyr Leu Phe Asp Ser Phe Phe Ser Leu Ile Lys Lys
385                 390                 395                 400
Gly Lys Ala Thr Thr Ile Thr Ser Val Leu Pro Lys Pro Ala Leu Val
                405                 410                 415
Ala Ser Arg Val Glu Val Ser Lys Val Leu Ile Leu Gly Ser Gly Gly
            420                 425                 430
Leu Ser Ile Gly Gln Ala Gly Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Ser Gln Ala
        435                 440                 445
Val Lys Ala Met Lys Glu Glu Asn Val Lys Thr Val Leu Met Asn Pro
    450                 455                 460
Asn Ile Ala Ser Val Gln Thr Asn Glu Val Gly Leu Lys Gln Ala Asp
465                 470                 475                 480
Thr Val Tyr Phe Leu Pro Ile Thr Pro Gln Phe Val Thr Glu Val Ile
                485                 490                 495
Lys Ala Glu Gln Pro Asp Gly Leu Ile Leu Gly Met Gly Gly Gln Thr
            500                 505                 510
Ala Leu Asn Cys Gly Val Glu Leu Phe Lys Arg Gly Val Leu Lys Glu
        515                 520                 525
Tyr Gly Val Lys Val Leu Gly Thr Ser Val Glu Ser Ile Met Ala Thr
    530                 535                 540
Glu Asp Arg Gln Leu Phe Ser Asp Lys Leu Asn Glu Ile Asn Glu Lys
545                 550                 555                 560
Ile Ala Pro Ser Phe Ala Val Glu Ser Ile Glu Asp Ala Leu Lys Ala
                565                 570                 575
Ala Asp Thr Ile Gly Tyr Pro Val Met Ile Arg Ser Ala Tyr Ala Leu
            580                 585                 590
Gly Gly Leu Gly Ser Gly Ile Cys Pro Asn Arg Glu Thr Leu Met Asp
        595                 600                 605
Leu Ser Thr Lys Ala Phe Ala Met Thr Asn Gln Ile Leu Val Glu Lys
    610                 615                 620
Ser Val Thr Gly Trp Lys Glu Ile Glu Tyr Glu Val Val Arg Asp Ala
625                 630                 635                 640
Asp Asp Asn Cys Val Thr Val Cys Asn Met Glu Asn Val Asp Ala Met
                645                 650                 655
Gly Val His Thr Gly Asp Ser Val Val Val Ala Pro Ala Gln Thr Leu
            660                 665                 670
Ser Asn Ala Glu Phe Gln Met Leu Arg Arg Thr Ser Ile Asn Val Val
        675                 680                 685
Arg His Leu Gly Ile Val Gly Glu Cys Asn Ile Gln Phe Ala Leu His
    690                 695                 700
Pro Thr Ser Met Glu Tyr Cys Ile Ile Glu Val Asn Ala Arg Leu Ser
705                 710                 715                 720
Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Phe
                725                 730                 735
Ile Ala Ala Lys Ile Ala Leu Gly Ile Pro Leu Pro Glu Ile Lys Asn
            740                 745                 750
Val Val Ser Gly Lys Thr Ser Ala Cys Phe Glu Pro Ser Leu Asp Tyr
        755                 760                 765
Met Val Thr Lys Ile Pro Arg Trp Asp Leu Asp Arg Phe His Gly Thr
    770                 775                 780
Ser Ser Arg Ile Gly Ser Ser Met Lys Ser Val Gly Glu Val Met Ala
785                 790                 795                 800
Ile Gly Arg Thr Phe Glu Glu Ser Phe Gln Lys Ala Leu Arg Met Cys
                805                 810                 815
His Pro Ser Ile Glu Gly Phe Thr Pro Arg Leu Pro Met Asn Lys Glu
            820                 825                 830
Trp Pro Ser Asn Leu Asp Leu Arg Lys Glu Leu Ser Glu Pro Ser Ser
        835                 840                 845
Thr Arg Ile Tyr Ala Ile Ala Lys Ala Ile Asp Asp Asn Met Ser Leu
    850                 855                 860
Asp Glu Ile Glu Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Lys Trp Phe Leu Tyr Lys
865                 870                 875                 880
Met Arg Asp Ile Leu Asn Met Glu Lys Thr Leu Lys Gly Leu Asn Ser
                885                 890                 895
Glu Ser Met Thr Glu Glu Thr Leu Lys Arg Ala Lys Glu Ile Gly Phe
            900                 905                 910
Ser Asp Lys Gln Ile Ser Lys Cys Leu Gly Leu Thr Glu Ala Gln Thr
        915                 920                 925
Arg Glu Leu Arg Leu Lys Lys Asn Ile His Pro Trp Val Lys Gln Ile
    930                 935                 940
Asp Thr Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ser Val Thr Asn Tyr Leu Tyr Val
945                 950                 955                 960
Thr Tyr Asn Gly Gln Glu His Asp Val Asn Phe Asp Asp His Gly Met
                965                 970                 975
Met Val Leu Gly Cys Gly Pro Tyr His Ile Gly Ser Ser Val Glu Phe
            980                 985                 990
Asp Trp Cys Ala Val Ser Ser Ile Arg Thr Leu Arg Gln Leu Gly Lys
        995                1000                1005
Lys Thr Val Val Val Asn Cys Asn Pro Glu Thr Val Ser Thr Asp
    1010                1015                1020
Phe Asp Glu Cys Asp Lys Leu Tyr Phe Glu Glu Leu Ser Leu Glu
    1025                1030                1035
Arg Ile Leu Asp Ile Tyr His  Gln Glu Ala Cys Gly Gly Cys Ile
    1040                1045                1050
Ile Ser Val Gly Gly Gln Ile Pro Asn Asn Leu Ala Val Pro Leu
    1055                1060                1065
Tyr Lys Asn Gly Val Lys Ile Met Gly Thr Ser Pro Leu Gln Ile
    1070                1075                1080
Asp Arg Ala Glu Asp Arg Ser Ile Phe Ser Ala Val Leu Asp Glu
    1085                1090                1095
Leu Lys Val Ala Gln Ala Pro Trp Lys Ala Val Asn Thr Leu Asn
    1100                1105                1110
Glu Ala Leu Glu Phe Ala Lys Ser Val Asp Tyr Pro Cys Leu Leu
    1115                1120                1125
Arg Pro Ser Tyr Val Leu Ser Gly Ser Ala Met Asn Val Val Phe
    1130                1135                1140
Ser Glu Asp Glu Met Lys Lys Phe Leu Glu Glu Ala Thr Arg Val
    1145                1150                1155
Ser Gln Glu His Pro Val Val Leu Thr Lys Phe Val Glu Gly Ala
    1160                1165                1170
Arg Glu Val Glu Met Asp Ala Val Gly Lys Asp Gly Arg ValIle
    1175                1180                1185
Ser His Ala Ile Ser Glu His Val Glu Asp Ala Gly Val His Ser
    1190                1195                1200
Gly Asp Ala Thr Leu Met Leu Pro Thr Gln Thr Ile Ser Gln Gly
    1205                1210                1215
Ala Ile Glu Lys Val Lys Asp Ala Thr Arg Lys Ile Ala Lys Ala
    1220                1225                1230
Phe Ala Ile Ser Gly Pro Phe Asn Val Gln Phe Leu Val Lys Gly
    1235                1240                1245
Asn Asp Val Leu Val Ile Glu Cys Asn Leu Arg Ala Ser Arg Ser
    1250                1255                1260
Phe Pro Phe Val Ser Lys Thr Leu Gly Val Asp Phe Ile Asp yal
    1265                1270                1275
Ala Thr Lys Val Met Ile Gly Glu Asn Val Asp Glu Lys His Leu
    1280                1285                1290
Pro Thr Leu Asp His Pro Ile Ile Pro Ala Asp Tyr Val Ala Ile
    1295                1300                1305
Lys Ala Pro Met Phe Ser Trp Pro Arg Leu Arg Asp Ala Asp Pro
    1310                1315                1320
Ile Leu Arg Cys Glu Met Ala Ser Thr Gly Glu Val Ala Cys Phe
    1325                1330                1335
Gly Glu Gly Ile His Thr Ala Phe Leu Lys Ala Met Leu Ser Thr
    1340                1345                1350
Gly Phe Lys Ile Pro Gln Lys Gly Ile Leu Ile Gly Ile Gln Gln
    1355                1360                1365
Ser Phe Arg Pro Arg Phe Leu Gly Val Ala Glu Gln Leu His Asn
    1370                1375                1380
Glu Gly Phe Lys Leu Phe Ala Thr Glu Ala Thr Ser Asp Trp Leu
    1385                1390                1395
Asn Ala Asn Asn Val Pro Ala Thr Pro Val Ala Trp Pro Ser Gln
    1400                1405                1410
Glu Gly Gln Asn Pro Ser Leu Ser Ser Ile Arg Lys Leu Ile Arg
    1415                1420                1425
Asp Gly Ser Ile Asp Leu Val Ile Asn Leu Pro Asn Asn Asn Thr
    1430                1435                1440
Lys Phe Val His Asp Asn Tyr Val Ile Arg Arg Thr Ala Val Asp
    1445                1450                1455
Ser Gly Ile Pro Leu Leu Thr Asn Phe Gln Val Thr Lys Leu Phe
    1460                1465                1470
Ala Glu Ala Val Gln Lys Ser Arg Lys Val Asp Ser Lys Ser Leu
    1475                1480                1485
Phe His Tyr Arg Gln Tyr Ser Ala Gly Lys Ala Ala
    1490                1495                1500
<210>5
<211>495
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(495)
<223>n is a，c，g，or t
<400>5
ctacttctca tgttcagcaa tttcttcttc tttatgtttt aaattacatg ttccataaaa    60
ataagaaatn cactgtgata cggtaattga ttttttcatt ttaaatgcag ctgtttgcca    120
cggaagccac atcagactgg ctcaacgcca acaatgtccc tgccacccca gtggcatggc    180
cgtctcaaga aggacagaat cccagcctct cttccatcag aaagtaagaa ctaggcatac    240
tgttttctga aataatttag aggattaact ttgagaacca gtatatgaat attcaccttg    300
cttgattgca agtcttttaa aacaaattta aaaatgaata catttgtgga tgattgtcaa    360
gtttcactct ccatcactat ggaatacata acgtcatgtg tacatggtga tatgaaacgt    420
gtttcaaaat acttcttagt aaggatactt tccttgacgg aaacaagtga gagtatgaag    480
aatgtaat gc agcac                                                    495
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>6
agctgtttgc cacggaagcc    20
