JP2015007090A - 一酸化窒素前駆体を用いる治療方法 - Google Patents

Abstract

【課題】尿素回路中間体産生及び／又は一酸化窒素産生低下、並びにそれらに起因する疾患の予防及び／又は治療方法の提供。【解決手段】シトルリン、アルギニン等に代表される一酸化窒素前駆体を、尿素回路中間体産生及び／又は一酸化窒素産生が低下した、或いはそれらに起因する疾患を発症した治療対象に投与する工程を含む方法。前記疾患としては、肝炎、肝硬変、肺高血圧症、壊死性腸炎（ＮＥＣ）、急性呼吸促迫症候群、民族特異的内皮機能不全、勃起障害、骨髄移植を受けた対象における骨髄移植毒性、敗血症、喘息等が挙げられ、前記投与方法としては経静脈又は経口投与が好ましい。【選択図】図１

Description

（関連出願との相互参照）
本出願書類は、２００４年２月２４日に出願された米国特許出願番号１０/７８５，３
７４号の一部継続出願であり、かつ優先権を主張する。１０／７８５，３７４号は、２０
００年６月１日に出願された米国特許出願０９／５８５，０７７号の一部継続であり、０
９／５８５，００７号は、１９９９年６月１日に出願された米国特許出願番号０９／３２
３，４７２の一部継続であり、現在特許番号６，３４６，３８２号である。これらの全内
容は、引用により本明細書中に組み込まれている。
（助成金の記述）
本研究は、ＮＩＨ助成金Ｒ２９−ＤＫ４６９６５、ＮＩＨ ＨＬ ５５１９８、ＮＩＨ
ＥＳ ０９９１５、及びＮＩＨ １Ｐ３０ ＣＡ ６８４８５により、援助されている。
従って、米国政府はここで開示される主題において、特定の権利を有する。

（技術分野）
ここで開示される主題は、カルバミルリン酸合成酵素Iの表現型の解析に有用な単離さ
れたポリヌクレオチド分子、これらの分子によってコードされたペプチド、並びに新規に
同定されたカルバミルリン酸合成酵素Iの多形性に関連する、これらの診断上、及び治療
上の使用に関するものである。そのような使用のうち、アルギニン産生が低下する高アン
モニア血症、及び対象の生体検査から単離された核酸試料の解析に基づいた骨髄移植毒性
に対して、対象の感受性を決定する方法がある。

（略語表）
ＡＢＧ ‐ 動脈血液ガス
ＡＬＩ ‐ 急性肺損傷
ＡＳＯ ‐ アリル特異的オリゴヌクレオチド
ＡＴＰ ‐ アデノシン三リン酸
ＢＣＡＡ ‐ 分枝鎖アミノ酸
ＢＭＴ ‐ 骨髄移植
ＢＳＡ ‐ ウシ血清アルブミン
ＢｕＣｙ ‐ ブスルファンシクロホスファミド
ＢＵＮ ‐ 血中尿素窒素
ＣＢＶＰ１６ ‐ シクロホスファミドビス−クロロエチルニトロソウレアエト
ポシド
ｃｃ ‐ 立方センチメートル
ＣＰＳＩ ‐ カルバミルリン酸合成酵素I
ＣＴＣ ‐ シクロホスファミドチオテパカルボプラチン
CVP16TBI ‐ シクロホスファミドエトポシド全身照射
ＥＣＭＯ ‐ 膜型人工肺
ｆｌ ‐ 全長
GSHosc ‐ グルタチオン合成酵素
ＨＡＴ ‐ ヒポキサンチンアミノプテリンチミジン
ＨＶＯＤ ‐ 肝中心静脈閉塞症
ｉＮＯ ‐ 一酸化窒素吸入
ＫＤａ ‐ キロダルトン
ＫＬＨ ‐ キーホールリンペットヘモシアニン
ｌ ‐ リットル
ＬＡＴ ‐ ライゲーションアクティベーテッドトランスレーション
（ligation activated translation）
ＬＣＲ ‐ リガーゼ連鎖反応
ＭＡＳ ‐ 胎便吸引症候群
ＮＡＧ ‐ ｎ−アセチルグルタミン酸
NASDA（商標） ‐ 核酸配列に基礎をおいた増幅法（商標）
ＮＯ、又はＮＯｘ‐ 一酸化窒素
ＮＯＳ ‐ 一酸化窒素合成酵素
Ｏ／Ｃ ‐ オルニチン／シトルリン
ＰＢＳＣＴ ‐ 末梢血幹細胞移植
ＰＰＨＮ ‐ 新生児持続性肺高血圧症
ＰＣＲ ‐ ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＣＲ ‐ リペアー連鎖反応
ＲＤＳ ‐ 呼吸窮迫症候群
ＲＥＦ ‐ 制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング
ＲＴ ‐ 逆転写酵素
ＳＳＣＰ ‐ 一本鎖DNA高次構造多型
ＳＤＡ ‐ 鎖置換活性化
ＳＮＰ ‐ 一塩基変異多型
ＴＣ ‐ チオテパシクロホスファミド
ＴＥＡＡ ‐ 全必須アミノ酸
ＵＣ ‐ 尿素回路
ＵＣＦ ‐ 尿素回路機能
ＶＰＡ ‐ バルプロ酸

アルギニンのインビボ合成経路はオルニチンで始まる。オルニチンは、カルバミルリン
酸と結合して、シトルリンを産生し、次にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下でアス
パラギン酸と結合して、アルギニノコハク酸を産生する。最終段階で、アルギニノコハク
酸からフマル酸が分離して。アルギニンを産生する。アルギニンの分解経路は、アルギニ
ンの加水分解反応によるものであり、オルニチンと尿素を産生する。これらの反応は、尿
素回路を形成する。尿素回路は内在性、及び外来性タンパクの代謝によって生成される無
駄な窒素を取り除くための一次経路として機能する。概略的に図１に示す。
代謝過程の途絶は、化学療法のしばしば起こる副作用である。事実、高投与量の化学療
法で使用される薬剤は、多くの細胞過程に影響を与える。肝臓や消化管などの、化学感受
性組織に集中している代謝過程は、とくに途絶の大きな危険性に面している。

窒素の普遍的な代謝回転やプロセシングは、体中のあらゆる組織に関与するが、尿素回
路の最初の重要なステップは、肝臓と腸に限定される。骨髄移植（BMT）に関連する高投
与量の化学療法は肝臓の機能を妨げ、腸に対して毒性がある。尿素回路不全を示唆する特
発性高アンモニア血症は、骨髄移植を受けた患者の高い死亡率に関連していることが報告
されている。Ｄａｖｉｅｓらの論文（骨髄移植ation, 17:1119-1125 (1996)）；Ｔｓｅら
の論文（American Journal of Hematology, 38:140-141 (1991)）、及びＭｉｔｃｈｅｌ
ｌらの論文（American Journal of Medicine, 85:662-667 (1988)）を参照されたい。
BMTのよく見られる合併症は、肝内性肝静脈閉塞症（HVOD）である。HVODは黄疸、肝臓
の大きさの増大、及び正常な肝臓血流の阻害に関連する。HVODは、患者の約２０から４０
％で起こり、深刻な罹患率と死亡率に関連する。

一酸化窒素（NO）は、高投与量の化学療法結果の結果生じる、血管緊張の調節、並びに
、肝臓開通性、及び肺小静脈の維持において役割を果たす。完全な尿素回路機能は、アン
モニアの排出だけではなく、NOの前駆体であるアルギニンの適切な組織内濃度の維持にも
重要である。
カルバミルリン酸合成酵素I（ＣＰＳＩ）は、尿素回路を介した尿素生成の最初の関与
段階を触媒する、律速酵素である。ＣＰＳＩは高度に組織特異的であり、ほとんど肝臓と
腸に限定されて産生され、機能する。ゲノム的にコードされたＣＰＳＩは、細胞質内で産
生され、ミトコンドリアへと輸送され、そこで、成熟した１６０ｋDaの単量体に切断され
る。該酵素は、補助因子であるN‐アセチルグルタミン酸（NAG）を使用して、２つのＡＴ
Ｐ分子の消費で、アンモニアと炭酸水素塩とを結合させ、カルバミルを形成する。

尿素回路機能低下に対する遺伝的素因は、高アンモニア血症を引き起こし、BMT関連毒
素を含む、次善尿素機能に関連した疾患に苦しむ人々、ＢＭＴを受けた人々、又は他には
環境的、若しくは薬理学的な肝臓毒の汚染に直面している人々の中に存在する、対立遺伝
子の特徴づけの技術が必要とされる。尿素回路におけるＣＰＳＩの役割を考慮して、その
ような人々の中に存在するＣＰＳＩ対立遺伝子の特徴づけを、特に必要としている。

（要約）
対象の次善尿素回路に対する感受性のスクリーニング方法を開示する。該方法は下記の
段階を含む：（a）対象からの核酸試料を獲得する段階；（b）該対象からの核酸試料にお
けるカルバミルリン酸合成酵素（ＣＰＳＩ）遺伝子の多型性を検出する段階、次善尿素回
路機能に対して対象の感受性を示す多型の存在を含む。ここで開示される主題に従って、
該多型性の検出は、特に、骨髄移植毒性に対する、対象の感受性の決定に関して提供され
る。

いくつかの実施態様において、カルバミルリン酸合成酵素ポリペプチドの多型性は、Ｃ
ＰＳＩ遺伝子のエキソン３６番目におけるCからAへのトランスバージョンを含み、いくつ
かの実施態様において、ｃＤＮＡのヌクレオチド４３４０番目は、ＣＰＳＩ遺伝子に対応
する。いくつかの実施態様において、該ＣＰＳＩ遺伝子に対応するｃDNAのヌクレオチド
４３４０番目におけるCからAへのトランスバージョンは、AACからACCへのトリプレット暗
号の変化をさらに含み、アミノ酸１４０５番目にスレオニン部分を有するＣＰＳＩポリペ
プチドをコードする。

また、ここで開示される主題は、単離、精製された、生物学的に活性なＣＰＳＩポリペ
プチドを提供する。いくつかの実施態様において、ここで開示される主題のポリペプチド
は、組換えポリペプチドである。いくつかの実施態様において、ここで開示される主題の
ポリペプチドは、アミノ酸１４０５番目にアスパラギン部分を有する、ヒトＣＰＳＩであ
る。

また、ここで開示される主題は、生物学的に活性なＣＰＳＩポリペプチドをコードする
、単離、精製されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施態様において、ここで
開示される主題のポリヌクレオチドは、ヒト由来のDNA分子を含む。いくつかの実施態様
において、ここで開示される主題のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド４３４０番目のC
からAへのトランスバージョンを含む、ＣＰＳＩ遺伝子に対応するｃDNAを含む。いくつか
の実施態様において、ここで開示される主題のポリヌクレオチドは、さらに、ヌクレオチ
ド４３４０番目においてACCからAACへのトリプレット暗号の変化を含み、かつアミノ酸１
４０５番目にアスパラギン部分を有するＣＰＳＩポリペプチドをコードしている、ＣＰＳ
Ｉ遺伝子に対応するｃＤＮＡを含む。

ここで開示される主題の方法の実施における使用に適し、かつここで開示される主題の
ポリペプチド及びポリヌクレオチドの検出における使用に適した、オリゴヌクレオチド、
核酸プローブ、及び抗体を含むキット、及び試薬を、本明細書中に開示する。また、ここ
で開示されている主題のポリヌクレオチド、及びポリペプチドの調製方法を、本明細書中
に開示する。
いくつかの実施態様において、ここで開示される主題は、本明細書中に記載したカルバ
ミルリン酸合成酵素I（ＣＰＳＩ）遺伝子の多型性に基づいた治療方法に関連するもので
ある。前記治療方法は、次善尿素回路（例えば、骨髄移植毒性）によって媒介、又は調整
される疾患の治療、及び予防において、一酸化窒素前駆体の投与、並びにここで開示され
る主題の単離精製されたポリヌクレオチドを使用する、遺伝子治療アプローチを含む。

従って、ここで開示される主題の目的は、脊椎動物の対象における、カルバミルリン酸
合成酵素I（ＣＰＳＩ）の分析に使用されうるポリヌクレオチド分子を提供することであ
る。
また、ここで開示される主題の目的は、対象の組織に由来するゲノムDNA、及びｃDNAを
含む、核酸の分析を通して獲得される情報に基づいて、脊椎動物の対象、特にヒト対象に
おけるＣＰＳＩ表現型の決定を提供することである。
ここで開示される主題の他の目的は、ＣＰＳＩ表現型を決定する、迅速な技術を提供す
ることである。

ここで開示される主題のさらなる目的は、ＣＰＳＩ多型を構成するＣＰＳＩの異なった
形態を識別する抗体の産生に使用される、ポリペプチド、及びポリヌクレオチドを提供す
ることである。
ここで開示される主題のさらなる目的は、該ＣＰＳＩ多型に関連し、かつ付随した臨床
的な症候群の診断、及び治療方法を提供することである。
ここで開示される主題の目的のいくつかは、上文に規定されており、他の目的は、以下
に最もよく記載された添付図面、及び実施例とともに、記載が進むにつれて明らかとなる
であろう。

（詳細な説明）
ここで開示されているものは、カルバミルリン酸合成酵素Ｉ (ＣＰＳＩ)の多型の驚く
べき発見であり、該酵素は、尿素回路の最初の律速段階を触媒する。特に、該多型は、Ｃ
ＰＳＩにおいて、１４０５番目のアミノ酸（異型接合性＝．４４）のスレオニン/アスパ
ラギンのアミノ酸置換によって特徴付けられる。
また、ここで開示されているものは、ＣＰＳＩ遺伝子の一塩基置換が、ＣＰＳＩの多型
の原因になっているという、驚くべき知見である。特に、ＣＰＳＩ遺伝子のエキソン３６
におけるＣからＡへのトランスバージョンは、ＡＣＣからＡＡＣにトリプレット暗号を変
化させ、そのコード化ＣＰＳＩポリペプチドによってコードされているＴ１４０５Ｎ変換
を引き起こす。

これらの発見の観点から、脊椎動物対象の組織に由来する核酸分子の操作は、ＣＰＳＩ
分析、前記核酸分子によりコードされたペプチドの発生、該ＣＰＳＩ多型に関連した診断
、及び治療方法の提供を達成することができる。これらの状況に利用される核酸分子は、
以下に記載するように増幅され、かつ一般的に、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及びＲＮＡ由来
のｃＤＮＡを含みうる。

（Ａ．一般的な考慮）
ＣＰＳＩに関する現在利用可能な構造情報のほとんどは、ラットＣＰＳＩ酵素の研究に
由来する。ラットＣＰＳＩ酵素、及びヒトＣＰＳＩ酵素はそれぞれ、１５００残基の単一
ポリペプチドから構成され、かつ約９５％の配列同一性を示す。ラットＣＰＳＩポリペプ
チド、及び核酸配列情報は、Nyunoya, H.らの論文（Journal of Biological Chemistry 2
60:9346-9356 (1985)）、及びGENBANK（登録商標）のアクセッション番号AH005315, M123
35, M12328, M12327, M12326, M12325, M12324, M12323, M12322, M12321, M12320, M123
19, M12318、及びM11710に開示されており、本明細書中に引用により組み込まれている。
ラットＣＰＳＩに関する構造情報は、配列相同性、並びに基質、及び補助因子の結合研究
に由来している；しかし、利用できる結晶データはない。

成熟ＣＰＳＩはモジュール式であり、２つの主要領域を含む。最初の領域は、残基３９
〜４０６番目であり、大腸菌ヘテロ二量体性の小サブユニットに対して相同的である。細
菌、及び酵母のＣＰＳＩポリペプチド、並びに核酸配列情報は、GENBANK（登録商標）の
アクセッション番号AB005063, X67573, M27174, P07258, P03965, BAA21088, SYBYCP, SY
BYCS、及びSYECCSに開示されており、本明細書中に引用により組み込まれている。

他の領域である、残基４１７〜１５００番目（以下“CPSドメイン”と呼ぶ。）は、大
腸菌CPSの大サブユニットに対して相同的である。（Meister, A.の論文、Adv. Enzymol.
Relat. Areas Mol. Biol. 62:315-374 (1989)）。このサブユニットは、アンモニアから
のカルバミルリン酸の合成、及び基質と補助因子との結合に関与する（Meister, A.の論
文Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 62:315-374 (1989)）。該CPSドメインは、該
プロゲノムの遺伝子重複、及びタンデム融合によって生じ、かつそれ自身は、図２に概略
的に示したように、２つのリン酸化ドメインと、ｎ−アセチルグルタミン酸（ＮＡＧ）の
結合に関与するＣ末端調節領域から構成されている。（Nyunoya, H.らの論文Journal of
Biological Chemistry 260:9346-9356 (1985)）。

図２に概略的に示したように、残基４０７〜４１６番目は、２つの主要サブユニット間
の架け橋として機能し、かつ残基１〜３８番目は、リーダーペプチドを構成し、該リーダ
ーペプチドは、取り除かれる前に未成熟ＣＰＳＩをミトコンドリアへと方向付けする。続
けて図２において、小サブユニット様領域は、ほぼ等しい２つのサブドメインから構成さ
れている。残基３９〜２１２番目の相互作用サブドメインは、大腸菌由来ＣＰＳの小サブ
ユニット内の、大サブユニットとの会合に必須である。残基２１３〜４０６番目のグルタ
ミナーゼサブドメインは、Guillou, F.らの論文（Proc Natl Acad Sci 86:8304-8308 (19
89)）;Nyunoya, H.らの論文（Journal of Biological Chemistry 260:9346-9356 (1985)
）;及びGuy, H. I.らの論文（Journal of Biological Chemistry 270:2190-2197 (1995)
）に記載されているように、いくつかのグルタミンアミドトランスフェラーゼと、他の構
成成分から遊離した場合、重要なグルタミナーゼ活性を示したＣＰＳＩの該領域とに相同
的である。ＣＰＳＩは、グルタミンの分離に必須なシステイン残基を欠いているため、該
グルタミナーゼサブドメインの機能は、この酵素では不明確である。

該ＣＰＳドメイン（大腸菌の大サブユニットに対応する）は、下記の反応に従って、ア
ンモニアからのカルバミルリン酸の合成を触媒すると考えられる：
２ ＡＴＰ +炭酸水素塩 +アンモニア → ２ ＡＤＰ +リン酸 +カルバミルリン酸
図１、及び２に概略的に示したように、この反応は、下記の３つの段階を含む：本明細
書中でＡＴＰ_Ａとして示されているＡＴＰ分子に炭酸水素塩リン酸化され、カルボキシリ
ン酸を生じる段階；カルボキシリン酸とアンモニアとから、カルバメートが合成される段
階；及び、Rubio, V.、及び Grisolia, S.の論文（Enzyme 26:233-239 (1981)）に記載さ
れているように、他のＡＴＰ分子（ＡＴＰ_Ｂ）によってカルバメートがリン酸化され、カ
ルバミルリン酸を生じる段階である。

図４に概略的に示したように、該ＣＰＳドメインは、重複と、該重複成分のタンデム融
合とによって生じているように見える；それゆえ、Nyunoya, H.らの論文（Journal of Bi
ological Chemistry 260:9346-9356 (1985)）に記載されているように、アミノ、及びＣ
ＯＯＨ末端の半分は、相同である。各々の相同性半分は、それぞれ４０、及び２０ｋＤａ
のアミノ、及びＣＯＯＨ末端ドメインを含み、該アミノ半分の４０ｋＤａのドメインは、
炭酸水素塩リン酸化（炭酸水素塩リン酸化ドメイン、残基４１７〜７８８番目）（図２）
に関与すると考えられる。該ＣＯＯＨ半分に対応するドメインは、Alonso, E.、及びRubi
o, V.の論文（European Journal of Biochemistry 229:377-384 (1995)）に記載されてい
るように、残基９６９〜１３２９番目のカルバメートリン酸化ドメイン（図２）を介して
、カルバメートのリン酸化に関与する。

これらのリン酸化ドメインは、炭酸水素塩をリン酸化する、公知の三次元構造を有する
酵素であるビオチンカルボキシラーゼ（Toh, H.らの論文（European Journal of Biochem
istry 215:687-696 (1993)））、並びに、似た反応を触媒する２つの酵素ＤＤ−リガーゼ
とグルタチオン合成酵素（ＧＳＨａｓｅ）に相同的である（Artymiuk, P. J.らの論文（N
ature Struct. Biol. 3:128-132 (1996)））。それゆえ、これらの酵素の情報は、ＣＰＳ
Ｉ欠損の患者における相同ドメインにおいて見出される変異を解明するのに有用である。

再び図２を参照すると、該大サブユニット様領域の２０ｋＤａドメインの、残基７８９
〜９６８番目のアミノ末端半分のドメインの機能は、確立されるべきものとして残されて
いる。対照的に、残基１３３０〜１５００番目の対応するＣ末端ドメインは、アロステリ
ックドメインと呼ばれており、その理由は、Rodriguez-Aparicio, L. B.らの論文（Bioch
emistry 28:3070-3074 (1989)）、及びCervera, J.らの論文（Biochemistry 35:7247-725
5 (1996)）に記載されているように、大腸菌酵素、ＵＭＰ、及びＩＭＰにおける、活性化
因子ＣＰＳＩの、ｎ−アセチルグルタミン酸（ＮＡＧ）、及びヌクレオチドエフェクター
が、このドメインに結合するためである。

（Ａ．１． 酵素プロセシング）
ヒトのＣＰＳＩ ｍＲＮＡは、１６５ｋＤａ、１５００アミノ酸のプレタンパク質をコ
ードしている。この前駆体のアミノ末端は３８残基を含み、８個の塩基性残基、及び１個
の酸性残基を含み、該成熟酵素の開始前にＰｒｏ−Ｇｌｙの４残基を有する。（Nyunoya,
H.らの論文（Journal of Biological Chemistry 260:9346-9356 (1985)）; Lagace, M.
らの論文（Journal of Biological Chemistry 262:10415-10418 (1987)）を参照されたい
）この高度に保存されたシグナル配列は、酵素が、ミトコンドリアマトリクスに入ること
を促進し、次にそこで切断され、１６０ｋＤａの成熟酵素を産生する。

（Ａ．２． ＣＰＳＩの通常発現）
ＣＰＳＩの酵素活性は、妊娠５〜１０週までのヒト胎児の肝臓において初めて検出され
た（Moorman, A. F.らの論文（Histochemical Journal 22:457-468 (1990)）。妊娠２０
週までに、ＣＰＳＩ濃度は、正常な成人での濃度の約５０％に達し、生まれるまでそれを
維持し、その後２０歳の成人での濃度へと徐々に増加する（Raiha, N. C. R. and Suihko
nen, J. の論文（Acta Paediatrica Scand 57:121-127 (1968))）。ＣＰＳＩの組織発現
は、本来肝臓に限定され、腸、及び腎臓において微量な活性を有する。肝臓が、成人にお
いて、その成熟房状構造に成長したとき、ＣＰＳＩは、小静脈門脈末端の周りの実質細胞
に区分化される（Moorman, A. F.らの論文（Histochemical Journal 22:457-468 (1990)
））。

その区分化に加えて、いくつかの因子は、ＣＰＳＩ活性、及び発現の制御において重要
であることが知られている。例えば、オルニチンが低濃度であるか、又は存在しないと、
ＣＰＳＩ活性は低下する。これは、おそらく、Jackson, M. J.らの論文（Annual Review
of Genetics 20:431-464 (1986)）; 及びRubio, V.の論文（Biochemical Society Transa
ctions 21:198-202 (1993)）に記載されているように、カルバミルリン酸（ＣＰ）の蓄積
による阻害効果のためである。ＣＰＳＩ ｍＲＮＡ、及び酵素、双方の濃度は、高タンパ
ク食とともに増加し、かつグルカゴン、及びグルココルチコイドに応答して増加する（Ja
ckson, M. J.らの論文（Annual Review of Genetics 20:431-464 (1986)）; de Groot, C
. J.らの論文（Biochemical & Biophysical Research Communications 124:882-888 (198
4)））。通常の刺激されていない肝臓組織において試験され、豊富なＣＰＳＩ ｍＲＮＡ
が検出されている。

（Ｂ． スクリーニング技術）
ここで開示される主題に従って、対象におけるアンモニア分解の減少、及びアルギニン
産生の低下を生じる、次善尿素回路機能に感受性のスクリーニング方法は以下を含む：（
ａ）該対象からの核酸試料を獲得する段階；（ｂ）該対象からの核酸試料におけるカルバ
ミルリン酸合成酵素Ｉ（ＣＰＳＩ遺伝子）の多型性を検出する段階であり、該多型の存在
は、アンモニア分解の減少、及びアルギニン産生の低下を結果として生じる次善尿素回路
機能に対して、対象の感受性を示唆する。ここで開示される主題に従って、該多型の検出
は、骨髄移植毒性に対する対象の感受性の決定に関して、特に提供される。

ここで開示される主題の多型は、本明細書中、及び実施例で開示されているように、Ｂ
ＭＴ、又はバルプロ酸の投与範囲を超えた多くの状況下において、毒性を予測するように
使用してもよいことをさらに指摘する。また、該多型は、成人の肝硬変や、他の仲介毒性
、及び肝臓機能が不全の新生児などの状況において、阻害されたアンモニア分解とアルギ
ニン産生の仲介、又は調節に関与する。
本明細書中、及び特許請求の範囲で使用されているように、“多型”という用語は、母
集団における、２以上の一般的に決定された選択的配列、又は対立遺伝子の発生を意味す
る。多型マーカーは、相違が発生する位置の遺伝子座である。典型的なマーカーは、少な
くとも２つの遺伝子座を有し、各々は１％よりも高い頻度で起こる。多型遺伝子座は、一
塩基対ほど小さくてもよい。

ここで開示される主題の有用な核酸分子は、４３４０番目の塩基のＣからＡへのトラン
スバージョンの領域内、及びトリプレット暗号がＡＣＣからＡＡＣへ変換されるエキソン
３６の範囲内において、ＣＰＳＩ配列と特異的にハイブリダイズするものを含む。このト
ランスバージョンは、該コード化ＣＰＳＩポリペプチドにおいて、Ｔ１４０５Ｎの変化を
導く。通常これらは、少なくとも２０ヌクレオチドの長さであり、コンセンサスＣＰＳＩ
ｃＤＮＡ配列（ＥＣ６．３．４．１６）の４３４０番目の塩基において、ＣからＡへの
トランスバージョンの領域に対応するヌクレオチド配列を有する。これは、ＡＣＣからＡ
ＡＣへとトリプレット暗号が変換される。本明細書中に用いられている“コンセンサス配
列”という用語は、ＣＰＳＩにおける核酸、又はタンパク質配列を意味し、該核酸、又は
アミノ酸は、正常な機能を有するタンパク質をコードしている遺伝子を運ぶ個体群におい
て、高頻度で発生することが知られている。すなわち、該核酸は正常な機能も有する。

提供される核酸分子は、放射性ラベル、蛍光ラベル、酵素ラベル、配列タグなどのよう
な、技術的に公知の技術に従って標識化することができる。ここで開示される主題の他の
態様に従って、核酸分子は、４３４０番目の塩基においてＣからＡへのトランスバージョ
ンを含む。そのような分子は例えば、対象の家族を通じて、特定の変異を追跡する、対立
遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブとして使用され得る。
身体試料は、該ＣＰＳＩ遺伝子が、４３４０番目の塩基において、ＣからＡへのトラン
スバージョンを含むかどうかを決定するために試験することができる。試験に適した身体
試料は、生体検査から得られたＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質を含むものを含有し、例
えば、生体検査組織の肝臓、及び腸；又は出生前の血液；又は胚組織を含む。

ここで開示される主題のいくつかの実施態様において、一対の単離オリゴヌクレオチド
プライマーを提供する： 5' −AGCTGTTTGCCACGGAAGCC− 3'(配列番号：６) 、及び5'− C
CCAGCCTCTCTTCCATCAGAAAGTAAG −3'(配列番号：７)。これらのプライマーは、ＣＰＳＩエ
キソン３６（ここで開示される主題の多型の位置）、かつ関連したイントロン性配列(配
列番号：５)に由来し、かつ１１９塩基対のフラグメントを産生する。ＣＰＳＩエキソン
３６（ここで開示される主題の多型の位置）、関連したイントロン性配列 (配列番号：５
)に由来する他のプライマーは、配列番号８〜１０と、図１０、及び実施例２(配列番号１
５、及び１６)で提供される。

該オリゴヌクレオチドプライマーは、ＢＭＴ合併症、又は毒性の結果として生じ得るよ
うな、高アンモニア血症の危険がある対象の診断に有用である。該プライマーは、配列決
定前に標的ポリヌクレオチドの増幅を指示する。これらの特有のＣＰＳＩエキソン３６オ
リゴヌクレオチドプライマーは、エキソン３６におけるＣからＡへのトランスバージョン
の同定に基づいてデザインされ、かつ生産された。

ここで開示される主題のいくつかの実施態様において、単離された対立遺伝子特異的オ
リゴヌクレオチドを提供する。また、それに類似した配列を、ここに開示される主題にお
いて提供する。該対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＢＭＴ合併症、又は毒性とし
て生じ得る、高アンモニア血症の危険がある対象の診断に有用である。これらの特有のＣ
ＰＳＩエキソン３６オリゴヌクレオチドプライマーは、エキソン３６におけるＣからＡへ
のトランスバージョンの同定に基づいてデザインされ、かつ生産された。

“実質的に相補的”、又は“実質的な配列”という用語は、ストリンジェント条件下に
おいて、提供される配列（例えば、配列番号：５〜１０）とハイブリダイズする配列、及
び／又はここで開示される主題の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドが、該配列とハイ
ブリダイズするような配列番号：５〜１０のいずれかに十分な相同性を有する配列を意味
する。本明細書中で用いられる“単離”という用語は、関連し得る他の核酸、タンパク質
、脂質、炭水化物、又は他の物質が実質的にフリーのオリゴヌクレオチドを含み、前記関
連とは、細胞物質、又は合成媒体である。“標的ポリヌクレオチド”又は“標的核酸”は
、例えば、ＣＰＳＩ−コード化ポリヌクレオチドのような対象の核酸配列を意味する。プ
ライマーハイブリダイゼーションに用いることができる他のプライマーは、本開示のＣＰ
ＳＩ多型に基づいて、当業者にすぐに確認され得る。

ここで開示される主題のプライマーは、多型遺伝子座の多くの核酸上の重合開始を提供
するように、十分な長さがあり、かつ適切な配列のオリゴヌクレオチドを含む。該ＣＰＳ
Ｉ遺伝子座を、図５に概略的に示す。特に、本明細書中で用いられる“プライマー”とい
う用語は、いくつかの実施態様において、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド、又はリ
ボヌクレオチドを含む配列であり、いくつかの実施態様では３つ以上であり、いくつかの
実施態様では８つよりも多く、かつ、いくつかの実施態様では、該ＣＰＳＩ遺伝子（該Ｄ
ＮＡ配列は、配列番号：１、及び３に含まれるＣＰＳＩに対して４３４０番目の塩基でＣ
からＡへのトランスバージョンを含む。）の少なくとも約２０ヌクレオチドを含む。ＣＰ
ＳＩに対して４３４０番目の塩基でシトシン（Ｃ）を含む対立遺伝子は、本明細書中では
、“ＣＰＳＩａ対立遺伝子”、“Ｔ１４０５対立遺伝子”、又は“スレオニン−コード化
対立遺伝子”と呼ぶ。ＣＰＳＩに対して４３４０番目の塩基でアデノシン（Ａ）を含む対
立遺伝子は、本明細書中では、“ＣＰＳＩｂ対立遺伝子”、“Ｎ１４０５対立遺伝子”、
又は“アルギニン−コード化対立遺伝子”と呼ぶ。

