MXPA06009468A - Metodos terapeuticos que emplean precursores de oxido nitrico - Google Patents

Abstract

Se usan moléculas aisladas de polinucleótidos y péptidos codificados por estas moléculas en el análisis de fenotipos humanos de carbamil-fosfato-sintetasaI, asícomo en aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas, con relación a un polimorfismo humano de carbamil-fosfato-sintetasa I, al analizar el ADN genómico o ADN genómico amplificado, o ADNc amplificado derivado de ARNm, es posible tipificar una carbamil-fosfato-sintetasa I humana con respecto al polimorfismo humano de carbamil-fosfato-sintetasa I, por ejemplo, en el contexto de diagnosis del tratamiento de enfermedad veno-oclusiva hepática (HVOD) asociada con trasplantes de médulaósea.

Description

MÉTODOS TERAPÉUTICOS QUE EMPLEAN PRECURSORES DE OXIDO NÍTRICO Campo de la Invención La materia actualmente descrita se refiere a moléculas aisladas de polinucleótidos, útiles para analizar fenotipos de carbamil-fosfato-sintetasa I, a péptidos codificados por estas moléculas, y a los usos terapéuticos y de diagnóstico de los mismos que se relacionan al recién identificado polimorfismo de carbamil-fosfato-sintetasa I. Entre estos usos están los métodos para determinar la susceptibilidad de un sujeto a hiperamonemia, producción disminuida de arginina y a toxicidad de trasplante de médula ósea en base a un análisis de una muestra de ácido nucleico aislada de biopsias de tejido del sujeto. Tabla- de abreviaciones AGB - Gas (es) de sangre arterial ALI - Lesión pulmonar aguda ASO - Oligonucleótido especifico de alelo ATP - Adenosina-trifosfato BCAA - Aminoácido (s) de cadena ramificada BMT - Trasplante de médula ósea BSA - Albúmina de suero bovino BuCy - Busulfan, ciclofosfamida BUN - Nitrógeno de urea sanguínea REF:175217 CBVP16 - Ciclofosfamida, bis-cloroetilnitrosourea, etopósido ce - Centímetros cúbicos CPSI - Carbamil-fosfato-sintetasa I CTC - Ciclofosfamida, tiotepa, carboplatina CVP16TBI - Ciclofosfamida, etopósido, irradiación corporal total ECMO - Oxigenación de membrana extracorporal fl - Longitud completa GSHosc - Glutationa-sintetasa HAT - Hipoxantina, aminopterina, timidina HVOD - Enfermedad veno-oclusiva hepática ÍNO - Óxido nítrico inhalado KDa - Kilodalton KLH - He ocianina de lapa I - Litro LAT - Traducción activada por ligación LCR - Reacción en cadena de ligasa MAS - Síndrome de aspiración de meconio NAG - n-acetil-glutamato NASDA*01 - Amplificación basada en secuencia de ácido nucleico NO o NOx - Óxido nítrico NOS - Óxido nitrico-sintetasa o/c - Ornitina/citrulina PBSCT - Trasplante de células madre de sangre periférica PPHN - Hipertensión pulmonar persistente en neonatos PCR - Reacción en cadena de polimerasa RCR - Reacción en cadena de reparación RDS - Síndrome de esfuerzo respiratorio REF - Huella distintiva de endonucleasa de restricción RT - Transcriptasa invertida SSCP - Polimorfismo de conformación de hebra individual SDA - Activación de desplazamiento de hebra SNP - Polimorfismo de nucleótido individual TC - Tiotepa, ciclofosfamida TEAA - Aminoácidos esenciales totales UC - Ciclo de urea UCF - Función de ciclo de urea VPA - Ácido valproico Antecedentes de la Invención La ruta de síntesis in vivo para arginina comienza con ornitina. La ornitina se combina con carbamil-fosfato para producir citrulina, que a su vez se combina con aspartato, en la presencia de adenosina-trifosfato (ATP) , para producir argininosuccinato. En el paso final, el fumarato se divide de argininosuccinato, para producir arginina. La ruta degradativa para arginina es por la acción hidrolitica de arginasa, para producir ornitina y urea. Estas reacciones forman el ciclo de urea. El ciclo de urea sirve como la ruta primaria para remover el nitrógeno de desecho producido por el metabolismo de proteínas endógenas y exógenas, y se muestra esquemáticamente en la Figura 1. La interrupción de los procesos metabólicos es un efecto secundario frecuente de la quimioterapia. En realidad, los agentes usados en la quimioterapia de alta dosis afectan varios procesos celulares. Los procesos metabólicos localizados en los tejidos quimio-sensibles, tal como el higado y tracto gastrointestinal, afrontan un riesgo particularmente grande de interrupción. El vuelco constante y el procesamiento constante de nitrógeno comprende todos los tejidos en el cuerpo, pero los primeros pasos críticos del ciclo de urea se limitan al higado e intestino. La quimioterapia de alta dosis asociada con trasplante de médula ósea (BMT) interfiere con la fusión hepática y es tóxica al intestino. La hiperamonemia idiopática, que es sugerente de la disfunción del ciclo de urea, se ha reportado que está asociada con alta mortalidad en pacientes que se someten a trasplante de médula ósea. Davies et al., Bone Marrow Transplantation, 17:1119-1125 (1996); Tse et al., American Journal of Hematology, 38:140-141 (1991); y Mitchell et al., American Journal of Medicine, 85:662-667 (1988) . Una complicación común de la BMT es la enfermedad veno-oclusiva hepática (HVOD) . La HVOD se asocia con ictericia, tamaño incrementado del higado e interrupción del flujo sanguíneo hepático normal. La HVOD se presenta entre aproximadamente 20 a 40% de los pacientes y está asociada con morbilidad y mortalidad severa. El óxido nítrico (NO) juega un papel en la regulación del tono vascular y el mantenimiento de la abertura de vénulas hepáticas y pulmonares después de la quimioterapia de alta dosis. La función intacta del ciclo de urea es importante no sólo para la expresión de amoniaco, sino para el mantenimiento de niveles adecuados en tejido de arginina, el precursor de NO. La carbamil-fosfato-sintetasa I (CPSI) es la enzima limitadora de la velocidad que cataliza el primer paso comprometido de la ureagénesis mediante el ciclo de urea. La CPSI es altamente especifica al tejido, con función y producción sustancialmente limitada a higado e intestinos.

Genómicamente codificada, la CPSI se produce en el citoplasma y se transporta a la mitocondria donde se escinde a su forma monomérica madura de 160 kD. La enzima combina amoniaco y bicarbonato para formar carbamilo con el gasto de las dos moléculas de ATP y el uso del co-factor N-acetil-glutamato (NAG) . Cualquier predisposición genética a una función disminuida del ciclo de urea conducirá a hiperamonemia y probablemente contribuirá a la severidad de los trastornos asociados con función sub-óptima del ciclo de urea, incluyendo toxicidad relacionada a BMT. De esta manera, existe una necesidad en la técnica de caracterización de los alelos presentes en poblaciones que sufren de trastornos asociados con función sub-óptima del ciclo de urea, que sufren de BMT u otra exposición contraria a hepatotoxinas ambientales o farmacológicas . En vista del papel de la CPSI en el ciclo de urea, existe una necesidad particular de caracterización de los alelos de CPSI presentes en estas poblaciones. Breve Descripción de la Invención Se describe un método para detectar la susceptibilidad a la función sub-óptima del ciclo de urea en un sujeto. El método comprende los pasos de: (a) obtener una muestra de ácido nucleico del sujeto; y (b) detectar un polimorfismo de un gen de carbamil-fosfato-sintasa I (CPSI) en la muestra de ácido nucleico del sujeto, la presencia del polimorfismo que indica que la susceptibilidad del sujeto a la función sub-óptima del ciclo de urea. De acuerdo con la materia actualmente descrita, se proporciona de manera particular la detección del polimorfismo, con respecto a la determinación de la susceptibilidad de un sujeto a toxicidad de trasplante de médula ósea. En algunas modalidades, del polipéptido de carbamil-fosfato-sintetasa comprende una transversión C a A en el exón 36 del gen de CPSI, y en algunas modalidades en el nucleótido 4340 de un ADNc que corresponde al gen de CPSI. En algunas modalidades, la transversión de C a A en el nucleótido 4340 del ADNc que corresponde al gen de CPSI comprende además un cambio en el código de triplete desde AAC a ACC, que codifica para un polipéptido de CPSI que tiene una porción de treonina en el aminoácidos 1405. La materia actualmente descrita también proporciona un polipéptido de CPSI, aislado y purificado, biológicamente activo. En algunas modalidades, un polipéptido de la materia actualmente descrita es un polipéptido recombinante. En algunas modalidades, un polipéptido de la materia actualmente descrita comprende CPSI humana