<210>7
<211>28
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>7
cccagcctct  cttccatcag aaagtaag    28
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>8
cacggaagcc  acatcagact    20
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>9
ttctgatgga agagaggctt g    21
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>10
agagtgaaac ttgacaatca tcca    24
<210>11
<211>5761
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(124)..(4626)
<400>11
gtcagcctta aacactgact gcacccctcc cagatttctt ttacattaac taaaaagtct    60
tatcacacaa tctcataaaa tttatgtaat ttcatttaat tttagccaca aatcatcttc    120
aaa atg acg agg tta ttg aca gct ttc aaa gtg gtg agg aca ctg aag    168
    Met Thr Arg Leu Leu Thr Ala Phe Lys Val Val Arg Thr Leu Lys
    1               5                   10                  15
act ggt ttt ggc ttt acc aat gtg act gca cac caa aaa tgg aaa ttt    216
Thr Gly Phe Gly Phe Thr Asn Val Thr Ala His Gln Lys Trp Lys Phe
                20                  25                  30
tca aga cct ggc atc agg ctc ctt tct gtc aag gca cag aca gca cac    264
Ser Arg Pro Gly Ile Arg Leu Leu Ser Val Lys Ala Gln Thr Ala His
            35                  40                  45
att gtc ctg gaa gat gga act aag atg aaa ggt tac tcc ttt ggc cat    312
Ile Val Leu Glu Asp Gly Thr Lys Met Lys Gly Tyr Ser Phe Gly His
        50                  55                  60
cca tcc tct gtt gct ggt gaa gtg gtt ttt aat act ggc ctg gga ggg    360
Pro Ser Ser Val Ala Gly Glu Val Val Phe Asn Thr Gly Leu Gly Gly
    65                  70                  75
tac cca gaa gct att act gac cct gcc tac aaa gga cag att ctc aca    408
Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Asp Pro Ala Tyr Lys Gly Gln Ile Leu Thr
80                  85                  90                  95
atg gcc aac cct att att ggg aat ggt gga gct cct gat act act gct    456
Met Ala Asn Pro Ile Ile Gly Asn Gly Gly Ala Pro Asp Thr Thr Ala
                100                 105                 110
ctg gat gaa ctg gga ctt agc aaa tat ttg gag tct aat gga atc aag    504
Leu Asp Glu Leu Gly Leu Ser Lys Tyr Leu Glu Ser Asn Gly Ile Lys
            115                 120                 125
gtt tca ggt ttg ctg gtg ctg gat tat agt aaa gac tac aac cac tgg    552
Val Ser Gly Leu Leu Val Leu Asp Tyr Ser Lys Asp Tyr Asn His Trp
        130                 135                 140
ctg gct acc aag agt tta ggg caa tgg cta cag gaa gaa aag gtt cct    600
Leu Ala Thr Lys Ser Leu Gly Gln Trp Leu Gln Glu Glu Lys Val Pro
    145                 150                 155
gca att tat gga gtg gac aca aga atg ctg act aaa ata att cgg gat    648
Ala Ile Tyr Gly Val Asp Thr Arg Met Leu Thr Lys Ile Ile Arg Asp
160                 165                 170                 175
aag ggt acc atg ctt ggg aag att gaa ttt gaa ggt cag cct gtg gat    696
Lys Gly Thr Met Leu Gly Lys Ile Glu Phe Glu Gly Gln Pro Val Asp
180                 185                 190
ttt gtg gat cca aat aaa cag aat ttg att gct gag gtt tca acc aag    744
Phe Val Asp Pro Asn Lys Gln Asn Leu Ile Ala Glu Val Ser Thr Lys
            195                 200                 205
gat gtc aaa gtg tac ggc aaa gga aac ccc aca aaa gtg gta gct gta    792
Asp Val Lys Val Tyr Gly Lys Gly Asn Pro Thr Lys Val Val Ala Val
        210                 215                 220
gac tgt ggg att aaa aac aat gta atc cgc ctg cta gta aag cga gga    840
Asp Cys Gly Ile Lys Asn Asn Val Ile Arg Leu Leu Val Lys Arg Gly
    225                 230                 235
gct gaa gtg cac tta gtt ccc tgg aac cat gat ttc acc aag atg gag    888
Ala Glu Val His Leu Val Pro Trp Asn His Asp Phe Thr Lys Met Glu
240                 245                 250                 255
tat gat ggg att ttg atc gcg gga gga ccg ggg aac cca gct ctt gca    936
Tyr Asp Gly Ile Leu Ile Ala Gly Gly Pro Gly Asn Pro Ala Leu Ala
                260                 265                 270
gaa cca cta att cag aat gtc aga aag att ttg gag agt gat cgc aag    984
Glu Pro Leu Ile Gln Asn Val Arg Lys Ile Leu Glu Ser Asp Arg Lys
            275                 280                 285
gag cca ttg ttt gga atc agt aca gga aac tta ata aca gga ttg gct    1032
Glu Pro Leu Phe Gly Ile Ser Thr Gly Asn Leu Ile Thr Gly Leu Ala
        290                 295                 300
gct ggt gcc aaa acc tac aag atg tcc atg gcc aac aga ggg cag aat    1080
Ala Gly Ala Lys Thr Tyr Lys Met Ser Met Ala Asn Arg Gly Gln Asn
    305                 310                 315
cag cct gtt ttg aat atc aca aac aaa cag gct ttc att act gct cag    1128
Gln Pro Val Leu Asn Ile Thr Asn Lys Gln Ala Phe Ile Thr Ala Gln
320                 325                 330                 335
aat cat ggc tat gcc ttg gac aac acc ctc cct gct ggc tgg aaa cca    1176
Asn His Gly Tyr Ala Leu Asp Asn Thr Leu Pro Ala Gly Trp Lys Pro
                340                 345                 350
ctt ttt gtg aat gtc aac gat caa aca aat gag ggg att atg cat gag    1224
Leu Phe Val Asn Val Asn Asp Gln Thr Asn Glu Gly Ile Met His Glu
            355                 360                 365
agc aaa ccc ttc ttc gct gtg cag ttc cac cca gag gtc acc ccg ggg    1272
Ser Lys Pro Phe Phe Ala Val Gln Phe His Pro Glu Val Thr Pro Gly
        370                 375                 380
cca ata gac act gag tac ctg ttt gat tcc ttt ttc tca ctg ata aag    1320
Pro Ile Asp Thr Glu Tyr Leu Phe Asp Ser Phe Phe Ser Leu Ile Lys
    385                 390                 395
aaa gga aaa gct acc acc att aca tca gtc tta ccg aag cca gca cta    1368
Lys Gly Lys Ala Thr Thr Ile Thr Ser Val Leu Pro Lys Pro Ala Leu
400                 405                 410                 415
gtt gca tct cgg gtt gag gtt tcc aaa gtc ctt att cta gga tca gga    1416
Val Ala Ser Arg Val Glu Val Ser Lys Val Leu Ile Leu Gly Ser Gly
                420                 425                 430
ggt ctg tcc att ggt cag gct gga gaa ttt gat tac tca gga tct caa    1464
Gly Leu Ser Ile Gly Gln Ala Gly Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Ser Gln
            435                 440                 445
gct gta aaa gcc atg aag gaa gaa aat gtc aaa act gtt ctg atg aac    1512
Ala Val Lys Ala Met Lys Glu Glu Asn Val Lys Thr Val Leu Met Asn
        450                 455                 460
cca aac att gca tca gtc cag acc aat gag gtg ggc tta aag caa gcg    1560
Pro Asn Ile Ala Ser Val Gln Thr Asn Glu Val Gly Leu Lys Gln Ala
    465                 470                 475
gat act gtc tac ttt ctt ccc atc acc cct cag ttt gtc aca gag gtc    1608
Asp Thr Val Tyr Phe Leu Pro Ile Thr Pro Gln Phe Val Thr Glu Val
480                 485                 490                 495
atc aag gca gaa cag cca gat ggg tta att ctg ggc atg ggt ggc cag    1656
Ile Lys Ala Glu Gln Pro Asp Gly Leu Ile Leu Gly Met Gly Gly Gln
                500                 505                 510
aca gct ctg aac tgt gga gtg gaa cta ttc aag aga ggt gtg ctc aag    1704
Thr Ala Leu Asn Cys Gly Val Glu Leu Phe Lys Arg Gly Val Leu Lys
            515                 520                 525
gaa tat ggt gtg aaa gtc ctg gga act tca gtt gag tcc att atg gct    1752
Glu Tyr Gly Val Lys Val Leu Gly Thr Ser Val Glu Ser Ile Met Ala
        530                 535                 540
acg gaa gac agg cag ctg ttt tca gat aaa cta aat gag atc aat gaa    1800
Thr Glu Asp Arg Gln Leu Phe Ser Asp Lys Leu Asn Glu Ile Asn Glu
    545                 550                 555
aag att gct cca agt ttt gca gtg gaa tcg att gag gat gca ctg aag    1848
Lys Ile Ala Pro Ser Phe Ala Val Glu Ser Ile Glu Asp Ala Leu Lys
560                 565                 570                 575
gca gca gac acc att ggc tac cca gtg atg atc cgt tcc gcc tat gca    1896
Ala Ala Asp Thr Ile Gly Tyr Pro Val Met Ile Arg Ser Ala Tyr Ala
                580                 585                 590
ctg ggt ggg tta ggc tca ggc atc tgt ccc aac aga gag act ttg atg    1944
Leu Gly Gly Leu Gly Ser Gly Ile Cys Pro Asn Arg Glu Thr Leu Met
            595                 600                 605
gac ctc agc aca aag gcc ttt gct atg acc aac caa att ctg gtg gag    1992
Asp Leu Ser Thr Lys Ala Phe Ala Met Thr Asn Gln Ile Leu Val Glu
        610                 615                 620
aag tca gtg aca ggt tgg aaa gaa ata gaa tat gaa gtg gtt cga gat    2040
Lys Ser Val Thr Gly Trp Lys Glu Ile Glu Tyr Glu Val Val Arg Asp
    625                 630                 635
gct gat gac aat tgt gtc act gtc tgt aac atg gaa aat gtt gat gcc    2088
Ala Asp Asp Asn Cys Val Thr Val Cys Asn Met Glu Asn Val Asp Ala
640                 645                 650                 655
atg ggt gtt cac aca ggt gac tca gtt gtt gtg gct cct gcc cag aca    2136
Met Gly Val His Thr Gly Asp Ser Val Val Val Ala Pro Ala Gln Thr
                660                 665                 670
ctc tcc aat gcc gag ttt cag atg ttg aga cgt act tca atc aat gtt    2184
Leu Ser Asn Ala Glu Phe Gln Met Leu Arg Arg Thr Ser Ile Asn Val
            675                 680                 685
gtt cgc cac ttg ggc att gtg ggt gaa tgc aac att cag ttt gcc ctt    2232
Val Arg His Leu Gly Ile Val Gly Glu Cys Asn Ile Gln Phe Ala Leu
        690                 695                 700
cat cct acc tca atg gaa tac tgc atc att gaa gtg aat gcc aga ctg    2280