また、ここで開示される主題に従って、該ＣＰＳＩ遺伝子のＣＰＳＩａ対立遺伝子とＣ
ＰＳＩｂ対立遺伝子とを識別するオリゴヌクレオチドを提供する。前記オリゴヌクレオチ
ドは、前記ヌクレオチド４３４０がアデノシンである場合、前記ＣＰＳＩに対応するｃＤ
ＮＡのヌクレオチド４３４０を含む前記ＣＰＳＩ遺伝子の一部分とハイブリダイズするが
、前記ヌクレオチド４３４０がシトシンである場合、前記ＣＰＳＩ遺伝子の前記部分とハ
イブリダイズしない。また、ここで開示される主題に従って、該ＣＰＳＩ遺伝子のＣＰＳ
ＩａとＣＰＳＩｂ対立遺伝子とを識別するオリゴヌクレオチドを提供する。前記オリゴヌ
クレオチドは、前記ヌクレオチド４３４０がシトシンである場合、前記ＣＰＳＩに対応す
るｃＤＮＡのヌクレオチド４３４０を含む前記ＣＰＳＩ遺伝子の一部分とハイブリダイズ
するが、前記ヌクレオチド４３４０がアデノシンである場合、前記ＣＰＳＩ遺伝子の前記
部分とハイブリダイズしない。いくつかの実施態様において、前記オリゴヌクレオチドは
、１０〜３０塩基の長さである。さらに、前記オリゴヌクレオチドは、検出可能なラベル
を含むことができる。

合成を助長する環境条件は、ヌクレオシド三リン酸、及びＤＮＡポリメラーゼなどの重
合化薬剤の存在、並びに、適切な温度、及びｐＨを含む。いくつかの実施態様において、
該プライマーは、増幅の最大効果のために一本鎖であるが、二本鎖とすることができる。
二本鎖の場合、該プライマーは、伸長産物調製に使用される前に、初めに、その鎖を分離
するように処理される。該プライマーは、重合用に含有した試薬の存在下で、伸長産物の
合成を準備するために十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、
緩衝液、及びヌクレオチド組成を含む多くの因子に依存するであろう。通常、該オリゴヌ
クレオチドプライマーは、１２−２０、もしくはそれ以上のヌクレオチドを含むが、より
少ないヌクレオチドを含んでもよい。

ここで開示される主題のプライマーは、増幅されるべきゲノム遺伝子座のそれぞれの鎖
に対して、“実質的に”相補的になるように設計される。これは、該プライマーが、重合
化薬剤の作用条件下で、これらの各々の鎖とハイブリダイズするように有意に相補的でな
ければならないことを意味する。言い換えると、該プライマーは、該トランスバージョン
の側方の５'、及び３'配列とハイブリダイズし、かつ該ゲノム遺伝子座の増幅が可能にな
るように、そこと有意に相補的であるべきである。

ここで開示される主題のオリゴヌクレオチドプライマーは、関連する反応ステップ数に
対して、指数関数的な量の多型性遺伝子座を生成する酵素的連鎖反応の増幅方法に使用さ
れる。通常、１つのプライマーは、該多型性遺伝子のマイナス（−）鎖に相補的であり、
かつ他は、プラス（＋）鎖に相補的である。変性核酸に該プライマーをアニーリングし、
続いて、大きいフラグメントのＤＮＡポリメラーゼΙ（Ｋｌｅｎｏｗ）、及びヌクレオチ
ドなどの酵素で伸長し、該標的多型遺伝子座配列を含む新規に合成された＋、及び−鎖を
生じる。また、これらの新規に合成された配列は鋳型であるため、変性、プライマーのア
ニーリング、及び伸長を繰り返し、該プライマーによって規定された（すなわち、ターゲ
ット多型性遺伝子座）領域を指数関数的に生成する。該連鎖反応の産物は、使用された特
異的プライマー末端に相当する末端を有する、分別ある核酸二量体である。

ここで開示される主題のオリゴヌクレオチドプライマーは、従来のリン酸トリエステル
、及びリン酸ジエステル法、又は、それらの自動化された実施態様のような、いくつかの
適切な方法を使用して調製され得る。いくつかの自動化された実施態様において、ジエチ
ルホスホラミダイトを、開始物質として用い、かつBeaucageらの論文（Tetrahedron Lett
ers 22:1859 1862 (1981)）に記述されているように合成してもよい。修飾された固相支
持体上でのオリゴヌクレオチド合成方法の１つは、米国特許第４，４５８，０６６号に記
載されている。

精製、又は未精製形態の核酸標本は、それが、該多型遺伝子座含有核酸配列を含むか、
又は含んでいるであろう場合に、開始核酸又は酸として使用することができる。従って、
該方法は、例えばメッセンジャーＲＮＡを含むＤＮＡ、又はＲＮＡを増幅してもよい。該
ＤＮＡ、又はＲＮＡは、一本鎖、又は二本鎖であってもよい。ＲＮＡが、鋳型として使用
される場合、該鋳型のＤＮＡへの逆転写に最適な酵素、及び／又は条件が利用されるであ
ろう。さらに、それぞれ一本鎖を含むＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドを利用してもよい。ま
た、核酸混合物を使用してもよく、或いは、同一、又は異なるプライマーを使用して、本
明細書中の増幅反応前に生成した核酸を利用してもよい。増幅されるべき特異的核酸配列
、すなわち該多型性遺伝子座は、大きな分子の一部分であってもよく、又は初めに、個々
の分子として存在することができ、それにより、該特異的配列は、全核酸を構成する。増
幅されるべき配列は、最初、純粋な形態で存在し；全ヒトＤＮＡに含まれるような複合体
混合物のマイナー部分であってもよい。

本明細書中で利用されるＤＮＡは、Molecular CloningにおいてManiatisらによって記
載された技術などの様々な技術により、血液、及び組織（いくつかの実施態様では、肝臓
組織）などの体試料から抽出されたものであり得る：A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor, N.Y., p 280 281 (1982)を参照されたい。その抽出された試料が混合物である
場合、増幅前に、該細胞、又は該試料の動物細胞膜を開き、かつ該核酸の鎖の露出、及び
／又は分離に有効な試薬量を用いて、それを処理することができる。該鎖を露出し、かつ
分離する溶解、及び核酸変性ステップにより、増幅をさらに容易に起こすことができるで
あろう。

デオキシリボヌクレオチド三リン酸であるdATP、dCTP、dGTP、及びdTTPを、プライマー
と共に、又は別々に、適当量の該合成混合物に加え、得られた溶液を、約１から１０分、
いくつかの実施態様では１から４分、９０から１００℃に加熱する。この加熱の後に、該
溶液を、プライマーハイブリダイゼーションが可能になるまで冷却する。その冷却された
混合物に、プライマー伸長反応に効果的な適切な試薬（本明細書中で“重合化薬剤”と呼
ばれる）を加え、かつ該反応を、技術的に公知の条件下で行う。また、該重合化薬剤を、
熱安定性の他の試薬とともに加えてもよい。この合成（又は増幅）反応は、室温から該重
合反応が機能しない温度までで起こすことができる。従って、例えば該薬剤としてDNAポ
リメラーゼを用いる場合、該温度は一般的に約４０℃以下である。最も都合良い該反応は
、室温で起こる。

該重合化薬剤は、酵素を含むプライマー伸長産物の合成を達成するように機能するであ
ろう全ての化合物、又は系であり得る。この目的に適した酵素には、例えば、E.コリＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、E.コリＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント（Klenow fragmen
t）、ポリメラーゼ突然変異タンパク質、逆転写酵素、Taqポリメラーゼのような熱安定性
酵素（すなわち、変性を起こすのに十分に上がった温度にした後に、プライマー伸長を行
う酵素）を含む他の酵素が含まれる。適切な酵素は、それぞれの多様型遺伝子座核酸鎖に
相補的なプライマー伸長産物の形成に適した方法で、ヌクレオチドの連結を促進するであ
ろう。一般的に、その合成法は、それぞれのプライマーの３'末端で開始し、合成が終結
するまで、鋳型鎖に沿って５'方向へと進み、異なった長さの分子を生成する。

新規に合成された鎖、及びその相補的核酸鎖は、上記のハイブリダイズ条件下で二本鎖
分子を形成するであろう。このハイブリッドは、該方法の次のステップで使用される。そ
の次のステップにおいて、新規に合成された二本鎖分子を、上記の幾つかの手順を用いて
変性条件にさらし、一本鎖分子を生成する。
変性、アニーリング、及び伸長産物合成のステップは、必要なだけ繰り返して、検出に
必要な程度に標的多型性遺伝子座核酸配列を増幅する。生成される特異的核酸配列の量は
、指数関数的種類に蓄積するであろう（PCR. A Practical Approach, ILR Press, Eds. M
cPhersonらの文献. (1992)）。

増幅産物は、放射性プローブを用いる、又は用いないサザンブロット分析によって検出
することができる。そのような方法の１つにおいて、例えば、該多型遺伝子座の核酸配列
のきわめて低いレベルを含む小さなDNA試料を増幅し、かつサザンブロッティング技術を
介して、又は類似のドットブロット分析を用いて解析される。非放射性プローブ、又はラ
ベルの使用は、高レベルの増幅シグナルによって促進される。あるいは、増幅産物検出に
使用されるプローブを、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光性化合物、生物発光性化合物
、化学発光性化合物、金属キレーター、又は酵素を用いて、直接的に、又は間接的にラベ
ルすることができる。当業者は、該プローブに結合する他の適切なラベルを理解している
であろう、又は慣例実験を用いて、それらを確認することができるであろう。

ここで開示される主題の方法により増幅された配列を、溶液中か、又は固相支持体に結
合した後で、ジデオキシシークエンシング（dideoxy sequencing）、ＰＣＲ、オリゴマー
制限（Saikiらの論文（Bio/Technology 3:1008 1012 (1985)））、対立遺伝子特異的オリ
ゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ解析（Connerらの論文（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S
.A. 80:278 (1983)））、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（oligomucleotide
ligation assays）（ＯＬＡｓ）（Landgrenらの論文（Science 241:1007, (1988)））な
どの特異的ＤＮＡ配列検出に通常適用される方法により、評価、検出、クローニング、及
び配列決定などを行うことができる。

いくつかの実施態様において、増幅方法は、本明細書中、及び米国特許第４，６８３，
１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，９６５，１８８号（それぞれは引用によ
り組み込まれている。）に記載されているように、PCRによるものであり、かつ当業者に
よって一般的に使用されている。別の増幅方法が評されており、かつ、それは、ここで開
示された主題のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅されたＣＰＳＩ遺伝子座が、該別の
方法により同様に増幅されるのであれば、利用することができる。そのような別の増幅系
には、対象のRNAの短い配列とT7プロモータとを用いて始まる自己持続配列複製があるが
、これに制限されない。逆転写酵素は、該ＲＮＡからcＤＮＡへとコピーし、かつ該ＲＮ
Ａを分解し、続いてＤＮＡの第二の鎖を逆転写酵素重合する。

他の核酸増幅技術は、核酸配列に基づいた増幅(NASBA（商標）)であり、これは、逆転
写酵素とT7 RNAポリメラーゼとを用い、かつ２つのプライマーが、その循環スキームを標
的とするように組み込まれる。NASBA（商標）増幅は、ＤＮＡ、又はＲＮＡのどちらかを
用いて始め、どちらかで終わることができ、かつ６０から９０分の間で、約１０^８コピー
に増幅する。

代わりに、核酸を、ライゲーションアクティベーテッドトランスクリプション（ligati
on activated transcription）（LAT）によって増幅することができる。LATは、部分的に
一本鎖であり、かつ部分的に二本鎖であるプライマーを１つ有する一本鎖鋳型から作用す
る。増幅は、数時間内にｃＤＮＡがプロモータオリゴヌクレオチドへライゲーションする
ことによって開始され、増幅は、約１０^８から約１０^９倍である。ＱＢレプリカーゼ系は
、ＭＤＶ１とよばれるＲＮＡ配列を、対象のＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡに結合すること
により利用され得る。試料と混合すると、該ハイブリッドＲＮＡは、標本のmＲＮＡから
その相補的部分を見つけ出し、結合し、レプリカーゼを活性化させ、対象の配列に沿って
タグをコピーする。

他の核酸増幅技術は、リガーゼ連鎖反応（LCR）であり、試料中の連続的な配列の存在
下、リガーゼによって共有結合される対象の配列の２つの異なったラベル化体の半分を用
いることにより機能する。修復連鎖反応（repair chain reaction）（RCR）核酸増幅技術
は、２つの相補的、かつ標的特異的オリゴヌクレオチドプローブ対、熱安定性ポリメラー
ゼ及びリガーゼ、並びに標的化配列を幾何学的に増幅するＤＮＡヌクレオチドを使用する
。２塩基のギャップが、該オリゴプローブ対を分離し、かつ該RCRが、通常のDNA修復を模
倣して、該ギャップを埋め、かつ連結する。

鎖置換反応（ＳＤＡ）による核酸増幅は、標的ＤＮＡが結合する５'末端の短い突出部
とともにＨｉｎｃＩＩ認識部位を含む、短いプライマーを使用する。ＤＮＡポリメラーゼ
は、硫黄含有アデニン類似体とともに、該突出部の反対のプライマー部分を埋める。Ｈｉ
ｎｃＩＩを加え、未修飾ＤＮＡ鎖のみを切断する。５'エキソヌクレアーゼ活性を欠如し
たＤＮＡポリメラーゼは、ニック部位に入り、かつ重合を始め、下流の始めのプライマー
を置換し、かつプライマーとして働く新しい鎖を作る。

ＳＤＡは、３７℃、２時間で約１０^７倍を超える増幅をする。ＰＣＲ、及びＬＣＲとは
異なり、ＳＤＡは、備えた温度循環を必要としない。ここで開示される主題の方法に有用
な他の増幅システムは、ＱＢレプリカーゼシステム（QB Replicase System）である。Ｐ
ＣＲは、ここで開示される主題の典型的な増幅方法であるが、これらの他の方法は、ここ
で開示される主題の方法に記載した該ＣＰＳＩ遺伝子座の増幅にも使用され得る。従って
、本明細書中、及び特許請求の範囲中で用いられる“増幅技術”という用語は、すべての
先の方法を含むことを意味している。

ここで開示される主題のいくつかの実施態様において、ジデオキシ配列決定、いくつか
の実施態様においては、次の標的核酸増幅により、対象由来試料の標的核酸を配列決定す
ることを含む、高アンモニア血症（その危険性がある）の素因、又は高い感受性を有する
対象を診断、又は同定する方法を提供する。
ここで開示される主題のいくつかの実施態様において、対象由来試料と該ＣＰＳＩ多型
の存在を検出する試薬とを接触させ、かつ該試薬を検出することを含む、高アンモニア血
症（その危険性がある）の素因、又は高い感受性を有している対象を診断する方法を提供
する。

他の方法は、対象由来試料の標的核酸と、４３４０番目の塩基、すなわちエキソン３６
内における、ＣからＡへのトランスバージョンの存在を検出する試薬とを接触させ、かつ
該トランスバージョンを検出することを含む。多くのハイブリダイゼーション方法は、当
業者に周知である。それらの多くは、ここで開示される主題を行う上で有用である。

肝中心静脈閉塞症（ＨＶＯＤ）は、骨髄移植（ＢＭＴ）において共通の毒性である。そ
れは約２０〜４０％の患者において起こり、かつ深刻な罹患率、及び死亡率に関連してい
る。ここで開示される主題に従って、不均衡の証拠を同定する目的で、ＢＭＴを受けたＨ
ＶＯＤ、及び非ＨＶＯＤグループにおいて、両方のＣＰＳＩ対立遺伝子の頻度を試験した
。その結果は、本明細書中で開示したＣＰＳＩ多型が、ＢＭＴ毒性に対する感受性に影響
することを示した。従って、該ＣＰＳＩ多型の検出を介した、ＢＭＴ毒性、特にＨＶＯＤ
に対する感受性のための対象のスクリーニング方法を、ここで開示される主題に従って提
供する。

ここで開示される主題の方法に使用される物質は、理論的に、診断キットの調製に適し
ている。そのようなキットは、バイアル、及びチューブなどを意味する密接に閉じ込める
１以上の容器内に運ぶように区画化されているものを意味するキャリアーを含む。該容器
の各々は、該方法に使用される分離成分の1つを含むことを意味する。例えば、該容器の
１つは、ＣＰＳＩ ＤＮＡの増幅手段を含んでいてもよく、該手段は、該対象由来の前記
標的ＤＮＡの増幅に必須の酵素、及びオリゴヌクレオチドプライマーを含む。

該オリゴヌクレオチドプライマーは、これらに制限されないが、配列番号：６〜１０、
又はそれに対して実質的に相補的、又は実質的に相同的なプライマー配列を含む群から選
択される配列を有するプライマーを含む。標的フランキング５'、及び３'ポリヌクレオチ
ド配列は、実質的に、配列番号：５に記載されている配列、及びそれに対して実質的に相
補的、又は相同的な配列を有する。ＣＰＳＩ増幅のための他のオリゴヌクレオチドプライ
マーは、本明細書中で示した、ここで開示される主題の開示で与えられ、当業者に公知で
あるか、又は容易に確認されるであろう。

ここで開示される主題に従ったキットは、対象から得られた生体試料から抽出した核酸
試料に対する試薬をさらに含み得る。当業者に容易に明白である前記試薬の全ては、ここ
で開示される主題の範囲内に含まれることが意図される。特定の例として、該核酸試料を
捕捉するためのガラスビーズの懸濁液、及び該ガラスビーズの核酸試料を溶出するための
溶出緩衝液を有する、該組織に適切な溶解緩衝液は、対象から得られた生体試料から核酸
を抽出するための試薬を含む。

他の例は、GENOMIC ISOLATION KIT A.S.A.P.（商標）(Boehringer Mannheim, Indianap
olis, Ind.)、ゲノムＤＮＡ単離システム（Genomic DNA Isolation System）(GIBCO BRL,
Gaithersburg, Md.)、ELU−QUIK（商標）DNA精製キット(Schleicher & Schuell, Keene,
N.H.)、ＤＮＡ抽出キット(Stratagene, La Jolla, Calif.)、及びTURBOGEN（商標）単離
キット(Invitrogen, San Diego, Calif.)などの商業的に利用できるものを含む。製造業
者の指示に従った、これらのキットの使用は、ここで開示される主題の方法の実施前に、
ＤＮＡの精製に許容できる。

（Ｃ．ＣＰＳＩ−コード化ポリヌクレオチド、及びそれによってコードされたＣＰＳＩポ
リペプチドに作用する規定）
ここで開示される主題に従って、精製され、かつ単離されたＣＰＳＩ−コード化ポリヌ
クレオチド、及びそれによってコードされたＣＰＳＩポリペプチドを提供する。特に提供
されるＣＰＳＩ−コード化ポリヌクレオチドは、ＣＰＳＩ遺伝子の４３４０番目の塩基、
すなわちエキソン３６内におけるCからAへのトランスバージョンを含む、ＣＰＳＩコード
ポリヌクレオチドを含む。それは、トリプレット暗号をＡＣＣからＡＡＣに変化し、かつ
コード化ＣＰＳＩポリペプチド中でＴ１４０５Ｎ変換を導く。特に、該T1405N変換を含む
コード化ＣＰＳＩポリペプチドも提供する。 従って、対立遺伝子多型ポリヌクレオチド
、及びそれよってコードされたポリペプチドを、ここで開示される主題に従って提供する
。さらにまた、前記ＣＰＳＩポリペプチドをコードしているＣＰＳＩ−コード化ポリヌク
レオチドであるように、生物学的に活性なＣＰＳＩポリペプチドを、ここで開示される主
題に従って提供する。例証的な生物学的活性は、該尿素回路の第一段階を仲介する生物学
的活性、及び抗ＣＰＳＩ抗体と交差反応する生物学的活性を含む。

提供されるＣＰＳＩ−コード化ポリヌクレオチド、及びポリペプチドは、当業者に公知
であるように、該尿素回路の生物学的重要性を与えられた広範な有用性を有する。例を通
して、該ＣＰＳＩ−コード化ポリヌクレオチド、及びポリペプチドは、生物学的試料中で
、ここで開示される主題のタンパク質、及び核酸の存在を検出するために使用されるスク
リーニングアッセイ、及びアッセイキットの調製に有用である。さらに、単離され、かつ
精製されたポリペプチドは、家畜用飼料添加剤として有用性を有し、従って、該ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドは、該ポリペプチド産生に有用である。
いくつかの実施態様において、提供されるＣＰＳＩポリヌクレオチド、及びポリペプチ
ドは、脊椎動物、及び無脊椎動物から単離される。従って、制限されないが哺乳類、酵母
、及び細菌ホモログを含むＣＰＳＩホモログを、ここで開示される主題に従って提供する
。ＣＰＳＩメンバーの代表的な哺乳類ホモログは、ラット、及びヒトホモログを含むが、
これに限定されない。

“ＣＰＳＩ遺伝子産物”、“ＣＰＳＩタンパク質”、及び“ＣＰＳＩポリペプチド”と
いう用語は、ＣＰＳＩの天然アミノ酸配列と実質的に同一であり、かつ該尿素回路中のカ
ルバミルリン酸合成を仲介し、かつＣＰＳＩポリペプチド対して上昇する抗ＣＰＳＩ抗体
と交差反応することができるという点で生物学的に活性なアミノ酸配列を有する、タンパ
ク質を意味する。

また、“ＣＰＳＩ遺伝子産物”、“ＣＰＳＩタンパク質”、及び“ＣＰＳＩポリペプチ
ド”は、少なくとも、天然ＣＰＳＩ遺伝子産物に共通の幾つかの生物学的活性を示すＣＰ
ＳＩ分子類似体を含む。さらに、突然変異誘発にたずさわる当業者は、未公表、又は未知
の他の類似体を、ＣＰＳＩ類似体の構築に使用可能であることを理解するであろう。“Ｃ
ＰＳＩ遺伝子産物”、“ＣＰＳＩタンパク質”、又は“ＣＰＳＩポリペプチド”は、天然
ＣＰＳＩ遺伝子産物のアミノ酸配列の全て、又は実質的に全てを含む必要性はない。より
短い、又はより長い配列は、ここで開示される主題に役立つことが予想される。 従って
、また、“ＣＰＳＩ遺伝子産物”という用語は、融合、又は組換えＣＰＳＩポリペプチド
、及びタンパク質を含む。前記タンパク質の調製方法は、本明細書中に記載されている。

“ＣＰＳＩ−コード化ポリヌクレオチド”、“ＣＰＳＩ遺伝子”、“ＣＰＳＩ遺伝子配
列”、及び“ＣＰＳＩ遺伝子分節”という用語は、上記に定義されたように、ＣＰＳＩ遺
伝子産物、ＣＰＳＩタンパク質、又はＣＰＳＩポリペプチドをコードしているポリヌクレ
オチド配列と実質的に同一な、全てのＤＮＡ配列を意味する。また、該用語は、そのよう
なＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ、又はアンチセンス配列を意味する。また、“ＣＰＳＩコ
ードポリヌクレオチド”、“ＣＰＳＩ遺伝子”、“ＣＰＳＩ遺伝子配列”、及び“ＣＰＳ
Ｉ遺伝子分節”は、関連した制御配列の全ての組合せを含んでもよい。

“実質的に同一”という用語は、ＣＰＳＩ遺伝子産物、又はＣＰＳＩアミノ酸配列、又
はＣＰＳＩ遺伝子、又はＣＰＳＩ核酸配列のいずれかを規定するように使用される場合、
特定の配列、例えば、変異配列が、１以上の欠失、置換、又は付加によって天然ＣＰＳＩ
配列と異なるが、その正味効果は、ＣＰＳＩの少なくとも幾つかの生物学的活性を保持し
ていることを意味する。あるいは、ＤＮＡ類似配列は、下記のような場合、本明細書中で
開示した特異的ＤＮＡ配列と“実質的に同一”である：（ａ）該ＤＮＡ類似配列が、天然
ＣＰＳＩ遺伝子のコード領域に由来する；又は（ｂ）該ＤＮＡ類似配列が、中程度のスト
リンジェント条件下で、（ａ）のＤＮＡ配列のハイブリダイゼーションを可能にし、かつ
それは、生物学的に活性なＣＰＳＩ遺伝子産物をコードしている；又は（ｃ）該ＤＮＡ配
列が、（ａ）、及び／又は（ｂ）で規定された該ＤＮＡ類似配列の遺伝暗号の結果として
変性する場合である。実質的に同一の類似タンパク質は、天然タンパク質の対応する配列
に対して、約６０％を超えて同一である。類似性の程度が低いが、同程度の生物学的活性
を有する配列は、均等と考えられる。核酸配列の決定において、実質的に類似したアミノ
酸配列をコードすることができる全ての対象の核酸配列は、コドン配列中の違いにも関わ
らず、参照核酸配列に対して実質的に類似していると考えられる。

（Ｃ．１． パーセント類似性）
パーセント類似性は、例えば、ウイスコンシン大学遺伝学者コンピューターグループ（
the University of Wisconsin Geneticist Computer Group）から利用可能なＧＡＰコン
ピュータープログラムを使用した配列情報の比較によって決定され得る。該ＧＡＰプログ
ラムは、Smith ら（Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)）によって改正された、Needlemanら
（J. Mol. Biol. 48:443 (1970)）の整列方法を使用している。手短に言えば、該ＧＡＰ
プログラムは、短い２つの配列中の記号の総数によって分割された、類似した整列記号（
すなわち、ヌクレオチド、又はアミノ酸）の数として、類似性を規定する。該ＧＡＰプロ
グラムにおける代表的既定パラメータは、下記のものを含む：（１）ヌクレオチドの単位
比較マトリクス（同一に対しては１、及び非同一に対しては０の値を含む）、及びSchwar
tzら（Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foun
dation, pp. 357-358 (1979)）によって記載されているような、Gribskovら（Nucl. Acid
s. Res. 14:6745 (1986)）の計量された比較マトリクス；（２）それぞれのギャップに対
して３．０のペナルティ、及びそれぞれの記号、及びそれぞれのギャップに対してさらに
０．０１のペナルティ；及び（３）終末ギャップは、ペナルティなしである。他の比較技
術を、実施例に記述する。

“相同性”という用語は、類似した機能、又はモチーフを有する遺伝子、又はタンパク
質を同定するために使用される、配列類似性の数学的に基づいた比較を示す。従って、“
相同性”という用語は、上記で規定した“類似性”、及び“パーセント類似性”という用
語と同義である。それゆえ、“実質的相同性”、又は“実質的類似性”という句は、類似
した意味を有する。

（Ｃ．２． 核酸配列）
特定の実施態様において、ここで開示される主題は、それぞれの配列内にＣＰＳＩ遺伝
子の本質的配列である配列を含むＣＰＳＩ遺伝子、及び遺伝子産物、又は対応するタンパ
ク質の使用に関連するものである。“ＣＰＳＩ遺伝子の配列として本質的な配列”という
用語は、該配列が、ＣＰＳＩポリペプチド、又はＣＰＳＩコードポリヌクレオチドの一部
分と実質的に一致し、かつＣＰＳＩタンパク質、又はＣＰＳＩ遺伝子の塩基、又はアミノ
酸と同一でない塩基、又はアミノ酸（ＤＮＡ、又はタンパク質のどちらか）を比較的少数
有する（又は、タンパク質が参照される場合、生物学的機能均等性である）ことを意味す
る。“生物学的機能均等性”という用語は、技術的に理解され、さらに本明細書中に詳細
に規定されている。従って、ＣＰＳＩタンパク質のアミノ酸、又はＣＰＳＩ遺伝子に同一
、又は機能的に均等であるアミノ酸を、いくつかの実施態様において約７０％〜約８０％
、いくつかの実施態様において約８１％〜約９０％、及びいくつかの実施態様において約
９１％〜約９９％の有する配列は、“本質的に同一”である配列であろう。

また、機能的に均等なコドンを有するＣＰＳＩ遺伝子産物、及びＣＰＳＩ遺伝子は、こ
こで開示される主題の範囲にわたる。“機能的に均等なコドン”という用語は、アルギニ
ン、又はセリンの６個のコドンのような、同じアミノ酸をコードするコドンを意味し、か
つ生物学的均等性のアミノ酸をコードするコドンを意味するように、本明細書中で使用さ
れる（表１参照）。

また、アミノ酸、及び核酸配列は、付加的なＮ、又はＣ末端アミノ酸、或いは５'、又
は３'配列のような付加的な残基を含むことができ、かつタンパク質発現に関連する場合
に、該配列が生物学的タンパク質活性の維持を含む上記基準に出会うまで、本明細書中で
開示される配列の１つに本質的に記載されていることが理解されるであろう。末端配列の
付加は、特に核酸配列に適用され、例えば、コード領域の５'、又は３'部分のどちらかの
側方の様々な非コード配列を含み得るか、又は遺伝子中に見出されることが知られる様々
な内部配列、すなわちイントロンを含み得る。

また、ここで開示される主題は、明細書中に示した配列に相補的であるか、又は本質的
に相補的であるＤＮＡ分節の使用を含む。“相補的”である核酸配列は、標準ワトソン-
クリック相補則に従った塩基対である。本明細書中で使用されているように、“相補的配
列”という用語は、実質的に相補的である核酸配列を意味し、上述した同一ヌクレオチド
比較によって評価してもよい。又は本明細書中で開示されるような比較的ストリンジェン
トな条件下で、該核酸分節とハイブリダイズすることができるように規定される。意図さ
れた相補的核酸分節の特定の例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

核酸ハイブリダイゼーションは、塩濃度、温度、又は有機溶媒などの条件、さらに、塩
基組成、相補鎖の長さ、及びハイブリダイズする核酸間でのヌクレオチド塩基ミスマッチ
の数に影響され、これは、当業者により容易に理解されるであろう。ストリンジェント温
度条件は、一般的に３０℃より上、典型的には３７℃より上、及びいくつかの実施態様に
おいては４５℃より上の温度を含むであろう。ストリンジェント塩条件は、通常１０００
ｍＭ未満、典型的には５００ｍＭ未満、及びいくつかの実施態様において２００ｍＭ未満
であろう。しかし、パラメータの組合せは、どの単一パラメータの尺度よりもさらに重要
である（Wetmur、及びDavidson、J. Mol. Biol. 31:349-370 (1968)を参照されたい。）
。

また、プローブ配列は、特定条件下で二本鎖ＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、三本
鎖、又は他の高次のＤＮＡ複合を形成することができる。前記プローブ調製、及び適切な
ハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知である。
本明細書中で使用されているように、“ＤＮＡ分節”という用語は、特定の種の全ゲノ
ムＤＮＡのない、単離されたＤＮＡ分子を意味する。さらに、ＣＰＳＩポリペプチドをコ
ードしているＤＮＡ分節は、ＣＰＳＩコード配列を含むＤＮＡ分節を意味するが、ホモサ
ピエンスなどの源種の全ゲノムＤＮＡから離れて単離されたか、又は精製されたものであ
る。“ＤＮＡ分節”という用語に含まれているのは、ＤＮＡ分節、及び前記分節の小さな
フラグメント、並びに、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、及びウイルスなどを
含む組換えベクターでもある。

同様に、単離、又は精製されたＣＰＳＩ遺伝子を含むＤＮＡ分節は、他の自然発生的遺
伝子、又はタンパク質をコードしている配列から実質的に離れて単離された、ＣＰＳＩを
コードしている配列を含むＤＮＡ分節を意味する。この観点において、“遺伝子”という
用語は、機能タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドコード単位を意味するように、簡
潔に使用される。当業者によって理解されているように、この機能的用語は、ゲノム配列
、及びｃＤＮＡ配列の両方を含む。“他をコードしている配列から実質的に離れて単離さ
れた”は、対象の遺伝子、この場合、ＣＰＳＩ遺伝子を意味し、ＤＮＡ分節のコード領域
の有意な部分を形成し、かつ該ＤＮＡ分節は、大きな染色体断片、又は他の機能遺伝子、
又はｃＤＮＡコード領域などの自然発生的コードＤＮＡの大きな部分は含まない。もちろ
ん、これは、最初に単離されたＤＮＡ分節を意味し、人の手によって該分節に後で付加さ
れる遺伝子、又はコード領域を排除しない。

特定の実施態様において、ここで開示される主題は、そのアミノ酸配列中に配列番号：
２、４、１２、及び１４の任意のアミノ酸配列を含むＣＰＳＩポリペプチドをコードして
いる単離されたＤＮＡ分節、及びＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターに関連するもの
である。他の特定の実施態様において、ここで開示される主題は、そのアミノ酸配列中に
ヒト組織に対応するＣＰＳＩポリペプチドのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードして
いる単離されたＤＮＡ分節、及びＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターに関連するもの
である。