que tiene una porción de asparagina en el aminoácidos 1405. La materia actualmente descrita también proporciona un polinucleótido aislado y purificado que codifica para un polipéptido de CPSI biológicamente activo. En algunas modalidades, un polinucleótido de la materia actualmente descrita comprende una molécula de ADN de un humano. En algunas modalidades, un polinucleótido de la materia actualmente descrita comprende un ADNc que corresponde al gen de CPSI y que incluye una transversión de C a A en el nucleótido 4340. En algunas modalidades, un nucleótido de la materia actualmente descrita comprende además un ADNc que corresponde al gen de CPSI que incluye un cambio en el código de triplete desde ACC a AAC en el nucleótido 4340, y codifica para un polipéptido de CPSI que tiene una porción de asparagina en el aminoácidos 1405. También se describen en la presente equipos y reactivos que incluyen oligonucleótidos, sondas de ácido nucleico y anticuerpos adecuados para el uso en llevar a cabo los métodos de la materia actualmente descrita y para el uso en la detección de los polipéptidos y polinucleótidos de la materia actualmente descrita. También se describen en la presente métodos para preparar los polinucleótidos y polipéptidos de la materia actualmente descrita. En algunas modalidades, la materia actualmente descrita se refiere -a métodos terapéuticos basados en un polimorfismo de un gen de carbamil-fosfato-sintasa I (CPSI) como se describe en la presente. Estos métodos terapéuticos incluyen la administración de precursores de óxido nítrico en el tratamiento y profilaxis de trastornos mediados o modulados por función sub-óptima del ciclo de urea (por ejemplo, toxicidad de trasplante de médula ósea) y planteamientos de terapia génica que usan un polinucleótido aislado y purificado de la materia actualmente descrita. Por lo tanto, es un objeto de la materia actualmente descrita proporcionar moléculas de polinucleótidos que se puedan usar en el análisis de carbamil-fosfato-sintetasa I (CPSI) en sujetos vertebrados. También es un objeto de la materia actualmente descrita proporcionar la determinación del fenotipo de CPSI en sujetos vertebrados y particularmente sujetos humanos, en base a la información obtenida a través del análisis de ácidos nucleicos, incluyendo ADN genómico y ADNc, derivados de tejidos del sujeto. Es aún otro objeto de la materia actualmente descrita proporcionar una técnica expedita para determinar el fenotipo de CPSI. Es aún un objeto adicional de la materia actualmente descrita proporcionar -moléculas de polipéptidos y polinucleótidos para el uso en la generación de anticuerpos que distinguen entre las diferentes formas de CPSI que constituyen el polimorfismo de CPSI. Es aún un objeto adicional de la materia actualmente descrita proporcionar métodos para diagnosticar y tratar síndromes clínicos relacionados a, y asociados con, el polimorfismo de CPSI. Alguno de los objetos de la materia actualmente descrita se han señalado anteriormente en la presente, otros objetos llegarán a ser evidentes conforme prosiga la descripción, cuando se tome en unión con las figuras anexas y los ejemplos como se describe mejor más adelante' en la presente . Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es una vista esquemática del ciclo de urea; La Figura 2 es una vista esquemática de la proteina de CPSI de consenso que no refleja las mutaciones reconocidas; La Figura 3 es una vista esquemática de la proteina de CPSI de consenso que representa varias mutaciones conocidas en la proteina y que representa el polimorfismo T1405N de la materia actualmente descrita. La Figura 4 es una vista esquemática de la modificación post-transcripcional reconocida de CPSI; La Figura 5 es una vista esquemática del sitio genómico humano para CPSI; La Figura 6 es una vista esquemática de una estrategia de clonación para un ADNc de longitud completa de CPSI; La Figura 7 es una vista esquemática de una estrategia de clonación alternativa para un ADNc de longitud completa de CPSI; La Figura 8 es una representación gráfica de la actividad metabólica de la proteina de CPSI expresada en células COS-7; La Figura 9 es una presentación gráfica del tamaño y posición de los intrones en el ADNc de CPSI; La Figura 10 es un diagrama del exón 36 (SEQ ID NO: ) que muestra las ubicaciones de los cebadores representativos de oligonucleótidos de la materia actualmente descrita; La Figura 11 presente la secuencia de aminoácidos de T1405 CPSI (SEQ ID NO: 4) (codón finalizador traducido como X", 165049 MW, 1.163602e+07 CN) , con el aminoácido inicial, metionina, considerado que está en una posición -1; La Figura 12 presenta la secuencia de aminoácidos de N1405 CPSI (SEQ ID NO: 2) (codón finalizador traducido como "X", 165062 MW, 1.161634E+07 CN) , con el aminoácido inicial metionina considerado que está en una posición -1; La Figura 13 es una gráfica de una curva de concentración de los niveles plasmáticos de arginina. La Figura 14 es una gráfica que muestra que la presión sanguínea media no difiere significativamente entre pacientes que reciben citrulina versus placebo (P = 0.53, ANCOVA multivariable) a todo lo largo del periodo de estudio de 48 horas. Se muestran media +/- SD para los grupos de tratamiento y de placebo. La Figura 15 es una gráfica de barras que muestra que los niveles medios en suero de citrulina fueron significativamente mayores en pacientes que reciben citrulina después de la derivación tanto inmediatamente después del máximo como a las 12 horas después del máximo (P = 0.012, p = 0.015), en tanto que las concentraciones de citrulina cayeron significativamente desde la linea base después de la derivación desde inmediatamente después del máximo y a las 12 horas después del máximo en pacientes que reciben placebo (P = 0.020, P = 0.001) . La Figura 16 es una gráfica de barras que muestra que los niveles medios en suero de arginina fueron significativamente mayores en pacientes que reciben citrulina después de la derivación por 12 horas después del máximo (P = 0.037), en tanto que las concentraciones de arginina cayeron significativamente desde la linea base en pacientes que reciben placebo después de la derivación por 12 horas después del máximo (p < 0.001). Descripción Detallada de la Invención Se describe"- en la presente el descubrimiento sorprendente de un polimorfismo de carbamil-fosfato-sintetasa I (CPSI) , la enzima que cataliza el primer paso limitante de la velocidad' del ciclo de urea. De manera particular, el polimorfismo se caracteriza por una sustitución de aminoácidos, treonina/asparagina en el aminoácido 1405 (heterocigosidad = .44) en CPSI . También se describe en la presente la observación sorprendente que un cambio de nucleótido individual en el gen de CPSI es responsable del polimorfismo de CPSI. De manera particular, una transversión de C a A con el exón 36 en el gen de CPSI cambia el código de triplete desde ACC a AAC y conduce al cambio de T1405N en el polipéptido codificado de CPSI. En vista de estos descubrimientos, se puede efectuar -la manipulación de las moléculas de ácido nucleico derivadas de los tejidos de sujetos vertebrados para proporcionar el análisis de los fenotipos de CPSI, para la generación de péptidos codificados por estas moléculas de ácido nucleico, y para la diagnosis y métodos terapéuticos que se relacionan al polimorfismo de CPSI. Se pueden amplificar las moléculas de ácido nucleico utilizadas en estos contextos, como se describe más adelante, e incluyen en general ARN, ADN genómico y ADNc derivado de ARN. A. Consideraciones Generales La mayoría de la información estructural actualmente disponible de la CPSI se deriva de estudios de la enzima de CPSI de rata. La enzima de CPSI de rata y la enzima de CPSI de humano comprenden cada una un polipéptido individual de 1,500 residuos y exhiben aproximadamente 95% de identidad de secuencia. La información de la secuencia de ácido nucleico y polipéptido de CPSI de rata se describe por Nyunoya, H., et al., Journal of Biological Chemistry 260:9346-9356 (1985) y en GENBANK® números de acceso AH005315, M12335, M12328, M12327, M12326, M12325, M12324, M12323, M12322, M12321, M12320, M12319, M12318 y M11710, incorporados en la presente como referencia. La información estructural acerca de CPSI de rata se deriva de la homología de secuencia y de los estudios de unión a sustrato y co-factor; sin embargo, no están disponibles los datos cristalográficos.