His Pro Thr Ser Met Glu Tyr Cys Ile Ile Glu Val Asn Ala Arg Leu
    705                 710                 715
tcc cga agc tct gct ctg gcc tca aaa gcc act ggc tac cca ttg gca    2328
Ser Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala
720                 725                 730                 735
ttc att gct gca aag att gcc cta gga atc cca ctt cca gaa att aag    2376
Phe Ile Ala Ala Lys Ile Ala Leu Gly Ile Pro Leu Pro Glu Ile Lys
                740                 745                 750
aac gtc gta tcc ggg aag aca tca gcc tgt ttt gaa cct agc ctg gat    2424
Asn Val Val Ser Gly Lys Thr Ser Ala Cys Phe Glu Pro Ser Leu Asp
            755                 760                 765
tac atg gtc acc aag att ccc cgc tgg gat ctt gac cgt ttt cat gga    2472
Tyr Met Val Thr Lys Ile Pro Arg Trp Asp Leu Asp Arg Phe His Gly
        770                 775                 780
aca tct agc cga att ggt agc tct atg aaa agt gta gga gag gtc atg    2520
Thr Ser Ser Arg Ile Gly Ser Ser Met Lys Ser Val Gly Glu Val Met
    785                 790                 795
gct att ggt cgt acc ttt gag gag agt ttc cag aaa gct tta cgg atg    2568
Ala Ile Gly Arg Thr Phe Glu Glu Ser Phe Gln Lys Ala Leu Arg Met
800                 805                 810                 815
tgc cac cca tct ata gaa ggt ttc act ccc cgt ctc cca atg aac aaa    2616
Cys His Pro Ser Ile Glu Gly Phe Thr Pro Arg Leu Pro Met Asn Lys
                820                 825                 830
gaa tgg cca tct aat tta gat ctt aga aaa gag ttg tct gaa cca agc    2664
Glu Trp Pro Ser Asn Leu Asp Leu Arg Lys Glu Leu Ser Glu Pro Ser
            835                 840                 845
agc acg cgt atc tat gcc att gcc aag gcc att gat gac aac atg tcc    2712
Ser Thr Arg Ile Tyr Ala Ile Ala Lys Ala Ile Asp Asp Asn Met Ser
        850                 855                 860
ctt gat gag att gag aag ctc aca tac att gac aag tgg ttt ttg tat    2760
Leu Asp Glu Ile Glu Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Lys Trp Phe Leu Tyr
    865                 870                 875
aag atg cgt gat att tta aac atg gaa aag aca ctg aaa ggg ctc aac    2808
Lys Met Arg Asp Ile Leu Asn Met Glu Lys Thr Leu Lys Gly Leu Asn
880                 885                 890                 895
agt gag tcc atg aca gaa gaa acc ctg aaa agg gca aag gag att ggg    2856
Ser Glu Ser Met Thr Glu Glu Thr Leu Lys Arg Ala Lys Glu Ile Gly
                900                 905                 910
ttc tca gat aag cag att tca aaa tgc ctt ggg ctc act gag gcc cag    2904
Phe Ser Asp Lys Gln Ile Ser Lys Cys Leu Gly Leu Thr Glu Ala Gln
            915                 920                 925
aca agg gag ctg agg tta aag aaa aac atc cac cct tgg gtt aaa cag    2952
Thr Arg Glu Leu Arg Leu Lys Lys Asn Ile His Pro Trp Val Lys Gln
        930                 935                 940
att gat aca ctg gct gca gaa tac cca tca gta aca aac tat ctc tat    3000
Ile Asp Thr Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ser Val Thr Asn Tyr Leu Tyr
    945                 950                 955
gtt acc tac aat ggt cag gag cat gat gtc aat ttt gat gac cat gga    3048
Val Thr Tyr Asn Gly Gln Glu His Asp Val Asn Phe Asp Asp His Gly
960                 965                 970                 975
atg atg gtg cta ggc tgt ggt cca tat cac att ggc agc agt gtg gaa    3096
Met Met Val Leu Gly Cys Gly Pro Tyr His Ile Gly Ser Ser Val Glu
                980                 985                 990
ttt gat tgg tgt gct gtc tct agt atc cgc aca ctg cgt caa ctt ggc    3144
Phe Asp Trp Cys Ala Val Ser Ser Ile Arg Thr Leu Arg Gln Leu Gly
            995                1000                1005
aag aag acg gtg gtg gtg aat tgc aat cct gag act gtg agc aca    3189
Lys Lys Thr Val Val Val Asn Cys Asn Pro Glu Thr Val Ser Thr
        1010                1015                1020
gac ttt gat gag tgt gac aaa ctg tac ttt gaa gag ttg  tcc ttg    3234
Asp Phe Asp Glu Cys Asp Lys Leu Tyr Phe Glu Glu Leu  Ser Leu
        1025                1030                1035
gag aga atc cta gac atc tac cat cag gag gca tgt ggt ggc tgc    3279
Glu Arg Ile Leu Asp Ile Tyr His Gln Glu Ala Cys Gly Gly Cys
        1040                1045                1050
atc ata tca gtt gga ggc cag att cca aac aac ctg gca gtt cct    3324
Ile Ile Ser Val Gly Gly Gln Ile Pro Asn Asn Leu Ala Val Pro
        1055                1060                1065
cta tac aag aat ggt gtc aag atc atg ggc aca agc ccc ctg cag    3369
Leu Tyr Lys Asn Gly Val Lys Ile Met Gly Thr Ser Pro Leu Gln
        1070                1075                1080
atc gac agg gct gag gat cgc tcc atc ttc tca gct gtc ttg gat    3414
Ile Asp Arg Ala Glu Asp Arg Ser Ile Phe Ser Ala Val Leu Asp
        1085                1090                1095
gag ctg aag gtg gct cag gca cct tgg aaa gct gtt aat act ttg    3459
Glu Leu Lys Val Ala Gln Ala Pro Trp Lys Ala Val Asn Thr Leu
        1100                1105                1110
aat gaa gca ctg gaa ttt gca aag tct gtg gac tac ccc tgc ttg    3504
Asn Glu Ala Leu Glu Phe Ala Lys Ser Val Asp Tyr Pro Cys Leu
        1115                1120                1125
ttg agg cct tcc tat gtt ttg agt ggg tct gct atg aat gtg gta    3549
Leu Arg Pro Ser Tyr Val Leu Ser Gly Ser Ala Met Asn Val Val
        1130                1135                1140
ttc tct gag gat gag atg aaa aaa ttc cta gaa gag gcg act aga    3594
Phe Ser Glu Asp Glu Met Lys Lys Phe Leu Glu Glu Ala Thr Arg
        1145                1150                1155
gtt tct cag gag cac cca gtg gtc ctg aca aaa ttt gtt gaa ggg    3639
Val Ser Gln Glu His Pro Val Val Leu Thr Lys Phe Val Glu Gly
        1160                1165                1170
gcc cga gaa gta gaa atg gac gct gtt ggc aaa gat gga agg gtt    3684
Ala Arg Glu Val Glu Met Asp Ala Val Gly Lys Asp Gly Arg Val
        1175                1180                1185
atc tct cat gcc atc tct gaa cat gtt gaa gat gca ggt gtc cac    3729
Ile Ser His  Ala Ile Ser Glu His Val Glu Asp Ala Gly Val His
        1190                1195                1200
tcg gga gat gcc act ctg atg ctg ccc aca caa acc atc agc caa    3774
Ser Gly Asp Ala Thr Leu Met Leu Pro Thr Gln Thr Ile Ser Gln
        1205                1210                1215
ggg gcc att gaa aag gtg aag gat gct acc cgg aag att gca aag    3819
Gly Ala Ile Glu Lys Val Lys Asp Ala Thr Arg Lys Ile Ala Lys
        1220                1225                1230
gct ttt gcc atc tct ggt cca ttc aac gtc caa ttt ctt gtc aaa    3864
Ala Phe Ala Ile Ser Gly Pro Phe Asn Val Gln Phe Leu Val Lys
        1235                1240                1245
gga aat gat gtc ttg gtg att gag tgt aac ttg aga gct tct cga    3909
Gly Asn Asp Val Leu Val Ile Glu Cys Asn Leu Arg Ala Ser Arg
        1250                1255                1260
tcc ttc ccc ttt gtt tcc aag act ctt ggg gtt gac ttc att gat    3954
Ser Phe Pro Phe Val Ser Lys Thr Leu Gly Val Asp Phe Ile Asp
        1265                1270                1275
gtg gcc acc aag gtg atg att gga gag aat gtt gat gag aaa cat    3999
Val Ala Thr Lys Val Met Ile Gly Glu Asn Val Asp Glu Lys His
        1280                1285                1290
ctt cca aca ttg gac cat ccc ata att cct gct gac tat gtt gca    4044
Leu Pro Thr Leu Asp His Pro Ile Ile Pro Ala Asp Tyr Val Ala
        1295                1300                1305
att aag gct ccc atg ttt tcc tgg ccc cgg ttg agg gat gct gac    4089
Ile Lys Ala Pro Met Phe Ser Trp Pro Arg Leu Arg Asp Ala Asp
        1310                1315                1320
ccc att ctg aga tgt gag atg gct tcc act gga gag gtg gct tgc    4134
Pro Ile Leu Arg Cys Glu Met Ala Ser Thr Gly Glu Val Ala Cys
        1325                1330                1335
ttt ggt gaa ggt att cat aca gcc ttc cta aag gca atg ctt tcc    4179
Phe Gly Glu Gly Ile His Thr Ala Phe Leu Lys Ala Met Leu Ser
        1340                1345                1350
aca gga ttt aag ata ccc cag aaa ggc atc ctg ata ggc atc cag    4224
Thr Gly Phe Lys Ile Pro Gln Lys Gly Ile Leu Ile Gly Ile Gln
        1355                1360                1365
caa tca ttc cgg cca aga ttc ctt ggt gtg gct gaa caa tta cac    4269
Gln Ser Phe Arg Pro Arg Phe Leu Gly Val Ala Glu Gln Leu His
        1370                1375                1380
aat gaa ggt ttc aag ctg ttt gcc acg gaa gcc aca tca gac tgg    4314
Asn Glu Gly Phe Lys Leu Phe Ala Thr Glu Ala Thr Ser Asp Trp
        1385                1390                1395
ctc aac gcc aac aat gtc cct gcc aac cca gtg gca tgg ccg tct    4359
Leu Asn Ala Asn Asn Val Pro Ala Asn Pro Val Ala Trp Pro Ser
        1400                1405                1410
caa gaa gga cag aat ccc agc ctc tct tcc atc aga aaa ttg att    4404
Gln Glu Gly Gln Asn Pro Ser Leu Ser Ser Ile Arg Lys Leu Ile
        1415                1420                1425
aga gat ggc agc att gac cta gtg att aac ctt ccc aac aac aac    4449
Arg Asp Gly Ser Ile Asp Leu Val Ile Asn Leu Pro Asn Asn Asn
        1430                1435                1440
act aaa ttt gtc cat gat aat tat gtg att cgg agg aca gct gtt    4494
Thr Lys Phe Val His Asp Asn Tyr Val Ile Arg Arg Thr Ala Val
        1445                1450                1455
gat agt gga atc cct ctc ctc act aat ttt cag gtg acc aaa ctt    4539
Asp Ser Gly Ile Pro Leu Leu Thr Asn Phe Gln Val Thr Lys Leu