また、ここで開示される主題は、配列番号１〜４、及び１１〜１４の特定の核酸、及び
アミノ酸配列に限定されないことが理解されるであろう。従って、組換えベクター、及び
単離されたＤＮＡ分節は、ＣＰＳＩポリペプチドコード領域自体を多様に含み、基本コー
ド領域内の選択された変更、又は改質を有するコード領域を含み、又はＣＰＳＩポリペプ
チドコード領域を含む、コードされた大きなポリペプチドを含むことができ、或いは、ア
ミノ酸配列に変異を有する生物学的機能均等性のタンパク質、又はペプチドをコードする
ことができる。

特定の実施態様において、ここで開示される主題は、そのアミノ酸配列中に配列番号２
、４、１２、及び１４のいずれかに本質的に記載されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
又はペプチドをコードする単離されたＤＮＡ分節、及び組換えベクターに関連するもので
ある。自然に、ＤＮＡ分節、又はベクターが、全長ＣＰＳＩ遺伝子産物をコードする場合
、典型的な核酸配列は、配列番号１、３、１１、及び１３のいずれかに本質的に記載され
、かつ尿素回路において活性を示すタンパク質をコードしている配列であり、それは、例
えば、本明細書中の実施例３に開示されているように、アンモニアからカルボニルリン酸
の産生を検出するための比色分析によって決定され得る。

“配列番号２、４、１２、及び１４のいずれかに本質的に記載の配列”という用語は、
配列番号２、４、１２、及び１４のいずれかの部分アミノ酸配列に実質的に対応する配列
が、配列番号２、４、１２、及び１４のいずれかのアミノ酸配列のアミノ酸と同一、又は
生物学的機能均等性でない比較的少数のアミノ酸を有することを意味する。“生物学的機
能均等性”という用語は、 当業者によく理解され、かつさらに本明細書中において詳細
に規定されている。従って、配列番号２、４、１２、及び１４のいずれかのアミノ酸に同
一、又は機能的に均等であるアミノ酸配列を、いくつかの実施態様において約７０％〜約
８０％、いくつかの実施態様において約８１％〜約９０％、及びいくつかの実施態様にお
いて約９１％〜９９％有する配列は、“配列番号２、４、１２、及び１４に本質的に記載
の配列”である配列であろう。

特定の実施態様において、ここで開示される主題は、遺伝子治療方法に関連し、ヒト組
織に由来する配列を含む、そのアミノ酸配列内に配列番号２、４、１２、及び１４のいず
れかのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしている単離されたＤＮＡ分節、及びＤＮ
Ａ配列を組み込んだ組換えベクターを使用する。他の特定の実施態様において、ここで開
示される主題は、そのアミノ酸配列中にヒト肝臓組織由来のＣＰＳＩタンパク質のアミノ
酸配列を含むタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ配列、及びＤＮＡ配列を組み込ん
だ組換えＤＮＡベクターに関連するものである。

特定の他の実施態様において、ここで開示される主題は、核酸配列内に、配列番号１、
３、１１、及び１３のいずれかに本質的に記載されている核酸配列を含むＤＮＡ分節、及
び組換えベクターに関連するものである。“配列番号１、３、１１、及び１３のいずれか
に本質的に記載の配列”という用語は、上記と同じ意味で用いられ、かつ配列番号１、３
、１１、及び１３の任意部分のそれぞれに実質的に対応する核酸配列を意味し、かつ配列
番号１、３、１１、及び１３のいずれかのコドンそれぞれと同一、又は機能的に均等でな
い比較的少数のコドンを有する。さらに、尿素回路の活性、抗ＣＰＳＩ抗体との交差反応
性、又はＣＰＳＩ遺伝子産物の他の生物学的活性を示す遺伝子産物をコードするＤＮＡ分
節を使用することができる。“機能的に均等なコドン”という用語は、アルギニン、又は
セリンにおける６個のコドンなど、同じアミノ酸をコードするコドンを意味し、かつまた
、生物学的均等性のアミノ酸をコードするコドンを意味するように、本明細書中で用いら
れる（表１を参照されたい）。

ここで開示される主題の核酸分節は、それ自身のコード配列の長さに関わらず、プロモ
ータ、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、複数クローニン
グ部位、及び他のコード分節などを組合せることができ、それらの全長は大幅に変化して
もよい。従って、一種の任意長さの核酸フラグメントは、いくつかの実施態様において、
調製の容易さにより制限された全長とともに、及び意図された組換えＤＮＡプロトコルの
使用によって用いられ得る。例えば、約１０ヌクレオチドのような配列番号１、３、１１
、及び１３それぞれのいずれかに対してセットされた核酸配列に相補的である短い伸長を
含み、かつ長さが10,000、又は5,000塩基対まで有し、特定の場合において3,000の分節が
好ましい、核酸フラグメントを調製することができる。また、全長約1,000、500、200、1
00、及び約50塩基対の全長を有するＤＮＡ分節は、有用であることが意図される。

ここで開示される主題のＤＮＡ分節は、生物学的機能均等性のＣＰＳＩタンパク質、及
びペプチドを含む。前記配列は、核酸配列、及び従ってコードされたタンパク質内に自然
に発生することが知られているコドン重複性、及び機能均等性の結果として生じ得る。あ
るいは、交換されるアミノ酸特性の考慮に基づいて、該タンパク質構造の変化を処理する
ことができる組換えＤＮＡ技術の適用を介して、機能的に均等なタンパク質、又はペプチ
ドを作成することができる。例えば、アミノ酸4、及び5番目におけるＩｌｅ、及びＬｅｕ
の置換は、配列番号１１〜１４である。人によってデザインされる変化は、例えば、該タ
ンパク質の抗原性の向上を導入するように、或いは、尿素回路の活性を、又は分子レベル
での他の活性を調査するために、ＣＰＳＩ変異を試験するように、部位特異的突然変異誘
発法の適用を介して導入され得る。

所望ならば、例えば、該ＣＰＳＩコード領域が、精製、又は免疫検出目的（例えば、親
和性クロマトグラフィー、及び酵素ラベルコード領域それぞれによって精製され得るタン
パク質）などの所望の機能を有する他のタンパク質、又はペプチドを有する、同一の発現
単位内に並べられた、融合タンパク質、及びペプチドを調製してもよい。
組換えベクターは、ここで開示される主題の重要なさらなる態様を形成する。特に有用
なベクターは、ＤＮＡ分節のコード部分がプロモータの制御下で位置しているベクターに
なるように意図される。該プロモータは、例えば哺乳動物組織のＣＰＳＩ遺伝子に自然に
付随しているプロモータの形態であってもよく、例えば、組換えクローニング及び／又は
ＰＣＲ技術を用いて、本明細書中で開示した組成に関連したコード分節、又はエキソンの
上流に位置した５'非コード配列を単離することにより獲得され得る。

他の実施態様において、特定の利点は、組換え、又は非相同プロモータの制御下で、コ
ードＤＮＡ分節を位置することにより獲得されるであろうことが意図される。本明細書中
で使用されているように、組換え、又は非相同プロモータは、自然環境においてＣＰＳＩ
遺伝子に通常関連しないプロモータを意味することが意図される。前記プロモータは、細
菌、ウイルス、真核、又は哺乳動物細胞から単離されたプロモータを含んでもよい。当然
のことながら、発現のために選択された細胞種において、ＤＮＡ分節の発現を効果的に指
示するプロモータを用いることは重要であろう。タンパク質発現のためのプロモータ、及
び細胞種の組合せ使用は、分子生物学の当業者に一般的に知られており、例えば、参照に
よって本明細書中に組み込まれているSambrookらの文献,1989を参照されたい。使用され
るプロモータは、構成的、又は誘導的であってもよく、かつ組換えタンパク質、又はペプ
チドの大量生産に有利であるような、導入されたＤＮＡ分節の高レベル発現を指示する適
切な環境下で使用され得る。高レベル発現の使用において提供される適切なプロモータシ
ステムは、バクチナウイルス（vaccina virus）プロモータ、及びバキュロウイルスプロ
モータを含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施態様において、ここで開示される主題は、尿素回路における活性、抗Ｃ
ＰＳＩ抗体への交差反応、又はここで開示される主題に従う他の生物学的活性を有する、
ＣＰＳＩポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する
。いくつかの実施態様において、ここで開示される主題の発現ベクターは、ヒトＣＰＳＩ
遺伝子産物をコードしているポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、こ
こで開示される主題の発現ベクターは、配列番号２、４、１２、及び１４のいずれかのア
ミノ酸残基配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む。いくつか
の実施態様において、ここで開示される主題の発現ベクターは、配列番号１、３、１１、
及び１３のいずれかのヌクレオチド塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施態様において、ここで開示される主題の発現ベクターは、エンハンサー
−プロモータに操作可能なように結合したポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様
において、ここで開示される主題の発現ベクターは、原核生物のプロモータに操作可能な
ように結合したポリヌクレオチドを含む。あるいは、ここで開示される主題の発現ベクタ
ーは、真核生物のプロモータであるエンハンサー−プロモータに操作可能なように結合し
たポリヌクレオチドを含み、かつ該発現ベクターは、ポリアデニル化シグナルをさらに含
み、これは、３'のカルボキシ末端アミノ酸に位置し、該コード化ポリペプチドの転写単
位内に存在する。

いくつかの実施態様において、ここで開示される主題は、尿素回路の調節における活性
、抗ＣＰＳＩ抗体との交差反応性、又はここで開示される主題に従う他の生物学的活性を
有する、ＣＰＳＩポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを用いてトランスフェ
クトされた組換え宿主細胞を提供する。配列番号１〜４、及び１１〜１４は、典型的な脊
椎動物であるヒト由来のヌクレオチド、及びアミノ酸配列を示している。また、ここで開
示される主題により提供されるものは、ラットを含む他の脊椎動物において見出された、
相同的、又は生物学的均等性のポリヌクレオチド、及びＣＰＳＩポリペプチドである。ま
た、ここで開示される主題によって提供されるものは、細菌、及び酵母を含む、無脊椎動
物において見出された、相同的、又は生物学的均等性のポリヌクレオチド、及びＣＰＳＩ
ポリペプチドである。

いくつかの実施態様において、ここで開示される主題の組換え宿主細胞は、ヒトＣＰＳ
Ｉポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトされる。い
くつかの実施態様において、ここで開示される主題の組換え宿主細胞は、配列番号１、３
、１１、及び１３のいずれかのポリヌクレオチド配列を用いてトランスフェクトされる。
いくつかの実施態様において、ここで開示される主題の宿主細胞は、真核生物の宿主細胞
である。いくつかの実施態様において、ここで開示される主題の組換え宿主細胞は、脊椎
動物細胞である。いくつかの実施態様において、ここで開示される主題の組換え宿主細胞
は、哺乳動物細胞である。

別の態様において、ここで開示される主題の組換え宿主細胞は、原核生物の宿主細胞で
ある。いくつかの実施態様において、ここで開示される主題の組換え宿主細胞は、細菌の
細胞であり、いくつかの実施態様においてエシェリシアコリの菌株である。いくつかの実
施態様において、組換え宿主細胞は、該組換え宿主細胞中の機能的な制御シグナルの転写
制御下にあるポリヌクレオチドを含み、該制御配列は、全ての必要な転写、及び転写後修
飾がある程度可能なＣＰＳＩポリペプチドの発現を適切に制御する。

いくつかの実施態様において、ここで開示される主題は、尿素回路における活性、抗Ｃ
ＰＳＩ抗体との交差反応性、又はここで開示される主題に従う他の生物学的活性を有する
ＣＰＳＩポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを用いて、形質転換細胞を産生
するように細胞をトランスフェクションすることを含む、ＣＰＳＩポリペプチドの調製方
法、及び該ポリペプチドの発現に十分な生物学的条件下で形質転換された宿主細胞の維持
方法を提供する。いくつかの実施態様において、該形質転換された宿主細胞は真核生物細
胞である。いくつかの実施態様において、該真核生物細胞は、脊椎動物細胞である。ある
いは、該宿主細胞は、原核生物細胞である。いくつかの実施態様において、該原核生物細
胞は、エシェリシアコリの細菌細胞である。いくつかの実施態様において、形質転換細胞
にトランスフェクトされるポリヌクレオチドは、配列番号１、３、１１、及び１３のいず
れかのヌクレオチド塩基配列を含む。配列番号１〜４、及び１１〜１４は、典型的な脊椎
動物であるヒトにおけるヌクレオチド、及びアミノ酸配列を示している。また、ここで開
示される主題により提供されるものは、他の脊椎動物、特に温血脊椎動物、特にはラット
において見出される、相同的、又は生物学的均等性のＣＰＳＩポリヌクレオチド、及びポ
リペプチドである。また、ここで開示される主題により提供されるものは、細菌、酵母を
含む無脊椎動物において見出される、相同的、又は生物学的均等性のポリヌクレオチド、
及びＣＰＳＩポリペプチドである。

先に記載したように、組換えＣＰＳＩタンパク質、及びペプチドを調製するための実施
態様の表現に関連して、より長いＤＮＡ分節が、最も頻繁に使用されることが意図され、
いくつかの実施態様において、全ＣＰＳＩタンパク質、又は機能ドメイン、又はその切断
産物をコードしているＤＮＡ分節が使用される。しかし、また、抗ＣＰＳＩ抗体を産生す
るために使用され得るようなＣＰＳＩペプチド、又はエピトープのコア領域の発現を指示
するためのより短いＤＮＡ分節の使用は、ここで開示される主題の範囲内に収まることが
理解されるであろう。

いくつかの実施態様において、約１５から約５０アミノ酸長さ、及びいくつかの実施態
様において約１５から約３０アミノ酸長さのペプチド抗原をコードしているＤＮＡ分節は
、特に有用であると考えられる。ペプチドをコードしているＤＮＡ分節は、一般的に、約
４５〜約１５０、又は約９０ヌクレオチドと同程度の長さをコードしている最小限度を有
しているであろう。全長タンパク質をコードしているＤＮＡ分節は、配列番号２、４、１
２、及び１４のいずれかに従って、タンパク質に対して約４，５００〜約４，６００ヌク
レオチドと同程度の長さをコードしている最小限度を有し得る。

当然のことながら、ここで開示される主題は、配列番号１、３、１１、及び１３のいず
れかに示した配列に対して相補的、又は本質的に相補的であるＤＮＡ分節も含む。“相補
的”、及び“本質的に相補的”という用語は、上記に規定されている。イントロン性、又
はフランキング領域を除いて、その詳細を図９に図解的に開示する。遺伝的暗号の縮重を
斟酌すれば、配列番号１、３、１１、及び１３のいずれかのヌクレオチドに同一又は機能
的に均等（すなわち、同じアミノ酸をコードしている）であるヌクレオチドを、いくつか
の実施態様において約７０％〜約８０％、いくつかの実施態様において約８１％〜約９０
％、いくつかの実施態様において約９１％〜約９９％有する配列は、“配列番号１、３、
１１、及び１３のいずれかに本質的に記載の配列”である配列であろう。また、配列番号
：１、３、１１、及び１３のいずれかに示したものと本質的に同一である配列は、比較的
ストリンジェントな条件下において、配列番号１、３、１１、及び１３のいずれかに相補
性を含む核酸分節とハイブリダイズできる配列として機能的に規定され得る。適切な比較
的ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、本明細書中に記述され、かつ当業
者に周知であろう。

（Ｃ．２． 生物学的機能均等性）
先に記載したように、改質と変化を、本明細書中で記載したＣＰＳＩタンパク質、及び
ペプチドの構造で行い、類似、又は他の所望の特性を有する分子を得てもよい。例えば、
特定のアミノ酸は、細胞の核中のような構造の相互作用能の大きな損失がなければ、タン
パク質構造中の他のアミノ酸に置換されてもよい。相互作用能、及びタンパク質特性は、
タンパク質の生物学的機能活性を規定するので、特定のアミノ酸配列置換を、タンパク質
配列（又は、もちろん、その基礎をなすＤＮＡコード配列）内で行い、かつ類似、又は同
等の対抗する特性（例えば、アンタゴニスト対アゴニスト）を有するタンパク質を得るこ
とができる。従って、それらの生物学的有用性、又は活性の大きな損失がなければ、該Ｃ
ＰＳＩタンパク質、及びペプチド（又は基礎をなすＤＮＡ）の配列において様々な変化を
行うことができる。

また、生物学的機能均等性のタンパク質、又はペプチドの規定に固有のものは、該分子
の規定部分内で行なわれ、かつ均等な生物学的活性の許容し得るレベルを有する分子を生
じる得る変化の数に、制限があるという概念であり、このことは当業者に理解されるであ
ろう。従って、生物学的機能均等性のペプチドは、特定のアミノ酸を置換（ほとんど、又
は全てではない）することができるペプチドとして、本明細書中で規定されている。もち
ろん、異なった置換を有する複数の異なったタンパク質／ペプチドを、ここで開示される
主題に従って容易に製造し、かつ使用することができる。

また、例えば、特定の残基が、活性サイト内の残基のような、タンパク質、又はペプチ
ドの生物学的、又は構造的特性に特に重要であることが示されている場合、前記残基は、
一般的に交換され得ないことが、よく理解される。これは、ここで開示される主題の場合
であり、例えば、もしＣＰＳＩポリペプチドのリン酸化ドメインに変化があったならば、
ここで開示される主題の結果生じるペプチドの有用性の態様の喪失を生じ得る。

本明細書中に記載されるＣＰＳＩタンパク質、及びペプチドの改質に使用され得るよう
なアミノ酸置換は、例えば、疎水性、親水性、及びサイズなどのアミノ酸側鎖置換基の相
対的な類似性に一般的に基づく。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形、及び型の分析は、ア
ルギニン、リジン、及びヒスチジンが、全てプラスに帯電した残基であり、アラニン、グ
リシン、及びセリンが、全て類似したサイズであり、かつフェニルアラニン、トリプトフ
ァン、及びチロシンが、全て一般的に類似した形であることを示す。従って、これらの考
慮に基づいて、アルギニン、リジン、及びヒスチジン；アラニン、グリシン、及びセリン
；並びにフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン；は生物学的機能均等性とし
て、本明細書中で規定されている。

そのような変化を作るにあたり、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮してもよい。各
アミノ酸は、それらの疎水性、及び帯電特性に基づいてハイドロパシー指数が割り当てら
れ、それらは、イソロイシン(＋４．５)、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、
フェニルアラニン(＋２．８)、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．
９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン
（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．
６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、
アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、及びア
ルギニン（−４．５）である。

一般的に、タンパク質の相互作用的な生物学的機能を付与するハイドロパシーアミノ酸
指数の重要性は、当業者に理解される（Kyte、及びDoolittleの論文、J. Mol. Biol. 157
:105-132 (1982)、引用により本明細書中に組み込まれている。）。特定のアミノ酸を、
類似したハイドロパシー指数、又はスコアを有する他のアミノ酸に置換しても、類似した
生物学的活性を保持することができることは公知である。ハイドロパシー指数が、いくつ
かの実施態様において初期値の±２以内であり、いくつかの実施態様において初期値の±
１であり、かつ、いくつかの実施態様において初期値の±０．５であるアミノ酸の置換は
、ハイドロパシー指数に基づいた変化の形成に使用され得る。

また、類似アミノ酸の置換が、親水性に基づいて効率的に作られ得ることは、当業者に
理解される。米国特許第４，５５４，１０１号は、引用により本明細書中に組み込まれて
おり、タンパク質の最も大きな局部平均親水性が、その近接アミノ酸の親水性に支配され
るので、その免疫原性と抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性に関連することを記
載している。アミノ酸を、類似した親水性値を有する別のものに置換し、それでも生物学
的均等性のタンパク質を得ることができることが理解される。

米国特許第４，５５４，１０１号に詳細に記述されているように、下記の親水性値はア
ミノ酸残基によって決められている：アルギニン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．
０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．
２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（
−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．
０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイ
シン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトフ
ァン（−３．４）である。

親水性値が、いくつかの実施態様において初期値の±２以内、いくつかの実施態様にお
いて初期値の±１以内、及びいくつかの実施態様において初期値の±０．５以内であるア
ミノ酸の置換は、類似した親水性値に基づいた変化の形成に使用され得る。
議論は、アミノ酸変化により生じる機能的に均等なポリペプチドに焦点を当てているが
、遺伝暗号が変質し、かつ２以上のコドンが、該同一アミノ酸をコードし得ることも考慮
して、これらの変化が、該コード化ＤＮＡの変更によってもたらされ得ることは明らかで
あろう。

（Ｃ．３． 配列改質技術）
本明細書中に記述したＣＰＳＩタンパク質、及びペプチドに対する改質は、部位特異的
変異誘発法などの技術を用いて行ってもよい。部位特異的変異誘発法は、基礎をなすＤＮ
Ａの特異的突然変異誘発を介して、個々のペプチド、又は生物学的機能均等性のタンパク
質、又はペプチドの調製に有用な技術である。該技術は、例えば、１以上の先の考慮を組
み込み、ＤＮＡに１以上のヌクレオチド配列変化を導入することによって配列変異を調製
し、かつ試験する、迅速な能力を提供する。部位特異的突然変異は、所望される変異のＤ
ＮＡ配列、並びに十分な数の近接したヌクレオチドをコードしている特異的オリゴヌクレ
オチド配列の使用を介して、変異の生成を可能にし、横断された欠失接合点の両端におい
て、安定な二本鎖の形成に十分なサイズ、及び配列複雑性のプライマー配列を提供する。
典型的に、長さが約１７〜３０ヌクレオチドのいくつかの実施態様のプライマーは、変更
した配列の両端の該接合点上の約５〜１０残基とともに使用され得る。

一般的に、部位特異的突然変異の技術は、出版物（例えば、Adelmanらの文献、1989）
に例示されているものとして技術的に公知である。認識されているように、典型的に、該
技術は、一本鎖、及び二本鎖の形態、双方が存在するファージベクターを使用する。部位
特異的突然変異誘発法に典型的なベクターは、Ｍ１３ファージのようなベクターを含む（
Messingらの文献、1981）。これらのファージは、容易に商業的に入手可能であり、一般
的に、当業者に周知のものである。また、二本鎖プラスミドは、プラスミドからファージ
に対象の遺伝子の転移段階を取り除いた部位特異的突然変異誘発法にルーチン的に使用さ
れる。

一般的に、これに従って、部位特異的突然変異誘発法は、一本鎖ベクターを最初に得る
か、又はその配列内に、例えばヒトＣＰＳＩポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を
含む、二本鎖ベクターの２本の鎖をバラバラに溶解することにより、実行される。所望の
変異配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、例えばCreaらの方法（1978）のよう
に、通常、合成的に調製される。次に、このプライマーを、一本鎖ベクターとともにアニ
ールし、該変異を有する鎖の合成を完了するために、Ｅ．コリ ポリメラーゼＩクレノウ
フラグメントなどのＤＮＡ重合酵素にさらす。従って、一本鎖が最初の無変異配列をコー
ドし、かつ２番目の鎖が所望の変異を有する、ヘテロ二本鎖が形成される。次に、このヘ
テロ二本鎖ベクターを使用して、Ｅ．コリ細胞などの適切な細胞を形質転換し、かつ変異
配列配置を有する組換えベクターを含むクローンを選択する。

部位特異的突然変異誘発法を用いた、該選択された遺伝子の配列変異型の調製は、潜在
的に有用なＣＰＳＩポリペプチド、又は該尿素回路において活性を有する他の種を産生す
る手段として提供される。これは、制限することを意味するわけではなく、これらのペプ
チドの配列変異型を得ることができる他の方法がある。例えば、ヒドロキシルアミンを用
いたプラスミドＤＮＡの突然変異誘発のために、所望の遺伝子をコードしている組換えベ
クターを、突然変異誘発物質で処理し、配列変異型を得てもよい（例えば、Eichenlaub、
1979によって記述された方法を参照されたい。）。

（Ｃ．４． 他の構造的均等物）
本明細書中で記述したＣＰＳＩペプチジル化合物に加えて、本発明者らは、他の立体的
類似化合物を考案し、該ペプチド構造の重要部分を模倣することができることも意図して
いる。そのような化合物を、ここで開示される主題のペプチドとして、同じ様式で使用し
てもよい。従って、これも、機能均等性である。構造的機能均等物の創出を、当業者に公
知のモデリング、及び化学的デザインの技術によって達成することができる。前記立体的
類似構造の全てが、ここで開示される主題の範囲内に含まれることが理解されるであろう
。

（Ｄ． 遺伝子産物の導入）
該遺伝子自身を使用して、該遺伝子産物を導入する場合、導入における従来の方法は、
その関連した制御配列と共に所望の遺伝子を組み込んだ組換えベクターの使用を介するで
あろう。組換えベクターの調製法は、当業者に周知であり、例えば、特に本明細書中に引
用により組み込まれているSambrookらの論文（1989）など、多くの参考文献に記述されて
いる。

ベクターにおいて、発現すべき配列をコードしているＤＮＡ、この場合ではＣＰＳＩ遺
伝子産物をコードしているＤＮＡは、プロモータに近接し、かつプロモータ制御下に置か
れていることが理解される。前記プロモータの制御下でコード配列を運ぶことは、技術的
に理解されており、それは、一般的に、該選択されたプロモータの約１〜約５０ヌクレオ
チド“下流”（すなわち、その３'）間で発現される、該遺伝子産物の転写的読み枠の転
写開始部位の５'末端に位置している。また、それが、最初の挿入されたＤＮＡ内に含ま
れていない場合、該ベクターの転写単位内に、適切なポリアデニル化部位（例えば、５'
−ＡＡＴＡＡＡ−３'）を組み込むことが所望されてもよい。典型的に、それらのポリＡ
付加部位は、転写終結前の位置に当たる、コード配列の約３０〜２０００ヌクレオチド“
下流”に配置される。

特定の遺伝子の制御配列（すなわち、ＣＰＳＩ遺伝子に対するＣＰＳＩプロモータ）を
使用することができるが、処理された該細胞の遺伝子型に適合する限り、他の制御配列が
使用され得ない理由はない。従って、それは、例えば、ＳＶ４０初期プロモータ、レトロ
ウイルス由来の長い末端繰り返しプロモータ、アクチンプロモータ、熱ショックプロモー
タ、及びメタロチオネインプロモータなどを含む一例の他の有用なプロモータを言及して
もよい。

当業者に公知のように、プロモータは、通常、転写が始まる（すなわち、転写開始部位
）点の前（上流）の約１００ヌクレオチド対内のＤＮＡ分子領域である。通常、その領域
は、異なる遺伝子の類似した相対的位置にあるＤＮＡ配列因子のいくつかの種類を含む。
本明細書中で用いられているように、“プロモータ”という用語は、技術的に、上流プロ
モータ領域、プロモータ領域、又は一般化された真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写単
位のプロモータ領域と呼ばれるものを含む。

離れた転写制御配列因子の別の種類は、エンハンサーである。エンハンサーは、特定の
コード配列（例えば、遺伝子）における、時間、位置、及び発現レベルの特異性を提供す
る。エンハンサーの主要な機能は、エンハンサーに結合する１以上の転写因子を含む細胞
における、コード配列の転写レベルを増加させることである。プロモータとは異なり、エ
ンハンサーはプロモータが存在する限り、転写開始部位から変化した間隔に位置したとき
に機能することができる。

本明細書中で使用されているように、“エンハンサー−プロモータ”という句は、エン
ハンサー、及びプロモータ要素の両方を含む複合単位を意味する。エンハンサー−プロモ
ータは、少なくとも１遺伝子産物をコードするコード配列に作用するように結合されてい
る。本明細書中で使用されているように、“作用するように結合される”という句は、エ
ンハンサー−プロモータが、コード配列の転写がそのエンハンサー−プロモータによって
制御、及び調節されるというような方向で、コード配列に接続されていることを意味する
。エンハンサー−プロモータをコード配列に作用するように結合させる方法は、当業者に
周知である。また、当業者に周知であるように、転写が調節されるコード配列に関連した
正確な方向と位置は、とりわけ、エンハンサー−プロモータの特異的な特性によって決め
られる。従って、ＴＡＴＡ ｂｏｘ最小プロモータは、通常、転写開始部位の約25〜約30
塩基対上流に位置し、かつ通常、上流プロモータ要素は、転写開始部位の約100〜200塩基
対上流に位置する。対照的に、エンハンサーは、該開始部位から下流に位置することがで
き、かつ、その部位からかなりの間隔で存在し得る。

ここで開示される主題のベクター構築に使用されるエンハンサー−プロモータは、トラ
ンスフェクトされる細胞内で発現を駆動する、任意のエンハンサー−プロモータであり得
る。周知の特性を有するエンハンサー−プロモータを使用することによって、遺伝子産物
発現のレベル、及びパターンを最適化することができる。

例えば、その対立遺伝子変異を含むヒトＣＰＳＩ遺伝子の導入のために、所望の遺伝子
を、影響される細胞に輸送するであろうベクター構築体を使用することが所望されるであ
ろう。これはもちろん、一般的に、該構築体が、例えば哺乳動物の肝臓細胞のような標的
細胞に輸送されることを要求するであろう。これは、いくつかの実施態様において、効率
的に細胞を感染させるためにＣＰＳＩ配列を運ぶウイルスベクターの使用を介する、所望
の遺伝子の導入によって達成され得る。これらのベクターは、いくつかの実施態様におい
て、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルスベクター、又はアデノ関連ウ
イルスであり得る。これらのベクターは、所望の配列を細胞に運ぶようにうまく使用し、
高い感染効率を有する傾向があるので、好ましい。適切なベクター−ＣＰＳＩ遺伝子構成
体は、本明細書中の下記に記載されているように、医薬組成物としての投与に適合される
。

発現ベクターにおいて一般的に使用されるウイルスプロモータは、ポリオーマ、サイト
メガロウイルス、アデノウイルス２、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）から由来す
るものである。ＳＶ４０の初期、及び後期プロモータは、両方とも、ＳＶ４０ウイルスの
複製起点も含む断片として該ウイルスから容易に得られるので、特に有用である。また、
ウイルス複製起点に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位まで伸びた約２５０ｂ
ｐの配列が含まれている場合、より小さな、又はより大きなＳＶ４０断片を使用してもよ
い。さらに、制御配列が、宿主細胞に適合性がある場合、所望の遺伝子配列に一般的に付
随したプロモータ、又は制御配列を利用する可能性があり、かつ頻繁に所望される。

複製起点は、ＳＶ４０、又は他のウイルス源（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、
ＢＰＶ）に由来し得るような外来性起点を含むベクターの構築によって、又は該宿主細胞
の染色体複製機序によって提供され得る。該ベクターが、該宿主細胞の染色体内に組み込
まれるならば、多くの場合、後者で十分である。

ＣＰＳＩ遺伝子自身が使用される場合、直接的に野生型ＣＰＳＩ遺伝子を単純にするこ
とが最も都合のよいであろう。従って、該ＣＰＳＩ遺伝子は、コード化ポリペプチドの１
４０５番目のアミノ酸が、スレオニンを含むように、スレオニンコード化対立遺伝子を含
み得る。もしくは、該ＣＰＳＩ遺伝子は、コード化ポリペプチドの１４０５番目のアミノ
酸が、アルギニンを含むように、アルギニンコード化対立遺伝子を含む。さらに、ＣＰＳ
Ｉ遺伝子の特定領域が、全野生型ＣＰＳＩ遺伝子、又はその全対立遺伝子多型を用いるこ
となく、排他的に使用され得ることが想定される。いくつかの実施態様において、尿素回
路を調節するために必要とされる最も小さな領域は、ＣＰＳＩ遺伝子構築体を受け取る細
胞内に、不必要なＤＮＡを導入しないように使用される。制限酵素の使用などの当業者に
周知の技術は、例証的なＣＰＳＩ遺伝子の小さな領域の産生を可能にするであろう。該尿
素回路を調節するためのこれらの領域の能力は、実施例に報告した試験によって容易に決
定され得る。一般的に、該尿素回路の調節を評価する技術は、技術的に公知である。

（Ｄ．１． トランスジェニック動物）
ここで開示される主題のＣＰＳＩ遺伝子を発現するか、又はＣＰＳＩ遺伝子の発現が“
ノックアウト”されている、トランスジェニック非ヒト動物を調製することも、ここで開
示される主題の範囲内で提供される。提供されるトランスジェニック非ヒト動物は、ＣＰ
ＳＩのＴ１４０５型か、又はＣＰＳＩのＮ１４０５型のいずれかを発現する。例証的なト
ランスジェニック動物はマウスである。