La CPSI madura es de naturaleza modular, que contiene 2 regiones principales. La primera región, residuos 39-406, es homologa a la subunidad pequeña de la CPS heterodimérica de Escherichia coli . La información de la secuencia de ácido nucleico y el polipéptido de CPSI de levadura y bacteria se describe en GENBANK® números de acceso AB005063, X67573, M27174, P07258, P03965, BAA21088, SYBYCP, SYBYCS, y SYECCS, incorporados en la presente como referencia. La otra región, residuos 417-1500 (referidos más adelante en la presente como el "dominio CPS") , es homólogo a la subunidad grande de CPS de E. coli . Meister, A., Adv. Enzymol . Relat . Áreas Mol . Biol . 62:315-374 (1989). Esta subunidad es responsable de la síntesis de carbamil-fosfato a partir de amoniaco y de la unión de los sustratos y co-factores. Meister, A., Adv. Enzymol . Relat . Áreas Mol . Biol . 62:315-374 (1989). El dominio CPS surge por la duplicación génica y la fusión en tándem en el pro-genoma, y, como se representa esquemáticamente en la Figura 2, se compone por si mismo de dos dominios de fosforilación y un dominio regulador C-terminal comprendido en la unión de n-acetil-glutamato (NAG) . Nyunoya, H., et al., Journal of Biological Chemistry 260:9346-9356 (1985). Como se representa esquemáticamente en la Figura 2, los residuos 407-416 actúan como un puente entre las dos subestructuras principales y los residuos 1-38 constituyen el péptido guia que dirige la CPSI inmadura a la mitocondria antes de ser removida. Continuando con la Figura 2, la región tipo subunidad pequeña está compuesta de dos subdo inios aproximadamente iguales. El subdominio de interacción, residuos 39-212 corresponde a la región que, en la subunidad pequeña de la CPS de E. coli, es necesaria para la asociación con la subunidad grande. El subdominio de glutaminasa, residuos 213-406, es homólogo a varias glutamina-amidotransferasas y a la región de CPSI que cuando se generó libre de otros componentes se exhibió con considerable actividad de glutaminasa, como se describe por Guillou, F. , et al. Proc. Nati Acad Sci 86:8304-8308 (1989); Nyunoya, H., et al., Journal of Biological Chemistry 260:9346-9356 (1985); y Guy H. I. Et al., Journal of Biological Chemistry 270:2190-2197 (1995) . Puesto que CPSI tiene perdido el residuo de cisteina necesario para dividir glutamina, la función del subdominio de glutaminasa es incierta en esta enzima. El dominio CPS (que corresponde a la subunidad grande en E. coli) se cree que cataliza la síntesis de carbamil-fosfato a partir de amoniaco, de acuerdo a la reacción: 2 ATP + bicarbonato + ? 2 ADP + fosfato + amoniaco carbamil-fosfato Como se muestra esquemáticamente en las Figuras 1 y 2, esta reacción comprende tres pasos: fosforilación de bicarbonato por una molécula de ATP que se designa en la presente como ATPñ, dando carboxifosfato; síntesis de carbamato a partir de carboxifosfato y amoniaco; y fosforilación de carbamato por otro molécula de ATP (ATPB) , dando carbamil-fosfato, como se describe por Rubio, V. y Grisolia, S., Enzyma 26:233-239 (1981). Como se muestra esquemáticamente en la Figura 4, el dominio de CPS parece haber surgido por duplicación y fusión en tándem del componente duplicado; por lo tanto, sus mitades amino- y COOH-terminales son homologas, como se describe por Nyunoya, H., et al., Journal of Biological Chemistry 260:9346-9356 (1985) . Cada mitad homologa comprende un dominio amino- y COOH-terminal de aproximadamente 40 y 20 kD, respectivamente, de lo cual el dominio de 40 kD de la mitad amino se cree que está comprendido en la fosforilación de bicarbonato (dominio de fosforilación de bicarbonato, residuos 417-788) (Figura 2) . El dominio correspondiente en la mitad COOH está comprendido en la fosforilación de carbamato mediante el dominio de fosforilación de carbamato, residuos 969-1329 (Figura 2) , como se describe por Alonso, E. y Rubio, V., European Journal of Biochemistry 229:377-384 (1995). Estos dominios de fosforilación son homólogos a biotina-carboxilasa (Toh, H. et al., European Journal of Biochemistry 215:687-696 (1993)), una enzima de estructura tridimensional conocida que fosforila bicarbonato así como DD- ligasa y glutationa-sintetasa (GSHasa) , dos enzimas que catalizan reacciones análogas (Artymiuk, P. J. et al., Nature Struct . Biol . . 3:128-132 (1996)). De esta manera, la información en estas enzimas es útil en la interpretación de las mutaciones encontradas en los dominios homólogos en los pacientes con deficiencia de CPSI. Con referencia nuevamente a la Figura 2, de los dominios de 20-kDa de la región tipo subunidad grande, permanece por ser establecida la función del dominio de la mitad amino-terminal, residuos 789-968. En contraste del dominio COOH-terminal correspondiente, residuos 1330-1500, se llama el dominio alostérico, debido a que el activador, n-acetil-glutamato (NAG) de CPSI y los efectores de nucleótido de la enzima de E. coli , UMP e IMP, se unen en este dominio, como se describe por Rodriguez-Aparicio, L. B. et al., Biochemistry 28:3070-3074 (1989) y Cervera, J. et al., Biochemistry 35:7247-7255 (1996). A.l. Procesamiento de Enzimas El ARNm de CPSI de humano codifica para una pre-proteína de 1500 aminoácidos de 165 kD. El término amino de este precursor contiene 38 residuos, incluyendo 8 residuos básicos, y 1 residuo ácido con una secuencia de Pro-Gly, 4 residuos antes del inicio de la enzima madura (Nyunoya, H. et al., ' Journal' of Biological Chemistry 260:9346-9356 (1985); Lagace, M. et al., Journal of Biological Chemistry 262:10415- 10418 (1987) . Esta secuencia de señal altamente conservada promueve la entrada de la enzima en la matriz mitocondrial, donde entonces se remueve para producir la enzima madura de 160 kD. A. 2. Expresión Normal de CPSI. Primero se detecta la actividad enzimática de CPSI en hígado fetal humano a las 5-10 semanas de gestación (Moorman, A. F. et al. Histochemical Journal 22:457-468 (1990) ) . A las 20 semanas de gestación, el nivel de CPSI alcanza aproximadamente 50% del nivel normal de adulto,,. "'donde permanece hasta. el nacimiento, después de lo cual se incrementa gradualmente a los niveles de adulto por los 20 años de edad (Raiha, N. C. R. y Suihkonen, J. Acta Paediatrica Scand 57:121-127 (1968)). Esencialmente, se limita al hígado la expresión en tejido de CPSI, con cantidades traza de actividad en el intestino y el riñon. "Cuando el hígado desarrolla su estructura acinar madura en la edad adulta, la CPSI se divide en compartimientos en las células parenquimales alrededor de las vénulas portales terminales (Moorman, A. F. et al. Histochemical Journal 22:457-468 (1990)). Además de su división en compartimientos, se conocen varios factores que son importantes en la regulación de la actividad y expresión de CPSI. Por ejemplo, niveles bajos o ausentes de ornitina disminuye la actividad de CPSI, presumiblemente debido a un efecto inhibidor de carbamoil- fosfatasa (CP) acumulada como se describe por Jackson, M. J. et al., Annual Review of Genetics 20:431-464 (1986); y Rubio, V., Biochemical Society Transactions 21:198-202 (1993)). Los niveles tanto de ARNm de CPSI como de la enzima se incrementan con una dieta de alto contenido de proteína, y en respuesta a glucagón y glucocorticoides (Jackson, M. J. et al., Annual Review of Genetics 20:431-464 (1986); de Groot, C. J. , et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 124:882-888 (1984)). En tejido hepático normal no estimulado que se ha examinado, se ha observado una abundancia de ARNm de CPSI. B. Técnicas de Detección De acuerdo con la materia actualmente descrita, se proporciona un método para detectar la susceptibilidad a función sub-óptima del ciclo de urea que da por resultado la depuración disminuida de amoniaco y la producción disminuida de arginina. El método comprende: (a) obtener una muestra de ácido nucleico del sujeto; y (b) detectar un polimorfismo de un gen de carbamil-fosfato-sintasa I (CPSI) en la muestra de ácido nucleico del sujeto, la presencia del polimorfismo que indica que la susceptibilidad del sujeto a la función subóptima del ciclo de urea que da por resultado depuración disminuida de amoniaco y producción disminuida de arginina. De acuerdo con la materia actualmente descrita, la detección del polimorfismo se proporciona de manera particular con respecto a la determinación de la susceptibilidad de un sujeto a toxicidad de trasplante de médula ósea. Además se señala que el polimorfismo de la materia actualmente descrita se puede usar para predecir la toxicidad en varias condiciones más allá de la administración de ácido valproico o BMT como se describe en la presente y en los ejemplos. El polimorfismo también está implicado en la mediación o modulación de depuración interrumpida de amoniaco y producción interrumpida de arginina en situaciones tal como cirrosis hepática de adulto, otras toxicidades por medicamentos, neonatos con función hepática dañada, y similares . Como se usa en la presente y en las reivindicaciones, el término "polimorfismo" se refiere a la ocurrencia de dos o más secuencias o alelos alternativos, genéticamente determinados, en una población. Un marcador polimórfico es el sitio en el cual se presenta la divergencia. Los marcadores de ejemplo tienen al menos dos alelos, cada uno que se presenta a una frecuencia de más de 1%. Un sitio polimórfico puede ser tan pequeño como un par de bases. Las moléculas de ácido nucleico útiles, de acuerdo con la materia actualmente descrita incluyen aquellas que hibridizarán específicamente a las secuencias de CPSI en la región de la transversión de C a A en la base 4340 y dentro del exón 36 cambiando el código de triplete desde ACC a AAC. Esta transversión conduce al cambio de T1405N en el polipéptido codificado de CPSI . Típicamente, estos son de al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud y tienen la secuencias de nucleótidos que corresponde a la región de la transversión de C a A en la base 4340 de la secuencia de ADNc de CPSI de consenso (EC6.3.4.16) , que cambia el código del triplete desde ACC a AAC. El término "secuencia de consenso", como se usa en la presente, se propone para referirse a una secuencia de proteína o ácido nucleico para CSPI, el ácido nucleico o los aminoácidos de la cual se conoce que se presentan con alta frecuencia de una población de individuos quienes tienen el gen que codifica para una proteína de funcionamiento normal, o ácido nucleico que por sí mismo tiene función normal. Las moléculas de ácido nucleico proporcionadas se pueden marcar de acuerdo a cualquier técnica conocida en la técnica, tal como con radiomarca, marcas fluorescentes, marcas enzimáticas. De acuerdo con otro aspecto de la materia actualmente descrita, las moléculas de ácido nucleico contiene la transversión de C a A en la base 4340. Estas moléculas se pueden usar como sondas de oligonucleótido específicas del alelo para seguir una mutación particular, por ejemplo, a través de una familia de sujetos. Se pueden probar muestras corporales para determinar si el gen de CPSI contiene la transversión de C a A en la base 4340. Las muestras corporales adecuadas para probar incluyen aquellas que comprenden ADN, ARN