        1460                1465                1470
ttt gct gaa gct gtg cag aaa tct cgc aag gtg gac tcc aag agt    4584
Phe Ala Glu Ala Val Gln Lys Ser Arg Lys Val Asp Ser Lys Ser
        1475                1480                1485
ctt ttc cac tac agg cag tac agt gct gga aaa gca gca tag        4626
Leu Phe His Tyr Arg Gln Tyr Ser Ala Gly Lys Ala Ala
        1490                1495                1500
agatgcagac accccagccc cattattaaa tcaacctgag ccacatgtta tctaaaggaa    4686
ctgattcaca actttctcag agatgaatat tgataactaa acttcatttc agtttacttt    4746
gttatgcctt aatattctgt gtcttttgca attaaattgt cagtcacttc ttcaaaacct    4806
tacagtcctt cctaagttac tcttcatgag atttcatcca tttactaata ctgtattttt    4866
ggtggactag gcttgcctat gtgcttatgt gtagcttttt actttttatg gtgctgatta    4926
atggtgatca aggtaggaaa agttgctgtt ctattttctg aactctttct atactttaag    4986
atactctatt tttaaaacac tatctgcaaa ctcaggacac tttaacaggg cagaatactc    5046
taaaaacttg ataaaatgaa atatagattt aatttatgaa ccttccatca tgatgtttgt    5106
gtattgcttc tttttggatc ctcattctca cccatttggc taatccagga atattgttat    5166
cccttcccat tatattgaag ttgagaaatg tgacagaggc atttagagta tggacttttc    5226
ttttcttttt ctttttcttt ttttcttttt gagatggagt cacactctcc aggctggagt    5286
gcagtggcac aatctcggct cactgcaatt tgcgtctccc aagttcaagc gattctcctg    5346
ctttagacta tggatttctt taaggaatac tggtttgcag ttttgttttc tggactatat    5406
cagcagatgg tagacagtgt ttatgtagat gtgttgttgt ttttatcatt ggattttaac    5466
ttggcccgag tgaaataatc agatttttgt cattcacact ctcccccagt tttggaataa    5526
cttggaagta aggttcattc ccttaagacg atggattctg ttgaactatg gggtcccaca    5586
ctgcactatt aattccaccc actgtaaggg caaggacacc attccttcta catataagaa    5646
aaaagtctct ccccaagggc agcctttgtt acttttaaat attttctgtt attacaagtg    5706
ctctaattgt gaacttttaa ataaaatact attaagaggt aaaaaaaaaa aaaaa         5761
<210>12
<211>1500
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>12
Met Thr Arg Leu Leu Thr Ala Phe Lys Val Val Arg Thr Leu Lys Thr
1               5                   10                  15
Gly Phe Gly Phe Thr Asn Val Thr Ala His Gln Lys Trp Lys Phe Ser
            20                  25                  30
Arg Pro Gly Ile Arg Leu Leu Ser Val Lys Ala Gln Thr Ala His Ile
        35                  40                  45
Val Leu Glu Asp Gly Thr Lys Met Lys Gly Tyr Ser Phe Gly His Pro
    50                  55                  60
Ser Ser Val Ala Gly Glu Val Val Phe Asn Thr Gly Leu Gly Gly Tyr
65                  70                  75                  80
Pro Glu Ala Ile Thr Asp Pro Ala Tyr Lys Gly Gln Ile Leu Thr Met
                85                  90                  95
Ala Asn Pro Ile Ile Gly Asn Gly Gly Ala Pro Asp Thr Thr Ala Leu
           100                 105                 110
Asp Glu Leu Gly Leu Ser Lys Tyr Leu Glu Ser Asn Gly Ile Lys Val
        115                 120                 125
Ser Gly Leu Leu Val Leu Asp Tyr Ser Lys Asp Tyr Asn His Trp Leu
    130                 135                 140
Ala Thr Lys Ser Leu Gly Gln Trp Leu Gln Glu Glu Lys Val Pro Ala
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Gly Val Asp Thr Arg Met Leu Thr Lys Ile Ile Arg Asp Lys
                165                 170                 175
Gly Thr Met Leu Gly Lys Ile Glu Phe Glu Gly Gln Pro Val Asp Phe
            180                 185                 190
Val Asp Pro Asn Lys Gln Asn Leu Ile Ala Glu Val Ser Thr Lys Asp
        195                 200                 205
Val Lys Val Tyr Gly Lys Gly Asn Pro Thr Lys Val Val Ala Val Asp
    210                 215                 220
Cys Gly Ile Lys Asn Asn Val Ile Arg Leu Leu Val Lys Arg Gly Ala
225                 230                 235                 240
Glu Val His Leu Val Pro Trp Asn His Asp Phe Thr Lys Met Glu Tyr
                245                 250                 255
Asp Gly Ile Leu Ile Ala Gly Gly Pro Gly Asn Pro Ala Leu Ala Glu
            260                 265                 270
Pro Leu Ile Gln Asn Val Arg Lys Ile Leu Glu Ser Asp Arg Lys Glu
        275                 280                 285
Pro Leu Phe Gly Ile Ser Thr Gly Asn Leu Ile Thr Gly Leu Ala Ala
    290                 295                 300
Gly Ala Lys Thr Tyr Lys Met Ser Met Ala Asn Arg Gly Gln Asn Gln
305                 310                 315                 320
Pro Val Leu Asn Ile Thr Asn Lys Gln Ala Phe Ile Thr Ala Gln Asn
                325                 330                 335
His Gly Tyr Ala Leu Asp Asn Thr Leu Pro Ala Gly Trp Lys Pro Leu
            340                 345                 350
Phe Val Asn Val Asn Asp Gln Thr Asn Glu Gly Ile Met His Glu Ser
        355                 360                 365
Lys Pro Phe Phe Ala Val Gln Phe His Pro Glu Val Thr Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Ile Asp Thr Glu Tyr Leu Phe Asp Ser Phe Phe Ser Leu Ile Lys Lys
385                 390                 395                 400
Gly Lys Ala Thr Thr Ile Thr Ser Val Leu Pro Lys Pro Ala Leu Val
                405                 410                 415
Ala Ser Arg Val Glu Val Ser Lys Val Leu Ile Leu Gly Ser Gly Gly
            420                 425                 430
Leu Ser Ile Gly Gln Ala Gly Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Ser Gln Ala
        435                 440                 445
Val Lys Ala Met Lys Glu Glu Asn Val Lys Thr Val Leu Met Asn Pro
    450                 455                 460
Asn Ile Ala Ser Val Gln Thr Asn Glu Val Gly Leu Lys Gln Ala Asp
465                 470                 475                 480
Thr Val Tyr Phe Leu Pro Ile Thr Pro Gln Phe Val Thr Glu Val Ile
                485                 490                 495
Lys Ala Glu Gln Pro Asp Gly Leu Ile Leu Gly Met Gly Gly Gln Thr
            500                 505                 510
Ala Leu Asn Cys Gly Val Glu Leu Phe Lys Arg Gly Val Leu Lys Glu
        515                 520                 525
Tyr Gly Val Lys Val Leu Gly Thr Ser Val Glu Ser Ile Met Ala Thr
    530                 535                 540
Glu Asp Arg Gln Leu Phe Ser Asp Lys Leu Asn Glu Ile Asn Glu Lys
545                 550                 555                 560
Ile Ala Pro Ser Phe Ala Val Glu Ser Ile Glu Asp Ala Leu Lys Ala
                565                 570                 575
Ala Asp Thr Ile Gly Tyr Pro Val Met Ile Arg Ser Ala Tyr Ala Leu
            580                 585                 590
Gly Gly Leu Gly Ser Gly Ile Cys Pro Asn Arg Glu Thr Leu Met Asp
        595                 600                 605
Leu Ser Thr Lys Ala Phe Ala Met Thr Asn Gln Ile Leu Val Glu Lys
    610                 615                 620
Ser Val Thr Gly Trp Lys Glu Ile Glu Tyr Glu Val Val Arg Asp Ala
625                 630                 635                 640
Asp Asp Asn Cys Val Thr Val Cys Asn Met Glu Asn Val Asp Ala Met
                645                 650                 655
Gly Val His Thr Gly Asp Ser Val Val Val Ala Pro Ala Gln Thr Leu
            660                 665                 670
Ser Asn Ala Glu Phe Gln Met Leu Arg Arg Thr Ser Ile Asn Val Val
        675                 680                 685
Arg His Leu Gly Ile Val Gly Glu Cys Asn Ile Gln Phe Ala Leu His
    690                 695                 700
Pro Thr Ser Met Glu Tyr Cys Ile Ile Glu Val Asn Ala Arg Leu Ser
705                 710                 715                 720
Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Phe
                725                 730                 735
Ile Ala Ala Lys Ile Ala Leu Gly Ile Pro Leu Pro Glu Ile Lys Asn
            740                 745                 750
Val Val Ser Gly Lys Thr Ser Ala Cys Phe Glu Pro Ser Leu Asp Tyr
        755                 760                 765
Met Val Thr LysIle Pro Arg Trp Asp Leu Asp Arg Phe Hi s Gly Thr
    770                 775                 780
Ser Ser Arg Ile Gly Ser Ser Met Lys Ser Val Gly Glu Val Met Ala
785                 790                 795                 800
Ile Gly Arg Thr Phe Glu Glu Ser Phe Gln Lys Ala Leu Arg Met Cys
                805                 810                 815
His Pro Ser Ile Glu Gly Phe Thr Pro Arg Leu Pro Met Asn Lys Glu
            820                 825                 830
Trp Pro Ser Asn Leu Asp Leu Arg Lys Glu Leu Ser Glu Pro Ser Ser
        835                 840                 845
Thr Arg Ile Tyr Ala Ile Ala Lys Ala Ile Asp Asp Asn Met Ser Leu
    850                 855                 860
Asp Glu Ile Glu Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Lys Trp Phe Leu Tyr Lys
865                 870                 875                 880
Met Arg Asp Ile Leu Asn Met Glu Lys Thr Leu Lys Gly Leu Asn Ser
                885                 890                 895
Glu Ser Met Thr Glu Glu Thr Leu Lys Arg Ala Lys Glu Ile Gly Phe
            900                 905                 910
Ser Asp Lys Gln Ile Ser Lys Cys Leu Gly Leu Thr Glu Ala Gln Thr
        915                 920                 925
Arg Glu Leu Arg Leu Lys Lys Asn Ile His Pro Trp Val Lys Gln Ile
    930                 935                 940
Asp Thr Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ser Val Thr Asn Tyr Leu Tyr Val
945                 950                 955                 960
Thr Tyr Asn Gly Gln Glu His Asp Val Asn Phe Asp Asp His Gly Met