トランスジェニック動物の調製技術は、技術的に公知である。典型的な技術は、米国特
許第５，４８９，７４２号（トランスジェニックラット）、米国特許第４，７３６，８６
６号、第５，５５０，３１６号、第５，６１４，３９６号、第５，６２５，１２５号、及
び第５，６４８，０６１号（トランスジェニックマウス）、米国特許第５，５７３，９３
３号（トランスジェニックブタ）、米国特許第５，１６２，２１５号（トランスジェニッ
ク鳥類）、及び米国特許第５，７４１，９５７号（トランスジェニックウシ類）に記載さ
れ、それぞれの全内容は、引用により本明細書中に組み込まれている。

トランスジェニックマウスの例証的な調製方法に関して、ＣＰＳＩ遺伝子産物をコード
しているクローン化組換え、又は合成ＤＮＡ配列、又はＤＮＡ分節を、受精したマウスの
卵内に注入する。該注入した卵を、偽妊娠メス内に移植し、かつ細胞を、ＣＰＳＩ遺伝子
産物を発現するトランスジェニックマウスを提供する期間、成長させる。いくつかの実施
態様において、該注入した配列は、該トランスジェニックマウスの肝臓細胞内で所望の遺
伝子を発現するために、関連したプロモータ配列を有するように構築される。

（Ｄ．２． 遺伝子療法）
ＣＰＳＩ遺伝子を、ここで開示される主題に従って、遺伝子療法に使用することができ
る。宿主細胞への核酸のリポソームのトランスフェクションを含む、例証的な遺伝子療法
は、米国特許第５，２７９，８３３号、第５，２８６，６３４号、第５，３９９，３４６
号、第５，６４６，００８号、第５，６５１，９６４号、第５，６４１，４８４号、及び
第５，６４３，５６７号に記載され、それぞれの内容は、引用により本明細書中に組み込
まれている。

簡潔に、標的細胞中の尿素回路の調節に対して行われるＣＰＳＩ遺伝子療法を記載する
。標的細胞は、肝臓細胞、及び腸細胞を含むが、それらに限定されない。いくつかの実施
態様において、ここで開示される主題の治療方法は、（ａ）該尿素回路を調節するＣＰＳ
Ｉポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド含有ＤＮＡ分子の有効量を細胞に輸送
する段階、及び（ｂ）前記ポリペプチドの発現に十分な条件下に該細胞を維持する段階を
含む、細胞内の該尿素回路の調節方法を提供する。

いくつかの実施態様において、輸送は、該ＤＮＡ分子を該細胞内に注入することによっ
て達成される。該細胞が対象内にある場合、いくつかの実施態様において、輸送は、該Ｄ
ＮＡ分子を該対象の循環系内に投与することによって達成され得る。いくつかの実施態様
において、投与は、（ａ）該ＤＮＡ分子を含むビヒクルを提供する段階、及び（ｂ）該対
象に該ビヒクルを投与する段階を含む。

いくつかの実施態様において、ビヒクルは、該ＤＮＡ分子を用いて形質転換されたか、
又はトランスフェクトされた細胞、或いは前記形質転換されたか、又はトランスフェクト
された細胞に由来するトランスフェクトされた細胞である。例証的な形質転換されたか、
又はトランスフェクトされた細胞は、肝臓細胞である。ここで開示される主題のＤＮＡ分
子を用いた、細胞の形質転換、又はトランスフェクト方法は、上述されている。

また、該ビヒクルは、腫瘍の抗原と特異的に感染するか、又は免疫反応するウイルス、
又は抗体である。一般的に、該構築体を該宿主の標的組織に輸送するために使用されるレ
トロウイルスは、３'−ＬＴＲ(直線移転領域)が不活化されているウイルスである。これ
らは、エンハンサーなしの３'−ＬＴＲであり、多くの場合、ＳＩＮ(自己不活化ウイルス
)と呼ばれる。なぜならば、該宿主細胞への生産的な導入後、該３'−ＬＴＲは、５'末端
へ移動し、かつ両方のウイルスＬＴＲは、転写活性に関して不活性になるためである。当
業者に周知のこれらのウイルスの使用により、該クローン化遺伝子の制御要素が、２つの
ＬＴＲ間の空間に挿入されている遺伝子をクローン化する。ウイルス感染系の利点は、適
切な受容細胞内に、非常に高レベルでの感染が可能であることである。

抗体は、ＤＮＡ分子を標的とし、かつ輸送するために使用されている。Ｎ末端改質ポリ
−Ｌ−リジン（ＮＰＬＬ）抗体接合体は、プラスミドＤＮＡと容易に複合体を形成する。
ＮＰＬＬと接合した細胞表面トロンボモジュリンに対するモノクローナル抗体の複合体は
、外来プラスミドＤＮＡが、抗原を発現するマウス肺上皮細胞系、及びマウス肺を標的と
するために用いられる。それらの標的とされた上皮細胞は、その外来ＤＮＡによってコー
ドされた産物を発現した。

また、ここで開示される主題のこの実施態様は、レトロウイルスベクター、及びワクシ
ニアウイルス（そのゲノムは、該ウイルスを非病原性とするために、別の方法で操作され
ている。）を含む、別のウイルス、又はファージベクターを用いて実施され得る。前記ウ
イルスの変異の作成方法は、米国特許第４，７６９，３３１号中に詳細に記載され、それ
は、引用により本明細書中に組み込まれている。

特定の例として、ヒトＣＰＳＩコード化ポリヌクレオチド、又は別の温血脊椎動物由来
のＣＰＳＩコード化ポリヌクレオチドホモログ、又は細菌や酵母などの無脊椎動物源由来
のＣＰＳＩコード化ホモログは、単離された肝臓細胞、又は他の関連した細胞内に導入さ
れる。該肝臓、又は他の関連した組織へのトランス遺伝子運搬細胞の再注入は、ヒト、及
び動物の高アンモニア血症、又は他の関連疾患への感受性に対する治療を提供する。

（Ｅ． 補充療法）
窒素クリアランスの役割に加えて、該尿素回路は、強力な血管拡張剤である一酸化窒素
（ＮＯ）前駆体として機能するアルギニンの体の本質的な源である。次善尿素回路機能の
治療方法は、シトルリンなどの一酸化窒素前駆体の投与による治療を含む、ここで開示さ
れる主題に従って提供される。典型的に、該次善尿素回路機能は、本明細書中で開示した
多型に関連がある。該次善尿素回路機能は、高アンモニア血症、又はシトルリン、及び／
又はアルギニン産生低下をさらに含む。

治療されるべき対象は、これに限定されないが一酸化窒素前駆体の産生障害に関連した
疾患のような、次善尿素回路機能に関連した疾患に苦しむ可能性がある。前記疾患は、障
害のある、又は損傷した肝臓、及び／又は消化管組織に伴う疾患を含むが、それらに限定
されない。代表的な疾患は、肝炎（肝炎Ａ、Ｂ、及びＣを含む）、硬化症、喘息、肺高血
圧症（一次、及び二次を含む）、骨髄移植を受けた対象における骨髄移植毒性、及びこれ
らの組合せを含むが、これらに限定されない。

また、治療されるべき対象は、次善尿素回路機能に関連した環境刺激に曝されるか、又
は曝される直前であり得る。前記環境刺激は、機能障害、又は損傷した肝臓、及び／又は
消化管組織に伴う刺激を含むが、それらに限定されない。代表的な環境刺激は、化学療法
、又は他の薬剤治療、心臓手術（手術後の肺の血管緊張の増加としていくつかの状況にお
いて表される）、増加された酸化ストレス、骨髄移植、敗血症、急性喘息発作、低酸素症
、肝臓毒汚染、及びこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。代表的な心臓手術
は、先天的な心臓欠陥の修復を含み、かつ先天的な心臓欠陥の修復に用いられる心肺バイ
パスをさらに含む。房室中隔欠損（ＡＶＳＤ）、又は大きな非制限的な心室欠損中隔（Ｖ
ＳＤ）のような、過剰な肺の血流と関連した心臓の障害は、代表的な心臓の障害である。
持続的な肺の過循環は、肺の血管平滑筋の肥大、及び過反応性を引き起こし得る。手術前
に、これらの患者は、多くの場合、うっ血性の心不全、及び不十分な体重増加を示す。外
科的修復は、この手術後の合併症を減らすために、できるだけ早く予定される。

付加的な心臓の障害の正しい手法は、両方向性グレン（bidirectional Glenn）、及び
改質フォンタン（modified Fontan）手法である。前記手順において、単心室障害を有す
る患者は、外科的手法を必要とし、その成功は、低い手術後の肺血管緊張の維持に依存す
る。単心室障害の段階的な矯正は、肺と体循環とを分けることを目的とする、一連の３つ
の外科的手法を必要とする。これらの手順の最初は、多くの場合、新生児期に行われる、
右室低形成を有する患者に対するBlalock-Taussig短絡術、又は左心室低形成症候群を有
する患者に対するノーウッドI（Norwood I）手法である。２番目の外科手術は、上大動脈
流を直接的に肺動脈へと方向転換する、双方向性のGlenn短絡術である。三番目、及び最
終段階は、改質フォンタン手法であり、下大静脈流を肺動脈へと方向転換し、それによっ
て肺、及び体循環の分離を完成する。Glenn、及びFontan手順とともに、肺血流量は、完
全に受動的になり、かつ静脈系（ＳＶＣ、及びＩＶＣ圧力）とＰＡ圧力との間の適切な勾
配圧力に依存する。手術直後の肺血管緊張の任意の上昇は、肺血流量低下、及びそれに続
く心拍出量低下を誘導し得る。長期的には、これらの手順後の上昇した肺血管緊張は、持
続性の胸水、胸膜又は縦隔の廃液管における長期の必要性、長期の換気、及び長期のＩＣ
Ｕ滞在を誘導し得る。

付加的な心臓の障害の正しい手順は、ノーウッドI手法である。ノーウッドI手法を実行
した左心室低形成症候群（ＨＬＨＳ）を有する幼児の術後処置は、平衡肺、及び全身流に
大きく依存している。肺血管抵抗における突然の上昇は、著しい低酸素血症、及び不飽和
化を引き起こし得る。まれに、低い肺血管抵抗は、血流が、全身の犠牲、及び冠循環で肺
へと短絡される場合に、有害であり得る。正確な外科技術、及び中央の短絡の最適なサイ
ズ化により、この合併症は、不十分な肺血流量を有する問題よりも、より一般的でなくな
った。

付加的な心臓の障害の正しい手法は、大血管転換手法（arterial Switch Procedures）
である。大血管転位症（ＴＧＡ）は、複雑な心臓病変であり、差し迫った新生児期におい
て外科的矯正を必要とする。ＴＧＡの矯正における大血管転換手法のタイミングは、特に
肺血管緊張問題を考慮する。多くの場合、外科手術は、周産期の肺血管緊張が部分的に低
下しているとき、５〜７日齢まで実施されない。右心室は、外科的矯正前の全身性の心室
であるために、手術後の肺血管抵抗における上昇は、通常よく容認され、肺動脈圧は通常
測定されない。しかし、手術後の肺血管緊張が増加した場合、好ましい組織、及び短いバ
イパス時期を有するいくつかの乳児が、まだ複雑な術後経過をとる理由を、部分的に説明
してもよい。

対象の次善尿素回路機能に関連した疾患の治療、又は予防方法は、ここで開示される主
題に従って提供される。該方法は、対象に、治療的有効量の一酸化窒素前駆体を投与する
ことを含み、それによって該疾患の治療、又は予防が達成される。該一酸化窒素前駆体は
、シトルリン、アルギニン、及びこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施態様において、次善尿素回路機能に起因する次善一酸化窒素形成が、治療
され得る。

また、肝炎、肝硬変、肺高血圧症（一次、及び二次の両方）、壊死性腸炎(ＮＥＣ)、急
性呼吸促迫症候群、民族特異的内皮機能不全、勃起障害、喘息、及びこれらの組み合わせ
からなる群から選択される、対象の疾患の治療、又は予防方法を開示する。いくつかの実
施態様において、該方法は、それを必要とする対象に、治療的有効量の一酸化窒素前駆体
を投与することを含む。該投与は、経静脈、又は経口投与であり得る。該一酸化窒素前駆
体は、シトルリン、アルギニン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
いくつかの実施態様において、該疾患は、壊死性腸炎であり、該対象は早産児である。

また、硝酸前駆体濃度を、それを必要とする対象において上昇させる方法を開示する。
いくつかの実施態様において、該方法は、該対象に、治療的有効量の一酸化窒素前駆体を
投与することを含み、それによって対象の一酸化窒素前駆体の濃度を上昇させる。該投与
は静脈注射、又は経口投与であり得る。該一酸化窒素前駆体は、シトルリン、アルギニン
、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。

任意に、ここで開示される主題の補充療法は、該対象のカルバミルリン酸合成酵素Ｉの
多型を最初に検出する段階をさらに含む。該カルバミルリン酸合成酵素ポリペプチドの多
型は、いくつかの実施態様において、ＣＰＳＩエキソン３６中にＣからＡへのトランスバ
ージョンを含み、いくつかの実施態様において、該ＣＰＳＩ遺伝子に対応するｃＤＮＡの
４３４０番目のヌクレオチドでＣからＡへのトランスバージョンを含む。いくつかの実施
態様において、該ＣＰＳＩ遺伝子に対応するｃＤＮＡの４３４０番目のヌクレオチドでＣ
からＡへのトランスバージョンは、ＡＡＣからＡＣＣへのトリプレット暗号の変化をさら
に含み、これは、１４０５番目のアミノ酸にスレオニン部分を有するＣＰＳＩポリペプチ
ドをコードしている。

尿素回路中間体（シトルリン、アルギニン）の有意な低下は、本明細書中で開示される
Ｔ１４０５Ｎ ＣＰＳＩ多型に関連したＢＭＴを受けた対象において見出される。ここで
開示される主題に従って、また、ＨＶＯＤ、及び／又は急性肺損傷などのＢＭＴ毒性の治
療、又は予防方法を、ここで開示される主題に従って提供する。該方法は、シトルリン、
及び／又はアルギニンなどの治療的有効量のＮＯ前駆体を、それを必要とする対象に投与
することを含む。いくつかの実施態様において、本明細書中で開示するＴ１４０５Ｎ Ｃ
ＰＳＩ多型は、該対象中に存在する。いくつかの実施態様において、治療的有効量のシト
ルリンは、該対象へ投与される。

ここで開示される主題に従って、ＢＭＴを受けた対象の毒性、及び／又はＨＶＯＤの発
生を減少させる方法を提供する。この方法は、該対象のアルギニン、及びＮＯ合成を増強
するため、有効量のアルギニン、及び／又はシトルリン、いくつかの実施態様においては
シトルリンを、該ＢＭＴ対象に投与することを含む。該対象のアルギニン、及びＮＯ合成
の増強により、ＢＭＴに関連したＨＶＯＤの発生を減少させ、かつ／又は実質的に抑制す
るであろう。シトルリンは、より容易にＮＯに変換されるように与えられる、代表的な補
充剤である。さらに、ここで開示される主題のＣＰＳＩ多型を有する対象は、この方法に
従って、補充のための例証的候補であることが意図される。

多くの実施態様において、ここで開示される主題で治療された対象は、好ましくはヒト
対象であるが、ここで開示される主題の原理は、ここで開示される主題が、“対象”とい
う用語に含まれることが意図される哺乳動物、及び鳥などの温血脊椎動物を含む、全ての
脊椎動物種に対して効果的であることを示す。これに関連して、哺乳動物は、高アンモニ
ア血症、ＢＭＴ毒性、及び尿素回路機能障害に関連した他の疾患の治療が所望される、全
ての哺乳動物種、特に農業の、及び家畜の哺乳動物種を含むことが理解される。

従って、意図されることは、ヒトなどの哺乳動物、並びに、絶滅の危機に瀕しているた
めに重要(シベリアンタイガーなど)、経済的重要性（人による消費のために農場で飼育さ
れた動物）、及び／又はヒトの社会的重要性（ペットとして、又は動物園において飼われ
ている動物）（例えば、ヒト以外の肉食動物(ネコ、及びイヌなど)、スワイン（ブタ、食
用ブタ、及びイノシシ）、反芻動物（ウシ、雄牛、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソ
ン、及びラクダなど）、及びウマ）のそれらの哺乳動物の治療である。また、意図される
ことは、絶滅の危機に瀕している、動物園で飼育される鳥類、並びに、より特には飼いな
らされた鳥類、すなわち、七面鳥、ニワトリ、カモ、ガチョウ、及びホロホロ鳥などの治
療を含む、鳥類の治療であり、それらはまた、人にとって経済的に重要である。従って、
意図されることは、飼いならされたスワイン（ブタ、及び食用ブタ）、反芻動物、ウマ、
及び家禽などを含む家畜類の治療であるが、これらに限定されない。

単一剤形を製造するために、キャリアー物質と結合され得る活性成分の量は、治療され
るホスト、及び投与の特定の様式に依存して変化するであろう。例えば、ヒトへの投与を
意図した製剤は、全組成の約５〜約９５パーセントで変化し得るキャリアー物質の適切か
つ都合のよい量で混合される、０．５ｍｇ〜５ｇの活性剤を含み得る。例えば、ヒト成人
において、一投与につき一人当たりの量は、一般的に、一日当たり数回まで、１ｍｇ〜５
００ｍｇである。従って、用量単位形は、一般的に、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、典型的に
は、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍ
ｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、又は１０００ｍｇの活性成分を含むであろう。

該一酸化窒素前駆体は、いくつかの実施態様において約０．０１ｍｇ〜約１，０００ｍ
ｇの範囲の投与量で、いくつかの実施態様において約０．５ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲の
投与量で、かつ、いくつかの実施態様において約１．０ｍｇ〜約２５０ｍｇの範囲の投与
量で投与される。また、該一酸化窒素前駆体は、いくつかの実施態様において約１００ｍ
ｇ〜約３０，０００ｍｇの範囲の投与量で、いくつかの実施態様において約２５０ｍｇ〜
１，０００ｍｇの範囲の投与量で投与され得る。代表的な投与量は、３．８ｇ／ｍ２／日
のアルギニン、又はシトルリンである(モル当量、分子量Ｌ−シトルリン １７５．２、
分子量Ｌ−アルギニン １７４．２)。

代表的な静脈シトルリン溶液は、１００ｍｇ／ｍｌ（１０％）溶液を含み得る。代表的
な静脈シトルリン用量は、２００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、及
び８００ｍｇ／ｋｇを含み得る。いくつかの実施態様において、例えば、６００、又は８
００ｍｇ／ｋｇ用量に限定されないが、該投与量は、全身血圧において観察された望まし
くない影響を緩和するために、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの量まで減らすことが
できる。

いくつかの実施態様において、用量は、環境刺激に曝す前（例えば、心肺バイパスなど
の心臓手術開始前３０分の１回投与、及び／又は手術前の一定時期に渡って１２時間毎の
ような、手術前一定周期に１，２，３，４，５，６回まで、又はそれ以上の用量）、環境
刺激に曝した後（例えば、手術後の医療環境に到着次第、及び／又は手術後の一定時期に
渡って１２時間毎のような、手術後一定周期に渡って１，２，３，４，５，６回まで、又
はそれ以上の用量）に、対象に投与され得る。
しかし、特定の対象全てに対する特有の投与量の濃度は、年齢、体重、全般的健康、性
別、食事、投与の時間、投与の経路、排泄率、薬剤の組み合わせ、及び療法を受ける特定
の疾患の重症度を含む、様々な因子に依存するであろう。

（Ｆ． 医薬組成物）
いくつかの実施態様において、ここで開示される主題は、ここで開示される主題のポリ
ペプチド、又はポリヌクレオチド、及び生理学的に許容し得るキャリアーを含む、医薬組
成物を提供する。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、生物学的に活性なＣＰＳ
Ｉポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む。もしくは、提供される医薬組
成物は、先に記載したように、用量中にシトルリン、又はアルギニンを含む。

ここで開示される主題の組成物は、通常、標準的な周知である無毒性の生理的に許容し
得るキャリアー、アジュバント、及び要望通りのビヒクルを含む用量単位製剤で、経口的
に、又は非経口的に投与される。本明細書中で用いられているように、“非経口”という
用語は、経静脈、筋肉内、動脈内注射、又は注入技術を含む。
注射可能な製剤、例えば、無菌の注射可能な水溶液、又は油性の懸濁液は、適切な分散
剤、又は湿潤剤、及び懸濁化剤を用いる公知技術に従って配合される。また、該無菌の注
射可能な製剤は、例えば１，３−ブタンジオールの溶液のような、無毒性の非経口に許容
し得る希釈剤、又は溶媒の、無菌の注射可能な溶液、又は懸濁液であり得る。

該許容可能なビヒクルのうち、使用され得る溶媒は、水、リンゲル液、及び等張性塩化
ナトリウム溶液である。さらに、無菌の不揮発性油は、溶媒、又は懸濁化剤として従来用
いられる。この目的のために、任意の無菌性の不揮発性油を、合成モノ又はジグリセリド
を含んで使用してもよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射可能な製剤に使用さ
れる。

例証的なキャリアーは、リン酸、乳酸、及びトリスなどを用いて緩衝化された中性生理
食塩水含む。もちろん、遺伝子治療の使用に提供される医薬組成物の場合、ベクター構築
体を受け入れた固体において任意の有害反応を引き起こさないように、十分にベクターを
精製して、欠陥のある干渉アデノウイルス粒子、又はエンドトキシン、及び他の発熱物質
など、望ましくない混入物質が本質的にないようにする。代表的な該ベクター精製手段は
、塩化セシウム勾配遠心分離などの浮遊密度勾配の使用を含む。

また、トランスフェクトされた細胞を、キャリアーとすることができる。一例として、
肝臓細胞を生物から摘出し、先に記載した方法を用いて、ここで開示される主題のポリヌ
クレオチドでトランスフェクトし、次に該トランスフェクトされた細胞を、該生物に戻す
ことができる（例えば、血管内に注入する。）。

（Ｇ． 抗体の産生）
いくつかの実施態様において、ここで開示される主題は、ここで開示される主題のポリ
ペプチド、又はポリヌクレオチドを用いた抗体免疫反応性を提供する。いくつかの実施態
様において、ここで開示される主題の抗体は、モノクローナル抗体である。抗体の調製、
及び特徴付け手段は、当業者に周知である（例えば、抗体研究室マニュアル（Antibodies
A Laboratory Manual）、E. Howell、及びD. Laneの文献、Cold Spring Harbor Laborat
ory, 1988を参照されたい。）。いくつかの実施態様において、抗体は、該ＣＰＳＩ多型
を含む、ＣＰＳＩの異なる形態間を区別する。

簡潔に言うと、ポリクローナル抗体は、ここで開示される主題のポリペプチド、又はポ
リヌクレオチドを含む免疫原を用いて動物を免疫し、かつその免疫された動物から抗血清
を回収することにより調製される。広い範囲の動物種を、抗血清の産生に使用することが
できる。抗−抗血清（anti-antisera）の産生に使用される典型的な動物は、ウサギ、マ
ウス、ラット、ハムスター、又はモルモットである。ウサギの比較的大量な血液のために
、ポリクローナル抗体の産生には典型的にウサギが選択される。

当業者に周知のように、所定のポリペプチド、又はポリヌクレオチドは、その免疫原性
が変化し得る。従って、多くの場合、該免疫原（例えば、ここで開示される主題のポリペ
プチド、又はポリヌクレオチド）をキャリアーと結合させる必要性がある。例証的なキャ
リアーは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）である。また、オボアルブミンなどの他のアルブミン、マウス血清アルブミン、又は
ウサギ血清アルブミンを、キャリアーとして使用することができる。

ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを、キャリアータンパク質に接合する手段は、当
業者に周知であり、グルタルアルデヒド、m−マレイミドベンコイル−N−ヒドロキシスク
シンイミドエステル（m-maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimide ester）、カルボジイ
ミド、及びビス−二アゾ化ベンジジン（bis-biazotized benzidine）を含む。
当業者に周知のように、特定の免疫原に対する免疫原性を、アジュバントとして公知の
免疫反応の非特異的刺激物質の使用により増強することができる。例証的なアジュバント
には、完全フロイントアジュバント（Freund's adjuvant）、不完全フロイントアジュバ
ント、水酸化アルミニウムアジュバントがある。

ポリクローナル抗体の産生に使用される免疫原の量は、とりわけ、該免疫原の性質、並
びに免疫化に使用される動物によって変化する。該免疫原の投与のために、様々な経路、
例えば、皮下、筋肉内、皮内、静脈内、及び腹腔内の経路を使用することができる。ポリ
クローナル抗体の産生は、免疫後の様々な時点で、該免疫された動物の血液を採取するこ
とによりモニターされる。免疫原性の所望濃度が得られた場合、該免疫された動物を採血
し、血清を単離し、かつ貯蔵され得る。

他の態様において、ここで開示される主題は、ＣＰＳＩポリペプチドに免疫反応性を有
する抗体の製造方法を提供し、該方法は、（ａ）組換え宿主細胞に、そのポリペプチドを
コードしているポリヌクレオチドをトランスフェクトする段階、（ｂ）該ポリペプチドの
発現に十分な条件下で、該宿主細胞を培養する段階、（ｃ）該ポリペプチドを回収する段
階、及び（ｄ）該ポリペプチドに対する抗体を調製する段階を含む。いくつかの実施態様
において、該ＣＰＳＩポリペプチドは、該尿素回路の最初の段階、抗ＣＰＳＩ抗体との交
差反応性、又はここで開示される主題に従った他の生物学的活性を仲介することができる
。いくつかの実施態様において、ここで開示される主題は、上記の方法に従って調製され
た抗体を提供する。

ここで開示される主題のモノクローナル抗体を、例えば、本明細書中にに引用により組
み込まれている米国特許第４，１９６，２６５号に記載されているような周知技術の使用
により、容易に調製することができる。通常、技術は、免疫反応を提供するのに十分な様
式で、最初に適切な動物を、選択された抗原（例えば、ここで開示される主題のポリペプ
チド、又はポリヌクレオチド）で免疫することを含む。マウス、及びラットなどのげっ歯
類は、例証的な動物である。次に、該免疫された動物の脾臓細胞を、不死の骨髄腫細胞と
融合させる。該免疫された動物がマウスである場合、代表的な骨髄腫細胞は、マウスＮＳ
−１骨髄腫細胞である。

該融合した脾臓/骨髄腫細胞を選択培地で培養し、親細胞から、融合した脾臓/骨髄腫細
胞を選択する。例えば、該組織培地中のヌクレオチドのデノボ合成を防ぐ薬剤の添加によ
り、融合細胞を、非融合親細胞の混合液から分離する。例証的な薬剤は、アミノプテリン
、メトトレキセート、及びアザセリンである。アミノプテリン、及びメトトレキセートは
、プリン合成のみを抑制する。アミノプテリン、又はメトトレキセートを使用する場合、
該培地を、ヌクレオチド源としてヒポキサンチン、及びチミジンで補う。アザセリンを使
用する場合、該培地を、ヒポキサンチンで補う。

この培養により、ハイブリドーマの集団を提供し、そこから特定のハイブリドーマを選
択する。通常、ハイブリドーマの選択は、該細胞をマイクロタイター中、単一クローン希
釈液で培養し、続いて、個々のクローンの上清を、抗原ポリペプチドとの反応性に対して
試験することにより行われる。次に、該選択されたクローンを、無制限に増殖させ、該モ
ノクローナル抗体を提供することができる。

特定の例として、ここで開示される主題の抗体を産生するために、ここで開示される主
題のポリペプチドを含む抗原約１〜２００μｇをマウスに腹腔内注入する。完全フロイン
トアジュバント（死んだマイコバクテリウムツベルクローシス（Mycobacterium tubercul
osis）を含む該免疫応答の非特異的刺激因子）などのアジュバントに関連した該抗原の注
入により、Ｂリンパ球を増殖するように刺激する。該最初の注入の後（例えば、少なくと
も２週間）に、不完全フロイントアジュバントを混合した第二投与量の抗原を注入するこ
とにより、マウスを追加免疫する。

該第二注入の数週間後に、マウスを尾部出血させ、かつ該血清を、放射線標識化抗原に
対して免疫沈降により滴定した。いくつかの実施態様において、追加免疫、及び滴定プロ
セスを、適切な滴定量に達するまで繰り返す。最も高い滴定量を有するマウスの脾臓を除
去し、かつ該脾臓をシリンジでホモジナイズすることにより、該脾臓リンパ球を得る。通
常、免疫されたマウス由来の脾臓は、約５×１０^７〜２×１０^８のリンパ球を含む。

骨髄腫細胞として公知の変異リンパ球細胞は、前記細胞が様々な周知の方法により増殖
している実験動物から得られる。骨髄腫細胞は、ヌクレオチド生合成のサルベージ経路を
欠いている。骨髄腫細胞は、腫瘍細胞であるため、これらは、組織培養において無制限に
増殖する。マウスＮＳ−１骨髄腫細胞など、マウス、及びラット由来骨髄腫細胞の多くの
培養細胞株が、構築されている。
骨髄腫細胞を、融合促進に適した条件下で、ここで開示される主題の抗原／ポリペプチ
ドを注入したマウス、又はラットの脾臓由来の正常抗体産生細胞と結合させる。融合条件
は、例えば、ポリエチレングリコールの存在下である。得られた融合細胞は、ハイブリド
ーマ細胞である。このような骨髄腫細胞、ハイブリドーマ細胞を、培養液中で無制限に増
殖させる。

ハイブリドーマ細胞を、未融合細胞から、ＨＡＴ培地(ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン)などの選択培地中で培養することにより分離する。未融合骨髄腫細胞は、
該サルベージ経路からのヌクレオチド合成に必須の酵素を欠いている。なぜならば、これ
らは、アミノプテリン、メトトレキセート、又はアザセリンの存在下で殺されるためであ
る。また、未融合リンパ球は、組織培養液中で増殖し続けることはない。従って、うまく
融合した細胞（ハイブリドーマ細胞）のみが、該選択細胞中で増殖することができる。

生存ハイブリドーマ細胞の各々は、単一の抗体を産生する。次に、ここで開示される主
題の抗原／ポリペプチドを用いて、これらの細胞を、該特異的抗体免疫反応性の生成のた
めにスクリーニングする。単一細胞ハイブリドーマを、該ハイブリドーマの限界希釈法に
より単離する。該ハイブリドーマを、何回も連続的に希釈し、かつ該希釈後に増殖させ、
該上清を、該モノクローナル抗体の存在について試験する。次に、この抗体を産生するク
ローンを大量に培養し、ここで開示される主題の抗体を都合の良い量で産生する。

ここで開示される主題のモノクローナル抗体の使用により、ここで開示される主題の特
定のポリペプチド、及びポリヌクレオチドが、抗原として認識され、かつ従って同定され
得る。同定後に、これらのポリペプチド、及びポリヌクレオチドを、抗体親和性クロマト
グラフィーなどの技術により、単離、精製することができる。抗体親和性クロマトグラフ
ィーにおいて、モノクローナル抗体を固体基質に結合し、かつ所望の高原を含む溶液に曝
す。該溶液から該抗原を、該結合抗体との免疫特異的反応（immunospecific reaction）
を介して除去する。次に、該ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを、該基質から容易に
除去し、かつ精製する。

（Ｈ． ここで開示される主題のポリヌクレオチド、又はポリペプチドの検出）
もう１つの方法として、ここで開示される主題は、ここで開示される主題のポリペプチ
ドの検出方法を提供する。該方法は、該ポリペプチドを、上記方法に従って調製した抗体
と免疫反応させて、抗体ポリペプチド接合体を形成し、かつ該接合体を検出することを含
む。
いくつかの実施態様において、ここで開示される主題は、ここで開示される主題のポリ
ペプチドをコードしているメッセンジャーＲＮＡ転写産物の検出方法を提供する。該方法
は、該メッセンジャーＲＮＡ転写産物を、該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオ
チド配列とハイブリダイズさせ、二本鎖を形成すること；及び該二本鎖を検出することを
含む。あるいは、ここで開示される主題は、ここで開示される主題のポリペプチドをコー
ドしているＤＮＡ分子の検出方法を提供する。該方法は、ＤＮＡ分子を、該ポリペプチド
をコードしているポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、二本鎖を形成すること；及び
該二本鎖を検出することを含む。