o proteína obtenida de biopsias, incluyendo biopsias de tejido hepático e intestinal; o de sangre, prenatal; o tejidos embriónicos, a manera de ejemplo. En algunas modalidades de la materia actualmente descrita, se proporciona un par de cebadores aislados de oligonucleótido: 5' -AGCTGTTTGCCACGGAAGCC-3' (SEQ ID NO: 6) y 5'-CCCAGCCTCTCTTCCATCAGAAAGTAAG-3' (SEQ ID NO: 7). Estos cebadores se derivan del exón 36 de CPSI (la ubicación del polimorfismo de la materia actualmente descrita) y las secuencias intrónicas relacionadas (SEQ ID NO: 5) y producen un fragmento de 119 pares de base. Otros cebadores derivados del exón 36 de CPSI (la ubicación del polimorfismo de la materia actualmente descrita) y las secuencias intrónicas relacionadas (SEQ ID NO: 5) se proporcionan en SEQ ID NOs: 8-10, en la Figura 10, y en el ejemplo 2 (SEQ ID NOs: 15 y 16) . Los cebadores de oligonucleótidos son útiles en la diagnosis de un sujeto en riesgo de hiperamonemia tal como puede resultar como una complicación de BMT o toxicidad. Los cebadores dirigen la amplificación de un polinucleótido objetivo antes de la secuenciación. Se diseñaron estos cebadores de oligonucleótido de exón 36 de CPSI, únicos, y se produjeron en base a la identificación de la transversión de C a A en el exón 36. En algunas modalidades de la materia actualmente descrita, se proporcionan oligonucleótidos específicos de alelo, aislados. También se proporcionan secuencias sustancialmente similares a los mismos, de acuerdo con la materia actualmente descrita. Los oligonucleótidos específicos de alelo son útiles en la diagnosis de un sujeto en riesgo de hiperamonemia, tal como pueda resultar como una toxicidad o complicación de BMT. Estos cebadores de oligonucleótido del exón 36 de CPSI, únicos, se diseñaron y produjeron en base a la identificación de la transversión de C a A en el exón 36. Los términos "sustancialmente complementario a" o "sustancialmente la secuencia de" se refieren a las secuencias que hibridizan a las secuencias proporcionadas (por ejemplo, SEQ ID NOs: 5-10) bajo condiciones severas y/o secuencias que tienen suficiente homología con cualquiera de SEQ ID NOs: 5-10, tal que los oligonucleótidos específicos de alelo de la materia actualmente descrita hibridizan a la secuencia. El término "aislado" como se usa en la presente incluye oligonucleótidos sustancialmente libres de otros ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los cuales puedan estar asociados, esta asociación que es ya sea de materia celular o en un medio de síntesis. Un "polinucleótido objetivo" o "ácido nucleico objetivo" se refiere a la secuencia de ácido nucleico de interés por ejemplo un polinucleótido que codifica para CPSI . Otros cebadores que se pueden usar para la hibridación por cebadores son fácilmente averiguables para aquellos expertos en la técnica en base a la descripción en la presente del polimorfismo de CPSI. Los cebadores de la materia actualmente descrita abarcan oligonucleótidos de suficiente longitud y secuencia apropiada para proporcionar inicio de polimerización en un número significativo de ácidos nucleicos en el sitio polimórfico. El sitio de CPSI se representa esquemáticamente en la Figura 5. Específicamente, el término "cebador" como se usa en la presente se refiere a una secuencia que comprende en algunas modalidades, dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, en algunas modalidades más de tres, y en algunas modalidades más de ocho, y en algunas modalidades al menos 20 nucleótidos del gen de CPSI en donde la secuencia de ADN contiene la transversión de C a A en la base 4340 con relación a CPSI contenida en SEQ ID NOs: 1 y 3. El alelo que incluye citosina (C) en la base 4340 con relación a CPSI se refiere en la presente como el "alelo de CPSIa", el "alelo T1405", o el "alelo de codificación de treonina". El alelo que incluye adenosina (A) en la base 4340 con relación a CPSI se refiere en la presente como el "alelo de CPSIb", el "alelo N1405", o el "alelo de codificación de arginina". Un oligonucleótido que distingue entre los alelos de CPSIa y CPSIb del gen de CPSI, en donde el oligonucleótido hibridiza a una porción del gen de CPSI que incluye el nucleótido 4340 del ADNc que corresponde al gen de CPSI cuando el nucleótido 4340 es adenosina, pero no hibridiza con esa porción del gen de CPSI cuando el nucleótido 4340 es citosina también se proporciona de acuerdo con la materia actualmente descrita. Un oligonucleótido que distingue entre los alelos de CPSIa y CPSIb del gen de CPSI, en donde el oligonucleótido hibridiza a una porción del gen de CPSI que incluye el nucleótido ~?340 del ADNc que corresponde al gen de CPSI cuando el ñucle.ótido 4340 es citosina, pero no hibridiza con esa porción del gen de CPSI cuando el nucleótido 4340 es adenosina también se proporciona de acuerdo con la materia actualmente descrita. Estos oligonucleótidos son en algunas modalidades de entre diez y treinta bases de longitud. Estos oligonucleótidos pueden comprender además opcionalmente una marca detectable . Las condiciones ambientales conducentes a la síntesis incluyen la presencia de trifosfatos de nucleósidos y un agente para la polimerización, tal como ADN-polimerasa, y una temperatura adecuada y pH adecuado. En algunas modalidades, el cebador es de hebra individual para máxima eficiencia en la amplificación, pero puede ser de doble hebra. Si es de doble hebra, el cebador se trata primero para separar sus hebras antes de ser usado para preparar los productos de extensión. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de extensión en la presencia del agente inductor para la polimerización. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, incluyendo temperatura, amortiguador, y composición de nucleótido. El cebador de oligonucleótido contiene típicamente 12-20 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos . Los cebadores de la -"materia actualmente descrita se designan que son "sustancialmente" complementarios a cada hebra del sitio genómico que se va a amplificar. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios para hibridizarse con sus hebras respectivas bajo condiciones que permitan que el agente realice la polimerización. En otras palabras, los cebadores deben tener suficiente complementariedad con las secuencias en 5' y 3' que flanquean la transversión para hibridizarse con ésta y permitir la amplificación del sitio genómico. Los cebadores de oligonucleótidos de la materia actualmente descrita se emplean en el método de amplificación que es una reacción en cadena, enzimática, que produce cantidades exponenciales del sitio polimórfico con relación al número de pasos de reacción comprendidos. Típicamente, un cebador es complementario a la hebra negativa (-) del sitio polimórfico y el otro es complementario a la hebra positiva (+) . La alineación de los cebadores a ácido nucleico desnaturalizado seguido por extensión con una enzima, tal como el fragmento grande de ADN-polimerasa I (Klenow) y nucleófidos, da por resultado las hebras + y recién sintetizadas que contienen la secuencia del sitio polimórfico objetivo. Debido a que estas secuencias recién sintetizadas también son plantillas, los* ciclos repetidos de desnaturalización, fijación de cebadores, y extensión, dan por resultado la producción exponencial de la región (es decir, la secuencia del sitio polimórfico objetivo) definida por los cebadores. El producto de la reacción en cadena es un dúplex discreto de ácido nucleico con términos que corresponden a los extremos de los cebadores específicos empleados. Los cebadores de oligonucleótido de la materia actualmente descrita se pueden preparar usando cualquier método adecuado, tal como métodos convencionales de fosfotriéster y fosfodiéster o modalidades automatizadas de los mismos. En algunas de estas modalidades automatizadas, se usan dietilfosforamiditas como materiales de inicio y se pueden sintetizar como se describe por Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22:1859-1862 (1981). En la patente de los Estados Unidos Número 4,458,066 se describe un método para sintetizar oligonucleótidos en un soporte sólido modificado. Se puede utilizar cualquier espécimen de ácido nucleico, en forma purificada o no purificada, como que el ácido o ácidos nucleicos de inicio, con la condición que contenga, o se sospeche que contiene, una secuencia de ácido nucleico que contiene el sitio polimórfico. De esta manera, el método para amplificar, por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo ARN mensajero, en donde el ADN o ARN pueden ser de hebra individual o de doble hebra. En el caso que el ARN que se va a usar como una plantilla, se utilizarán enzimas y/o condiciones óptimas para transcribir de forma invertida la plantilla al ADN. Además, se puede utilizar un híbrido de ADN-ARN que contiene una hebra de cada uno. También se puede emplear una mezcla de ácidos nucleicos, o también se pueden utilizar los ácidos nucleicos producidos en una reacción anterior de amplificación en la presente, usando los mismos o diferentes cebadores. La secuencia específica de ácido nucleico que se va a amplificar, es decir, el sitio polimórfico, puede ser una fracción de una molécula más grande o puede estar presente de manera inicial como una molécula discreta, de modo que la secuencia específica constituye el ácido nucleico completo. No es necesario que la secuencia se amplifique para estar presente inicialmente en una forma pura; puede ser una fracción menor de una mezcla compleja, tal como contenida en ADN humano completo. El ADN utilizado en la presente se puede extraer de una muestra corporal, tal como sangre, material de tejido (en algunas modalidades tejido hepático) , y similares por una variedad de técnicas tal como se describe por Maniatis et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y., p 280-281 (1982). Si la muestra extraída es impura, se puede tratar antes de la amplificación con una cantidad de un reactivo efectiva para abrir las células, o membranas celulares de animales de la muestra, y exponer y/o separar las hebras de los ácidos nucleicos. El paso de desnaturalización de ácido nucleico y lisis para exponer y separar las hebras permitirá que se presente mucho más fácilmente la amplificación. Los trifosfatos de desoxirribonucleótidos dATP, dCTP, dGPT, y dTTP se adicionan a la mezcla de síntesis, ya sea de manera separada o junto con los cebadores, en cantidades adecuadas y la solución resultante se calienta a aproximadamente 90-100 °C desde aproximadamente 1 a 10 minutos, en algunas modalidades de 1 a 4 minutos. Después de este periodo de calentamiento, la solución se deja enfriar para permitir la hibridación de los cebadores. A la mezcla enfriada se adiciona un agente apropiado para efectuar la reacción de extensión a los cebadores (llamada en la presente "agente para polimerización") , y la reacción se deja presentar bajo condiciones conocidas en la técnica. El agente para la polimerización también se puede adicionar junto con los otros reactivos si es estable al calor. Esta 'reacción de síntesis (o amplificación) puede presentarse a temperatura ambiente hasta a una temperatura por arriba de la cual