                965                 970                 975
Met Val Leu Gly Cys Gly Pro Tyr His Ile Gly Ser Ser Val Glu Phe
            980                 985                 990
Asp Trp Cys Ala Val Ser Ser Ile Arg Thr Leu Arg Gln Leu Gly Lys
        995                 1000                1005
Lys Thr Val Val Val Asn Cys Asn Pro Glu Thr Val Ser Thr Asp
    1010                1015                1020
Phe Asp Glu Cys Asp Lys Leu Tyr Phe Glu Glu Leu Ser Leu Glu
    1025                1030                1035
Arg Ile Leu Asp Ile Tyr His Gln Glu Ala Cys Gly Gly Cys Ile
    1040                1045                1050
Ile Ser Val Gly Gly Gln Ile Pro Asn Asn Leu Ala Val Pro Leu
    1055                1060                1065
Tyr Lys Asn Gly Val Lys Ile Met Gly Thr Ser Pro Leu Gln Ile
    1070                1075                1080
Asp Arg Ala Glu Asp Arg Ser Ile Phe Ser Ala Val Leu Asp Glu
    1085                1090                1095
Leu Lys Val Ala Gln Ala Pro Trp Lys Ala Val Asn Thr Leu Asn
    1100                1105                1110
Glu Ala Leu Glu Phe Ala Lys Ser Val Asp Tyr Pro Cys Leu Leu
    1115                1120                1125
Arg Pro Ser Tyr Val Leu Ser Gly Ser Ala Met Asn Val Val Phe
    1130                1135                1140
Ser Glu Asp Glu Met Lys Lys Phe Leu Glu Glu Ala Thr Arg Val
    1145                1150                1155
Ser Gln Glu His Pro Val Val Leu Thr Lys Phe Val Glu Gly Ala
    1160                1165                1170
Arg Glu Val Glu Met Asp Ala Val Gly Lys Asp Gly Arg Val Ile
    1175                1180                1185
Ser His Ala Ile Ser Glu His Val Glu Asp Ala Gly Val His Ser
    1190                1195                1200
Gly Asp Ala Thr Leu Met Leu Pro Thr Gln Thr Ile Ser Gln Gly
   1205                 1210                1215
Ala Ile Glu Lys Val Lys Asp Ala Thr Arg Lys Ile Ala Lys Ala
    1220                1225                1230
Phe Ala Ile Ser Gly Pro Phe Asn Val Gln Phe Leu Val Lys Gly
    1235                1240                1245
Asn Asp Val Leu Val Ile Glu Cys Asn Leu Arg Ala Ser Arg Ser
    1250                1255                1260
Phe Pro Phe Val Ser Lys Thr Leu Gly Val Asp Phe Ile Asp Val
    1265                1270                1275
Ala Thr Lys Val Met Ile Gly Glu Asn Val Asp Glu Lys His Leu
    1280                1285                1290
Pro Thr Leu Asp His Pro Ile Ile Pro Ala Asp Tyr Val Ala Ile
    1295                1300                1305
Lys Ala Pro Met Phe Ser Trp Pro Arg Leu Arg Asp Ala Asp Pro
    1310                1315                1320
Ile Leu Arg Cys Glu Met Ala Ser Thr Gly Glu Val Ala Cys Phe
    1325                1330                1335
Gly Glu Gly Ile His Thr Ala Phe Leu Lys Ala Met Leu Ser Thr
    1340                1345                1350
Gly Phe Lys Ile Pro Gln Lys Gly Ile Leu Ile Gly Ile Gln Gln
    1355                1360                1365
Ser Phe Arg Pro Arg Phe Leu Gly Val Ala Glu Gln Leu His Asn
    1370                1375                1380
Glu Gly Phe Lys Leu Phe Ala Thr Glu Ala Thr Ser Asp Trp Leu
    1385                1390                1395
Asn Ala Asn Asn Val Pro Ala Asn Pro Val Ala Trp Pro Ser Gln
    1400                1405                1410
Glu Gly Gln Asn Pro Ser Leu Ser Ser Ile Arg Lys Leu Ile Arg
    1415                1420                1425
Asp Gly Ser Ile Asp Leu Val Ile Asn Leu Pro Asn Asn Asn Thr
    1430                1435                1440
Lys Phe Val His Asp Asn Tyr Val Ile Arg Arg Thr Ala Val Asp
    1445                1450                1455
Ser Gly Ile Pro Leu Leu Thr Asn Phe Gln Val Thr Lys Leu Phe
    1460                1465                1470
Ala Glu Ala Val Gln Lys Ser Arg Lys Val Asp Ser Lys Ser Leu
    1475                1480                1485
Phe His Tyr Arg Gln Tyr Ser Ala Gly Lys Ala Ala
    1490                1495                1500
<210>13
<211>5761
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(124)..(4626)
<400>13
gtcagcctta aacactgact gcacccctcc cagatttctt ttacattaac taaaaagtct    60
tatcacacaa tctcataaaa tttatgtaat ttcatttaat tttagccaca aatcatcttc    120
aaa atg acg agg att att aca gct ttc aaa gtg gtg agg aca ctg aag    168
    Met Thr Arg Ile Ile Thr Ala Phe Lys Val Val Arg Thr Leu Lys
    1               5                  10                  15
act ggt ttt ggc ttt acc aat gtg act gca cac caa aaa tgg aaa ttt    216
Thr Gly Phe Gly Phe Thr Asn Val Thr Ala His Gln Lys Trp Lys Phe
                20                  25                  30
tca aga cct ggc atc agg ctc ctt tct gtc aag gca cag aca gca cac    264
Ser Arg Pro Gly Ile Arg Leu Leu Ser Val Lys Ala Gln Thr Ala His
            35                  40                  45
att gtc ctg gaa gat gga act aag atg aaa ggt tac tcc ttt ggc cat    312
Ile Val Leu Glu Asp Gly Thr Lys Met Lys Gly Tyr Ser Phe Gly His
        50                  55                  60
cca tcc tct gtt gct ggt gaa gtg gtt ttt aat act ggc ctg gga ggg    360
Pro Ser Ser Val Ala Gly Glu Val Val Phe Asn Thr Gly Leu Gly Gly
    65                  70                  75
tac cca gaa gct att act gac cct gcc tac aaa gga cag att ctc aca    408
Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Asp Pro Ala Tyr Lys Gly Gln Ile Leu Thr
80                  85                  90                  95
atg gcc aac cct att att ggg aat ggt gga gct cct gat act act gct    456
Met Ala Asn Pro Ile Ile Gly Asn Gly Gly Ala Pro Asp Thr Thr Ala
                100                 105                 110
ctg gat gaa ctg gga ctt agc aaa tat ttg gag tct aat gga atc aag    504
Leu Asp Glu Leu Gly Leu Ser Lys Tyr Leu Glu Ser Asn Gly Ile Lys
            115                 120                 125
gtt tca ggt ttg ctg gtg ctg gat tat agt aaa gac tac aac cac tgg    552
Val Ser Gly Leu Leu Val Leu Asp Tyr Ser Lys Asp Tyr Asn His Trp
        130                 135                 140
ctg gct acc aag agt tta ggg caa tgg cta cag gaa gaa aag gtt cct    600
Leu Ala Thr Lys Ser Leu Gly Gln Trp Leu Gln Glu Glu Lys Val Pro
    145                 150                 155
gca att tat gga gtg gac aca aga atg ctg act aaa ata att cgg gat    648
Ala Ile Tyr Gly Val Asp Thr Arg Met Leu Thr Lys Ile Ile Arg Asp
160                 165                 170                 175
aag ggt acc atg ctt ggg aag att gaa ttt gaa ggt cag cct gtg gat    696
Lys Gly Thr Met Leu Gly Lys Ile Glu Phe Glu Gly Gln Pro Val Asp
                180                 185                 190
ttt gtg gat cca aat aaa cag aat ttg att gct gag gtt tca acc aag    744
Phe Val Asp Pro Asn Lys Gln Asn Leu Ile Ala Glu Val Ser Thr Lys
            195                 200                 205
gat gtc aaa gtg tac ggc aaa gga aac ccc aca aaa gtg gta gct gta    792
Asp Val Lys Val Tyr Gly Lys Gly Asn Pro Thr Lys Val Val Ala Val
         210                 215                 220
gac tgt ggg att aaa aac aat gta atc cgc ctg cta gta aag cga gga    840
Asp Cys Gly Ile Lys Asn Asn Val Ile Arg Leu Leu Val Lys Arg Gly
    225                 230                 235
gct gaa gtg cac tta gtt ccc tgg aac cat gat ttc acc aag atg gag    888
Ala Glu Val His Leu Val Pro Trp Asn His Asp Phe Thr Lys Met Glu
240                 245                 250                 255
tat gat ggg att ttg atc gcg gga gga ccg ggg aac cca gct ctt gca    936
Tyr Asp Gly Ile Leu Ile Ala Gly Gly Pro Gly Asn Pro Ala Leu Ala
                260                 265                 270
gaa cca cta att cag aat gtc aga aag att ttg gag agt gat cgc aag    984
Glu Pro Leu Ile Gln Asn Val Arg Lys Ile Leu Glu Ser Asp Arg Lys
            275                 280                 285
gag cca ttg ttt gga atc agt aca gga aac tta ata aca gga ttg gct    1032
Glu Pro Leu Phe Gly Ile Ser Thr Gly Asn Leu Ile Thr Gly Leu Ala
        290                 295                 300
gct ggt gcc aaa acc tac aag atg tcc atg gcc aac aga ggg cag aat    1080
Ala Gly Ala Lys Thr Tyr Lys Met Ser Met Ala Asn Arg Gly Gln Asn
    305                 310                 315
cag cct gtt ttg aat atc aca aac aaa cag gct ttc att act gct cag    1128
Gln Pro Val Leu Asn Ile Thr Asn Lys Gln Ala Phe Ile Thr Ala Gln
320                 325                 330                 335
aat cat ggc tat gcc ttg gac aac acc ctc cct gct ggc tgg aaa cca    1176
Asn His Gly Tyr Ala Leu Asp Asn Thr Leu Pro Ala Gly Trp Lys Pro
                340                 345                 350
ctt ttt gtg aat gtc aac gat caa aca aat gag ggg att atg cat gag    1224
Leu Phe Val Asn Val Asn Asp Gln Thr Asn Glu Gly Ile Met His Glu
            355                 360                 365
agc aaa ccc ttc ttc gct gtg cag ttc cac cca gag gtc acc ccg ggg    1272
Ser Lys Pro Phe Phe Ala Val Gln Phe His Pro Glu Val Thr Pro Gly
        370                 375                 380
cca ata gac act gag tac ctg ttt gat tcc ttt ttc tca ctg ata aag    1320
Pro Ile Asp Thr Glu Tyr Leu Phe Asp Ser Phe Phe Ser Leu Ile Lys
    385                 390                 395
aaa gga aaa gct acc acc att aca tca gtc tta ccg aag cca gca cta    1368
Lys Gly Lys Ala Thr Thr Ile Thr Ser Val Leu Pro Lys Pro Ala Leu
400                 405                 410                 415