本明細書中に開示する該検出、及びスクリーニングアッセイを、予後診断ツールとして
使用することができる。ヒトＣＰＳＩ−コード化ポリヌクレオチド、並びに、これらのタ
ンパク質産物を、高アンモニア血症、及びヒトの他の遺伝的ＣＰＳＩ関連疾患に対する感
受性をスクリーニングするための予後指標として、臨床環境に容易に使用することができ
る。
また、本明細書中に開示する該検出、及びスクリーニングアッセイを、診断方法の一部
として使用することができる。ヒトＣＰＳＩ−コード化ポリヌクレオチド、並びに、これ
あのタンパク質産物を、高アンモニア血症、及びヒトの他の遺伝的ＣＰＳＩ関連疾患に対
する感受性を診断するための臨床環境に容易に使用することができる。

（Ｈ．１ ここで開示される主題のポリペプチドに対するスクリーニングアッセイ）
ここで開示される主題は、生物学的試料の、ＣＰＳＩポリペプチドの存在に対するスク
リーニング方法を提供する。いくつかの実施態様において、該ＣＰＳＩポリペプチドは、
尿素回路における活性、抗ＣＰＳＩ抗体との交差反応性、又はここで開示される主題に従
う他の生物学的活性を有する。スクリーニングされる生物学的試料は、細胞外又は細胞内
体液、或いは、細胞若しくは組織抽出物又はホモジネートなどの生体液であり得る。また
、生物学的試料は、単離された細胞（例えば培養液中）、或いは、組織試料又は組織学試
料中などの回収細胞であり得る。組織試料を、液体培地中で懸濁化するか、又は顕微鏡用
スライドなどの固体支持体上に固定することができる。肝臓組織は、特に意図された組織
である。

いくつかの実施態様において、該Ｎ１４０５ＣＰＳＩポリペプチドとＴ１４０５ＣＰＳ
Ｉポリペプチドとを識別する抗体を提供する。前記抗体は、ポリクローナル抗体を含むが
、いくつかの実施態様において、上記で調製されたモノクローナル抗体である。
スクリーニングアッセイ方法に従って、生物学的試料を、存在が評価されるポリペプチ
ドとの抗体免疫反応に曝露する。通常、曝露は、該抗体、及び候補ポリペプチド、双方を
含む液体培地中で混合することにより達成される。該ポリペプチドとともに該抗体、又は
該試料、どちらかが、固体支持体（例えば、カラム、又はマイクロタイタープレート）に
付くことができる。
該生物学的試料を、生物学的反応条件下で、抗体ポリペプチド接合体形成に十分な時間
、該抗体に曝露する。生物学的反応条件は、イオン組成、濃度、温度、及びｐＨなどを含
む。

イオン組成、及び濃度は、蒸留水のそれ〜２質量モル濃度のＮａＣｌ溶液に及ぶ。いく
つかの実施態様において、モル浸透圧濃度は、約１００ｍオスモル／Ｌ〜約４００ｍオス
モル／Ｌの範囲であり、かつ、いくつかの実施態様において、約２００ｍオスモル／Ｌ〜
約３００ｍオスモル／Ｌの範囲である。温度は、いくつかの実施態様において約４℃〜約
１００℃、いくつかの実施態様において約１５℃〜約５０℃、いくつかの実施態様におい
て約２５℃〜約４０℃である。ｐＨは、いくつかの実施態様において約４．０の値〜約９
．０の値、いくつかの実施態様において約６．５の値〜約８．５の値、いくつかの実施態
様において約７．０の値〜約７．５の値である。生物学的条件の制限は、該選択された条
件が抗体−ポリペプチド接合体を形成し、かつ該条件が該抗体、又は該ポリペプチド、ど
ちらも不利に影響させないことのみである。
曝露時間は、とりわけ、使用される該生物学的条件、抗体及びポリペプチド濃度、及び
該試料（例えば、体液、又は組織試料）の性質で変わるであろう。曝露時間決定手段は、
当業者に周知である。通常、該試料が体液であり、かつその試料中のポリペプチド濃度が
約１０^−１０Ｍである場合、曝露時間は、約１０分〜約２００分である。

該試料中のポリペプチドの存在は、抗体−ポリペプチド接合体の形成、及び存在を検出
することにより検出される。前記抗体−抗原（例えば、レセプターポリペプチド）接合体
、又は複合体の検出方法は、技術的に周知であり、かつ遠心分離、及び親和性カラムクロ
マトグラフィーなどの手順、該抗体−候補レセプター複合体に対する二次抗体の結合を含
む。
いくつかの実施態様において、該抗体に付着されている標識を検出することにより、検
出を達成する。例証的かつ周知の前記標識には、放射性ラベル（例えば、^３２Ｐ、^１２５
Ｉ、^１４Ｃ）、二次抗体、又はホースラディシュペルオキシダーゼがある。抗体への標識
の付着方法は、技術的に周知である。商業的キットが利用できる。

（Ｈ．２ 抗ポリペプチド抗体のスクリーニングアッセイ）
他の態様において、ここで開示される主題は、ＣＰＳＩポリペプチドとの抗体免疫反応
性の存在に対する、生物学的試料のスクリーニング方法を提供する。いくつかの実施態様
において、該ＣＰＳＩポリペプチドは、尿素回路における活性、抗ＣＰＳＩ抗体との交差
反応性、又はここで開示される主題に従う他の生物学的活性を有する。前記方法に従って
、生物学的試料を、生物学的条件下で、抗体−ポリペプチド接合体形成に十分な時間で、
ＣＰＳＩポリペプチドに曝露し、該形成される接合体を検出する。

（Ｈ．３ ここで開示される主題のＣＰＳＩポリペプチドをコードしているポリヌクレオ
チドのスクリーニングアッセイ）
核酸分子、特にプローブ分子を、ここで開示される主題のコード化ＣＰＳＩポリペプチ
ドの被検核酸源に対するオリゴヌクレオチドとして、ハイブリダイズに使用することがで
きる。好ましくは、該ＣＰＳＩポリペプチドは、尿素回路における活性、抗ＣＰＳＩ抗体
との交差反応性、又はここで開示される主題に従う他の生物学的活性を有する。該プロー
ビング（probing）は、該オリゴヌクレオチドを、プロセシングするＣＰＳＩ遺伝子の被
検核酸源にハイブリダイズすることにより達成される。いくつかの場合において、該プロ
ーブは、単一プローブのみで構成され、他の場合において、該プローブは、特定のアミノ
酸配列、又は該ポリペプチドの配列をベースとしたプローブの収集物で構成され、かつ該
遺伝暗号に固有の重複性の多様性を説明する。

この方法のプロービングに適切なＤＮＡ源は、ここで開示される主題のポリペプチドを
発現することができ、かつ対象の細胞株のゲノムライブラリであり得る。あるいは、ＤＮ
Ａ源は、対象の細胞株からの全ＤＮＡを含み得る。ここで開示される主題のハイブリダイ
ゼーション方法により、候補ＤＮＡ分節が同定されると、ポジティブクローンが、さらな
るハイブリダイゼーション、制限酵素地図作成、配列決定、及び／又は発現、及び試験に
より得られることが確認される。

あるいは、前記ＤＮＡ分子を、下記のこれらの使用を含む多くの技術、並びに、本明細
書中に開示したＤＮＡ分節の配列に対するＤＮＡ配列の類似性に依存する他の技術に使用
することができる：（１）本明細書中に記載したＣＰＳＩ多型などの、対象の細胞由来の
ＤＮＡにおける正常、及び異常ＤＮＡ配列を検出するための診断ツール；（２）前記配列
を潜在的に含むＤＮＡライブラリからの該ポリペプチドファミリー、及び関連ポリペプチ
ドの他のメンバーの検出、及び単離方法；（３）これらの配列を増幅する目的で、関連配
列にハイブリダイズするプライマー；（４）天然ＣＰＳＩ ＤＮＡ配列を変更するプライ
マーである。

上述のように、特定の態様において、ここで開示される主題により提供されるＤＮＡ配
列情報は、選択されたＣＰＳＩ遺伝子のコード配列に特異的にハイブリダイズする比較的
短いＤＮＡ（又はＲＮＡ）配列（例えばプローブ）の調製を可能にする。これらの態様に
おいて、適切な長さの核酸プローブは、ここで開示される主題のポリペプチドのコード配
列の考慮に基づいて調製される。他のコード配列に特異的にハイブリダイズする前記核酸
プローブの能力は、様々な実施態様において特に有用である。最も重要なことには、該プ
ローブを、所定試料中の相補的配列の存在を検出するための様々なアッセイに使用するこ
とができることである。しかし、変異種プライマー、又は他の遺伝子構築体の調製に使用
されるプライマーの調製のための該配列情報の使用を含む、他の使用が想定される。

ここで開示される主題に従って、特定の利点を提供するために、ハイブリダイゼーショ
ン研究又はアッセイに使用される代表的な核酸配列は、ここで開示される主題の核酸配列
の少なくとも１４〜４０、又は非常に長いヌクレオチド伸張に対して、例えば、配列番号
：１、３、１１、及び１３のいずれかに示した配列に対して相補的であるプローブ配列を
含む。少なくとも１４ヌクレオチド長さのサイズは、該フラグメントが、安定かつ選択的
な二本鎖分子の形成に十分な長さであることの保証を助長する。いくつかの実施態様にお
いて、該ハイブリッドの安定性、及び選択性を増加するように、１４塩基長さよりも大き
い伸張に渡って相補的配列を有する分子を使用することができ。それによって、得られる
特異的ハイブリッド分子の質、及び程度を改善することができる。いくつかの実施態様に
おいて、１４〜２０ヌクレオチド長さ以上の遺伝子−相補的伸張を有する核酸分子を使用
することができる。前記フラグメントを、例えば、化学的方法による該フラグメントの直
接的合成、米国特許第４，６８３，２０２号（本明細書中に引用により組み込まれている
。）のＰＣＲ技術などの核酸複製技術の適用、又は組換え産物のために、組換えベクター
中への選択配列の導入により、容易に調製することができる。

従って、ここで開示される主題のヌクレオチド配列は、該遺伝子の相補的伸張を有する
二本鎖分子を選択的に形成する能力のために使用され得る。想定される適用によって、異
なる条件のハイブリダイゼーションを使用し、該プローブの該標的配列への選択性の程度
を変化させる。高度の選択性を要求する適用のために、通常、該ハイブリッド形成に比較
的ストリンジェントな条件を使用する。例えば、０．０２Ｍ〜０．１５Ｍの塩、約５０℃
〜約７０℃の温度、特に、約５５℃、約６０℃、及び約６５℃の温度によりもたらされる
、比較的に低塩濃度、及び／又は高温の条件を選択する。前記条件は、選択的であり、か
つ該プローブと該鋳型又は標的鎖との間のミスマッチがもしあっても、ほとんど許容され
ない。

もちろん、いくつかの適用にとって、例えば、基礎をなす鋳型にハイブリダイズした変
異プライマー鎖を用いて、変異体を調製することが所望される場合、又は関連種からポリ
ペプチドコード配列を単離することを探究する場合、該ヘテロ二本鎖の形成に、ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件は必要でない。前記状況下、０．１５Ｍ〜０．９
Ｍの塩、約２０℃〜約５５℃の温度範囲、特に、約２５℃、約３７℃、約４５℃、及び約
５０℃の温度を使用する。その結果、クロス−ハイブリダイズ種を、コントロールハイブ
リダイゼーションに対して正のハイブリダイズシグナルとして容易に同定することができ
る。どの場合でも、増加温度と同じ方法において該ハイブリッド二本鎖を不安定化する働
きを持つホルムアミドの増加量の添加により、通常、条件をさらにストリンジェントにす
ることができことが認識されるであろう。

いくつかの実施態様において、ここで開示される主題の核酸配列を、ハイブリダイゼー
ション検出用ラベルなどの適切な方法と組み合わせて使用することに利点がある。放射性
、酵素、又はアビジン／ビオチンなどの他のリガンドを含む、多くの適切な標識方法は、
技術的に公知であり、それにより、検出シグナルを与えることができる。いくつかの実施
態様において、放射性、又は他の環境的に望ましくない試薬の代わりに、おそらく、ウレ
アーゼ、アルカリホスファターゼ、又はペルオキシダーゼなどの酵素タグを使用する。酵
素タグの場合、熱量標識基質が知られており、ヒトの目、又は分光光度法で、可視的な方
法を提供し、相補的核酸含有試料との特異的ハイブリダイゼーションを同定するように使
用することができる。

一般に、本明細書中に記載した該ハイブリダイゼーションプローブは、溶液ハイブリダ
イゼーションの試薬としても、いくつかの実施態様において固相使用としても有用である
。固相と伴ういくつかの実施態様において、試験ＤＮＡ（又はＲＮＡ）含有該試料を吸着
させるか、或いは、選択したマトリックス又は表面に付着させる。次に、この固定された
一本鎖核酸を、所望の条件下で、選択プローブとの特異的ハイブリダイゼーションに曝す
。該選択される条件は、とりわけ、要求される特定の基準に基づいた特定の状況に依存す
る（例えば、Ｇ＋Ｃ含有率、標的核酸種、核酸源、ハイブリダイゼーションプローブのサ
イズなどである。）。次に、ハイブリダイズした表面を非特異的結合プローブ除去のため
に洗浄し、特異的ハイブリダイゼーションを該ラベル方法により検出、又はさらに定量す
る。

（Ｈ．４ アッセイキット）
他の態様において、ここで開示される主題は、生物学的試料中における、ここで開示さ
れる主題のポリペプチドの存在を検出するための診断アッセイキットを提供する。該キッ
トは、該ポリペプチドと免疫反応することができる一次抗体を含む第一容器を含有する。
該一次抗体は、少なくとも１つのアッセイにおいて機能するのに十分な量で存在する。い
くつかの実施態様において、ここで開示される主題のアッセイキットは、該一次抗体と免
疫反応する二次抗体を含む第二容器をさらに含有する。いくつかの実施態様において、こ
こで開示される主題のアッセイキットに使用される抗体は、モノクローナル抗体である。
いくつかの実施態様において、該一次抗体は、固体支持体に付着される。いくつかの実施
態様において、該一次、及び二次抗体は、標識を含み、かつ、いくつかの実施態様におい
て、該標識は、放射性ラベル、又は酵素である。

また、ここで開示される主題は、薬剤をスクリーニングするための診断キットを提供す
る。前記キットは、ここで開示される主題のポリペプチドを含み得る。該キットは、薬剤
とここで開示される主題のレセプターとの間の相互作用を検出するための試薬を含む。提
供される試薬は、放射標識され得る。該キットは、ここで開示される主題のレセプターと
結合、又は相互作用することができる、公知の放射標識化薬剤を含む。
別の態様において、ここで開示される主題は、生物学的試料中における、ここで開示さ
れる主題のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの存在を検出するための診断
アッセイキットを提供する。該キットは、いくつかの実施態様において、配列番号：１、
３、１１、及び１３のいずれかの、少なくとも１０個連続のヌクレオチド塩基の分節と同
一か、又は相補的な第二ポリヌクレオチドを含む第一容器を含有する。

いくつかの実施態様において、ここで開示される主題は、生物学的試料中における、こ
こで開示される主題のポリペプチドと免疫反応する抗体の存在を検出するための診断アッ
セイキットを提供する。該キットは、該抗体と免疫反応するＣＰＳＩポリペプチドを含む
第一容器を含有する。該ポリペプチドは、少なくとも１つのアッセイにおいて機能するの
に十分な量で存在する。いくつかの実施態様において、該ＣＰＳＩポリペプチドは、尿素
回路における活性、抗ＣＰＳＩ抗体との交差反応性、又はここで開示される主題に従う他
の生物学的活性を有する。該キットの試薬は、液体溶液として提供されるか、固体支持体
に付着されるか、又は乾燥粉末として提供され得る。いくつかの実施態様において、該試
薬が、液体溶液として提供される場合、該液体溶液は、水溶液である。いくつかの実施態
様において、該試薬が、固体支持体に付着される場合、該固体支持体は、クロマトグラフ
媒体か、又は顕微鏡用スライドであり得る。該提供される試薬が、乾燥粉末である場合、
該粉末は、適切な溶媒の添加により再構成され得る。該溶媒は、提供され得る。

（実施例）
下記実施例は、ここで開示される主題の代表的様式を説明することを含んでいる。下記
実施例の特定の態様は、本発明者らが発見し、かつ意図した技術、又は手順に関して記載
されており、ここで開示される主題の実施において効果的に作用する。これらの実施例は
、本発明者らの標準的な実験室実施の使用を介して例示される。本開示、及び当業者の一
般的水準の点から、当業者は、下記実施例が、例証的なもののみであることを意図し、多
くの変化、改質、及び変更を、ここで開示される主題の意図、及び範囲から外れることな
しに使用することができることを認識するであろう。

（実施例１〜３に使用される物質、及び方法）
下記物質、及び方法を、実施例１〜３のそれぞれに使用する。また、追加の物質、及び
方法を、各実施例に記載する。
（臨床／患者採用）
移植後の急性肺損傷、及び多臓器障害の機序を理解する目的の該ＢＭＴ肺外傷後移植（
BMT-Lung Injury Following Engraftment）（ＬＩＦＥ）研究において、バンダービルト
大学医療センター（Vanderbilt University Medical Center）, Nashville, Tennesseeで
ＢＭＴを受けた２００以上の患者を登録した。悪性腫瘍の治療のためにＢＭＴ、又はＰＢ
ＳＣＴを継続的に受けている患者の同意を求めた。臓器不全（ＨＶＯＤを含む）、及び反
転の規定を、予期して規定し、かつ入院中に同時にデータを回収した。研究登録者（化学
療法を受ける前）と、切除化学放射線治療終了後の移植日（骨髄注入前）との血漿、細胞
ペレット、及び尿を回収した。

（アミノ酸分析）
血液、及び尿を、回収後すぐに遠心分離した。全ての試料を氷浴し、次に分析まで−７
０℃で保存した。これらの保存条件下で、グルタミン、システイン、及びホモシステイン
が減少することが知られているので、これらを該分析に使用しなかった。血漿アミノ酸を
、バンダービルト診断研究室（Vanderbilt Diagnostic Laboratories）, バンダービルト
大学, Nashville, Tennesseeで測定した。簡潔に言うと、スルホサリチル酸でタンパク質
を沈殿させ、かつ０．４５μｍ ＡＣＲＯＤＩＳＣ（商標）４フィルターを通して濾過す
ることにより、血漿のタンパク質フリー抽出液を調製した。Beckmann 7300アミノ酸分析
器（Beckmann, Palo Alto, California)の４成分ｐＨ、及びイオン強度勾配クエン酸リチ
ウム緩衝液系を用いて、陽イオン交換クロマトグラフィーによりアミノ酸を分離した。ニ
ンヒドリンを用いたアミノ酸のカラム誘導体化後に、５７０ｎｍで一級アミンアミノ酸、
及び４４０ｎｍで二級アミンを検出した。標準物質で装置を較正することにより定量した
(Sigma, St. Louis, Missouri)。

（統計）
血漿アミノ酸値を、平均±ＳＥＭとして示した。スチューデントｔ検定を用いて、基準
と化学療法後のアミノ酸値とを比較した。対立遺伝子頻度を、カイ二乗分析を用いて、Ｈ
ＶＯＤ患者とそうでない患者とを比較した。
（患者）
患者を、バンダービルト大学でＢＭＴリフト研究（BMT Lift Study）に登録した患者か
ら識別した。ＤＮＡを、移植前血液、又はスパン尿試料（spun urine samples）から単離
した。ＨＶＯＤ状態を、バルティモア基準（Baltimore criteria）を用いて決定した。
- ビリルビン＞２．０ｍｇ／ｄｌ
- 肝腫大
- ２％の急激な重量増加

（遺伝子型）
ＱＩＡＭＰ（商標）血液キット（Ｑｉａｇｅｎ)を用いて、ＤＮＡを単離した。該Ｔ１
４０５Ｎ多型は、下記のようにＤＮＡ配列を変化する。
CCT-GCC-ACC-CCA-GTG 正常
CCT-GCC-AAC-CCA-GTG 変化
ＣからＡへのトランスバージョンは、ピリミジンＣをプリンＡに置き換え、Msl Iサイ
トを破壊する。ＣＰＳＩの第３５番目のイントロン内からのプライマー、及び該ＣＰＳＩ
遺伝子のエキソン３６からの外来プライマーの使用は、該変化を含む領域を包含した３８
７ｂｐフラグメントを確実にＰＣＲ増幅する。この組合せは、強力な増幅を与える。また
、ＰＣＲ Ｒｅａｄｙ-ｔｏ-Ｇｏ（商標）ビーズを、増幅に使用する(Pharmacia)。

該ＣからＡへのトランスバージョンにより作成された二次構造を利用して、未変性ゲル
を用いて該多型を検出した。この変化は、十分な二次構造を作成し、制限酵素(Msl I)に
よる確実な消化を抑制する。また、この変化は、該反応において、ＩＴＰがＧＴＰに置換
されない限り、直接配列分析を妨げる。未変性ゲルは、この変化により作成される該二次
構造を利用する。１５固体を、この方法、及び配列分析により比較した。
該ゲル中のＤＮＡフラグメントを検出するために、銀染色技術を適用した。この安価で
迅速な方法は、電気泳動後すぐにバンドの視覚化を可能にする。
（統計分析）
有意な試料サイズを、該結果にカイ二乗分析を実施して得た。Hardy-Weinburg式を使用
して、該遺伝子型の予想される頻度を計算した(ｐ^２+２ｐｑ+ｑ^２)。Ｐ値は、自由度２を
用いて、標準カイ二乗の表から得た。

（実施例１）
（ＣＰＳＩエキソン多型（Ｔ１４０５Ｎ）の対立遺伝子は、ＨＶＯＤの存在、又は非存在
に対して、Hardy-Weinburg平衡にない。）
ここで開示される主題に従って、該ＣＰＳＩｍＲＮＡ（約．４４異型接合性）の３'末
端近くの共通の多型を同定した。この変化の配列分析は、該トリプレット暗号がＡＣＣか
らＡＡＣに変化する、４３４０番目の塩基のＣからＡへのトランスバージョンを示してい
た。これは、１４０５番目のアミノ酸で、スレオニンからアスパラギンへの置換を生じる
（本明細書中では、"Ｔ１４０５Ｎ"と呼ぶ）。このスレオニンは、アロステリックドメイ
ン内に存在し、それは、該サイン配列（signature sequence）PV(A/S)WP(T/S)(A/Q)Eに先
行し、補助因子ｎ−アセチル−グルタミン酸（ＮＡＧ）の結合に重要な配列である

ＮＡＧにより活性化される全ての公知ＣＰＳＩにおいて、スレオニン残基は、該サイン
配列の前の２つの残基の間に存在する(Rubioの論文, Biochemical Society Transactions
21:198-202 (1998))。構造機能研究に基づき、ＮＡＧのアセトアミド基のカルボニル酸
素との水素結合形成が、このアクチベータの結合において重要な役割を担うようである(S
tapletonらの論文, Biochemistry 35:14352-14361 (1996); Javid-Majd et al., Biochem
istry 35:14362-14369 (1996))。アスパラギンでの該スレオニン側鎖の置換により、ＮＡ
Ｇとの水素結合形成が変更され、かつＣＰＳＩ酵素機能の質的変化、及びＮＡＧの有効プ
ールに対する感受性変化を生じることが予想される。出願人は、特定の理論全てに縛られ
ることを望まないが、前例の他の生体異物の効果に基づき、増加投与量の化学療法後のＮ
ＡＧの利用可能性制限が、尿素回路機能不全を進行する機序の１つであると推測される。

ＢＭＴライフ研究グループから、１２６固体が遺伝子型と特定された。このグループの
３０固体が、ＨＶＯＤの兆候を示した（２４％）。血液細胞から７０患者、及び尿細胞ペ
レットから５６患者が遺伝子型と特定された。１５患者からの試料をＰＣＲで再増幅し、
かつ配列決定して、この結果の一貫性を確認した。
表２、及び３は、ＨＶＯＤ＋、及びＨＶＯＤ−の患者の間における、該Ｔ１４０５Ｎ多
型の遺伝子型分析の結果を示す。該Ｃ対立遺伝子（本明細書中では、ＣＰＳＩａ対立遺伝
子、又はスレオニンコード化対立遺伝子と呼ぶ。）は、実験集団において、頻度．６２を
有し、かつＡ対立遺伝子（本明細書中では、ＣＰＳＩｂ対立遺伝子、又はアスパラギンコ
ード化対立遺伝子と呼ぶ。）は、頻度０．３８を有する。表中のカイ二乗値は、４．３（
Ｐ＝０．１）であり、該多型は、おそらく、ＨＶＯＤに対してHardy-Weinburg平衡にない
ことを示している。従って、これらは、ＨＶＯＤを有するＢＭＴ患者における、該Ｔ１４
０５Ｎ対立遺伝子の分布の不平衡の証拠を提供し、該多型が、ＢＭＴ毒性に感受性のある
対象の同定に使用することができることを示している。

約２００患者の研究から集めた追加データは、次善尿素回路機能に対する感受性の検出
において該多型の使用を支持する、さらに統計的な証拠を提供した。このデータは、上記
の統計的方法に従う。
骨髄移植毒性は、著しい罹患率、及び死亡率を示す。ＨＶＯＤは、ＢＭＴ患者の乏しい
予後診断に関連する。この研究は、該ＣＰＳＩ酵素とＨＶＯＤの発症との間の関連性を評
価するために着手された。該Ｔ１４０５Ｎ多型は、ＣＰＳＩ機能に影響を及ぼす。該集団
のその広い分布は、両形態が、正常状態の適切な尿素回路機能を提供することを示唆して
いる。代謝のストレッサーの添加（高投与量の化学療法など）は、有効閾値以下の低いＣ
ＰＳＩ効率を供給する。従って、該データの分析は、ＨＶＯＤが、該アスパラギンコード
化対立遺伝子よりも該スレオニンコード化対立遺伝子を有する患者において発症するよう
であることを示唆している。該スレオニンコード化対立遺伝子は、げっ歯類のＣＰＳＩに
共有される。

（実施例２）
（骨髄移植後合併症患者のカルバミル合成酵素Ｉの生化学的、及び遺伝的変更）
骨髄移植（ＢＭＴ）、及び末梢血幹細胞移植（ＰＢＳＣＴ)は、選ばれた悪性腫瘍の一
次療法として次第に使用されるようになった。造血再構成するための幹細胞支持の使用は
、潜在的な致死的癌を根絶する実質的な増加投与量の化学療法を可能にする。感染予防、
及び移植片対宿主疾患予防の改善に関して、化学療法に誘発される臓器機能不全が、この
治療の広範囲使用の重大な障害として残っている。

ＢＭＴ後の初期の、肝中心静脈閉塞症（ＨＶＯＤ）、高ビリルビン血症の臨床的症候群
(血清ビリルビン＞２．０ｍｇ／ｄＬ)、肝腫大、及び体液貯留は、５４％以下の患者を苦
しませる、ＢＭＴ後の主な投与量制限毒性である。また、ＢＭＴ後にＨＶＯＤを発現する
多くの患者は、急性肺損傷(ＡＬＩ)の基準を満たす。危険なＨＶＯＤ患者のほとんど半数
は、機械換気が要求され、９０％を超える死亡率を伴う。前記データは、若い患者集団で
さえ、一連の臓器機能不全の死亡率に対する大きな効果であることを強調し、かつ肺機能
不全患者の急性肺損傷後の乏しい予後診断の診断的に重要な関連性を強調する。この組織
相互作用に応答する機序は、完全に理解されていない。

この実施例において、ＢＭＴ前に投与される調節化学療法は、該ＵＣの初期酵素に影響
を与え、かつ二次的に、患者を肺機能不全にかかりやすくする可能性があり、かつ多臓器
障害を分析する。該血漿アミノ酸は、障害性ＵＣ機能、及び一酸化窒素(ＮＯｘ)産生低下
、双方の見解をサポートした。これらの見解の点において、本明細書中に記載したＣＰＳ
−Ｉのエキソンの一塩基多型（ＳＮＰ）に対して、患者をスクリーニングした。該ＳＮＰ
の同型接合性が、遺伝薬理学的相互作用と調和して、ＨＶＯＤの発生率低下に関連し、か
つＢＭＴ後の初期生存者を増加させることを発見した。

（方法）
（臨床／患者採用）
移植後の急性肺損傷及び多臓器障害の機序を理解する目的の整合臨床生化学実施調査で
ある、該骨髄移植肺外傷後移植（Bone Marrow Transplant-Lung Injury Following Engra
ftment）（ＢＭＴ−ＬＩＦＥ）研究において、過去３年に渡って、バンダービルト大学
医療センターでＢＭＴを受けた２００患者を登録した。臓器不全、及び反転の規定を、予
期して規定し、かつ入院中同時に、及びＢＭＴ６０日後までにデータを回収した。除外基
準は、活性ウイルス、及び造血幹細胞支持（ＰＢＳＣＴ、又はＢＭＴのどちらか)を用い
た先の増加投与量の治療を含む。

基準からの重量増加＞５％、又は未熟肝腫大の発症、どちらかを有する、移植後２１日
前のビリルビン＞２ｍｇ／ｄＬの患者において、肝中心静脈閉塞症（ＨＶＯＤ）を確認し
た。急性肺損傷(ＡＬＩ)を、臨床的心機能異常がない場合、３００未満の吸入気酸素濃度
(ＰａＯ_２／ＦｉＯ_２)の一部分に動脈血中の酸素分圧比を用いて、３連続日に対して、胸
部Ｘ線写真上の両方の浸潤物として規定した。移植後６０日生存患者を、生存者として規
定した。研究登録者（化学療法を受ける前）、及び骨髄注入前の高投与量化学療法終了数
日後のＢＭＴ当日の血漿、循環細胞ペレット、及び尿を回収した。試料を等分し、かつ直
ぐに氷上に置き、分析前に−８０℃保存した。

（アミノ酸分析）
６０患者の−８、及び０日（前処置、及び移植日）の冷凍保存した血漿試料のアミノ酸
分析を行った。最初に、予備実験のために患者試料をランダムに選択した。；次に分析試
料を、ＣＰＳ−Ｉの該ＳＮＰ ＡＡ遺伝子型（下記参照）の特別患者、及びＨＶＯＤ、及
びＡＬＩのＢＭＴ後合併症を有する追加の患者を含めて、特に充実させた。スルホサリチ
ル酸でタンパク質を沈殿させ、かつ０．４５μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃ４(Gelman Sciences
, Ann Arbor, Michigan)を通して濾過することにより、血漿のタンパク質フリー抽出液を
調製した。

Beckmann 7300アミノ酸分析器（Beckmann, Palo Alto, California)の４成分ｐＨ、及
びイオン強度勾配クエン酸リチウム緩衝液系を用いて、陽イオン交換クロマトグラフィー
によりアミノ酸を分離した。ニンヒドリンを用いたアミノ酸のカラム誘導体化後に、５７
０ｎｍで一級アミンアミノ酸、及び４４０ｎｍで二級アミンを検出した。標準物質で装置
を較正することにより定量した(Sigma, St. Louis, Missouri)。シトルリン、アルギニン
、及びオルニチンを、該尿素回路を介する中間体のフラックスの測定可能な指数として試
験した。

（血漿一酸化窒素代謝産物(ＮＯｘ)の測定）
試料を、除タンパクし、かつカドミウムビーズとともにインキュベートして硝酸塩を亜
硝酸塩に変換した後に、患者のサブグループにおいて、改質グリース試薬を使用して、血
漿ＮＯｘを測定した。
（Ｔ１４０５Ｎ多型の検出）
ＣＰＳ１の第３６番目のエキソン（CGGAAGCCACATCAGACTGG(配列番号：１５)）、及びイ
ントロン(GGAGAGTGAAACTTGACAATCATC(配列番号：１６))内からのオリゴヌクレオチドプラ
イマー、及びゲノムＤＮＡ変化含有領域を含む２５１ｂｐフラグメントを確実に増幅する
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、バフィーコート調製、又は尿沈渣から得た。プライ
マーの組合せは、ＰＣＲ Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏビーズ(Pharmacia)、及び下記のＰＣＲ
サイクル条件を用いて、再現可能な増幅を与えた：５５℃で１分アニール、７５℃で１分
伸長、及び９４℃で１分変性の３５サイクルである。