no funciona por más tiempo el agente para polimerización. De esta manera, por ejemplo, si se usa ADN-polimerasa como el agente, la temperatura en general no será mayor de aproximadamente 40 °C. De manera más conveniente, la reacción puede presentarse a temperatura ambiente. El agente para polimerización puede ser cualquier compuesto o sistema que funcionará para lograr la síntesis de los productos de extensión de cebadores, incluyendo enzimas. Las enzimas adecuadas para este propósito incluyen, por ejemplo, ADN-polimerasa I de E. coli , fragmento Klenow de ADN-polimerasa de E. coli , muteínas de polimerasa, transcriptasa invertida, otras enzimas, incluyendo enzimas estables al calor (es decir, aquellas enzimas que realizan la extensión de cebadores después de ser sometidas a temperaturas suficientemente elevadas para provocar la desnaturalización) , tal como Tag-polimerasa. La enzima adecuada facilitará la combinación de los nucleótidos de la manera apropiada para formar los productos de extensión de cebadores que son complementarios a cada hebra de ácido nucleico del sitio polimórfico. En general, la síntesis se iniciará en el extremo 3' de cada cebador y proseguirá en la dirección 5' a lo largo de la hebra de la plantilla, hasta que termina la síntesis, produciendo moléculas de diferentes longitudes. La hebra recién sintetizada y su hebra de ácido nucleico complementaria formará una molécula de doble hebra bajo condiciones de hibridación descritas anteriormente y este híbrido se usa en los pasos subsiguientes del método. En el siguiente paso, se somete la molécula de doble hebra, recién sintetizada, a condiciones de desnaturalización usando cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente para proporcionar moléculas de hebra individual. Los pasos de desnaturalización, fijación, y síntesis de producto por extensión, se puede repetir tan frecuentemente como sea necesario para amplificar la secuencia de ácido nucleico del sitio polimórfico objetivo al grado necesario para la detección. La cantidad de la secuencia de ácido nucleico específica producida se acumulará de una manera exponencial. PCR. A Practical Approach, ILR Press, Eds. McPherson et al. (1992). Los productos de amplificación se pueden detectar por análisis de transferencia Southern con o sin el uso de sondas radioactivas. En este método, por ejemplo, una pequeña muestra de ADN que contiene un nivel muy bajo de la secuencia de ácido nucleico del sitio polimórfico, se amplifica, y analiza mediante técnica de transferencia Southern o de manera similar, usando análisis de transferencia de punto. El uso de sondas no radioactivas, o marcas, se facilita por el alto nivel de la señal amplificada. De manera alternativa, las sondas usadas para detectar los productos amplificados pueden ser marcadas de manera directa o indirectamente detectables, por ejemplo, con un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelador metálico o una enzima. Aquellos expertos en la técnica conocerán otras marcas adecuadas para la unión a la sonda, o serán capaces de averiguar esto, usando experimentación de rutina. Adicionalmente, las secuencias amplificadas por los métodos de la materia actualmente descrita se pueden evaluar, detectar, clonar, secuenciar y similares, ya sea en solución o después de la unión a un soporte sólido, por cualquier método usualmente aplicado a la detección de una secuencia específica de ADN tal como secuenciación de didesoxi, PCR, restricción por oligómero (Saiki et al., Bio/Technology 3:1008-1012 (1985) , análisis con sonda de oligonucleótido especifico de alelo (ASO) (Conner et al., Proc. Nati . Acad. Sci . E. U.A. 80:278 (1983), ensayo de ligación con oligonucleótido (OLA) (Landgren et al., Science 241:1007, 1998), y similares. Se han analizado las técnicas moleculares para análisis de ADN (Landgren et al., Science 242:229-237, 1988). En algunas modalidades, el método de amplificación es por PCR, como se describe en la presente y en las patentes de los Estados Unidos números 4,683,195; 4,683,202; y 4,965,188 cada una de las cuales se incorpora de este modo como referencia; y como se usa comúnmente por aquellos expertos en la técnica. Se han descrito métodos alternativos de amplificación y también se pueden emplear en tanto que .el sitio de CPSI amplificado por PCR usando cebadores de la materia actualmente descrita se amplifican de manera similar por los medios alternativos. Estos sistemas alternativos de amplificación incluyen de manera enunciativa y sin limitación replicación de secuencia auto-sostenida, que empieza con una secuencia corta de ADN de interés y un promotor T7. La transcriptasa invertida copia el ARN en ADNc y degrada el ARN, seguido por transcriptasa invertida que polimeriza una segunda hebra del ADN. Otra técnica de amplificación de ácido nucleico es amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA101) que usa trascripción invertida y T7-ARN-polimerasa e incorporan dos cebadores al objetivo de su esquema cíclico. La amplificación por NASBAMR puede empezar con ya sea ADN o ARN y terminar con cualquiera, y amplifica a aproximadamente 108 copias en el espacio de 60 a 90 minutos. De manera alternativa, se puede amplificar ácido nucleico por trascripción activada por ligación (LAT) . La LAT trabaja de una plantilla de hebra individual con un cebador individual que es parcialmente de hebra individual y parcialmente de doble hebra. La amplificación se inicia al ligar un ADNc al oligonucleótido de promotor y en el espacio de unas pocas horas, la amplificación es de aproximadamente 108 a aproximadamente 109 veces. Se puede utilizar el sistema de replicasa QB al unir una secuencia de ARN llamada MDV-1 al ARN complementario a una secuencia de ADN de interés. Al mezclar como una muestra, el ARN híbrido encuentra su complemento entre los ARNm el espécimen y se une, activando la replicasa para copiar la secuencia de interés a lo largo del indicador. Otra técnicaJ de amplificación de ácido nucleico, la reacción en cadena de ligasa (LCR) , trabaja al usar dos mitades diferentemente " marcadas de una secuencia de interés que están unidas covalentemente por ligasa en la presencia de la secuencia contigua en una muestra, formando un nuevo objetivo. La técnica - de amplificación de ácido nucleico de reacción en cadena de reparación (RCR) usa dos pares de sondas de oligonucleótidos complementarios y específicos del objetivo, polimerasa termoestable y ligasa termoestable, y nucleótido de ADN para amplificar geométricamente las secuencias seleccionadas como objetivo. Una separación de dos bases separa los pares de sondas de oligo, y la RCR rellena y une la separación, imitando la reparación normal de ADN. La amplificación de ácido nucleico por activación de desplazamiento de hebra (SDA) utiliza un cebador corto que contiene un sitio de reconocimiento para Hinc II con una saliente corta en el extremo 5' que se une al ADN objetivo. Una ADN-polimerasa se rellena en la parte del cebador opuesta a la saliente con análogos de adenina que contiene azufre. Se adiciona Hinc II pero sólo corta la hebra no modificada de ADN. Una ADN-polimerasa que carece de actividad de 5' exonucleasa entra en el sitio de la mella y empieza a polimerizar, desplazando la hebra inicial del cebador en la "dirección 3' y construyendo una nueva que sirve como más cebador . La SDA produce una amplificación mayor de aproximadamente 107 veces en 2 horas a 37 °C. Diferente de PCR y LCR, la SDA no requiere un funcionamiento cíclico instrumentado de temperatura. Otro sistema de amplificación útil en el método de la materia actualmente descrita es el sistema replicasa QB. Aunque PCR es un método de- ejemplo de amplificación si la materia actualmente descrita, también se pueden usar otros métodos para amplificar el sitio de CPSI como se describe en el método de la materia actualmente descrita. De esta manera, el término "técnica de amplificación" como se usa en la presente y en las reivindicaciones se propone para abarcar todos los métodos anteriores . En algunas modalidades de la materia actualmente descrita, se proporciona un método para diagnosticar o identificar un sujeto que tiene una predisposición o mayor susceptibilidad a (en riesgo de) hiperamonemia, que comprende secuenciar un ácido nucleico objetivo de una muestra a partir de un sujeto por secuenciación de didesoxi, en algunas modalidades, seguido por amplificación del ácido nucleico o j etivo . En algunas modalidades de la materia actualmente descrita, se proporciona un método para diagnosticar a un sujeto que tiene una predisposición o mayor susceptibilidad a (en riesgo de) hiperamonemia, que comprende poner en contacto un ácido nucleico objetivo de una muestra a partir de un sujeto, con un reactivo que detecta la presencia del polimorfismo de CPSI y que detecta el reactivo. Otro método comprende poner en contacto un' ácido nucleico objetivo de una muestra de un sujeto con un reactivo que detecta la presencia de la transversión de C a A en la base 4340, es decir, dentro del exón 36, y que detecta la transversión. Son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica varios métodos de hibridación. Muchos de los mismos son útiles al llevar a cabo la materia actualmente descrita. La enfermedad veno-oclusiva hepática (HVOD) es una toxicidad común en trasplante de médula ósea (BMT) . Se presentan aproximadamente 20 a 40% de los pacientes que se asocia con morbilidad y mortalidad severa. De acuerdo con la materia actualmente descrita, la frecuencia de ambos alelos de CPSI se probó en un grupo con HVOD y sin HVOD que se somete a BMT en un esfuerzo para identificar la evidencia de desequilibrio. Los resultados indicaron que el polimorfismo de CPSI descrito en la presente afecta la susceptibilidad a una toxicidad por BMT. De esta manera, se proporciona, de acuerdo con la materia actualmente descrita, un método para detectar sujetos con susceptibilidad a toxicidad de BMT, y particularmente a HVOD, mediante la detección del polimorfismo de CPSI. Los materiales para el uso en el método de la materia actualmente descrita son idealmente adecuados para la preparación de un equipo de diagnóstico. Este equipo puede comprender * un medio portador que se divide en compartimientos para recibir en confinamiento cerrado uno o más medios de recipiente, tal como frascos, tubos y similares, cada uno de los medios de recipiente que comprende uno de los elementos separados que se va a usar en el método. Por ejemplo, uno de los medios de recipiente puede comprender un medio para amplificar el ADN de CPSI, el medio que comprende las enzimas necesarias y los cebadores de oligonucleótidos necesarios para amplificar el ADN subjetivo a partir del sujeto. Los cebadores de oligonucleótidos incluyen cebadores que tienen una secuencia seleccionada del grupo que incluye, de manera enunciativa y sin limitación: SEQ ID NOs: 6-10, o secuencias de cebador sustancialmente complementarias o sustancialmente homologas a esto. La secuencia de polinucleótidos en 5' y 3', de flanqueo, objetivos, tienen sustancialmente la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5, y las secuencias sustancialmente complementarias u homologas a esto.