gtt gca tct cgg gtt gag gtt tcc aaa gtc ctt att cta gga tca gga    1416
Val Ala Ser Arg Val Glu Val Ser Lys Val Leu Ile Leu Gly Ser Gly
                420                 425                 430
ggt ctg tcc att ggt cag gct gga gaa ttt gat tac tca gga tct caa    1464
Gly Leu Ser Ile Gly Gln Ala Gly Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Ser Gln
            435                 440                 445
gct gta aaa gcc atg aag gaa gaa aat gtc aaa act gtt ctg atg aac    1512
Ala Val Lys Ala Met Lys Glu Glu Asn Val Lys Thr Val Leu Met Asn
        450                 455                 460
cca aac att gca tca gtc cag acc aat gag gtg ggc tta aag caa gcg    1560
Pro Asn Ile Ala Ser Val Gln Thr Asn Glu Val Gly Leu Lys Gln Ala
    465                 470                 475
gat act gtc tac ttt ctt ccc atc acc cct cag ttt gtc aca gag gtc    1608
Asp Thr Val Tyr Phe Leu Pro Ile Thr Pro Gln Phe Val Thr Glu Val
480                 485                 490                 495
atc aag gca gaa cag cca gat ggg tta att ctg ggc atg ggt ggc cag    1656
Ile Lys Ala Glu Gln Pro Asp Gly Leu Ile Leu Gly Met Gly Gly Gln
                500                 505                 510
aca gct ctg aac tgt gga gtg gaa cta ttc aag aga ggt gtg ctc aag    1704
Thr Ala Leu Asn Cys Gly Val Glu Leu Phe Lys Arg Gly Val Leu Lys
            515                 520                 525
gaa tat ggt gtg aaa gtc ctg gga act tca gtt gag tcc att atg gct    1752
Glu Tyr Gly Val Lys Val Leu Gly Thr Ser Val Glu Ser Ile Met Ala
        530                 535                 540
acg gaa gac agg cag ctg ttt tca gat aaa cta aat gag atc aat gaa    1800
Thr Glu Asp Arg Gln Leu Phe Ser Asp Lys Leu Asn Glu Ile Asn Glu
    545                 550                 555
aag att gct cca agt ttt gca gtg gaa tcg att gag gat gca ctg aag    1848
Lys Ile Ala Pro Ser Phe Ala Val Glu Ser Ile Glu Asp Ala Leu Lys
560                 565                 570                 575
gca gca gac acc att ggc tac cca gtg atg atc cgt tcc gcc tat gca    1896
Ala Ala Asp Thr Ile Gly Tyr Pro Val Met Ile Arg Ser Ala Tyr Ala
                580                 585                 590
ctg ggt ggg tta ggc tca ggc atc tgt ccc aac aga gag act ttg atg    1944
Leu Gly Gly Leu Gly Ser Gly Ile Cys Pro Asn Arg Glu Thr Leu Met
            595                 600                 605
gac ctc agc aca aag gcc ttt gct atg acc aac caa att ctg gtg gag    1992
Asp Leu Ser Thr Lys Ala Phe Ala Met Thr Asn Gln Ile Leu Val Glu
        610                 615                 620
aag tca gtg aca ggt tgg aaa gaa ata gaa tat gaa gtg gtt cga gat    2040
Lys Ser Val Thr Gly Trp Lys Glu Ile Glu Tyr Glu Val Val Arg Asp
    625                 630                 635
gct gat gac aat tgt gtc act gtc tgt aac atg gaa aat gtt gat gcc    2088
Ala Asp Asp Asn Cys Val Thr Val Cys Asn Met Glu Asn Val Asp Ala
640                 645                 650                 655
atg ggt gtt cac aca ggt gac tca gtt gtt gtg gct cct gcc cag aca    2136
Met Gly Val His Thr Gly Asp Ser Val Val Val Ala Pro Ala Gln Thr
                660                 665                 670
ctc tcc aat gcc gag ttt cag atg ttg aga cgt act tca atc aat gtt    2184
Leu Ser Asn Ala Glu Phe Gln Met Leu Arg Arg Thr Ser Ile Asn Val
            675                 680                 685
gtt cgc cac ttg ggc att gtg ggt gaa tgc aac att cag ttt gcc ctt    2232
Val Arg His Leu Gly Ile Val Gly Glu Cys Asn Ile Gln Phe Ala Leu
        690                 695                 700
cat cct acc tca atg gaa tac tgc atc att gaa gtg aat gcc aga ctg    2280
His Pro Thr Ser Met Glu Tyr Cys Ile Ile Glu Val Asn Ala Arg Leu
    705                 710                 715
tcc cga agc tct gct ctg gcc tca aaa gcc act ggc tac cca ttg gca    2328
Ser Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala
720                 725                 730                 735
ttc att gct gca aag att gcc cta gga atc cca ctt cca gaa att aag    2376
Phe Ile Ala Ala Lys Ile Ala Leu Gly Ile Pro Leu Pro Glu Ile Lys
                740                 745                 750
aac gtc gta tcc ggg aag aca tca gcc tgt ttt gaa cct agc ctg gat    2424
Asn Val Val Ser Gly Lys Thr Ser Ala Cys Phe Glu Pro Ser Leu Asp
            755                 760                 765
tac atg gtc acc aag att ccc cgc tgg gat ctt gac cgt ttt cat gga    2472
Tyr Met Val Thr Lys Ile Pro Arg Trp Asp Leu Asp Arg Phe His Gly
        770                 775                 780
aca tct agc cga att ggt agc tct atg aaa agt gta gga gag gtc atg    2520
Thr Ser Ser Arg Ile Gly Ser Ser Met Lys Ser Val Gly Glu Val Met
    785                 790                 795
gct att ggt cgt acc ttt gag gag agt ttc cag aaa gct tta cgg atg    2568
Ala Ile Gly Arg Thr Phe Glu Glu Ser Phe Gln Lys Ala Leu Arg Met
800                 805                 810                 815
tgc cac cca tct ata gaa ggt ttc act ccc cgt ctc cca atg aac aaa    2616
Cys His Pro Ser Ile Glu Gly Phe Thr Pro Arg Leu Pro Met Asn Lys
                820                 825                 830
gaa tgg aca tct aat tta gat ctt aga aaa gag ttg tct gaa cca agc    2664
Glu Trp Pro Ser Asn Leu Asp Leu Arg Lys Glu Leu Ser Glu Pro Ser
            835                 840                 845
agc acg cgt atc tat gcc att gcc aag gcc att gat gac aac atg tcc    2712
Ser Thr Arg Ile Tyr Ala Ile Ala Lys Ala Ile Asp Asp Asn Met Ser
        850                 855                 860
ctt gat gag att gag aag ctc aca tac att gac aag tgg ttt ttg tat    2760
Leu Asp Glu Ile Glu Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Lys Trp Phe Leu Tyr
    865                 870                 875
aag atg cgt gat att tta aac atg gaa aag aca ctg aaa ggg ctc aac    2808
Lys Met Arg Asp Ile Leu Asn Met Glu Lys Thr Leu Lys Gly Leu Asn
880                 885                 890                 895
agt gag tcc atg aca gaa gaa acc ctg aaa agg gca aag gag att ggg    2856
Ser Glu Ser Met Thr Glu Glu Thr Leu Lys Arg Ala Lys Glu Ile Gly
                900                 905                 910
ttc tca gat aag cag att tca aaa tgc ctt ggg ctc act gag gcc cag    2904
Phe Ser Asp Lys Gln Ile Ser Lys Cys Leu Gly Leu Thr Glu Ala Gln
            915                 920                 925
aca agg gag ctg agg tta aag aaa aac atc cac cct tgg gtt aaa cag    2952
Thr Arg Glu Leu Arg Leu Lys Lys Asn Ile His Pro Trp Val Lys Gln
        930                 935                 940
att gat aca ctg gct gca gaa tac cca tca gta aca aac tat ctc tat    3000
Ile Asp Thr Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ser Val Thr Asn Tyr Leu Tyr
    945                 950                 955
gtt acc tac aat ggt cag gag cat gat gtc aat ttt gat gac cat gga    3048
Val Thr Tyr Asn Gly Gln Glu His Asp Val Asn Phe Asp Asp His Gly
960                 965                 970                 975
atg atg gtg cta ggc tgt ggt cca tat cac att ggc agc agt gtg gaa    3096
Met Met Val Leu Gly Cys Gly Pro Tyr His Ile Gly Ser Ser Val Glu
                980                 985                 990
ttt gat tgg tgt gct gtc tct agt atc cgc aca ctg cgt caa ctt ggc    3144
Phe Asp Trp Cys Ala Val Ser Ser Ile Arg Thr Leu Arg Gln Leu Gly
            995                     1000                1005
aag aag acg gtg gtg gtg aat tgc aat cct gag act gtg agc aca    3189
Lys Lys Thr Val Val Val Asn Cys Asn Pro Glu Thr Val Ser Thr
        1010                1015                1020
gac ttt gat gag tgt gac aaa ctg tac ttt gaa gag ttg tcc ttg    3234
Asp Phe Asp Glu Cys Asp Lys Leu Tyr Phe Glu Glu Leu Ser Leu
        1025                1030                1035
gag aga atc cta gac atc tac cat cag gag gca tgt ggt ggc tgc    3279
Glu Arg Ile Leu Asp Ile Tyr His Gln Glu Ala Cys Gly Gly Cys
        1040                1045                1050
atc ata tca gtt gga ggc cag att cca aac aac ctg gca gtt cct    3324
Ile Ile Ser Val Gly Gly Gln Ile Pro Asn Asn Leu Ala Val Pro
        1055                1060                1065
cta tac aag aat ggt gtc aag atc atg ggc aca agc ccc ctg cag    3369
Leu Tyr Lys Asn Gly Val Lys Ile Met Gly Thr Ser Pro Leu Gln
        1070                1075                1080
atc gac agg gct gag gat cgc tcc atc ttc tca gct gtc ttg gat    3414
Ile Asp Arg Ala Glu Asp Arg Ser Ile Phe Ser Ala Val Leu Asp
        1085                1090                1095
gag ctg aag gtg gct cag gca cct tgg aaa gct gtt aat act ttg    3459
Glu Leu Lys Val Ala Gln Ala Pro Trp Lys Ala Val Asn Thr Leu
        1100                1105                1110
aat gaa gca ctg gaa ttt gca aag tct gtg gac tac ccc tgc ttg    3504
Asn Glu Ala Leu Glu Phe Ala Lys Ser Val Asp Tyr Pro Cys Leu
        1115                1120                1125
ttg agg cct tcc tat gtt ttg agt ggg tct gct atg aat gtg gta    3549
Leu Arg Pro Ser Tyr Val Leu Ser Gly Ser Ala Met Asn Val Val
        1130                1135                1140
ttc tct gag gat gag atg aaa aaa ttc cta gaa gag gcg act aga    3594
Phe Ser Glu Asp Glu Met Lys Lys Phe Leu Glu Glu Ala Thr Arg
        1145                1150                1155
gtt tct cag gag cac cca gtg gtc ctg aca aaa ttt gtt gaa ggg    3639
Val Ser Gln Glu His Pro Val Val Leu Thr Lys Phe Val Glu Gly
        1160                1165                1170