ホルムアミド処置後、試料を、未変性ＭＤＥ（商標）ゲル（FMC, Rockland, Maine)中
、４℃で４時間、電気泳動にかけ、次に硝酸銀で染色して、ＤＮＡフラグメントを検出し
た。未変性ゲル電気泳動、及び直接配列分析、両方を用いて、１７固体の確証的遺伝子型
の同定結果を得た。患者を、ＣＣ又はＡＡの同型接合性ＳＮＰ遺伝子型、或いは異型接合
性（ＡＣ）を有する者に分類した。比較のために、同定方法を用いて、アルツハイマー病
の１００患者の集団を分析して、ＣＰＳＩ ＳＮＰ遺伝子型の分布を評価した。

（統計分析）
化学療法前と後との血漿アミノ酸濃度、及び患者グループ間の濃度を、スチューデント
ｔ検定、又はウィルコクスン順位和検定（Wilcoxon's Rank Sum Test）を用いて比較した
（該データが、正常に分布していない場合）。ＣＰＳＩの遺伝子型の分布を、全グループ
の対立遺伝子頻度を計算し、かつＰ^２分析を用いて、特に選択したサブグループのHardy-
Weinberg平衡の証拠を探索することにより、グループに渡って比較した。特定の臨床転帰
の存在、及び非存在により分けられた患者グループ（例えば、ＨＶＯＤ、ＡＬＩ、及び死
亡）において、感受性、特異性、予測値、及び相対リスク評価を、特定のアミノ酸値を用
いて構築された２×２分割表から得た。

（結果）
ＢＭＴ−ＬＩＦＥ研究において、２００患者を登録した。５２％が自家移植を受け（平
均年齢４６±１歳）、４８％が同種異系移植片を受けた（平均年齢４０±１歳）。同種移
植を受けた患者の２４％が、適合非血縁ドナーからの移植片を受けた。自家グループの患
者のほぼ３分の２が女性であり、この集団の乳がんの増加罹患率を反映している。移植の
適応症は多様であるが、該患者の７９％が、乳がん、白血病、又は非ホジキンリンパ腫に
対して移植された。ＢＭＴ前に使用される異なる準備措置は、ＣＴＣ(シクロホスファミ
ド、チオテパ、カルボプラチン)、ＢｕＣｙ(ブスルファン、シクロホスファミド)、ＣＶ
Ｐ１６ＴＢＩ(シクロホスファミド、エトポシド、全身照射)、ＣＢＶＰ１６(シクロホス
ファミド、ビス−クロロエチルニトロソ尿素、エトポシド)、ＴＣ(チオテパ、シクロホス
ファミド)を含む。

罹患率、及び死亡率、双方は、ＢＭＴ後に異常ではない。本研究の全般的な６０日死亡
率は１４％であり、同種移植を受けた患者の２０％である。急性肺損傷(ＡＬＩ)、及び肝
中心静脈閉塞症(ＨＶＯＤ)の各々の合併症は、該患者の１９％に発症した。これらの合併
症は、同種移植を受けた患者において、２倍を超えて一般的であった。ＨＶＯＤ発生患者
のグループにおいて、また、６２％（２４／３８）が、入院時にＡＬＩの基準を満たして
いた。ＡＬＩの場合の３８％（１４／３８）のみが、ＨＶＯＤの基準を満たしていない患
者に発症した。

ＣＰＳ−Ｉ ＡＡ ＳＮＰ遺伝子型の特別な患者、及び移植後合併症の追加の患者で、
標本抽出時に特に豊富な該患者の小集団（６０／２００）は、化学療法の投与、及び移植
日前に、血漿アミノ酸測定を受けた。化学療法前、及び後の該ＵＣ（シトルリン、オルニ
チン、及びアルギニン)に関与する、選択されたアミノ酸の濃度の比較は、有意な相違を
示した。シトルリン濃度は、２３．４±１．３μＭから９．１±０．７μＭ(Ｐ＜０．０
５)への平均グループ減少で、実質的に全ての患者において減少した。アルギニン濃度は
、約３５％(Ｐ＜０．０５)上昇し、かつオルニチン濃度は、２１％(Ｐ＜０．０５)上昇し
た。

オルニチン／シトルリン(Ｏ／Ｃ比)は、ＵＣの初期段階を介するフラックスの指標（す
なわち、低い値は、よい回路流動を示す。）であり、研究登録者で３．９±０．７から、
誘導化学療法後で１１．８±１．８に増加した(Ｐ＜０．０５)。また、変化は、該ＵＣの
一部ではないアミノ酸で生じる。２つの脂肪族アミノ酸であるグリシン、及びアラニンの
濃度は、タンパク質取り込み（急性、又は慢性）減少のために単に該回路を介する中間体
のフラックス低下と一致しないパターンにおいて、それぞれ１１％、及び１９％に有意に
減少する。フェニルアラニン、及びメチオニン濃度は、それぞれ４３％、及び２３％上昇
し、無症状性肺機能不全を示唆している。

基準の血漿シトルリン濃度、及び該Ｏ／Ｃ比は、予後に重要である。ＢＭＴの６０日生
存者は、非生存者よりも高基準シトルリン濃度を有していた(それぞれ、２４．４±１．
３対１７．７±２．９μＭ；Ｐ＜０．０５)。ＢＭＴ後６０日前に死の相対危険度は、２
０未満の登録シトルリン濃度の患者で２．９２であった。２０μＭを超えた血漿シトルリ
ン濃度の死に対しての陰性適中率は、９０％であった。登録者のＯ／Ｃ比は、ＨＶＯＤ(
２．８±０．２)、又はＡＬＩ(２．９±０．２)を発現していない患者を、これらの合併
症（それぞれ、５．８±１．９、及び６．５±２．７；Ｐ＜０．０５)を後に発現した患
者と比較した場合、前者で有意に低かった。研究登録者のＢＭＴ６０日生存者と非生存者
とのＯ／Ｃ比の比較は、生存者において低い値を示す傾向にあることを示した(３．３±
０．２対６．９±３．９；Ｐ＝０．０６)。２．５未満の基準Ｏ／Ｃ比に関連したＢＭＴ
の後の６０日以内の死に対する陰性適中率は、９２％であった。

また、ＢＭＴ日の予備療法後のいくつかの尿素回路アミノ酸中間体濃度にも、有意性が
あった。血漿アルギニン濃度は、非生存者(９２．３±１０．４μＭ)(Ｐ＜０．０５)と比
べて、生存者(１１４．５±５．９μＭ)で高い。重度の肺機能不全を発現しない患者(１
８．４±５．９対９．５±０．７；Ｐ＜０．０５)と比較した場合、ＡＬＩを後発現する
患者は、Ｏ／Ｃ比が有意に高く、さらに障害性のＵＣＦを示唆している。１０未満の化学
療法後Ｏ／Ｃ比のＡＬＩ発現に対する陰性適中率は高い（８６％）が、この閾値に関連し
た死亡率の相対危険度は、１．４４のみである。後にＨＶＯＤを発現する患者のＢＭＴ日
の患者において高いＯ／Ｃ比になる傾向がある(Ｐ＝０．０９)。

結晶中の一酸化窒素代謝産物(ＮＯｘ)濃度を、６２患者において測定した。血漿ＮＯｘ
濃度は、誘導療法後、２０％減少し、研究登録者で４０±２μＭからＢＭＴ日で３２±２
μＭであった(Ｐ＜０．０５)。ＨＶＯＤ、又はＡＬＩのどちらかを発症している２０患者
のＢＭＴ日のＮＯｘ中央値は、２８μＭであり；前記合併症のない患者の血漿ＮＯｘは、
３５μＭであった。異なるＣＰＳＩ ＳＮＰ遺伝子型の患者を比較した場合、血漿ＮＯｘ
の間に明らかな違いは観測されなかった。

特定の患者が、誘導療法、及びＢＭＴ後の罹患合併症を発症する遺伝的素因を有してい
るかどうかを評価するため、本研究の全ての患者のＣＰＳＩ ＳＮＰの遺伝子型を特定し
た。２００患者のうち、１９６患者（すなわち、２臨床的排除；２不成功ＰＣＲ増幅）か
らデータを分析し、該ＣＰＳ−Ｉ Ｃ４３４０Ａ ＳＮＰが、ＨＶＯＤ発現でHardy-Wein
berg平衡にある場合に測定した。ＢＭＴを受けた患者のＣＰＳＩ ＳＮＰ遺伝子型の分布
は、該コントロールグループ（アルツハイマー病の１００患者）の分布と同一であった。
すなわち、４４％ＣＣ（野生型）、４５％ＡＣ（異型接合体）、及び１１％（該トランス
バージョンに対する同型接合体）であった。ＣＣ、又はＡＣ遺伝子型の患者のＨＶＯＤの
罹患率は、それぞれ１８％、及び２４％であった。ＡＡ遺伝子型の患者では、ＨＶＯＤの
例がなかった。

ＨＶＯＤ発現で、この対立遺伝子分布がHardy-Weinburg平衡にない(Ｐ^２＝５．０６、
Ｐ＜０．０５)という発見は、該ＳＮＰ ＡＡ遺伝子型が、誘導化学療法後の肝障害に対
する感受性を変更することを示唆している。また、該ＳＮＰ遺伝子型間で、ＢＭＴ後６０
日の死亡率が異なる傾向がある。非生存者は、ＡＣ、及びＣＣ遺伝子型グループが、それ
ぞれ１５％、及び２０％であった。興味深いことに、該ＡＡ遺伝子型患者の全ては、ＢＭ
Ｔ後６０日生存した(Ｐ^２＝３．３６；Ｐ＝０．０６)。注目点は、該Ｐ^２スコアのほとん
ど全てが、該ＡＡ／生存細胞に由来することである。ＡＬＩ罹患率において、異なるＳＮ
Ｐ Ｃ４３４０Ａ遺伝子型患者間に有意な違いはない（それぞれ、ＡＡ、ＡＣ、及びＣＣ
において、それぞれ１６％、１５％、及び２５％)。ＡＬＩは、該ＡＣ、又はＣＣ遺伝子
型、どちらかの患者の有意な死亡率に関連している（それぞれ、７１％、及び６６％）が
、ＡＬＩを発現した該ＡＡ遺伝子型の患者全ては、最終的に、ＣＸＲの両側肺疾患浸潤物
、及び障害性ガス交換を回復させ、ＢＭＴ後６０日生存した。

（考察）
本実施例にあるデータは、ＢＭＴ後の患者のＨＶＯＤとＡＬＩとの間の密接な関連性を
反映する。ＨＶＯＤのほぼ３分の２の患者は、ＡＬＩの基準値を満たしている。この研究
において、ＡＬＩ患者の６８％（２６／３８）は、機械喚起を必要とする。Rubenfelt、
及びCrawfordは、重要な生存を報告しており、ＢＭＴ後の機械喚起を必要とする患者の６
％のみが、抜管、続いて３０日生存で該病院から退院と規定している。Rubenfeld, G. D.
、及びCrawford, S. W.の論文, Annals of Internal Medicine (1996) 125:625-33を参照
されたい。
ＨＶＯＤは、増加投与量化学療法の主な投与量制限毒性がある。ＢＭＴの３週間以内に
発症する体液貯留、黄疸、腹水、及び有痛性肝拡大により臨床的に特徴付けられる。これ
らの臨床的基準を満たす、これらの非生存患者の検視研究は、＞８０％のケースにおいて
、組織学的確認を提供し、かつ増進した局所血栓症が、ＨＶＯＤの病因の起因事象であり
得るという考えと一致している。

ＢＭＴを受けた患者のシトルリン濃度の有意な減少、及び血漿オルニチン濃度の上昇は
、誘導化学療法後の患者の肝臓ＵＣを介する炭素中間体のフラックスに有意な障害がある
ことを示唆している。他のアミノ酸のパターンの分析は、この効果が、単にタンパク質取
り込み低下のためだけではないことを主張している。飢餓性患者に見られる該パターンと
は対照的に、グリシン濃度、及び分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）が、通常、有意に上昇する
場合、本発明者らは、グリシン低下と該ＢＣＡＡの有意な変化はないこととを観測した。
さらに、飢餓は、肝臓のＣＰＳＩの活性を増加する傾向があり、かつ血漿オルニチンが増
加することはないはずである。

ＢＭＴを受けた患者の前処置能力は、特に予後の重要性を有していた。ＢＭＴ後の６０
日非生存者、及びＨＶＯＤ、又はＡＫＩを発現しているこれらの患者は、これらの合併症
のない患者と比較して、シトルリン濃度が有意に低く、かつＯ／Ｃ比が高い。興味深いこ
ととして、ＢＭＴの非生存者は、誘導療法後の血漿アルギニン値が、生存患者と比較して
低いことを観測した。末端肝細静脈に初期ＵＣ酵素を含む細胞のクラスター形成の点にお
いて、アルギニン、及び一酸化窒素（ＮＯ）、双方の局所濃度が非常に高くなり、かつ、
これらの血管の開存性を維持すること、及び領域肝血流を調節することに重要な役割をに
なう可能性がある。誘導化学療法後の血漿ＮＯｘ濃度の有意な低下を示している該研究は
、ＮＯ産生がＢＭＴ時に変更されるという考えをサポートしている。

移植日のアルギニンの明らかに正常な血漿濃度と、血漿ＮＯｘの顕著な低下との間の明
らかな相違は、異なる臓器基盤を渡るアルギニン、及びシトルリンのフルックスの複雑な
インビボ速度論を強調する。全身のアルギニンの安定同位体研究は、血漿アルギニン代謝
回転の約１５％のみが、尿素形成に関連しており、かつ血漿アルギニン代謝回転の１．２
％のみが、ＮＯ形成に関連していることを確認している。さらに、インビトロ研究は、シ
トルリンからアルギニンへの尿素回路中間体の実質的チャネリングを実証しており、それ
は、基質の外来供給により影響される。誘導化学療法ストレス時に尿素回路機能、及び肝
臓ＮＯ産生を維持する、個々の患者の能力は、ＢＭＴ後の合併症に対する耐性に部分的に
影響を及ぼし得る。

ＨＶＯＤ発症の性別差はないので、本研究者らは、Ｘ連鎖性オルニチントランスカルバ
ミラーゼ遺伝子よりも、ＣＰＳＩ、常染色体コード化遺伝子に関連した潜在的な遺伝薬理
学的組織に焦点を合わせた。該分子を特徴付けることは、新生児の原因、及び遅発性ＣＰ
ＳＩ欠如の基礎を変化するが、該ＣＰＳＩ ｍＲＮＡ（０．４４異型接合性）の３’末端
近くの共通のＳＮＰを同定した。このＣ４３４０Ａトランスバージョンは、１４０５番目
のアミノ酸で、アスパラギン（ＡＡＣ）のスレオニン（ＡＣＣ）への予測される置換をコ
ードしている(Ｔ１４０５Ｎ)。このスレオニンは、アロステリックドメイン内にあり、酵
素活性を増加する補助因子ｎ−アセチル−グルタミン酸（ＮＡＧ）の結合に重要な該配列
ＰＶ(Ａ／Ｓ)ＷＰ(Ｔ／Ｓ)(Ａ／Ｑ)Ｅに先行する。出願人は、特定の理論全てに縛られる
ことを望まないが、前例の他の生体異物の効果に基づき、増加投与量の化学療法後のＮＡ
Ｇの利用可能性制限が、尿素回路機能不全を進行する機序の１つであると推測される。そ
れにもかかわらず、該ＣＰＳ−Ｉ ＳＮＰ ＡＡ遺伝子型の存在は、ＨＶＯＤ発現防御、Ａ
ＬＩを発症した場合のその回復、及びＢＭＴ後の６０日生存の改善に関連することは明ら
かである。従って、このデータは、ＵＣ機能の変更が、敗血症、及び急性肺損傷時の肝臓
−肺相互作用の改質において役割を担うことを示唆している。

要約すると、この実施例は、ＢＭＴ前に増加投与量の化学療法を受けた患者の肝臓ＵＣ
機能の有意な機能障害を実証している。回路機能の深刻な混乱を有する患者は、ＢＭＴ後
に罹患合併症を発症するようである。さらに、ＣＰＳ−Ｉ Ｃ４３４０Ａ ＳＮＰと、Ｂ
ＭＴ後合併症及び短期間生存、双方との有意な関連性を発見した。前記データは、ＢＭＴ
を受けた患者の危険性評価に有用であり、かつ高投与量化学療法時のＵＣ機能をサポート
する治療計画のための原理を提供する。

（実施例３）
（アルギニン／シトルリン補充療法）
尿素回路産生物（アルギニン、及びシトルリン）のさらなる低下、及び前駆体（アンモ
ニア、グルタミンなど）の増加は、ＢＭＴ関連毒性に寄与する多型に起因する。該ＢＭＴ
ライフ研究の一部として、ＢＭＴを受けた１０患者において、シトルリン、及びアルギニ
ン濃度を測定した。
ＢＭＴにおいて使用される高投与量化学療法は、尿素回路酵素の正常機能を崩壊させ、
かつ又はＨＶＯＤ関連毒性の発症、どちらかに寄与する。この情報をさらに評価するため
に、誘導化学療法終了前、及び後に、ＢＭＴを受けた１０患者からの保存血漿の分析を行
った。アミノ酸プロフィールを、全ての試料から決定した。特定の注目は、該尿素回路中
間体シトルリン、アルギニン、及びオルニチンに払われる。表４に示すように、前処理基
準平均２４±３μｍｏｌ／Ｌ〜後処置平均８±１μｍｏｌ．／Ｌ(Ｐ＜０．００１)の全患
者のシトルリン濃度の顕著な低下。血漿アルギニン濃度は、幾つかの患者にアルギニン含
有非経口的栄養法を使用したにもかかわらず、９１±６μｍｏｌ．／Ｌ〜７０±６μｍｏ
ｌ．／Ｌ(Ｐ＜０．０５)の平均から減少した。

シトルリン、及びアルギニンの減少は、全非経口的栄養法を受けた患者、及びそうでな
い患者において同じであり、かつ男、及び女で同じであった。シトルリンの減少は、該尿
素回路の第一段階を介する流動の減少があることを示唆している（図１）。
従って、ここで開示される主題に従って、ＢＭＴを受けた患者のＨＶＯＤ毒性、及び／
又は発症の低下方法を提供する。この方法は、該ＢＭＴ患者に、該患者のアルギニン、及
びＮＯ合成の増強に有効な量のアルギニン、及び／又はシトルリン、いくつかの実施態様
において、シトルリンを投与することを含む。該患者のアルギニン、及びＮＯ合成の増強
は、ＢＭＴに関連したＨＶＯＤの発症を減少し、かつ／又は実質的に抑制する。シトルリ
ンは、より容易にＮＯに変換されるように与えられる、代表的な補充剤である。

（実施例４）
（機能性全長ＣＰＳＩ発現クローンの構築）
多くの戦略を試みた後に、全コード領域を含むヒトＣＰＳＩ ｃＤＮＡ発現クローンを
構築した。図６、及び７は、該発現クローンの構築に使用される方法の概略図である。こ
のクローンは、完全に配列決定されており、かつ技術的に特徴付けられているコンセンサ
スＣＰＳＩ配列からの変化は全くない。

ＣＰＳＩタンパク質を製造する該クローンの能力を、ＣＯＳ−７細胞で試験した。ＣＯ
Ｓ−７細胞は、天然ＣＰＳＩ活性、又は産生がないために選択された。ｆｌＣＰＳＩ−Ｐ
ＣＤＮＡ３．１構築体でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞のウェスタンブロット分析
を準備した。これらの肝臓由来細胞がＣＰＳＩ活性を維持しているので、ＨｅｐＧ２細胞
抽出物をコントロールとして使用した。トランスフェクトしていないＣＯＳ−７細胞をネ
ガティブコントロールとして使用した。該トランスフェクトしていないＣＯＳ−７細胞と
は異なり、該ＨｅｐＧ２細胞、及びＣＯＳ−７−ｆｌＣＰＳＩ細胞は、ウサギ抗ラットＣ
ＰＳＩ抗体を用いて、予測された１６０ｋＤを示した。さらに、比色分析を行い、アンモ
ニアからカルバミルリン酸の産生を検出した。図８に図示したように、該トランスフェク
ト細胞は、ＨｅｐＧ２細胞と同じ活性を示したが、トランスフェクトされていないＣＯＳ
−７細胞は示さなかった。

部位特異的突然変異誘発法により、該Ｔ１４０５含有ＣＰＳＩ挿入が行なわれ、かつ該
Ｎ１４０５多型性コドンを有するコピーが作成される。該Ｎ１４０５多型性コドンを、そ
の全長さに対して配列決定した。他の変化は、検出されなかった。宿主細菌によりＤＮＡ
内へのメチル化導入に利点を有するＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（商標）（Stratagene）システ
ムを使用して、この構築体を調製した。
これらの構築体を使用して、ＣＯＳ細胞、及び発現系としてそれぞれのＣＰＳＩ／ＰＣ
ＤＮＡ ３．１を用いて対立遺伝子(Ｔ１４０５、Ｎ１４０５)でコードされた組換えＣ
ＰＳＩタンパク質の安定供給を提供する。酵素学的に活性なＣＰＳＩは、図８に示した系
を用いて製造した。

これらの実験の構成は、ＣＰＳＩ機能上の該Ｔ１４０５Ｎ多型のインビトロ効果を測定
することである。実施例１、及び２で考察したように、この変化は、ＮＡＧ濃度に対する
酵素の感受性に影響を与える。２０固体の該ＣからＡ変化のスクリーニングは、２５％の
同型接合性ＡＡグループとともに５０％の異型接合性割合を示した。これは、全体集団の
かなりの部分が、ＣＰＳＩ機能の潜在的質的異常性を有することを示唆している。この異
常性は、正常条件下では沈黙しているが、ストレス条件、及び高投与量の化学療法、又は
バルプロ酸投与などの毒性により現れる。

次に、該タンパク質産物の比較段階を行う。第一段階は、該発現ｍＲＮＡ、及びタンパ
ク質の物理特性を調査する。ｆｌＣＰＳＩから調製されたメッセージのノーザンブロット
を、探索する。ポジティブコントロールは、ＨｅｐＧ２、及びヒト肝臓メッセージを含む
。ネガティブコントロールは、空カセットｐｃＤＮＡ３．１をトランスフェクトしたＣＯ
Ｓ−７細胞とした。メッセージ由来の発現ｆｌＣＰＳＩは、該クローンが、１ｋｂの３’
未トランスフェクト領域を含まないので、ネガティブＣＰＳＩよりも幾らか小さい(４．
９ｋｂ対５．７ｋｂ)。

同じコントロールを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより細胞可溶化物のウェスタンブロ
ット分析を行った。クーマシーブルー染色を使用して、全タンパク質産物を調査した。特
異的ＣＰＳＩ検出のために、ポリクローナルウサギ抗ラットＣＰＳＩ抗体を使用した。こ
の抗体は、ＣＯＳ−７細胞、並びにコントロール試料から発現ＣＰＳＩを検出する。最後
に、該タンパク質構造の変化を、立体配座変化の検出に有用なツールである２Ｄ電気泳動
により移動パターンを調査して測定した。確認された大きな変化全ては、おそらく、その
変異体のＣＰＳＩ機能の変更を説明している。

次の段階は、発現酵素の機能特性を測定することである。この目的のために、感受性比
色分析を改質している(Pierson, D. L., J. Biochem. Biophys. Methods, 3:31-37 (1980
))。該改質アッセイは、２０〜５０ｍｇの組織又は細胞から４〜５回、分析できる。
最初に該組織を、０．７５Ｍ ＫＣｌ中でホモジナイズする。ＡＴＰ、及びＮＡＧを含
む小分子を、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５カラム(Boehringer)を通して除去する。該
反応混合物は、炭酸水素アンモニウム、ＡＴＰ、マグネシウムＤＴＴ、ｎ−アセチルグル
タミン酸（ＮＡＧ）、及びトリエタノールアミンを含む。全ての試薬濃度を変えることが
でき、かつＨｅｐＧ２細胞での実験は、低及び高濃度ＮＡＧ(０．５０ｍＭ)で活性低下を
示す。予備ＣＯＳ−７細胞発現実験において、ＮＡＧがないと、測定可能な酵素活性がな
いことを示した。

ＣＰＳＩは、アロステリック酵素であるので、ＮＡＧ濃度変化においてミカエリス−メ
ンテン動力学に従わない。しかし、ＮＡＧ量を固定した場合、カルバミルリン酸産生は安
定する。図８に示すように、３７℃でインキュベーション後の該溶液にヒドロキシルアミ
ン添加して、異なる時間(０、５、１０、２０、２５、３０分)に対するカルバミルリン酸
産生を測定する。また、この段階を９５℃で行い、該酵素を不活性化し、かつカルバミル
リン酸のさらなる産生を抑制する。ヒドロキシルアミンは、カルバミルリン酸をヒドロキ
シ尿素に変換し、次に、該ヒドロキシ尿素を、ブタンジオンを有する硫酸／酢酸溶液で処
理し、４５８ｎｍに吸収ピークを有する化合物へと誘導する。次に該反応物を、１２，０
００Ｘｇで１５分間回転し、沈殿タンパク質を除去する。次に、それぞれの反応物の４５
８ｎｍの吸光度を測定する。通常、活性は、反応の２０〜３０分後に低下し始める。

多くの発現細胞ペレットを、分析用に貯蔵する。活性測定が、一貫した酵素量に基づい
ていることを確認するために、上述のウサギ抗ラットＣＰＳＩなどのＣＰＳＩ抗体を用い
て、発現ＣＰＳＩを、貯蔵試料のウェスタンブロット分析により定量する。最初に、一定
量の基質及び補助因子、並びに経時変化分析を用いて、基礎的活性を測定する。変化量の
炭酸水素アンモニア、ＡＴＰ、及びＮＡＧを用いて、これらの成分に対して結合効率を測
定する。これらの成分を、通常量の０〜１０倍量に変える。また、該ホモジネートの熱処
理後に、酵素活性を測定する。タンパク質ラベル（パルスチェイス）実験を行い、時間に
対する該タンパク質の安定性を測定する。

上記の方法を用いて、安定ＣＰＳＩタンパク質発現を得る。安定トランスフェクト細胞
株の作成は、これらの実験を行うためのＣＰＳＩの両多様性の十分な量の産生を可能にす
る。活性研究において、Ｎ１４０５の活性変化を、ＣＰＳＩのＴ１４０５型と比較して記
録する。また、異なるＮＡＧ濃度下での該酵素活性変化を記録する。これらの結果は、次
善尿素回路機能、及び高アンモニア血症、並びに、それに関連したアルギニン産生低下に
対する予測感受性において、ここで開示される主題の多型の役割をサポートしている。

（実施例５）
（バルプロ酸治療患者に見られるアンモニア上昇に対する、Ｔ１４０５Ｎ多型と尿素回路
中間体との関連性）
バルプロ酸(ＶＰＡ)は、特に欠神発作の治療又は他の発作障害の補助療法に一般的に使
用される発作薬である。ＶＰＳ治療の毒性は、複雑かつ多変量のプロセスであり、かつ恐
らく、幾つかの代謝崩壊を示す。高アンモニア血症、並びに、肝臓微小空胞変性及び壊死
は、最も一般的に報告されている深刻な医学的合併症である。
少数の患者にのみ、毒性高アンモニア血症の発現が伴うが、有意な罹患率、及び死亡率
を有し、かつ幾つかの死が、この合併症に起因している。無症候性高アンモニア血症の発
現（血漿アンモニア濃度が６０μｍｏｌ／Ｌよりも大きい）は、ＶＰＡ投与１時間以内に
生じるが、比較的よく見られる。

（ＶＰＡ誘発高アンモニア血症の機序）
ＶＰＡが高アンモニア血症を引き起こす機序は、討論の対象であり、かつ現在、多くの
異なる説は、技術的サポートがある。腎臓モデルは、グルタミン代謝変化により、増加ア
ンモニアが該肝臓に取り込まれることを提案しているが、多くの他の理論は、尿素回路機
能の別の局面に焦点を合わせている。例えば、Warterらの論文, Revue Neurologique, 13
9:753-757 (1983)を参照されたい。該尿素回路は、ヒトの中のアンモニアを除去するため
の主要な機序であるので、高アンモニア血症は、何らかの方法で、ＶＰＡ及び／又はその
代謝産物と尿素回路機能及び許容能阻害との相互作用から生じるものと考えられる。

ＶＰＡ療法における尿素回路機能不全の証拠は、血漿アンモニアの上昇に加えて、多く
の実験、及び臨床的観察に由来する。例えば、Marriniらは、アミノ酸及びＶＰＡ取り込
み後の非腎摘出動物において、基準及び刺激ＣＰＳＩ活性、双方の減少を測定した(Marri
niらの論文, Neurology 38:365-371 (1988))。また、Marriniらは、アミノ酸取り込み及
びＶＰＡを注入した腎摘出ラットが、高アンモニア血症も発現することを観察した。他の
グループ、Castro-Gagoらは、ＶＰＡで処置したてんかん性の子供２２人の血清アミノ酸
を測定し、前駆体の増加よりも尿素回路効率低下に関わるアスパラギン酸、及びオルニチ
ンの減少を発見した(Castro-Gagoらの論文, Childs Neurons System 6:434-436 (1990))
。

（カルバミルリン酸合成酵素Ｉの重要性）
ＶＰＡ誘発尿素回路欠損の機序は、通常、ミトコンドリアのカルバミル合成酵素Ｉ(Ｃ
ＰＳＩ)を中心に回転する。ＶＰＡ過剰投与後の深刻な毒性を有する患者は、５０％正常
ＣＰＳＩ活性であることを発見した(Bourrierらの論文, Prese Medicale 17:2063-2066 (
1988))。出願人は、中断後の即時逆転を有するバルプロ酸を投与した時に悪化した、幾つ
かの温和なＣＰＳＩ欠損患者を観察した。

（ＮＡＧの役割）
Ｎ−アセチルグルタミン酸（ＮＡＧ）は、ＣＰＳＩに必要なアロステリック補助因子で
ある。ＮＡＧＡは、ＣＰＳＩの細胞分布に似た細胞分布を有するミトコンドリア中のグル
タミン酸とアセチルＣｏＡから合成される(Shigesadaらの論文, Journal of Biological
Chemistry 246: 5588-5595 (1971))。それは、グルタミン酸（アミノ酸異化作用由来）と
アセチルＣｏＡとから合成される。ＮＡＧ利用能の変更によりＣＰＳＩ活性低下を予測す
る、幾つかの方法がある。ＮＡＧ合成酵素の遺伝子欠如が観察され、かつ、この酵素は、
プロピオニルＣｏＡ、又はコハク酸などの他の基質により完全に阻害されることが知られ
ている(Bachmannらの論文, New England Journal of Medicine 304:543 (1981)；Kamoun
らの論文, Lancet 48 (1987)；Coudeらの論文, J. Clin. Invest. 64:1544-1551 (1979)
；Rabierらの論文, Biochem. And Biophys. Research Comm. 91:456-460 (1979)；Rabier
らの論文, Biochimie 68:639-647 (1986))。ＣＰＳＩが増加量のプロピオニルＣｏＡの存
在により競合的に阻害され、かつＶＰＡ療法が血液のプロピオン酸濃度を増加させること
は、実験的に示されている(Coulterらの論文, Lancet 1 (8181): 1310-1311 (1980)；Gru
skayらの論文, Ped. Res. 15:475 (1981)；Schmidt, R. D., Clin. Chim. Acta. 74:39-4
2 (1977))。また、ＶＰＡ曝露は、アセチルＣｏＡ、及びグルタミン酸、双方の濃度が低
下することにより、無処置肝細胞中のＮＡＧ濃度を低下することが示されている(Coudeら
の論文, Biochem. J. 216:233-236 (1983))。グルタミン濃度の低下は、ピルビン酸デヒ
ドロゲナーゼ、及びピルビン酸カルボキシラーゼに起因する。

他に、ＣｏＡがバルプロイルＣｏＡ（valproyl CoA）を製造するためのＶＰＡ療法に転
換されるので、ミトコンドリアのアセチルＣｏＡの減少が生じることを示唆している(Bec
kerらの論文, Archives of Biochemistry & Biophysics 223:381-392 (1983))。また、Ｖ
ＰＡが、得られるアセチルＣｏＡの減少とともに脂肪酸β酸化を中断することは周知であ
る(Eadieらの論文, Med. Toxicol. 3:85-106 (1998))。これらの機序の全ては、ＮＡＧ不
足を導き得る。なぜならば、ＮＡＧは、アセチルＣｏＡから合成されるためである。ＮＡ
Ｇ利用能にＶＰＡの影響を与えると、ＮＡＧに対するＣＰＳＩ結合特性の全ての変化が、
その活性に影響を及ぼすであろう。