Se conocerán o serán fácilmente averiguables por aquellos expertos en la técnica otros cebadores de oligonucleótidos para amplificar CPSI, dada la descripción de la materia actualmente descrita presentada en la presente. Un equipo de acuerdo con la materia actualmente descrita puede comprender además un reactivo o reactivos para extraer una muestra de ácido nucleico de una muestra biológica obtenida de un sujeto. Se contemplan que estén dentro del alcance de la materia actualmente descrita, cualquiera de los reactivos como será fácilmente evidente para un experto en la técnica. A manera de ejemplo particular, un amortiguador adecuado de lisis para el tejido junto con una suspensión de cuentas de vidrio para capturar la muestra de ácido nucleico y un amortiguador de elusión para eludir la muestra de ácido nucleico de las cuentas de vidrio comprenden reactivos para extraer una muestra de ácido nucleico de una muestra biológica obtenida de un sujeto. Otros ejemplos incluyen equipos comercialmente disponibles, tal como GENOMIC ISOLATION KIT A.S.A.P. (Boehringer Mannheim, Indianápolis, Ind. ) , sistema de aislamiento de ADN genómico (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md. ) , equipo de purificación de ADN ELU-QUIKMR (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.), equipo de extracción de ADN (Stratagene, La Jolla, Calif.), equipo de aislamiento TURBOGEN1^1 (Invitrogen, San Diego, Calif.), y similares. El uso de estos equipos de acuerdo a las instrucciones del fabricante en general es aceptable para la purificación de ADN antes de practicar los métodos de la materia actualmente descrita. C. Definiciones que Afectan el Polinucleótido codificande de CPSI, Purificados y Aislados y Polipéptidos de CPSI Codificados por los Mismos De acuerdo con la materia actualmente descrita, se proporcionan polinucleótidos codificantes de CPSI, purificados y aislados; y polipéptidos de CPSI codificados por los mismos. Un polinucleótido que codifica para CPSI particularmente proporcionado, comprende un polinucleótido que codifica para CPSI que incluye una transversión de C a A en la base 4340, es decir, dentro del exón 36, del gen de CPSI que cambia el código de triplete desde ACC a AAC y conduce al cambio de T1405N en el polipéptido codificado de CPSI. El polipéptido codificado de CPSI que comprende el cambio de T1405N también se proporciona de manera particular. De esta manera, se proporcionan, de acuerdo con la materia actualmente descrita, polinucleótidos variantes alélicos y polipéptidos codificados por los mismos. Además, también se proporciona, de acuerdo con la materia actualmente descrita, un polipéptido de CPSI biológicamente activo, como que es un polinucleótido que codifica para CPSI que codifica para este polipéptido de CPSI. Las actividades biológicas de ejemplo incluyen la actividad biológica para mediar el primer paso del ciclo de urea y la actividad biológica de reticulación con un anticuerpo anti- CPSI. Los polinucleótidos y polipéptidos que codifican para CPSI, proporcionados, tienen amplia utilidad dado el significado biológico del ciclo de urea, como se conoce en la técnica. A manera de ejemplo, son útiles los polinucleótidos y polipéptidos que codifican para CPSI, en la preparación de ensayos de detección y equipos de ensayo que se usan para detectar la presencia de las proteínas y ácidos nucleicos de la materia actualmente descrita en muestras biológicas. Adicionalmente, es bien conocido que los polipéptidos aislados y purificados tienen utilidad como aditivos alimenticios para ganado y de esta manera los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos son útiles en la producción de los polipéptidos. En algunas modalidades, los polipéptidos y polinucleótidos de CPSI, proporcionados, se aislan a partir de fuentes invertebradas y vertebradas. De esta manera, los homólogos de CPSI, incluyendo, de manera enunciativa y sin limitación, homólogos de mamífero, levadura y bacterianos, se proporcionan de acuerdo con la materia actualmente descrita. Los homólogos representativos de mamífero de los miembros de CPSI incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, homólogos de rata y humano. Los términos "producto génico de CPSI", "proteína de CPSI", y "polipéptido de CPSI" se refieren a proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que son sustancialmente idénticas a las secuencias nativas de aminoácidos en la CPSI y que son biológicamente activas ya que son capaces de mediar la síntesis de carbamil-fosfato en el ciclo de urea, o de la reacción cruzada con anticuerpos anti-CPSI formulados contra un polipéptido de CPSI. Los términos "producto génico de CPSI", "proteína de CPSI" y "polipéptido de CPSI" también incluyen análogos de moléculas de CPSI que exhiben al menos alguna actividad biológica en común con productos génicos nativos de CPSI. Adicionalmente, aquellos- expertos en la técnica de la mutagénesis apreciarán que se pueden usar, para construir análogos de CPSI, otros análogos, puesto que como los aún no descubiertos ni descritos. No hay necesidad de que un "producto génico de CPSI", "proteína de CPSI" o "polipéptido de CPSI" comprenda toda, o sustancialmente toda la secuencia de aminoácidos del producto génico nativo de CPSI . Se anticipa que secuencias más cortas o más largas son de uso en la materia actualmente descrita. De esta manera, el término "producto génico de CPSI" también incluye polipéptidos y proteínas de CPSI de fusión o recombinantes. Se describen en la presente métodos para preparar estas proteínas. Los términos "polinucleótido que codifica para CPSI", "gen de CPSI", secuencia de gen de CPSI" y "segmento de gen de CPSI" se refieren a cualquier secuencia de ADN que sea sustancialmente idéntica a una secuencia de polinucleótido que codifique para un producto génico de CPSI, proteína de CPSI o polipéptido de CPSI como se define anteriormente. Los términos también se refieren a ARN, o secuencias antisentido, compatibles con estas secuencias de ADN. Un "polinucleótido que codifica para CPSI", "gen de CPSI", "secuencia de gen de CPSI" y "segmento de gen de CPSI" también pueden comprender cualquier combinación de secuencias de control asociadas. - El término- "sustancialmente idéntico", cuando se usa para definir ya sea un producto génico de CPSI o una secuencia de aminoácidos de CPSI, o un gen de CPSI o secuencia de ácido nucleico de CPSI, significa que una secuencia particular, por ejemplo, una secuencia mutante, varía de la secuencia de una CPSI natural por una o más supresiones, sustituciones, o adiciones, el efecto neto de lo cual es retener al menos algo de actividad biológica de la CPSI. De manera alternativa, las secuencias análogas de ADN son "sustancialmente idénticas" a secuencias de ADN específicas descritas en la presente si: (a) la secuencia análoga de ADN se deriva de regiones de codificación del gen natural del CPSI; o (b) la secuencia análoga de ADN es capaz de hibridación de las secuencias de ADN de (a) bajo condiciones moderadamente severas y que codifica para el producto génico de CPSI biológicamente activo; o (c) las secuencias de ADN son degenerativas como resultado del código genético a las secuencias análogas de ADN definidas en (a) y/o (b) . Las proteínas análogas sustancialmente idénticas serán más que aproximadamente 60% idénticas a la secuencia correspondiente de la proteína nativa. Se considera que son equivalentes secuencias que tienen menos grados de similitud pero comparable a la actividad biológica. Al determinar la secuencia de ácido nucleico, todas las presentes secuencias de ácido nucleico capaces de codificar para secuencias de aminoácidos sustancialmente similares, se considera que son sustancialmente similares a una secuencia de ácido nucleico de referencia, a pesar de las diferencias en las secuencias de los codones . C. 1. Por Ciento de Similitud Por ejemplo, se puede determinar el por ciento de similitud, al comparar la información de secuencia usando un programa de computadora GAP, disponible de la University of Wisconsin Geneticist Computer Group. El programa GAP utiliza el método de alineación de Needleman et al., J. Mol . Biol . 48:443 (1979), como se revisa por Smith et al., Adv. Appl .