gcc cga gaa gta gaa atg gac gct gtt ggc aaa gat gga agg gtt    3684
Ala Arg Glu Val Glu Met Asp Ala Val Gly Lys Asp Gly Arg Val
        1175                1180                1185
atc tct cat gcc atc tct gaa cat gtt gaa gat gca ggt gtc cac    3729
Ile Ser His Ala Ile Ser Glu His Val Glu Asp Ala Gly Val His
        1190                1195                1200
tcg gga gat gcc act ctg atg ctg ccc aca caa acc atc agc caa    3774
Ser Gly Asp Ala Thr Leu Met Leu Pro Thr Gln Thr Ile Ser Gln
        1205                1210                1215
ggg gcc att gaa aag gtg aag gat gct acc cgg aag att gca aag    3819
Gly Ala Ile Glu Lys Val Lys Asp Ala Thr Arg Lys Ile Ala Lys
        1220                1225                1230
gct ttt gcc atc tct ggt cca ttc aac gtc caa ttt ctt gtc aaa    3864
Ala Phe Ala Ile Ser Gly Pro Phe Asn Val Gln Phe Leu Val Lys
        1235                1240                1245
gga aat gat gtc ttg gtg att gag tgt aac ttg aga gct tct cga    3909
Gly Asn Asp Val Leu Val Ile Glu Cys Asn Leu Arg Ala Ser Arg
        1250                1255                1260
tcc ttc ccc ttt gtt tcc aag act ctt ggg gtt gac ttc att gat    3954
Ser Phe Pro Phe Val Ser Lys Thr Leu Gly Val Asp Phe Ile Asp
        1265                1270                1275
gtg gcc acc aag gtg atg att gga gag aat gtt gat gag aaa cat    3999
Val Ala Thr Lys Val Met Ile Gly Glu Asn Val Asp Glu Lys His
        1280                1285                1290
ctt cca aca ttg gac cat ccc ata att cct gct gac tat gtt gca    4044
Leu Pro Thr Leu Asp His Pro Ile Ile Pro Ala Asp Tyr Val Ala
        1295                1300                1305
att aag gct ccc atg ttt tcc tgg ccc cgg ttg agg gat gct gac    4089
Ile Lys Ala Pro Met Phe Ser Trp Pro Arg Leu Arg Asp Ala Asp
        1310                1315                1320
ccc att ctg aga tgt gag atg gct tcc act gga gag gtg gct tgc    4134
Pro Ile Leu Arg Cys Glu Met Ala Ser Thr Gly Glu Val Ala Cys
        1325                1330                1335
ttt ggt gaa ggt att cat aca gcc ttc cta aag gca atg ctt tcc    4179
Phe Gly Glu Gly Ile His Thr Ala Phe Leu Lys Ala Met Leu Ser
        1340                1345                1350
aca gga ttt aag ata ccc cag aaa ggc atc ctg ata ggc atc cag    4224
Thr Gly Phe Lys Ile Pro Gln Lys Gly Ile Leu Ile Gly Ile Gln
        1355                1360                1365
caa tca ttc cgg cca aga ttc ctt ggt gtg gct gaa caa tta cac    4269
Gln Ser Phe Arg Pro Arg Phe Leu Gly Val Ala Glu Gln Leu His
        1370                1375                1380
aat gaa ggt ttc aag ctg ttt gcc acg gaa gcc aca tca gac tgg    4314
Asn Glu Gly Phe Lys Leu Phe Ala Thr Glu Ala Thr Ser Asp Trp
        1385                1390                1395
ctc aac gcc aac aat gtc cct gcc aac cca gtg gca tgg ccg tct    4359
Leu Asn Ala Asn Asn Val Pro Ala Asn Pro Val Ala Trp Pro Ser
        1400                1405                1410
caa gaa gga cag aat ccc agc ctc tct tcc atc aga aaa ttg att    4404
Gln Glu Gly Gln Asn Pro Ser Leu Ser Ser Ile Arg Lys Leu Ile
        1415                1420                1425
aga gat ggc agc att gac cta gtg att aac ctt ccc aac aac aac    4449
Arg Asp Gly Ser Ile Asp Leu Val Ile Asn Leu Pro Asn Asn Asn
        1430                1435                1440
act aaa ttt gtc cat gat aat tat gtg att cgg agg aca gct gtt    4494
Thr Lys Phe Val His Asp Asn Tyr Val Ile Arg Arg Thr Ala Val
        1445                1450                1455
gat agt gga atc cct ctc ctc act aat ttt cag gtg acc aaa ctt    4539
Asp Ser Gly Ile Pro Leu Leu Thr Asn Phe Gln Val Thr Lys Leu
        1460                1465                 1470
ttt gct gaa gct gtg cag aaa tct cgc aag gtg gac tcc aag agt    4584
Phe Ala Glu Ala Val Gln Lys Ser Arg Lys Val Asp Ser Lys Ser
        1475                1480                1485
ctt ttc cac tac agg cag tac agt gct gga aaa gca gca tag        4626
Leu Phe His Tyr Arg Gln Tyr Ser Ala Gly Lys Ala Ala
        1490                1495               1500
agatgcagac accccagccc cattattaaa tcaacctgag ccacatgtta tctaaaggaa    4686
ctgattcaca actttctcag agatgaatat tgataactaa acttcatttc agtttacttt    4746
gttatgcctt aatattctgt gtcttttgca attaaattgt cagtcacttc ttcaaaacct    4806
tacagtcctt cctaagttac tcttcatgag atttcatcca tttactaata ctgtattttt    4866
ggtggactag gcttgcctat gtgcttatgt gtagcttttt actttttatg gtgctgatta    4926
atggtgatca aggtaggaaa agttgctgtt ctattttctg aactctttct atactttaag    4986
atactctatt tttaaaacac tatctgcaaa ctcaggacac tttaacaggg cagaatactc    5046
taaaaacttg ataaaatgaa atatagattt aatttatgaa ccttccatca tgatgtttgt    5106
gtattgcttc tttttggatc ctcattctca cccatttggc taatccagga atattgttat    5166
cccttcccat tatattgaag ttgagaaatg tgacagaggc atttagagta tggacttttc    5226
ttttcttttt ctttttcttt ttttcttttt gagatggagt cacactctcc aggctggagt    5286
gcagtggcac aatctcggct cactgcaatt tgcgtctccc aagttcaagc gattctcctg    5346
ctttagacta tggatttctt taaggaatac tggtttgcag ttttgttttc tggactatat    5406
cagcagatgg tagacagtgt ttatgtagat gtgttgttgt ttttatcatt ggattttaac    5466
ttggcccgag tgaaataatc agatttttgt cattcacact ctcccccagt tttggaataa    5526
cttggaagta aggttcattc ccttaagacg atggattctg ttgaactatg gggtcccaca    5586
ctgcactatt aattccaccc actgtaaggg caaggacacc attccttcta catataagaa    5646
aaaagtctct ccccaagggc agcctttgtt acttttaaat attttctgtt attacaagtg    5706
ctctaattgt gaacttttaa ataaaatact attaagaggt aaaaaaaaaa aaaaa         5761
<210>14
<211>1500
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>14
Met Thr Arg Ile Ile Thr Ala Phe Lys Val Val Arg Thr Leu Lys Thr
1               5                   10                  15
Gly Phe Gly Phe Thr Asn Val Thr Ala His Gln Lys Trp Lys Phe Ser
            20                  25                  30
Arg Pro Gly Ile Arg Leu Leu Ser Val Lys Ala Gln Thr Ala His Ile
        35                  40                  45
Val Leu Glu Asp Gly Thr Lys Met Lys Gly Tyr Ser Phe Gly His Pro
    50                  55                  60
Ser Ser Val Ala Gly Glu Val Val Phe Asn Thr Gly Leu Gly Gly Tyr
65                  70                  75                  80
Pro Glu Ala Ile Thr Asp Pro Ala Tyr Lys Gly Gln Ile Leu Thr Met
                85                  90                  95
Ala Asn Pro Ile Ile Gly Asn Gly Gly Ala Pro Asp Thr Thr Ala Leu
            100                 105                 110
Asp Glu Leu Gly Leu Ser Lys Tyr Leu Glu Ser Asn Gly Ile Lys Val
        115                 120                 125
Ser Gly Leu Leu Val Leu Asp Tyr Ser Lys Asp Tyr Asn His Trp Leu
    130                 135                 140
Ala Thr Lys Ser Leu Gly Gln Trp Leu Gln Glu Glu Lys Val Pro Ala
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Gly Val Asp Thr Arg Met Leu Thr Lys Ile Ile Arg Asp Lys
                165                 170                 175
Gly Thr Met Leu Gly Lys Ile Glu Phe Glu Gly Gln Pro Val Asp Phe
            180                 185                 190
Val Asp Pro Asn Lys Gln Asn Leu Ile Ala Glu Val Ser Thr Lys Asp
        195                 200                 205
Val Lys Val Tyr Gly Lys Gly Asn Pro Thr Lys Val Val Ala Val Asp
    210                 215                 220
Cys Gly Ile Lys Asn Asn Val Ile Arg Leu Leu Val Lys Arg Gly Ala
225                 230                 235                 240
Glu Val His Leu Val Pro Trp Asn His Asp Phe Thr Lys Met Glu Tyr
                245                 250                 255
Asp Gly Ile Leu Ile Ala Gly Gly Pro Gly Asn Pro Ala Leu Ala Glu
            260                 265                 270
Pro Leu Ile Gln Asn Val Arg Lys Ile Leu Glu Ser Asp Arg Lys Glu
        275                 280                 285
Pro Leu Phe Gly Ile Ser Thr Gly Asn Leu Ile Thr Gly Leu Ala Ala
    290                 295                 300
Gly Ala Lys Thr Tyr Lys Met Ser Met Ala Asn Arg Gly Gln Asn Gln
305                 310                 315                 320
Pro Val Leu Asn Ile Thr Asn Lys Gln Ala Phe Ile Thr Ala Gln Asn
                325                 330                 335
His Gly Tyr Ala Leu Asp Asn Thr Leu Pro Ala Gly Trp Lys Pro Leu
            340                 345                 350
Phe Val Asn Val Asn Asp Gln Thr Asn Glu Gly Ile Met His Glu Ser
        355                 360                 365
Lys Pro Phe Phe Ala Val Gln Phe His Pro Glu Val Thr Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Ile Asp Thr Glu Tyr Leu Phe Asp Ser Phe Phe Ser Leu Ile Lys Lys
385                 390                 395                 400
Gly Lys Ala Thr Thr Ile Thr Ser Val Leu Pro Lys Pro Ala Leu Val
                405                 410                 415
Ala Ser Arg Val Glu Val Ser Lys Val Leu Ile Leu Gly Ser Gly Gly
            420                 425                 430
Leu Ser Ile Gly Gln Ala Gly Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Ser Gln Ala
        435                 440                 445
Val Lys Ala Met Lys Glu Glu Asn Val Lys Thr Val Leu Met Asn Pro
    450                 455                 460
Asn Ile Ala Ser Val Gln Thr Asn Glu Val Gly Leu Lys Gln Ala Asp
465                 470                 475                 480
Thr Val Tyr Phe Leu Pro Ile Thr Pro Gln Phe Val Thr Glu Val Ile
                485                 490                 495