従って、この実施例は、高アンモニア血症生成用モデル薬剤としてＶＰＡを用いて、高
アンモニア血症に対する感受性を有するＣＰＳＩ遺伝子における、ここで開示される主題
の多型の存在、又は非存在の間の関係を決定する実験を説明する。最初に、ＰＣＲ増幅、
及び未変性ゲル使用などの本明細書中に記載した方法に従ってＴ１４０５Ｎ多型の遺伝子
型を特定するために、バルプロ酸治療を開始した患者からゲノムＤＮＡを単離する。これ
らの患者の遺伝子型特定後、これらの患者に対して、前、及び後処置アミノ酸、及びアン
モニア測定を行う。特に、実施例Ｉに記載したＱＩＡｍｐ（商標）（Qiagen)キットを用
いて、ＤＮＡを全血液から単離する。

次に、血漿の全ＶＰＡ濃度を、酵素媒介免疫アッセイ技術により測定する(EMIT（商標
） Syva-Behring, San Jose, CaliforniaのSyva 30RJ 分析器)。この技術は、患者血漿の
ＶＰＡと酵素Ｇ６ＰＤＨで複合されたものとの間のサイトに結合するＶＰＡ抗体に対する
競合的結合に利用する。該抗体からＶＰＡ酵素複合体の放出により、該酵素が再活性化さ
れ、かつその活性は、該基質添加時に、ＮＡＤＨの形成割合で評価される。ＮＡＤＨ産生
を、３４０ナノメートル（ｎｍ）での分光法によりモニターする。フリー（タンパク質結
合のない）ＶＰＡを、３０００ダルトンを切り捨てる遠心分離マイクロ分離フィルター装
置（centrifugal micro partition filter device）を用いて血漿から単離する(CENTRIFR
EE, Amicon, Beverley, Massachusetts)。該血漿限外濾過液中のＶＰＡ濃度を、全ＶＰＡ
に対して記載するように測定する。

ＶＰＡ患者から回収したデータを、遺伝子型と表現型との間の相関について分析する。
さらに、フリー、及び遠心分離ＶＰＡ分画を比較し、ＮＡＧ産生、及び利用能の効果を評
価する。ＮＡＧ利用能においてＶＰＡの公知の効果がある場合、該後者の比較が準備され
る。例えば、ＶＰＡ曝露は、アセチルＣｏＡ、及びグルタミン酸、双方の濃度が低下する
ことにより、無処置肝細胞中のＮＡＧ濃度を低下することが示されている。Coudeらの論
文, Biochem. J. 216:233-236 (1983)を参照されたい。従って、この比較は、ＮＡＧに対
するＣＰＳＩ結合特性変化が、ＣＰＳＩの活性に影響を与えることを反映する。

（実施例６）
（ＣＰＳＩのさらなる多型の検出）
ＣＰＳＩメッセージの変異分析で開発された技術を用いて、１０の非ＣＰＳＩ欠乏、無
関係の患者を、該コード領域のさらなる多型に対してスクリーニングした。これは、リン
パ芽球腫、及び線維芽細胞株由来の"非正統的"転写物を用いて行った。該集団の広範な効
果を有する多型は、このサイズ試料において明らかとなるべきである。本明細書中、及び
クレーム中に使用される用語"多型"は、集団内の２以上の遺伝子的に決定された別の配列
、又は対立遺伝子の発生を意味する。多型性指標は、相違のある遺伝子座である。例証的
な指標は、少なくとも２つの対立遺伝子を有し、各々が、１％未満の頻度で生じることで
ある。従って、提供される多型性指標は、制限断片長多型、可変数の縦列反復(ＶＮＴＲ'
ｓ)、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、及びテトラヌクレオチド反復
を含む。

多くの"変異"検出技術が行われており、その全ては、Summar, M.らの論文, J. Inherit
ed Metabolic Disease 21:30-39 (1998)に記載されているように、未変性一本鎖ＤＮＡの
移動性の検出可能な変化に基づく。これらの技術により同定されたＣＰＳＩ変異の例を、
図３に開示する。ＣＰＳＩメッセージの大きなサイズ（約５，７００塩基）のために、少
しの反応で大量のＤＮＡをスクリーニングする方法が使用される。制限エンドヌクレアー
ゼフィンガープリント法（ＲＥＦ）は、優れた感受性とともに、約２，０００ｂｐまでの
スクリーニングする大きなＤＮＡフラグメントのために提供する。

１μｇの全ＲＮＡ、及び該ＣＰＳＩメッセージの中間からのオリゴ−ｄＴプライマー、
又はアンチセンスプライマーを用いて、逆転写反応（ＲＴ）を行う。該ＲＴ産物を鋳型と
して用いて、ＰＣＲ反応を、４，６００塩基コード領域に渡って４つの重なりフラグメン
トを作成する４つの異なるプライマーセットで行う。コントロールＰＣＲ反応を、各実験
セットで行い、混入する鋳型が増幅されることを確認する、ゲノムＤＮＡは、この研究に
好ましくない。それは、該遺伝子のサイズ（８０，０００＋ｂｐ）、イントロンの数（３
６）、及びＣＰＳＩのイントロン エキソン境界の配列決定が終了していないためである
。しかし、イントロンの位置は、図９に図的に特徴付けした。
上述の４つの重なりＲＴ／ＰＣＲ産物を、変異のスクリーニングに使用する。制限地図
の慎重な分析により、１００〜２５０ｂｐの範囲の切片に開裂する各フラグメントに対す
る３つの制限酵素の選択を可能にする。このサイズのフラグメントは、一本鎖高次構造多
型（ＳＳＣＰ）分析に適している。該酵素は、各断片がその長さに渡って一様に評価され
得るように選択される。

消化前に、該ＰＣＲ産物をゲル電気泳動、及びアガロース部分からの単離により精製す
る。３時間後に、消化フラグメントを、エタノールで沈殿させる。これらのフラグメント
を、定数３５ワットで行う４℃の６％未変性ポリアクリルアミドゲル内に分離する。これ
らの条件は、Liu, Q.、及びSommer, S. S.の論文, Biotechniques 18(3):470-477 (1995)
に記載されているように、一本鎖フラグメントの立体配座変化の検出を最適化する。銀染
色でＤＮＡ検出を行い、かつ該ゲルを移動度シフトに対して記録する。シフトした全ての
フラグメントの位置に基づいて、サイクル−配列決定プロトコル（cycle-sequencing pro
tocol）を用いて直接、該ＲＴ／ＰＣＲ産物の配列分析を行う。Ｔａｑポリメラーゼエラ
ーに起因する変異の可能性を除去するために、新たなＲＴ産物を、各ケースにおいて増幅
し、かつ配列決定する。コード化メッセージの全４，６００塩基を、この方法で迅速に配
列決定する。不明確な領域を含む全ての領域を配列決定し、予測配列の変化を探す。

各ＲＴ／ＰＣＲフラグメントの制限消化産物を単離する。次に、これらの個々のフラグ
メントを、上述の未変性ゲル中で組合せ消化する。この方法の該フラグメントパターンを
特徴付けすることにより、全ての観測された移動度シフトに関係した該ＣＰＳＩメッセー
ジの一部分を迅速に同定する。
頻度を確立するために、これらの実験において検出された多型を、Centre d'Etude Pol
ymorphsim Humanise(ＣＥＰＨ)親パネルに対して遺伝子型特定する。全ての変化を、コド
ン使用のこれらの効果に対して調査し、かつミスセンス変異の結果生じるものを、本明細
書中に開示したＣＰＳＩ特性データを用いて調査する。

実施例３に記載した技術を使用して、これらの変化を含むサイト直接変異を発現する。
この系を用いて、ＣＰＳＩ産生、及び活性の変化のインビトロ効果を観察する。
Ｔ３４４Ａ多型を、ＣＰＳＩ中で検出した。オリゴヌクレオチドプライマーを第１０番
目のエキソン(U1119:tactgctcagaatcatggc 配列番号：１７)、及びイントロン(LI10+37:
tcatcaccaactgaacagg 配列番号：１８)から使用して、変化を含む９１ｂｐフラグメン
トを増幅した。ＰＣＲサイクル条件は、５９℃で１分間アニール、７２℃で１分間伸長、
及び９４℃で１分間変性の３５サイクルである。患者を、ＡＡ、又はＴＴの同型接合性Ｓ
ＮＰ遺伝子型を有するもの、又は異型接合性(ＡＴ)であるものにクラス分けした。この多
型の成人集団分布は、３５％ＡＡ、４４％ＡＴ、及び２１％ＴＴである。

また、１１８−ＣＴＴ多型をＣＰＳＩ中に検出した。オリゴヌクレオチドプライマーを
５’非翻訳領域(U5'-74: ggttaagagaaggaggagctg - 配列番号：１９)、及びイントロン(L
175: aaccagtcttcagtgtcctca - 配列番号：２０)から使用して、該変化を含む２４９ｂｐ
フラグメントを増幅した。ＰＣＲサイクル条件は、５９℃で１分間アニール、７２℃で１
分間伸長、及び９４℃で１分間変性の３５サイクルである。患者を、１１８トリヌクレオ
チド挿入又は欠失を有する同型接合性遺伝子型を有するもの、或いは異型接合性であるも
のにクラス分けした。この多型の成人集団分布は、３４％ＣＴＴ−、４３％異型接合性、
及び２３％ＣＴＴ＋である。

（実施例７）
（持続性肺高血圧症を有する新生児患者のカルバミルリン酸合成酵素Ｉの生化学的、及び
遺伝的変更）
この実施例は、病気時の新生児持続性肺高血圧症(ＰＰＨＮ)の病因における内在性ＮＯ
産生制限の役割を調査する。内在性ＮＯは、尿素回路中間体アルギニンの産物である。ア
ルギニンの産物は、該尿素回路の律速酵素であるカルバミルリン酸合成酵素(ＣＰＳＩ)に
依存する。新生児は、半分以下の正常尿素回路機能を有し、酵素形態、及び機能の小さい
変化に特に影響されやすい。ＣＰＳＩの共通のエキソンの多型(Ｔ１４０５Ｎ)を観測して
おり、それは、該尿素回路の第一段階を通る流れに影響を及ぼす。
この実施例において、ＰＰＨＮを発現した新生児が、対応するコントロールよりも低い
ＮＯ前駆体（アルギニン、及びシトルリン)を有するかどうかを試験した。また、ＰＰＨ
Ｎ患者が、ＡＡ（アスパラギン／アスパラギン）ＣＰＳＩ遺伝子型よりも低い機能に関連
するＣＣ（スレオニン／スレオニン）、又はＡＣ（アスパラギン／スレオニン）ＣＰＳＩ
遺伝子型を優性に有するかどうかを分析した。

（方法）
バンダービルト新生児集中治療部（Vanderbilt Neonatal Intensive Care Unit）に入
院している、＞２ｋｇ、＞３５週、及び＜７２時間の４７新生児（心エコー検査で記録さ
れた肺高血圧症を有する新生児（ｎ＝２２）、及び有しない新生児（ｎ＝２５））を登録
した。呼吸困難の重症度の臨床的に重要な測定を記録した。アンモニア濃度、及び血漿ア
ミノ酸プロフィールを得た。未変性ＭＤＥ（商標）ゲルにＰＣＲ増幅ＤＮＡを流し、遺伝
子型を測定した。

（結果）
ＰＰＨＮ患者は、平均アルギニンが２１．５μｍｏｌ／ｌであったが、そうでない患者
は平均３８．３μｍｏｌ／ｌ(ｐ＝０．０００４)であった。該シトルリン平均は、それぞ
れ６．１μｍｏｌ／ｌ、及び１０．３μｍｏｌ／ｌ(ｐ＝０．０２)であった。アルギニン
、及びシトルリン濃度は、酸素付加指数、機械換気日間、及び追加Ｏ_２を要求する日間で
測定されたように、低酸素血症の重症度に逆に関連していた。Ｔ１４０５ＮのＰＰＨＮ患
者の遺伝子型の分析は、５ＣＣ、１７ＡＣ、及び０ＡＡを示したが、該コントロールは、
７ＣＣ、１６ＡＣ、及び２ＡＡであった（予測された集団対立遺伝子頻度を用いて、カイ
二乗ｐ＝０．００５）。該ＣＣ遺伝子型の乳児は、アルギニン、及びシトルリン平均（２
１．５μｍｏｌ／ｌ、及び５．８μｍｏｌ／ｌ)が、該ＡＡ遺伝子型の乳児（３１．５μ
ｍｏｌ／ｌ、及び１３．５μｍｏｌ／ｌ)よりも低くく、該酵素の２つの形態間の機能的
相違と一致する。
（結論）
この実施例は、病気新生児のＰＰＨＮ発現が、該尿素回路中間体アルギニン、及びシト
ルリンの不適当な利用能に関連することを示している。該ＣＰＳＩ ＤＮＡのＴ１４０５
Ｎ多型は、酵素機能低下、及び続くＮＯ前駆体濃度低下を導く。

（考察）
カルバミルリン酸合成酵素(ＣＰＳＩ)は、該尿素回路の律速段階を触媒し、それによっ
てアルギニン、及びシトルリンを含む該尿素回路中間体の組織濃度を決定する。本明細書
中に開示したように、該ＣＰＳＩ遺伝子の広範分布したＣ〜Ａエキソン多型は、重大なＮ
−アセチルグルタミン酸結合ドメインの近くの１４０５位置で、変換スレオニンをアスパ
ラギンに変化させる。ＣＰＳＩの該アスパラギン含有体は、酵素機能研究において、さら
に効率的な反応速度論を表すというデータが示されている。

該Ｔ１４０５Ｎ対立遺伝子は、５０％異型接合性を示し、かつ正常健康成人の無症状変
異体になるように見える。実施例１〜３に開示したように、該スレオニン含有酵素が不適
当な濃度のアルギニン、及びシトルリンを産生し、かつ肝中心静脈閉塞症、急性肺損傷、
及び死の発生率増加に関連している、骨髄移植準備のための高投与量の化学療法に成人が
曝露された。内皮細胞において、Ｌ−アルギニンから一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）によ
り一酸化窒素（ＮＯ）が生じるので、尿素回路中間体の濃度低下は、内在性ＮＯ産生制限
による血管緊張の障害になりやすい。

本実施例の期待される集団研究において、類似プロセスが新生児持続性肺高血圧症(Ｐ
ＰＨＮ)の病因に関与し得る可能性を調査した。肺血管抵抗調節において、及び胎児から
新生児の循環において、内在的に産生したＮＯ機能（Lipsitz, E. C.らの論文. J Pedia
tr Surg (1996) 31:137-140; Abman, S.H.らの論文 Am J Physiol (1990) 259:H1921-H19
27）。妊娠２０週、及び満期産の間において、ＣＰＳＩ産生、及び機能は、成人レベルの
５０％未満である。この生理的欠陥は、特に、肝機能に影響を及ぼす他の新生児ストレス
、例えば仮死又は敗血症が加わった場合に、該Ｔ１４０５Ｎ遺伝子変異の作用を明らかに
し得る。

この研究に適した患者は、１９９９年７月１日〜２０００年２月２９日に呼吸困難のた
めにバンダービルト大学医療センター新生児集中医療棟(ＮＩＣＵ)に入院していた、妊娠
期間≧３５週、及び出生時体重≧２ｋｇの適切に成長した新生児である。多発先天的異常
（multiple congenital anomalies）、公知の遺伝的症候群、及び解剖学的原因の肺高血
圧症（先天性横隔膜ヘルニア、ポッター症候群、仮死性胸郭形成異常など）の乳児は除外
した。血漿アミノ酸プロフィール、アンモニア濃度、及びＢＵＮ濃度、一酸化窒素代謝産
物測定、並びにＣＰＳ１遺伝子型特定のために、最初の７２時間の生活において、５１新
生児から３ｃｃ採血した。輸血、経腸的又は非経口的タンパク質取り込み前、一酸化窒素
吸入投与前、或いはＥＣＭＯカニューレ挿入前に採血した。

該登録者の回収したデータは、（１）基準特性（当時の血液で、出生時体重、妊娠期間
、性別、人種、アプガースコア、初期診断、全ての肺合併症、及び出生後の年齢を記載し
た。）、及び（２）呼吸サポート(ＦｉＯ_２、ＭＡＰ、ｉＮＯ、ＥＣＭＯ)、及び臨床反応
(ＡＢＧｓ、機械換気、及び追加Ｏ_２の継続期間、生存)を含む。最大酸素付加指数[ＯＩ
＝ＦｉＯ_２ｘＭＡＰ／ＰａＯ_２]を、呼吸困難の重症度の測定として使用した。主な初期
診断は、（１）出生時仮死：最初のＡＢＧ又は臍帯血ガス、プラス、明らかな又は神経学
的な機能不全、及び終末器官損傷の混合アシドーシスを有する５分アプガースコア＜５、
（２）呼吸窮迫症候群(ＲＤＳ)：すりガラス肺野、及び胸部Ｘ線のエアブロンコグラム、
プラスＡＢＧの過炭酸症／低酸素症の組合せでの呼吸困難の臨床的症候群（注意：これら
の新生児の妊娠期間を考えると、この写真の乳児は、界面活性物質欠如、又は先天性肺炎
、どちらかを有し得る；しかし、得られたポジティブ気管吸引カルチャー（positive tra
cheal aspirate culture）のケースはない。）、及び（３）胎便吸引症候群（ＭＡＳ）：
輸送での羊水混濁、プラス呼吸困難、低酸素血症、及び粗悪浸潤物胸部Ｘ線の臨床症状の
病歴を含む。

乳児が、肺動脈圧上昇の正常な心臓内の解剖学的構造、及び心エコー図法の証拠をとと
もに、有意な低酸素血症(１００％Ｏ_２＞６時間で、ＰａＯ_２＜１００)を発現した場合、
肺高血圧症(ＰＰＨＮ)を有すると規定した。後者を、（１）右左又は二方向性管の卵円孔
流動（foramen ovale flow）、又は（２）盲目の第三者（blinded third party）により
読まれるような三尖弁逆流噴出（tricuspid regurgitation jet）のドップラー推定値（D
oppler estimate）に基づく肺動脈圧上昇(＞３５ｍｍＨｇ)として規定した。

４７患者の新鮮血漿試料のアミノ酸分析を行った。スルホサリチル酸でタンパク質を沈
殿させ、かつ０．４５μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃ４(Gelman Sciences, Ann Arbor, Michiga
n)を通して濾過することにより、血漿のタンパク質フリー抽出液を調製した。
Beckmann 7300アミノ酸分析器（Beckmann, Palo Alto, California)の４成分ｐＨ、及
びイオン強度勾配クエン酸リチウム緩衝液系を用いて、陽イオン交換クロマトグラフィー
によりアミノ酸を分離した。ニンヒドリンを用いたアミノ酸のカラム誘導体化後に、５７
０ｎｍで一級アミンアミノ酸、及び４４０ｎｍで二級アミンを検出した。標準物質で装置
を較正することにより定量を達成した(Sigma, St. Louis, Missouri)。シトルリン、及び
アルギニンを、該尿素回路を介する中間体のフラックスの測定可能な指数として検出した
。

（血漿一酸化窒素代謝産物(ＮＯｘ)の測定）
試料を除タンパクし、かつカドミウムビーズとともにインキュベートして硝酸塩を亜硝
酸塩に変換した後に、患者のサブグループにおいて、改質グリース試薬を使用して、血漿
ＮＯｘを測定した。
（ＳＮＰ検出）
ＣＰＳ１の第３６番目のエキソン(Ｕ４２９５−配列番号：１５）、及びイントロン(Ｌ
Ｉ３６−配列番号：１６)内からのオリゴヌクレオチドプライマー、及びゲノムＤＮＡ変
化含有領域を含む２５１ｂｐフラグメントを確実に増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を、全体の血液製剤から得た。プライマーの組合せは、Ｔａｑポリメラーゼ(Promega
)、及び下記のPCRサイクル条件を用いて、再現可能な増幅を与えた：６７℃で１分アニー
ル、７２℃で１分伸長、及び９４℃で１分変性の３５サイクルである。ホルムアミド処置
後、試料を、未変性ＭＤＥ（商標）ゲル（FMC, Rockland, Maine)中、４℃で５時間、電
気泳動にかけ、次に硝酸銀で染色して、ＤＮＡフラグメントを検出した。患者を、ＣＣ又
はＡＡの同型接合性ＳＮＰ遺伝子型、或いは異型接合性（ＡＣ）を有する者に分類した。
未変性ゲル電気泳動、及び直接配列分析を用いた遺伝子型特定は、上述のように生じた。
従って、Ｔ１４０５Ｎ多型の成人集団分布は、４５％ＣＣ、４４％ＡＣ、及び１１％ＡＡ
と決定された。

上記の同定技術を用いて、Ｔ３４４Ａ多型を検出した。オリゴヌクレオチドプライマー
を第１０番目のエキソン(U1119:tactgctcagaatcatggc 配列番号：１７)、及びイントロ
ン(LI10+37: tcatcaccaactgaacagg 配列番号：１８)から使用して、変化を含む９１ｂｐ
フラグメントを増幅した。ＰＣＲサイクル条件は、５９℃で１分間アニール、７２℃で１
分間伸長、及び９４℃で１分間変性の３５サイクルである。患者を、ＡＡ、又はＴＴの同
型接合性ＳＮＰ遺伝子型を有するもの、又は異型接合性(ＡＴ)であるものにクラス分けし
た。この多型の成人集団分布は、３５％ＡＡ、４４％ＡＴ、及び２１％ＴＴである。

上記の同定技術を用いて、該１１８−ＣＴＴ多型を検出した。オリゴヌクレオチドプラ
イマーを５’非翻訳領域(U5'-74: ggttaagagaaggaggagctg - 配列番号：１９)、及びイン
トロン(L175: aaccagtcttcagtgtcctca - 配列番号：２０)から使用して、該変化を含む２
４９ｂｐフラグメントを増幅した。ＰＣＲサイクル条件は、５９℃で１分間アニール、７
２℃で１分間伸長、及び９４℃で１分間変性の３５サイクルである。患者を、１１８トリ
ヌクレオチド挿入又は欠失を有する同型接合性遺伝子型を有するもの、或いは異型接合性
であるものにクラス分けした。この多型の成人集団分布は、３４％ＣＴＴ−、４３％異型
接合性、及び２３％ＣＴＴ＋である。

アンモニア、及び血漿アミノ酸濃度を、スチューデントＴ−検定を用いて、患者のグル
ープ間で比較した。ＣＰＳＩ遺伝子型の分布を、全グループの対立遺伝子頻度を計算し、
かつ特に選択されたサブグループにおいて、カイ二乗分析を用いてHardy-Weinberg平衡の
証拠を探索することにより、グループに渡って比較した。初めに登録した５１新生児のう
ち、２５人がＰＰＨＮを発現したが、２６人はしなかった。乳児登録時における出生時体
重、妊娠期間、人種、又は出生後の年齢を含む、２つのグループの基準特性において実質
的に有意な違いはなかった。しかし、該コントロールグループにおいて、男性のわずかな
優性があった。

初期診断の分布は、一様に分散していた。該ＰＰＨＮグループにおいて、５乳児が出生
時仮死であり、９乳児がＲＤＳであり、５乳児が胎便吸引症候群であり、かつ６乳児が他
の診断を有していた。初期ＰＰＨＮの４乳児を含む。コントロールグループにおいて、４
乳児が出生時仮死であり、８乳児がＲＤＳであり、３乳児がＭＡＳであり、かつ１１乳児
が他の診断を有していた。他の診断は、上室性頻拍症、分娩時外傷、及びウイルス性敗血
症を含んでいた。該研究において、陽性細菌の血液培養液を有している乳児はいなかった
。

予想どおり、ＰＰＨＮに初期病状を併発した乳児は、幾つかの臨床的基準によるコント
ロールよりも重症な病気を発現する。ＰＰＨＮの８乳児は、吸入ＮＯ（ｉＮＯ）を要求し
、２乳児はＥＣＭＯを要求し、かつ２乳児は死亡した（ｉＮＯにおいて、仮死、及び複数
臓器系不全の１乳児；肺胞毛細管形成異常の別の乳児を、ＥＣＭＯから除外した。）。明
らかに、ｉＮＯ、又はＥＣＭＯで処置した該コントロールはいなかった；該コントロール
グループの死亡はなかった。
ＰＰＨＮの３乳児を分析から除外した。肺生検時に肺胞毛細管形成異常が発見された乳
児は、肺高血圧症の解剖学的病因があると考えられていた。別の乳児を誤って先天性横隔
膜ヘルニアで登録し、かつ第３を、ＴＰＮ開始後に、１９９時間齢で登録した。該コント
ロールグループの１乳児を、プラーダー−ヴィリ症候群になる低血圧症の原因を示す核型
分析後に、分析から除外した。

アミノ酸分析において、ＰＰＨＮ乳児は、血清アルギニン、及びシトルリン濃度が有意
に低かった。ＰＰＨＮケースの平均アルギニン濃度は、２１．５±９．２μｍｏｌ／ｌで
あったが、コントロールグループの平均アルギニンは、３８．３±１８．４μｍｏｌ／ｌ
（ｐ＝０．０００４）であった。ＰＰＨＮケースの平均シトルリンは、コントロールグル
ープの１０．３±７μｍｏｌ／ｌと比較して、６．１±３．６μｍｏｌ／ｌであった（ｐ
＝０．０２）。この２つのグループ間のグルタミン、グリシン、アラニン、リジン、バリ
ン、オルニチン、及びロイシンを含む他のアミノ酸濃度において、有意な差はなかった。
全必須アミノ酸（ＴＥＡＡ）の濃度は、ＰＰＨＮケースにおいて、わずかに低かった（約
５３７μｍｏｌ／ｌ対約６５４μｍｏｌ／ｌ）。しかし、この差は、出生時体重、妊娠期
間、又は出生後の時間数により統計学的に有意でない（ｐ＝０．０８）。ＴＥＡＡ濃度は
、６時間齢前に採血した４乳児において有意に高いことが発見された(約１０２１．５μ
ｍｏｌ／ｌ対約５４２μｍｏｌ／ｌ、ｐ＝０．００２６)。この差は、胎盤循環から、こ
れらの乳児の非経口的タンパク質流入の新しい休止を反映していると推定される。

仮死、ＲＤＳ、ＭＡＳ、及び"他"の初期診断分類を別々に分析した場合、アルギニン、
及びシトルリン濃度の違いはないことがわかった。各グループにおいて、肺高血圧症の乳
児は、低い値を有する傾向にあるが、該結果は、各グループの少数の乳児を考えると、統
計的に有意でない。例えば、ＰＰＨＮで仮死した乳児は、仮死したコントロールの平均ア
ルギニン約５２．７μｍｏｌ／ｌに比べ、約１８．５μｍｏｌ／ｌであり（ｐ＝０．０６
）、かつ平均シトルリン約１４．３μｍｏｌ／ｌに比べ、約６．８μｍｏｌ／ｌであった
（ｐ＝０．０４）。

血清アルギニン、及びシトルリンの濃度間、及び低酸素血症の重症度に逆相関があった
。アルギニン、及びシトルリン値は、酸素付加指数の増加、機械換気日間の増加、及び追
加酸素を要求する日を増加した出生時体重、妊娠期間、又は出生後の時間数につれて、進
行的に低下した。ＰＰＨＮ乳児内のＮＨ_３濃度は、コントロール内の濃度よりもわずかに
高い傾向がある(５４±１８．１μｍｏｌ／ｌ対４５．６±１２μｍｏｌ／ｌ)。しかし、
これらの値は、統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．０８）。ＣＰＳ１ Ｔ１４０５Ｎ遺
伝子型分析時に、ＰＰＨＮを発現した２２乳児のうち、５はＣＣであり、かつ１７はＡＣ
であった。該ＰＰＨＮケースにおいてＡＡはなかった。該２５コントロールにおいては、
７ＣＣ、１６ＡＣ、及び２ＡＡであった。次に、遺伝子型のこれらの分布を、該ＰＰＨＮ
グループ中のHardy-Weinberg平衡の証拠を示す全グループの対立遺伝子頻度を計算して比
較した。カイ二乗分析において、これらの２つのグループは、ｐ−値＝０．００５であり
、互いに有意な差がある。ＡＡ遺伝子型の２乳児のうち、一方はＲＤＳを有し、他方は、
出生時仮死を患っていた。どちらの乳児も、ＯＩ＞１５；換気＜１週、及び酸素＜１０日
の両消費を達成していない。

ＣＣ遺伝子型の乳児は、平均アルギニン濃度２１．９±７μｍｏｌ／ｌ、及びシトルリ
ン濃度５．８±１．８μｍｏｌ／ｌであったが、ＡＡ遺伝子型の乳児は、平均アルギニン
濃度３１．５±３．５μｍｏｌ／ｌ、及び平均シトルリン濃度１３．５±６．４μｍｏｌ
／ｌであった。再び、少数のＡＡを考えると、このデータは、それぞれ０．１、及び０．
００６のｐ値を有し、統計的相違に達するのは困難である。

（実施例８）
（子ブタの経静脈シトルリン供給は、血漿アルギニン濃度を増加する。）
以前に、経静脈シトルリンを臨床モデルに使用していない。この実施例は、子ブタの血
清アルギニン濃度に対してＩＶシトルリン、及びその効果の安全性を評価した。５〜２１
日齢の標的最小重量４ｋｇの９デュロック種ブタの全てを利用した。全ての子ブタを麻酔
導入、及び気管開口術を施した。中心線を大腿動脈に置き、かつ持続的に血流力学的にモ
ニターした。シトルリン（６００ｍｇ／ｋｇ ＩＶ）を、５子ブタに投与した。コントロ
ール動物には、生理食塩水を与えた。シトルリン投与前、及び投与数時間後に血清アミノ
酸を抜取った。
ＩＶシトルリン投与１〜２時間後で血清アルギニン濃度がピークになり、かつ３時間後
に基準以上を維持した。コントロールと比べて、全ての時間点で有意性に達していた（ｐ
＜０．００１）。血行動態の不安定化がないことが観察された。

（薬物動態）
上記データに基づき、ＩＶシトルリンの単独投与後の血漿シトルリン、及びアルギニン
濃度に対して、薬物動態を計算した。薬物動態データは、半減期（ｔ１／２）、排出定数
（Ｋｅｌ）、分布体積（Ｖｄ）、及び血漿クリアランス（ＣＬｐ）を含む。
血漿シトルリン濃度は、急速に増加し、かつｔ１／２＝１．５時間、Ｋｅｌ＝．４６２
時間^−１、Ｖｄ＝２．２５Ｌ、及びＣＬｐ＝１．０５Ｌ／時間を示した。しかし、血漿ア
ルギニンに対するシトルリンの効果は、ＮＯシンターゼの基質であるので興味深かった。
血漿アルギニン濃度の濃度曲線を、図１３に示した。この曲線に基づいた、血漿アルギニ
ンの薬物動態は、下記のようであった：ｔ１／２＝１８時間、Ｋｅｌ＝．０３９時間^−１
、Ｖｄ＝２．８５Ｌ、及びＣＬｐ＝０．１１Ｌ／時間である。長い半減期、及び遅いクリ
アランスは、ＩＶシトルリンの単独投与が、血行動態に有害な影響なく、平等に長い間隔
に渡って、血漿アルギニン濃度増加の維持に有効であることを示している。

（実施例９）
（先天性心臓外科手術における経口シトルリン供給）
本実施例は、シトルリン供給が血清シトルリン濃度を増加し、内在性ＮＯ産生を介して
、手術後の肺高血圧症のリスクを低下させるかどうかの評価に関連するものである。特に
、本実施例は、経口シトルリンの手術中供給が、血清シトルリン濃度を増加し、該尿素回
路を介した一酸化窒素の大きな産生を導き、それによって、手術後の肺高血圧症のリスク
を低下するかどうかの測定に関連するものである。
無作為化した、プラセボ対照、二重盲検の研究を行った。先天性心臓障害の外科的矯正
を受け、かつ手術後の肺高血圧症を発現するリスクのある４０乳児／小児が、経口シトル
リン、又はプラセボを受けた。シトルリン、又はプラセボの５回投与量（１．９ｇ／ｍ^２
／投与量）を、手術前に、手術直後に投与し、次に１２時間ごとに３回投与量を投与した
。血清シトルリンの一次的指標を、５つの時間点で測定した。全身血圧、血清アルギニン
及び一酸化窒素代謝産物、ＣＰＳＩ遺伝子型、及び肺高血圧症の存在／非存在の二次的結
果測定を得た。