Math . 2:482 (1981). De manera concisa, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros representativos por defecto del programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) de nucleótidos y la matriz de comparación ponderada de Gribskov et al., Nucí. Acids . Res . 14:6745 (1986), como se describe por Schwartz et al., eds., Atlas of Protein Seqúense and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 357-358 (1979); (2) una penalidad de 3.0 para cada separación y una penalidad adicional de 0.01 para cada símbolo y cada separación; y (3) ninguna penalidad para separaciones terminales. En los ejemplos se describen otras técnicas de comparación. El término "homología" describe una comparación matemáticamente basada de similitudes de secuencia que se usan para identificar genes o proteínas con funciones o motivos similares. Por consiguiente, el término "homología" es sinónimo con el término "similitud" y "por ciento de similitud" como se define anteriormente. De esta manera, las frases ("homología sustancial" o "similitud sustancial" tienen significados similares. C. 2. Secuencias de Ácido Nucleico En ciertas modalidades, la materia actualmente descrita se refiere al uso de genes de CPSI y productos génicos que incluyen dentro de sus secuencias respectivas, una secuencia que es esencialmente aquella de un gen de CPSI, o la proteina correspondiente. El término "una secuencia esencialmente como aquella de un gen de CPSI", significa que la secuencia corresponde sustancialmente a una porción de un polipéptido de CPSI o polinucleótido que codifica para CPSI y tiene relativamente pocas bases o aminoácidos (ya sea ADN o proteína) que no son idénticos a aquellos de una proteína de CPSI o gen de CPSI, (o un equivalente biológicamente funcional, cuando se refiere a proteínas) . El término "equivalente biológicamente funcional" es bien entendido en la técnica y se describe adicionalmente en detalle en la presente. Por consiguiente, las secuencias que tienen en algunas modalidades entre aproximadamente 70% y aproximadamente 80%, en algunas modalidades entre aproximadamente 81% y aproximadamente 90%, y en algunas modalidades entre aproximadamente 91% y aproximadamente 99%, de aminoácidos que son idénticos o funcionalmente equivalentes a los aminoácidos de una proteína de CPSI o gen de CPSI, serán secuencias que son "esencialmente las mismas". Los productos génicos de CPSI y genes de CPSI que tienen codones funcionalmente equivalentes también se cubren por la materia actualmente descrita. El término "codón funcionalmente equivalente" se usa en la presente para referirse a codones que codifican para el mismo aminoácido, tal como los seis codones para arginina o serina, y también para referirse a codones que codifican para aminoácidos biológicamente equivalentes (ver tabla 1) .

Tabla 1 Tabla del código genético Aminoácidos Codones Alanina Ala A GCA; GCC; GCG; GCU Cisteina Cys C UGC; UGU Ácido aspártico Asp D GAC; GAU Ácido glutámico Glu E GAA; GAG Fenilalanina Phe F UUC; UUU Glicina Gly G GGA; GGC; GGG; GGU Histidina His H CAC; CAU Isoleucina lie I AUA; AUC; AUU Lisina Lys K AAA; AAG Leucina Leu L UUA; UUG; CUA; CUC; CUG; CUU Metionina Met M AUG Asparagina Asn N AAC; AAU Prolina Pro P CCA; CCC; CCG; CCU Glutamina Gln Q CAÁ; CAG Arginina Arg R AGA; AGG; CGA; CGC; CGG; CGU Serina Ser S ACT; AGU; UCA; UCC; UCG; UCU Treonina Thr T ACÁ; ACC; ACG; ACU Valina Val V GUA; GUC; GUG; GUU Triptofano Trp W UGG Tirosina Tyr Y UAC; UAU También se entenderá que las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico pueden incluir residuos adicionales, tal como aminoácidos N o C terminales, adicionales, o secuencias 5' ó 3', y aún ser esencialmente como se expone en una de las secuencias descritas en la presente, en tanto que la secuencia cumpla con los criterios establecidos anteriormente, incluyendo el mantenimiento de la actividad de la proteína biológica donde se relacione la expresión de la proteína. La adición de secuencias terminales aplica particularmente a secuencias de ácido nucleico que pueden incluir, por ejemplo, varias secuencias de no codificación que flanquean cualquiera de las porciones- 5' ó 3' de la región de codificación o pueden incluir varias secuencias internas, es decir, intrones, que se conoce que se presentan dentro de los genes. La materia actualmente descrita también abarca el uso de segmentos de ADN que son complementarios, o esencialmente complementarios, a las secuencias expuestas en la especificación. Las secuencias de ácido nucleico que son "complementarias" son aquellas que son de pares de bases de acuerdo a las reglas normales de complementariedad de Watson-Crick. Como se usa en la presente, el término "secuencias complementarias" significa secuencias de ácido nucleico que son sustancialmente complementarias, como se puede valorar por la misma comparación de nucleótidos expuesta anteriormente, o como se define que son capaces de hibridizar al segmento de ácido nucleico en cuestión bajo condiciones relativamente severas tal como aquellas descritas en la presente. Un ejemplo particular de un segmento contemplado de ácido nucleico complementario es un oligonucleótido antisentido. La hibridación de ácido nucleico se afectará por condiciones tal como la concentración de sal, temperatura, o solventes orgánicos, además de la composición de la base, longitud de las hebras complementarias, y el número de malapareamientos de bases de nucleótidos entre -_los ' ácidos nucleicos de hibridación, como se apreciará fácilmente por aquellos expertos en la técnica. Las condiciones de temperaturas severas incluirán en general temperaturas por encima de 30 °C, típicamente por encima de 37 °C, y en algunas modalidades por encima de 45 °C. Las condiciones severas de sal serán ordinariamente menos de 1000 mM, típicamente menos de 500 mM, y en algunas modalidades menos de 200 mM. Sin embargo, la combinación de parámetros es mucho más importante que la medición de cualquier parámetro individual. (Ver por ejemplo, Wetmur & Davidson, J. Mol . Biol . 31:349-370 (1968)). Las secuencias de sonda también pueden hibridizar de manera específica a ADN dúplex bajo ciertas condiciones para formar triplex u otros complejos de ADN de orden superior. La preparación de estas sondas y las condiciones adecuadas de hibridación son bien conocidas en la técnica.

Como se usa en la presente, el término "segmento de ADN" se refiere a una molécula de ADN que se ha aislado libre el ADN genómico total de una especie particular. Adicionalmente, un segmento de ADN que codifica para un polipéptido de CPSI se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias de' codificación de CPSI, aún se aisla fuera de, o se purifica libre de, el ADN genómico total de una especie fuente, tal como Homo sapiens. Incluidos dentro del término- "segmento de ADN" están los segmentos de ADN y segmentos más pequeños de estos segmentos, y también vectores recombinantes, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus y similares. De manera similar,- un segmento de ADN que comprende un gen purificado o aislado de CPSI se refiere a un segmento de ADN que incluye secuencias de codificación de CPSI aisladas sustancialmente fuera de otros genes o secuencias de codificación de proteínas, que se presentan en forma natural. A este respecto, el término "gen" se usa por simplicidad para referirse a una unidad funcional de codificación de proteína, polipéptido o péptido. Como se entenderá por aquellos expertos en la técnica, este término funcional incluye tanto secuencias genómicas como secuencias de ADNc. "Sustancialmente aislado fuera de otras secuencias de codificación" significa que el gen de interés, en este caso, el gen de CPSI, forma la parte significativa de la región de codificación del segmento de ADN, y que el segmento de ADN no contiene porciones grandes del ADN de codificación que se presenta de forma natural, tal como fragmentos cromosómicos grandes u otros genes funcionales o regiones de codificación de ADNc. Por supuesto, esto se refiere a segmentos de ADN como se aisla originalmente, y no excluye genes o regiones de codificación adicionadas posteriormente al segmento por la mano del hombre. En modalidades particulares, la materia actualmente descrita se refiere a segmentos de ADN aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ADN que codifican para un polipéptido de CPSI que incluye dentro de su secuencia de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 4, 12 y 14. En otras modalidades particulares, la materia actualmente descrita se refiere a segmentos aislados de ADN y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ADN que codifican para una proteína que incluye dentro de su secuencia de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de CPSI que corresponde a tejidos humanos. También se apreciará que la materia actualmente descrita no se limita a las secuencias particulares de ácido nucleico y de aminoácidos de SEQ ID NOS: 1-4 y 11-14. Por lo tanto los vectores recombinantes y los segmentos aislados de ADN incluyen de forma diversa la región de codificación de polipéptido de CPSI, misma, incluyen regiones de codificación que tienen alteraciones o modificaciones seleccionadas en la región básica de codificación, o incluyen polipéptidos codificados, más grandes, que incluyen sin embargo regiones de codificación de polipéptido de CPSI o pueden codificar para proteínas o péptidos equivalentes, biológicamente funcionales, que tienen secuencias variantes de aminoácidos . En ciertos modalidades, la materia actualmente descrita se refiere a segmentos aislados de ADN y vectores recombinantes que codifican para una proteína o péptido que incluye dentro de su secuencia de aminoácidos una secuencia de aminoácidos esencialmente como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS : 2, 4, 12, y 14. De forma natural, donde el segmento de ADN, o vector, codifica para un producto génico de CPSI de longitud completa, la secuencia de ácido nucleico de ejemplo es aquella que es esencialmente como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS : 1, 3, 11, y 13 y que codifica para una proteína que exhibe actividad en el ciclo de urea, como se puede determinar por ejemplo por ensayos colorimétricos para detectar la producción de carbonil-fosfato a partir de amoniaco, como se describe en la presente en el Ejemplo 3. El término "una secuencia esencialmente como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS : 2, 4, 12 y 14" significa que la secuencia corresponde sustancialmente a una porción de una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOS : 2, 4, 12 y 14 y tiene relativamente menos aminoácidos que no son idénticos a, o un equivalente biológicamente funcional de, los aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 4, 12 y 14. El término "equivalente biológicamente funcional" es bien entendido en la técnica y se define además en detalle en la presente. Por consiguiente, las secuencias, que tienen en algunas modalidades entre aproximadamente 70% y aproximadamente 80%, en algunas modalidades entre aproximadamente 81% y aproximadamente 90%, y en algunas modalidades entre aproximadamente 91%- y aproximadamente 99%; de aminoácidos que son idénticos o funcionalmente equivalentes a los aminoácidos en cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 4, 12 y 14, serán secuencias que "una secuencia esencialmente como se expone en SEQ ID NOS: 2, 4, 12 y 14". En modalidades particulares, la materia actualmente descrita se refiere a métodos de