Lys Ala Glu Gln Pro Asp Gly Leu Ile Leu Gly Met Gly Gly Gln Thr
            500                 505                 510
Ala Leu Asn Cys Gly Val Glu Leu Phe Lys Arg Gly Val Leu Lys Glu
        515                 520                 525
Tyr Gly Val Lys Val Leu Gly Thr Ser Val Glu Ser Ile Met Ala Thr
    530                 535                 540
Glu Asp Arg Gln Leu Phe Ser Asp Lys Leu Asn Glu Ile Asn Glu Lys
545                 550                 555                 560
Ile Ala Pro Ser Phe Ala Val Glu Ser Ile Glu Asp Ala Leu Lys Ala
                565                 570                 575
Ala Asp Thr Ile Gly Tyr Pro Val Met Ile Arg Ser Ala Tyr Ala Leu
            580                 585                 590
Gly Gly Leu Gly Ser Gly Ile Cys Pro Asn Arg Glu Thr Leu Met Asp
        595                 600                 605
Leu Ser Thr Lys Ala Phe Ala Met Thr Asn Gln Ile Leu Val Glu Lys
    610                 615                 620
Ser Val Thr Gly Trp Lys Glu Ile Glu Tyr Glu Val Val Arg Asp Ala
625                 630                 635                 640
Asp Asp Asn Cys Val Thr Val Cys Asn Met Glu Asn Val Asp Ala Met
                645                 650                 655
Gly Val His Thr Gly Asp Ser Val Val Val Ala Pro Ala Gln Thr Leu
            660                 665                 670
Ser Asn Ala Glu Phe Gln Met Leu Arg Arg Thr Ser Ile Asn Val Val
        675                 680                 685
Arg His Leu Gly Ile Val Gly Glu Cys Asn Ile Gln Phe Ala Leu His
    690                 695                 700
Pro Thr Ser Met Glu Tyr Cys Ile Ile Glu Val Asn Ala Arg Leu Ser
705                 710                 715                 720
Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Phe
                725                 730                 735
Ile Ala Ala Lys Ile Ala Leu Gly Ile Pro Leu Pro Glu Ile Lys Asn
            740                 745                 750
Val Val Ser Gly Lys Thr Ser Ala Cys Phe Glu Pro Ser Leu Asp Tyr
        755                 760                 765
Met Val Thr Lys Ile Pro Arg Trp Asp Leu Asp Arg Phe His Gly Thr
    770                 775                 780
Ser Ser Arg Ile Gly Ser Ser Met Lys Ser Val Gly Glu Val Met Ala
785                 790                 795                 800
Ile Gly Arg Thr Phe Glu Glu Ser Phe Gln Lys Ala Leu Arg Met Cys
                805                 810                 815
His Pro Ser Ile Glu Gly Phe Thr Pro Arg Leu Pro Met Asn Lys Glu
            820                 825                 830
Trp Pro Ser Asn Leu Asp Leu Arg Lys Glu Leu Ser Glu Pro Ser Ser
        835                 840                 845
Thr Arg Ile Tyr Ala Ile Ala Lys Ala Ile Asp Asp Asn Met Ser Leu
    850                 855                 860
Asp Glu Ile Glu Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Lys Trp Phe Leu Tyr Lys
865                 870                 875                 880
Met Arg Asp Ile Leu Asn Met Glu Lys Thr Leu Lys Gly Leu Asn Ser
                885                 890                 895
Glu Ser Met Thr Glu Glu Thr Leu Lys Arg Ala Lys Glu Ile Gly Phe
            900                 905                 910
Ser Asp Lys Gln Ile Ser Lys Cys Leu Gly Leu Thr Glu Ala Gln Thr
        915                 920                 925
Arg Glu Leu Arg Leu Lys Lys Asn Ile His Pro Trp Val Lys Gln Ile
    930                 935                 940
Asp Thr Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ser Val Thr Asn Tyr Leu Tyr Val
945                 950                 955                 960
Thr Tyr Asn Gly Gln Glu His Asp Val Asn Phe Asp Asp His Gly Met
                965                 970                 975
Met Val Leu Gly Cys Gly Pro Tyr His Ile Gly Ser Ser Val Glu Phe
            980                 985                 990
Asp Trp Cys Ala Val Ser Ser Ile Arg Thr Leu Arg Gln Leu Gly Lys
        995                 1000                1005
Lys Thr Val Val Val Asn Cys Asn Pro Glu Thr Val Ser Thr Asp
    1010                1015                1020
Phe Asp Glu Cys Asp Lys Leu Tyr Phe Glu Glu Leu Ser Leu Glu
    1025                1030                1035
Arg Ile Leu Asp Ile Tyr His Gln Glu Ala Cys Gly Gly Cys Ile
    1040                1045                1050
Ile Ser Val Gly Gly Gln Ile Pro Asn Asn Leu Ala Val Pro Leu
    1055                1060                1065
Tyr Lys Asn Gly Val Lys Ile Met Gly Thr Ser Pro Leu Gln Ile
    1070                1075                1080
Asp Arg Ala Glu Asp Arg Ser Ile Phe Ser Ala Val Leu Asp Glu
    1085                1090                1095
Leu Lys Val Ala Gln Ala Pro Trp Lys Ala Val Asn Thr Leu Asn
    1100                1105                1110
Glu Ala Leu Glu Phe Ala Lys Ser Val Asp Tyr Pro Cys Leu Leu
    1115                1120                1125
Arg Pro Ser Tyr Val Leu Ser Gly Ser Ala Met Asn Val Val Phe
    1130                1135                1140
Ser Glu Asp Glu Met Lys Lys Phe Leu Glu Glu Ala Thr Arg Val
    1145                1150                1155
Ser Gln Glu His Pro Val Val Leu Thr Lys Phe Val Glu Gly Ala
    1160                1165                1170
Arg Glu Val Glu Met Asp Ala Val Gly Lys Asp Gly Arg Val Ile
    1175                1180                1185
Ser His Ala Ile Ser Glu His Val Glu Asp Ala Gly Val His Ser
    1190                1195                1200
Gly Asp Ala Thr Leu Met Leu Pro Thr Gln Thr Ile Ser Gln Gly
    1205                1210                1215
Ala Ile Glu Lys Val Lys Asp Ala Thr Arg Lys Ile Ala Lys Ala
    1220                1225                1230
Phe Ala Ile Ser Gly Pro Phe Asn Val Gln Phe Leu Val Lys Gly
   1235                1240                 1245
Asn Asp Val Leu Val Ile Glu Cys Asn Leu Arg Ala Ser Arg Ser
    1250                1255                1260
Phe Pro Phe Val Ser Lys Thr Leu Gly Val Asp Phe Ile Asp Val
    1265                1270                1275
Ala Thr Lys Val Met Ile Gly Glu Asn Val Asp Glu Lys His Leu
    1280                1285                1290
Pro Thr Leu Asp His Pro Ile Ile Pro Ala Asp Tyr Val Ala Ile
    1295                1300                1305
Lys Ala Pro Met Phe Ser Trp Pro Arg Leu Arg Asp Ala Asp Pro
    1310                1315                1320
Ile Leu Arg Cys Glu Met Ala Ser Thr Gly Glu Val Ala Cys Phe
    1325                1330                1335
Gly Glu Gly Ile His Thr Ala Phe Leu Lys Ala Met Leu Ser Thr
    13401                345                1350
Gly Phe Lys Ile Pro Gln Lys Gly Ile Leu Ile Gly Ile Gln Gln
    1355                1360                1365
Ser Phe Arg Pro Arg Phe Leu Gly Val Ala Glu Gln Leu His Asn
    1370                1375                1380
Glu Gly Phe Lys Leu Phe Ala Thr Glu Ala Thr Ser Asp Trp Leu
    1385                1390                1395
Asn Ala Asn Asn Val Pro Ala Asn Pro Val Ala Trp Pro Ser Gln
    1400                1405                1410
Glu Gly Gln Asn Pro Ser Leu Ser Ser Ile Arg Lys Leu Ile Arg
    1415                1420                1425
Asp Gly Ser Ile Asp Leu Val Ile Asn Leu Pro Asn Asn Asn Thr
    1430                1435                1440
Lys Phe Val His Asp Asn Tyr Val Ile Arg Arg Thr Ala Val Asp
    1445                1450                1455
Ser Gly Ile Pro Leu Leu Thr Asn Phe Gln Val Thr Lys Leu Phe
    1460                1465                1470
Ala Glu Ala Val Gln Lys Ser Arg Lys Val Asp Ser Lys Ser Leu
    1475                1480                1485
Phe His Tyr Arg Gln Tyr Ser Ala Gly Lys Ala Ala
    1490                1495                1500
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>15
cggaagccac atcagactgg    20
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>16
ggagagtgaa acttgacaat catc    24
<210>17
<211>19
<212>DNA
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tactgctcag aatcatggc    19
<210>18
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tcatcaccaa ctgaacagg    19
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<213>Homo sapiens
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ggttaagaga aggaggagct g    21
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aaccagtctt cagtgtcctc a    21
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<211>8
<212>PRT
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>X is A or S
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>X is T or S
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>X is A or Q
<400>23
Pro Val Xaa Trp Pro Xaa Xaa Glu
1               5

Claims (13)

1.一氧化氮前体在制备治疗或预防对象中亚最佳的尿素循环功能所致一氧化氮形成降低的药物中的应用，所述治疗或预防包括给患有与尿素循环中间体产生降低相关的病症的对象或者暴露于或将暴露于与尿素循环中间体产生降低相关的环境刺激的对象施用治疗有效量的一氧化氮前体，从而治疗或预防与所述病症或环境刺激相关的亚最佳尿素循环功能所致的一氧化氮形成降低。
2.权利要求1的应用，其中所述病症选自由肺动脉高压、坏死性小肠结肠炎(NEC)、人种特异性内皮细胞功能失调及其组合组成的组。
3.权利要求1的应用，其中所述与尿素循环中间体产生降低相关的环境刺激是心脏手术。
4.权利要求3的应用，其中术后肺动脉高压的风险在暴露于心脏手术的对象中是被降低的。
5.权利要求1-4任一项的应用，进一步包括检测对象中CPSI基因的多态性的最初步骤，优选其中在CPSI基因的第4340位核苷酸胞嘧啶转变为腺苷，其中治疗或预防的疾病或病症在具有所述多态性的患者中。
6.权利要求1-4任一项的应用，其中所述药物用于施用给人。
7.权利要求6的应用，其中所述人是新生儿、早产儿或婴儿。
8.权利要求1-4任一项的应用，其中所述药物静脉内施用。
9.权利要求1-4任一项的应用，其中升高一氧化氮前体水平的化合物是瓜氨酸、精氨酸或其组合。
10.权利要求9的应用，其中所述一氧化氮前体是瓜氨酸。
11.权利要求1-4任一项的应用，其中所述一氧化氮前体以大约0.01mg至大约1000mg范围的剂量施用。
12.权利要求1-4任一项的应用，其中所述一氧化氮前体以大约0.5mg至大约500mg范围的剂量施用。
13.权利要求1-4任一项的应用，其中所述一氧化氮前体以大约1.0mg至大约250mg范围的剂量施用。
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