４０患者を問題なく登録し、かつシトルリン、又はプラセボを受ける２０の等しいグル
ープを無作為化した。４８時間の研究時間の間で、該シトルリン、及びプラセボグループ
間の平均血圧の繰り返し測定に違いはなかった（Ｐ＝０．５３）。中央値のシトルリン濃
度は、該シトルリングループの方が、手術直後（３６ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ ２８〜４８
ｕｍｏｌ／Ｌ対２６ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ ２４〜３５ｕｍｏｌ／Ｌ、Ｐ＝０．０１２）
、及び手術１２時間後（３７ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ １８〜８３ｕｍｏｌ／Ｌ対２０ｕｍ
ｏｌ／Ｌ ＩＱＲ １５〜２９ｕｍｏｌ／Ｌ、Ｐ＝０．０１５）でのプラセボと比較して
有意に大きかった。シトルリン濃度は、該プラセボグループの手術後段階全体を通して有
意に低下し（Ｐ＝０．００１）、一方、濃度は、シトルリン供給で有意に上昇した（Ｐ＝
０．０１４）。平均血清アルギニン濃度は、手術１２時間後でのシトルリングループにお
いて、有意に高かった(３６ｕｍｏｌ／Ｌ ＋／−２４ｕｍｏｌ／Ｌ対２３ｕｍｏｌ／Ｌ
＋／−１３ｕｍｏｌ／Ｌ、Ｐ＝０．０３７)。アルギニン濃度は、該プラセボグループ
の手術後段階全体を通して有意に低下し（Ｐ＜０．００１）、一方、濃度は、シトルリン
供給で基準を維持した（Ｐ＝０．５３３）。手術後に肺高血圧症を発現した９患者（６プ
ラセボ、３シトルリン）全ては、シトルリン供給で得られた中央値濃度（３７ｕｍｏｌ／
Ｌ）（Ｐ＝０．０３６）未満の血清シトルリン濃度を有していた。肺高血圧症の患者に、
該ＣＰＳＩ多型がＡＡ遺伝子型の患者はいなかった（Ｐ＝０．７４３）。
患者は、有意な副反応の証拠なく、シトルリン投与を許容する。経口シトルリン供給は
、心配バイパス後に、血清シトルリン、及びアルギニン、双方を有意に増加させる。正常
値以上の血清シトルリン濃度は、手術後の肺高血圧症のリスク低下に関連する。

（方法）
（患者登録）
無作為化した、対照、二重盲検の研究において４０患者を登録した。登録には、先天性
心臓障害矯正の６つの外科的手法のうちの１つを受けた全ての６歳未満の乳児、又は小児
を考慮した。望ましい外科的手法は、１）左心室低形成症候群（ＨＬＨＳ）、又はＨＬＨ
Ｓの変種に対するノーウッドＩ手法、２）両方向性グレン、３）改質フォンタン、４）房
室中隔欠損修復（ＡＶＳＤ）、５）大血管転換手法がある。除外基準は、１）外科的に処
理されない狭い有意な肺動脈、２）以前の肺動脈ステント配置、３）以前の肺動脈血管形
成、４）有意な左側ＡＶ値逆流（left sided AV valve regurgitation）、５）肺静脈戻
り異常（pulmonary venous return abnormalities）、又は６）肺静脈狭窄を含む。

心境部外科病院（Cardiothoracic Surgery Clinic）（外来患者）、又はバンダービル
ト小児科医院（Vanderbilt Children's Hospital）（入院患者）での手術前評価時に、登
録患者の両親から、情報を与えた上での書面での同意を得た。バンダービルト小児科医院
の３心臓外科医のうちの１人が、同じ心配バイパス、及び心臓麻痺製剤を用いて外科的手
法を行った。
肺高血圧症を、平均肺動脈圧が全身平均血圧の少なくとも１／２であり、かつ２５ｍｍ
Ｈｇ超過であるものとして規定した。直接肺動脈圧測定を、両方向性グレン又は改質フォ
ンタン手法後の患者状態における具体的な上大静脈中心線、或いは段階Ｉノーウッド手法
を受けた患者を除いた他の全患者の経胸腔的肺動脈カテーテル、どちらかから得た。中心
線は、心臓麻酔医により配置され、かつ肺の線は、心胸部外科医により直接配置された。

直接測定に加えて、２つの心室構造を有する全患者の心エコー図の評価を介して、肺動
脈圧を推定した。肺高血圧症の存在を確認するエコーの見解は、１）有意な三尖弁逆流、
２）肺動脈弁狭窄の証拠のない拡大、又は肥大右心室、３）脳室内中隔平坦化（intraven
tricular septal flattening）を含む。全ての心エコー図は、ヴァンダービルト小児科医
院の小児心臓専門医により解釈された。
全ての医師（外科医、心臓病専門医、集中治療専門医、及びＰＩ）、調査看護師、ＰＣ
ＣＵ看護スタッフ、及び患者は、無作為化スキーム、及び処置腕割当（treatment arm as
signments）が分からない。臨床データ、及び患者特徴を、研究結果の知見前に診療記録
から得た。

（有害事象）
シトルリン投与は、全身低血圧症の理論的危険性がある。４８時間研究期間時に、１時
間毎に全身血圧をモニターした。有害事象を、平均血圧の基準から２５パーセントよりも
大きい減少として規定した。患者を、容量蘇生法（volume resuscitation）、及び／又は
変力／血管収縮サポートを用いて症候的に処置した。患者を、低血圧症が処置に応答しな
くなるまで、除外させなかった。

（研究プロトコル）
４０患者を、手術直前に、無作為にプラセボ、又はシトルリンのどちらかを受けさせた
。バンダービルト病院臨床薬学（Vanderbilt Hospital Clinical Pharmacy）の治験薬サ
ービス（Investigational Drug Service）で、以前の４ブロック無作為入れ換えに従って
、乱数発生コンピューターを用いて無作為化を行った。モデルを治療（ＩＴＴ）する意図
で患者を登録した。

懸濁化剤として蒸留水を用いて、シトルリンを１００ｍｇ／ｍｌ（１０％）溶液として
投与した。該薬剤、及びプラセボを混合し、かつ治験薬サービスにより分配した。シトル
リン、及びプラセボを、容量、及び色に対して一致させた。シトルリンを、１日投与量３
．８ｇ／ｍ^２、及び全投与量９．５ｇ／ｍ^２として、１２時間毎に１．９ｇ／ｍ^２投与量
で５回投与した。この投与量は、該尿素回路欠陥を有する乳児／小児に投与した、現在の
シトルリン補充治療により決定され、急性肺損傷のリスクのところで成人骨髄移植患者の
進行中の臨床試験で投与された投与量と同じである(バンダービルト大学医療センター、B
rian Christman ＭＤ)。

手術室で麻酔、及び挿管の導入後に、プラセボ/シトルリンの最初の投与量を、調査看
護師、又は医師により配置された口胃供給チューブを介して投与した。第２投与量を、回
復のための小児発症治療部（Pediatric Critical Care Unit）(ＰＣＣＵ)到着後すぐに与
えた。第３、第４、及び第５投与量を、それぞれＰＣＣＵ内で、手術後１２時間、２４時
間、及び３６時間で投与した。手術後の投与量は、ＰＣＣＵの臨床看護師により配置され
た経鼻胃供給チューブを介して経腸的に、又は一度該患者を抜管して口から与えられた。

（試料回収）
血液３ミリリットルを、５回の時間点で各患者から得た：手術直前及び手術直後、次に
手術後１２、２４、及び４８時間である。手術前の血液試料を、麻酔導入、及び動脈又は
中心静脈カテーテルの配置の後に回収した。手術直後の試料を、小児発症治療部(ＰＣＣ
Ｕ)到着時に回収し、かつ次の試料を、該ＰＣＣＵ到着後にそれぞれの時間間隔で回収し
た。クエン酸塩加チューブで、試料を回収し、氷上に置き、かつ処理まで４℃で保存した
。血漿と細胞とを分離するために、回収３時間以内に試料を遠心分離した。血漿試料を、
さらなる実験室分析まで−７０℃で冷凍した。
結果データ確認のための重要な要素は、中心静脈（ＣＶＬ）、又は動脈経路（ＡＬ）に
対する接触性であった。登録患者の両親は、血液試料が手術に必要な線から得られ、かつ
中心静脈評価が医療的に必要ない時、追加の採血がないであろうことを保証した。結果変
数の測定が利用できない時は、本研究の投与を続けなかった。

（実験室測定）
血清シトルリン、アルギニン、及び全ての他のアミノ酸の濃度を、タンパク質フリー抽
出液のアミノ酸分析により測定した。7300アミノ酸分析器（Beckmann, Palo Alto, Calif
ornia, アメリカ合衆国)を用いて、陽イオン交換クロマトグラフィーにより、アミノ酸を
分離した。該分析器の較正は、患者試料の試験前に終了させた。
一酸化窒素代謝産物濃度を、比色分析非酵素的アッセイ（colorimetric nonenzymatic
assay）(Oxford Biomedical Research, Oxford, Michigan, アメリカ合衆国)を介して分
析した。最初に、血漿試料を、硫酸亜鉛溶液を用いて除タンパクした。次に、硝酸塩を、
カドミウムビーズとともにインキュベーションして、亜硝酸塩に還元した。次に遠心分離
し、該上清にグリース試薬スルファニルアミド、及びＮ−（１−ナフチル）エチレンジア
ミンを連続的に加えた（１４）。次に、各試料の吸光度を、５４０ｎＭで測定し、かつ次
に、該コントロールとして希釈亜硝酸ナトリウムの標準曲線を利用して、一酸化窒素代謝
産物濃度を測定した。

本明細書中に上述したように、Ｔ１４０５Ｎ多型のＣＰＳＩ遺伝子型を特定した。該バ
フィーコートの単離を、手術前のクエン酸塩加血液試料から１０００ｇで５分の遠心分離
により得て、次に−７０℃で貯蔵した。次に、ゲノムＤＮＡ単離キットを、白血球細胞か
らＤＮＡ抽出のために利用した(Promega Corp, Madison, Wisconsin, アメリカ合衆国)。
次に、本明細書中に記載したＴ１４０５Ｎプライマーを使用して、単離ＤＮＡ試料のＰＣ
Ｒ増幅を完了した。次に、ＰＣＲ産物を、ＭＤＥヘテロ二本鎖キットを利用して、変異検
出増強（mutation detection enhancement）（ＭＤＥ）電気泳動により分類した(AT Bioc
hem, Malvern, Pennsylvania, アメリカ合衆国)。この方法の利用により、コントロール
と比較する正確な一塩基置換の可視化を可能にする。

（統計分析）
人工心肺後の乳児、及び小児状態の平均シトルリン濃度は、以前に報告され、手術後１
２時間で２０．７ ＋／− １３．０ｕｍｏｌ／Ｌである。４０患者の試料サイズは、両側
の有意性、及びα＝０．０５を用いて、シトルリン(ｎ＝２０)とプラセボ(ｎ＝２０)との
差１３ｕｍｏｌ／Ｌ(１ＳＤ)を検出するように、８７％のパワー（１−β）を有するであ
ろう。｛試料サイズを、ＰＳパワー、及び試料サイズプログラムを用いて計算する（Ｄｕ
ｐｏｎｔ ＷＤ、及びＰｌｕｍｍｅｒ ＷＤ：ＰＳパワー、及び試料サイズプログラムは、
インターネットで無料で利用できる。Controlled Clin Trials,1997;18:274; バージョン
2.1.30｝

４８時間研究期間で、平均血圧の多面配列測定で表された薬剤安全性を、多変量ＡＮＣ
ＯＶＡを介して評価した。連続結果変数、アミノ酸、及び一酸化窒素代謝産物濃度を、非
正常分布に対して四分位範囲（ＩＱＲ）の中央値、又は適切な場合、＋／−ＳＤの平均値
として報告した。マン−ホイットニーＵ検定を用いて、範囲外値を占めるグループ間の連
続変数を比較した。そうでなければ、スチューデントｔ検定を使用した。対となる連続値
の分析を、ウィルコクスン順位和検定で比較した。無作為化の成功に対する二分の結果、
及び肺高血圧症の存在、又は非存在を、割合として報告し、かつフィッシャーの直接確率
検定で評価した。全ての分析は両側とし、かつ相違の統計的有意性を、Ｐ−値＜０．０５
で考慮した。統計ソフトウェアＳＴＡＴＡ（バージョン６．０，ＳＴＡＴＡ社, College
Station, Texas)、及びＳＰＳＳ(著作権2004, SPSS社)を、ヒト遺伝子研究（Human Genet
ics Research）センターのJeff Canter，ＭＤにより指導されたデータ分析に使用した。

（結果）
（患者登録）
４０患者を問題なく登録し、かつシトルリン(n＝２０)、又はプラセボ(n＝２０)を無作
為に受けた。４８時間の研究時間の間で、無作為化は、基準で、シトルリンとプラセボグ
ループとの間の有意な差はなかった（表１）。
研究集団(Ｎ＝４０)の年齢の中央値は、５５％男性、及び９０％白色人種で８．５ヶ月
であった(ＩＱＲ ４−２９ ｍｏ)。外科的介入は、ノーウッド段階Ｉ（８％）ＢＤＧ又は
フォンタン（５３％）、ＶＳＤ又はＡＶＳＤ修復（２５％）、及び大血管転換修復（１５
％）である。研究グループ内のＴ１４０５Ｎ多型の該ＣＰＳＩ遺伝子型分布は、５ＡＡ(
１２．５％)、２３ＡＣ(５７．５％)、１２ＣＣ(３０％)であり、一般集団で予測された
分布に類似している。

（安全性）
平均血圧は、該シトルリン、及びプラセボグループ間で違いはなかった（Ｐ＝０．５３
０）（図１４）。４８時間の研究期間で死亡はなかったが、３患者は、外科的修復の３０
日以内に、手術後の合併症から死亡した。該患者のシトルリンとプラセボグループ間に有
意な違いはなかった(２対１，Ｐ＝０．４８７)。全ての死は、薬剤投与研究とは無関係で
あることがわかった。無作為にシトルリンを受けた１患者を、手術直後に除外した。なぜ
ならば、有意な外科的合併症は、膜型人工肺（ＥＣＭＯ）を介するサポートを要求し、か
つ４８時間研究期間内のさらなる修復のためのＯＲに戻るためである。治療意図を維持し
た。患者を、データ分析中の手術前の結果測定を包含した該シトルリングループで表した
が、しかし、患者データがないために、手術後の結果分析から外した。

（血清シトルリン）
血清シトルリン濃度中央値は、経口シトルリンを受けた患者においてプラセボと比較し
た場合、手術直後(３６ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ ２８〜４８ｕｍｏｌ／Ｌ対２６ｕｍｏｌ／
Ｌ ＩＱＲ ２４〜３５ｕｍｏｌ／, Ｐ＝０．０１２)、及び手術後１２時間（３７ｕｍｏ
ｌ／Ｌ ＩＱＲ １８〜８３ｕｍｏｌ／Ｌ対２０ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ １５〜２９ｕｍｏ
ｌ／Ｌ, Ｐ＝０．０１５）、双方で有意に高かった（図１５）。血清シトルリン濃度は、
手術直後、及び手術後１２時間、双方のプラセボグループの基準から有意に低下した（そ
れぞれ、３２ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ ２５〜４４ｕｍｏｌ／Ｌ対２６ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ
２４〜３５ｕｍｏｌ／Ｌ、及び２０ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ １５〜２９ｕｍｏｌ／Ｌ, Ｐ＝
０．０２０、及びＰ＜０．００１）。一方、血清シトルリン濃度は、手術直後のシトルリ
ン供給での基準から上昇し、かつ手術後１２時間で濃度が上昇し続けた(それぞれ、２９
ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ ２５〜３４ｕｍｏｌ／Ｌ対３６ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ ２８〜４８ｕ
ｍｏｌ／Ｌ、及び３７ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ １８〜８３ｕｍｏｌ／Ｌ, Ｐ＝０．０１４、
及びＰ＝０．１８４)。
手術後１２時間より後の結果測定は、データ点の損失により不明瞭となった。９患者は
回復し、かつ手術後２４時間で一般小児科フロアに移動した。

（アルギニン、及び一酸化窒素代謝産物）
手術後１２時間での平均血清アルギニン濃度は、経口シトルリンを受けた患者において
、プラセボと比較して有意に高かった(３６＋／−２４ｕｍｏｌ／Ｌ対２３＋／−１３ｕ
ｍｏｌ／Ｌ, Ｐ＝０．０３７)（図１６）。血清アルギニン濃度は、手術後１２時間のプ
ラセボグループの基準から有意に低下した(３８ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ ３０〜５２ｕｍｏ
ｌ／Ｌ対３４ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ １５〜４５ｕｍｏｌ／Ｌ、及び２２ｕｍｏｌ／Ｌ Ｉ
ＱＲ １３〜３３ｕｍｏｌ／Ｌ, Ｐ＝０．０７７、及びＰ＜０．００１)。一方、血清アル
ギニン濃度は、該シトルリングループの基準からの有意な低下はなかった(それぞれ、３
３ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ ２５〜５４ｕｍｏｌ／Ｌ対３３ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ ２２〜４１
ｕｍｏｌ／Ｌ、及び３０ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ １５〜５６ｕｍｏｌ／Ｌ, Ｐ＝０．５３３
、及びＰ＝０．５３３)。
一酸化窒素代謝産物の濃度は、シトルリン、及びプラセボグループ間での手術直後(４
２ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ ２７〜７２対４０ｕｍｏｌ／Ｌ IQR ２７〜５５ｕｍｏｌ／Ｌ,
Ｐ＝０．４３０)、又は手術後１２時間(４５ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ ２８〜８１対４３ｕｍ
ｏｌ／Ｌ ＩＱＲ ２０〜６８ｕｍｏｌ／Ｌ, Ｐ＝０．５１８)で違いはなかった。

吸入一酸化窒素を、手術後期間において５患者に投与し、該患者全ては、手術直後で脱
飽和、及び低血圧症を示した。該５患者のうちの３患者は、直接肺動脈圧測定により肺高
血圧症と記録された。５患者のうちの２患者（１フォンタン、１ノーウッド）を、ｉＮＯ
試験に置いた。フォンタン手法を受けた患者を、手術直後に２度、血胸、及び心臓タンポ
ナーデの緩和に対して調査し、かつ開窓術拡張のためにＯＲに後で戻した。ノーウッド手
法を受けた患者を、心筋抑制のために多くの失敗した試みの後、該ＯＲのバイパスの結果
に対する試みとしてｉＮＯに置いた。両患者は、手術後１２時間以内のプロトコルにより
ｉＮＯをやめさせた。

（肺高血圧症）
９患者が、手術後に肺高血圧症を発現した。それは、プラセボグループにおいて６患者
（６７％）、及び処置グループにおいて３患者（３３％）であった(Ｐ＝０．４５１)。肺
高血圧症の全患者は、血漿シトルリン濃度が、先に報告した６歳小児のシトルリン濃度の
標準より低く(３０ｕｍｏｌ／Ｌ ＩＱＲ ２３〜３７ｕｍｏｌ／Ｌ)、かつシトルリン供給
でえら得た中央値濃度よりも低かった(３７ｕｍｏｌ／Ｌ， Ｐ＝０．０３６)。肺高血圧
症患者は、Ｔ１４０５Ｎ多型の予測されたＣＰＳＩ遺伝子型分布を有しておらず、０ＡＡ
(０％)、６ＡＣ(６７％)、３ＣＣ(３３％)であった。しかし、少数の肺高血圧症患者のた
めに有意ではない（Ｐ＝０．７４３）。

シトルリン投与のために、ＮＯ前駆体のこの有意な低下を抑制した。該プラセボグルー
プは、バイパス後にシトルリン、及びアルギニン濃度の有意な低下を示し続けることを示
した。対照的に、経口シトルリンを受けた患者において、シトルリン濃度の有意な増加、
及びアルギニンの手術前濃度の維持があった。ＮＯ前駆体濃度における心肺バイパスの効
果を逆転する能力は、内在性ＮＯ産生が肺高血圧症を抑制するように使用される場合に不
適切である。

手術後に肺高血圧症を発現する患者は、シトルリン濃度が、基準より予測された濃度未
満であり、かつシトルリン供給で得られた３７ｕｍｏｌ／Ｌの中央値濃度未満であった。
肺高血圧症の発現は、シトルリン供給又は他の素因（遺伝的、外科的、環境的）により得
られる血清シトルリン濃度に依存した。プラセボグループの２０患者のうちの１８患者（
９０％）の全体は、該処置グループの２０患者のうちの９患者（４７％）に対して、シト
ルリンが３７ｕｍｏｌ／Ｌ以下であった。低シトルリン濃度の患者のうち、２７患者のう
ちの９患者（３３％）が肺高血圧症を発現した。肺高血圧症患者は、手術直後の研究グル
ープ(Ｐ＝０．０３)と比較して、シトルリン濃度が最も低かった。従って、シトルリン、
又は内在性ＮＯ産生の吸収に影響を与える因子は、肺高血圧症を発現するリスクを増加し
た。

特定の遺伝子の多型は、ＮＯ前駆体利用能を保存する役割を担い得る。前記酵素カルバ
ミル合成酵素Ｉは、該尿素回路の律速酵素であり、従ってシトルリン、及びアルギニン産
生を決定する。尿素回路機能不全は、上述のバイパス後の乳児／小児の新生児持続性肺高
血圧症(ＰＰＨＮ)、及び手術後肺高血圧症の発現に関連している。ＣＰＳＩのＴ１４０５
Ｎ多型は、ＰＰＨＮを有する新生児、及びバイパス後の先天性心臓病患者のアルギニン、
及び一酸化窒素濃度低下に有意に関連した。この多型のＡＡ遺伝子型は、肺高血圧症を発
現した小児科集団において、不十分に表示された。本発明者らは、本研究の肺高血圧症を
発現した９患者が、該ＡＡ遺伝子型でないことを再び示す。

（結論）
患者は、有意な副反応の証拠なく、シトルリン投与を許容する。経口シトルリン供給は
、プラセボを受けた患者のＮＯ前駆体の有意な低下と比較して、シトルリン濃度を有意に
増加させ、かつ手術前のアルギニン濃度を維持する。正常以上の血清シトルリン濃度を維
持した患者は、シトルリン投与又は素因により、手術後の肺高血圧症を発現しない。

（参照文献）
下記に示した引用文献、並びに、本明細書中に引用した全ての引用文献は、本明細書中
に引用により組み込まれており、該内容は、方法論、技術、及び／又は本明細書中で使用
した組成物を補充、説明、背景提供、又は教示する。

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米国特許第5,399,346号
米国特許第5,162,215号
米国特許第5,279,833号
米国特許第5,643,567号
米国特許第4,683,202号
米国特許第4,683,195号
米国特許第5,286,634号
米国特許第5,646,008号
米国特許第4,196,265号
米国特許第5,489,742号
米国特許第5,550,316号
米国特許第5,573,933号
米国特許第5,614,396号
米国特許第5,625,125号
米国特許第5,641,484号
米国特許第5,648,061号
米国特許第5,651,964号
米国特許第4,965,188号
米国特許第4,769,331号
米国特許第5,741,957号
米国特許第4,458,066号
米国特許第4,554,101号
米国特許第4,736,866号

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ここで開示される主題の様々な詳細が、ここで開示される主題の範囲から外れることな
く変化し得ることが理解されるであろう。さらに、先の記載は、説明のみを目的とするも
のであり、請求項で規定したここで開示される主題を制限ことを目的とするものではない
。

図１は、尿素回路の概略図である。 図２は、認識された変異が反映されていないＣＰＳＩタンパク質のコンセンサスの概略図である。 図３は、ＣＰＳＩタンパク質のコンセンサスであり、該タンパク質の幾つかの公知の変異、及びここで開示される主題のＴ１４０５Ｎ多型が示されている。 図４は、ＣＰＳＩの認識された転写後修飾の概略図である。 図５は、ＣＰＳＩのヒトゲノム遺伝子座の概略図である。 図６は、全長ＣＰＳＩ ｃＤＮＡのクローニング戦略の概略図である。 図７は、全長ＣＰＳＩ ｃＤＮＡの別のクローニング戦略の概略図である。 図８は、ＣＯＳ−７細胞において発現させたＣＰＳＩタンパク質の代謝活性のグラフ描写である。 図９は、ＣＰＳＩ ｃＤＮＡにおけるイントロンのサイズと位置のグラフ式表現である。 図１０は、ここで開示される主題の代表的オリゴヌクレオチドプライマーの位置を示しているエキソン３６（配列番号：５）の図である。 図１１は、T１４０５ ＣＰＳＩ（配列番号：４）のアミノ酸配列を示しており（終止コドンは“Ｘ”として翻訳されており、１６５０４９ＭＷ、１．１６３６０２ｅ＋０７ＣＮ）、開始アミノ酸のメチオニンは、ａ−１の位置と考えられる。 図１２は、Ｎ１４０５ ＣＰＳＩ（配列番号：２）のアミノ酸配列を示しており（終止コドンは“Ｘ”として翻訳されており、１６５０６２ＭＷ、１．１６１６３４ｅ＋０７ＣＮ）、開始アミノ酸のメチオニンは、ａ−１の位置と考えられる。 図１３は、血漿アルギニン濃度の濃度曲線のグラフである。 図１４は、４８時間の実験期間を通じて、シトルリン対プラシーボ（Ｐ＝０．５３、多変量ＡＮＣＯＶＡ）を与えられた患者間で、平均血圧は有意な差がないことを示したプロットである。平均＋/−ＳＤは、処理、及びプラシーボグループに対して示されている。 図１５は、平均血清シトルリン濃度は、手術直後、及び手術１２時間後（Ｐ＝０．０１２、Ｐ＝０．０１５）にバイパスした後にシトルリンを与えられた患者において有意に高く、一方、シトルリン濃度は、プラシーボを与えられた患者において、手術直後、及び手術１２時間後（Ｐ＝０．０２０、Ｐ＝０．００１）にバイパスした後の基準から有意に低くなっていることを示した棒グラフである。 図１６は、平均血清アルギニン濃度が、手術１２時間後（Ｐ＝０．０３７）にバイパスした後にシトルリンを与えられていた患者よりも明らかに高く、一方、アルギニン濃度は、手術１２時間後（Ｐ＜０．００１）にバイパスした後にプラシーボを与えられた患者において、基準から明らかに低くなっていることを示した棒グラフである。

Claims (33)

1. 対象の次善尿素回路機能に起因する、一酸化窒素産生低下の治療、又は予防方法であっ
   て、それを必要とする対象に、治療的有効量の一酸化窒素前駆体を投与することを含み、
   それによって次善尿素回路機能に起因する、一酸化窒素産生低下の治療、又は予防を達成
   する、前記方法。
2. 前記投与が経静脈的、又は経口的である、請求項１記載の方法。
3. 前記次善最適尿素回路機能が、尿素回路中間体の産生低下を含む、請求項１記載の方法
   。
4. 前記対象が、尿素回路中間体の産生低下に関連した疾患に苦しむか、又は前記対象が、
   尿素回路中間体の産生低下に関連した環境刺激に曝されるか、若しくは曝される直前であ
   る、請求項１記載の方法。
5. 前記疾患が、肝炎、肝硬変、肺高血圧症、壊死性腸炎（NEC）、急性呼吸促迫症候群、
   民族特異的内皮機能不全、勃起障害、骨髄移植を受けた対象における骨髄移植毒性、敗血
   症、喘息、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項４記載の方法。
6. 前記環境刺激が、化学療法、心臓手術、増加された酸化ストレス、骨髄移植、敗血性シ
   ョック、急性喘息、低酸素状態、肝臓毒汚染、及びこれらの組合せからなる群から選択さ
   れる、請求項４記載の方法。
7. 前記一酸化窒素前駆体が、シトルリン、アルギニン、及びこれらの組合せからなる群か
   ら選択される、請求項１記載の方法。
8. 前記一酸化窒素前駆体が、約１００ｍｇから約３０，０００ｍｇの範囲の投与量で投与
   される、請求項１記載の方法。
9. 前記一酸化窒素前駆体が、約２５０ｍｇから約１，０００ｍｇの範囲の投与量で投与さ
   れる、請求項８記載の方法。
10. 前記対象がヒトである、請求項１記載の方法。
11. 骨髄移植された対象における骨髄移植毒性の治療、又は予防方法であって、該対象に治
    療的有効量の一酸化窒素前駆体を経静脈的に、又は経口的に投与することを含み、それに
    よって該対象の骨髄移植毒性が、治療、又は予防される、前記方法。
12. 前記投与が経静脈的、又は経口的である、請求項１１記載の方法。
13. 前記一酸化窒素前駆体が、シトルリン、アルギニン、及びこれらの組合せからなる群か
    ら選択される、請求項１１記載の方法。
14. 前記一酸化窒素前駆体が、約１００ｍｇから約３０，０００ｍｇの範囲の投与量で投与
    される、請求項１１記載の方法。
15. 前記一酸化窒素前駆体が、約２５０ｍｇから約１，０００ｍｇの範囲の投与量で投与さ
    れる、請求項１４記載の方法。
16. 前記骨髄移植毒性が、肝内性肝静脈閉塞症、及び/又は急性肺損傷を含む、請求項１１
    記載の方法。
17. 前記対象がヒトである、請求項１１記載の方法。
18. 対象において、肝炎、肝硬変、肺高血圧症、壊死性腸炎（NEC）、急性呼吸促迫症候群
    、民族特異的内皮機能不全、勃起障害、喘息、及びこれらの組合せからなる群から選択さ
    れる疾患の治療、又は予防方法であって、それを必要とする対象に、治療的有効量の一酸
    化窒素前駆体を投与することを含む、前記方法。
19. 前記投与が経静脈的、又は経口的である、請求項１８記載の方法。
20. 前記一酸化窒素前駆体が、シトルリン、アルギニン、及びこれらの組合せからなる群か
    ら選択される、請求項１８記載の方法。
21. 前記一酸化窒素前駆体が、約１００ｍｇから約３０，０００ｍｇの範囲の投与量で投与
    される、請求項１８記載の方法。
22. 前記一酸化窒素前駆体が、約２５０ｍｇから約１，０００ｍｇの範囲の投与量で投与さ
    れる、請求項２１記載の方法。
23. 前記対象がヒトである、請求項１８記載の方法。
24. 前記疾患が壊死性腸炎（NEC）であり、かつ前記対象が早産児である、請求項１８記載
    の方法。
25. 硝酸前駆体濃度を上昇させる方法であって、それを必要とする対象に、治療的有効量の
    一酸化窒素前駆体を投与することを含み、それによって該対象における一酸化窒素前駆体
    の濃度が上がることを含む、前記方法。
26. 前記投与が経静脈的、又は経口的である、請求項２５記載の方法。
27. 前記一酸化窒素前駆体が、シトルリン、アルギニン、及びそれらの組み合わせからなる
    群から選択される、請求項２５記載の方法。
28. 前記一酸化窒素前駆体が、約１００ｍｇから約３０，０００ｍｇの範囲の投与量で投与
    される、請求項２５記載の方法。
29. 前記一酸化窒素前駆体が、約２５０ｍｇから約１，０００ｍｇの範囲の投与量で投与さ
    れる、請求項２８記載の方法。
30. 医薬として許容し得るキャリアーと、治療的有効量の一酸化窒素前駆体とを含む医薬組
    成物であって、経静脈、又は経口投与用に適合させた、前記医薬組成物。
31. 前記一酸化窒素前駆体が、シトルリン、アルギニン、及びこれらの組合せからなる群か
    ら選択される、請求項３０記載の医薬組成物。
32. 前記一酸化窒素前駆体が、約１００ｍｇから約３０，０００ｍｇの範囲の投与量で存在
    する、請求項３０記載の医薬組成物。
33. 前記一酸化窒素前駆体が、約２５０ｍｇから約１，０００ｍｇの範囲の投与量で投与さ
    れる、請求項３２記載の医薬組成物。

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