terapia génica que usan segmentos aislados de ADN y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ADN que codifican para una proteína que incluye dentro de su secuencia de aminoácidos una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 4, 12 y 14, las secuencias que incluyen SEQ ID NOS: 2, 4, 12 y 14 que se derivan de tejido humano. En otras modalidades particulares, la materia actualmente descrita se refiere a secuencias aisladas de ADN y vectores recombinantes de ADN que incorporan secuencias de ADN que codifican para una proteína que incluye dentro de su secuencia de aminoácidos la secuencia de aminoácidos de la proteína de CPSI de tejido ~ hepático humano . En ciertas modalidades, la materia actualmente descrita se refiere a segmentos aislados de ADN y vectores recombinantes que incluye dentro de su secuencia una secuencia de ácido nucleico esencialmente como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 3, 11, y 13. El término "una secuencia esencialmente como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 3; 11, y 13" se usa en el mismo sentido como se describe anteriormente y significa que la secuencia de ácido nucleico corresponde sustancialmente a una porción de cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 3, -11 y 13, respectivamente, y tiene relativamente menos codones que no son idénticos, o funcionalmente equivalentes, a los codones de cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 3, 11 y 13, respectivamente. Nuevamente, los segmentos de ADN que codifican para productos génicos que exhiben actividad en el ciclo de urea, reactividad cruzada con un anticuerpo anti-CPSI, u otra actividad biológica del producto génico de CPSI, se pueden emplear. El término "codón funcionalmente equivalente" se usa en la presente para referirse a codones que codifican para el mismo aminoácido, tal como los seis codones para arginina o serina, y también para referirse a codones que codifican para aminoácidos biológicamente equivalentes (ver Tabla 1) . Los segmentos de aminoácido de la materia actualmente descrita, a pesar de la longitud de la secuencia de codificación misma, se pueden combinar con otras secuencias de ADN, tal como promotores, intensificadores, señales de poliadenilación, sitios adicionales de enzimas de restricción, múltiples sitios de clonación, otros segmentos de codificación, y similares, tal que puede variar considerablemente su longitud completa. Por lo tanto, se contempla que un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud se puede emplear, con la longitud total que se limita en algunas modalidades por la facilidad de preparación y uso en el protocolo propuesto de ADN recombinante. Por ejemplo, se pueden preparar fragmentos de ácido nucleico que incluyen un tramo corto complementario a la secuencia de ácido nucleico expuesta en cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 3, 11, y 13, respectivamente, tal como aproximadamente 10 nucleótidos, y que son de hasta 10000 ó 5000 pares de base de longitud, con segmentos de 3000 que son preferidos en ciertos casos. También se contempla que son útiles los segmentos de ADN con longitudes totales de aproximadamente 1000, 500, 200, 100 y aproximadamente 50 pares de base de longitud. Los segmentos de ADN de la materia actualmente descrita abarcan proteínas y péptidos de CPSI, equivalentes, biológicamente funcionales. Estas secuencias pueden surgir como una consecuencia de la redundancia de codón y equivalencia funcional que se conoce que se presenta de forma natural dentro de las secuencias de ácido nucleico y las proteínas codificadas de este modo. De manera alternativa, se pueden crear proteínas o péptidos funcionalmente equivalentes mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante, de los cuales se pueden manejar cambios en la estructura de la proteína, en base a consideraciones de las propiedades de los aminoácidos que se intercambian, por ejemplo, sustitución de lie por Leu en los aminoácidos 4 y 5 es SEQ ID NOS: 11-14. Los cambios diseñados por el hombre se pueden introducir a través de la aplicación de técnicas de mutagénesis dirigidas al sitio, por ejemplo, para introducir mejoras a la antigenicidad de la proteína o para probar mutantes de CPSI a fin de examinar la actividad en el ciclo de urea, u otra actividad a nivel molecular. Si se desea, también pueden prepararse proteínas de fusión y péptidos, por ejemplo, donde la región de codificación de CPSI se alinea dentro de la misma unidad de expresión con otras proteínas o péptidos que tienen funciones deseadas, tal como para propósitos de purificación o inmunodetección (por ejemplo, proteínas que se han purificado por cromatografía de afinidad y regiones de codificación de marca enzimática, respectivamente) . Los vectores recombinantes forman aspectos adicionales, importantes de la materia actualmente descrita. Se contemplan vectores particularmente útiles para que sean aquellos en los cuales la porción de codificación del segmento de ADN se coloque bajo el control de un promotor. El promotor puede estar en la forma del promotor que naturalmente está asociado con el gen de CPSI, por ejemplo, en tejidos de mamífero, o se puede obtener al aislar la secuencia de no codificación en 5' localizadas en la dirección 5' del segmento de codificación, o exón, por ejemplo, usando clonación recombinante y/o tecnología de PCR, en unión con las composiciones descritas en la presente. En otras modalidades, se contempla que se obtendrán ciertas ventajas al colocar el segmento de ADN. de codificación bajo el control de un promotor recombinante, o heterólogo.

- Como se usa en la presente, se propone que un promotor recombinante o heterólogo se refiere a un promotor que normalmente no está asociado con un gen de CPSI en su ambiente natural. Estos promotores pueden incluir promotores aislados de células bacterianas, virales, eucarióticas, o de mamífero. De forma natural, será importante emplear un promotor que dirija de forma efectiva la expresión del segmento ADN en el tipo celular elegido para la expresión. El uso del promotor y las combinaciones del tipo celular para la expresión de proteína se conocen en general por aquellos expertos en la técnica de biología molecular, por ejemplo ver, Sambrook et al., 1989, incorporada en la presente como referencia. Los promotores empleados pueden ser constitutivos, o inducibles, y se pueden usar bajo las condiciones apropiadas para dirigir la expresión de alto nivel del segmento introducido de ADN, tal como es ventajoso en la producción a gran escala de proteínas o péptidos recombinantes. Los sistemas promotores apropiados proporcionados para el uso en expresión de alto nivel incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, el promotor de virus de vaccinia y el promotor de baculovirus. En algunas modalidades, la materia actualmente descrita proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido de CPSI que tiene actividad en el ciclo de urea, que reacciona de forma cruzada como un anticuerpo anti-CPSI, u otra actividad biológica de acuerdo con la materia actualmente descrita. En algunas modalidades, un vector de expresión de la materia actualmente descrita comprende un polinucleótido que codifica para un producto génico humano de CPSI. En algunas modalidades, un vector de expresión de la materia actualmente descrita comprende un polinucleótido que purifica para un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 4, 12 y 14. En algunas modalidades, un vector de expresión de la materia actualmente descrita comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de base de nucleótido de cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 3, 11 y 13. En algunas modalidades, un vector de expresión de la materia actualmente descrita comprende un polinucleótido enlazado operativamente a un intensificador-promotor. En algunas modalidades, un vector de expresión de la materia actualmente descrita comprende un polinucleótido operativamente enlazado a un promotor procariótico. De manera alternativa, un vector de expresión de la materia actualmente descrita comprende un polinucleótido operativamente enlazado a un intensificador-promotor que es un promotor eucariótico, y el vector de expresión comprende además una señal de poliadenilación que se coloca 3' del aminoácido carboxi-terminal y dentro de una unidad de trascripción del polipéptido codificado. En algunas modalidades, la materia actualmente descrita proporciona una célula hospedadora recombinante, transfectada con un polinucleótido que codifica para un polipéptido de CPSI que tiene actividad en la modulación del ciclo de urea, que reacciona de forma cruzada con un anticuerpo anti-CPSI, u otra actividad biológica de acuerdo con la materia actualmente descrita. SEQ ID NOS: 1-4 y 11-14 exponen secuencias de nucleótidos y aminoácidos de un vertebrado de ejemplo, un humano. También se proporcionan- por la materia actualmente descrita polinucleótidos homólogos o biológicamente equivalentes y polipéptidos de CPSI encontrados en otros vertebrados, incluyendo rata. También proporcionados por la materia actualmente descrita son los polinucleótidos homólogos o biológicamente equivalentes y polipéptidos de CPSI encontrados en invertebrados, incluyendo bacterias y levaduras . En algunas modalidades, una célula hospedadora recombinante de la materia actualmente descrita se transfecta con el polinucleótido que codifica para el polipéptido humano de CPSI. En algunas modalidades, una célula hospedadora recombinante de la materia actualmente descrita se transfecta con la secuencia de polinucleótido de cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 3, 11, y 13. En algunas modalidades, una_ célula hospedadora de la materia actualmente descrita es una célula hospedadora eucariótica. En algunas modalidades, una célula hospedadora recombinante de la materia actualmente descrita es _ una célula de vertebrado. En algunas modalidades, una célula hospedadora recombinante de la materia actualmente descrita es una célula de mamífero. En otro aspecto, una célula hospedadora recombinante de la materia actualmente descrita es una célula hospedadora procariótica. En algunas modalidades, una célula hospedadora recombinante de la materia actualmente descrita es una célula bacteriana, en algunas modalidades una cepa de Escherichia coli . En algunas modalidades, una célula hospedadora recombinante comprende un polinucleótido bajo el control transcripcional de señales reguladoras funcionales en la célula hospedadora recombinante, en donde las señales reguladoras controlan apropiadamente la expresión de polipéptido de CPSI de una manera para permitir toda la modificación transcripcional y post-transcripcional necesaria. En algunas modalidades, la materia actualmente descrita proporciona un método para preparar un polipéptido de CPSI que comprende transfectar una célula con el polinucleótido que codifica para un polipéptido de CPSI que tiene actividad en el ciclo de urea, que reacciona de forma cruzada con un anticuerpo anti-CPSI, u otra actividad biológica de acuerdo con la materia actualmente descrita, para producir una célula hospedadora transformada; y mantener -1-a célula hospedadora transformada bajo condiciones biológicas suficientes para la expresión del polipéptido. En algunas modalidades, la célula hospedadora transformada es una célula eucariótica. En algunas modalidades, la célula eucariótica es una célula de vertebrado. De manera alternativa, la célula hospedadora es una célula procariótica. En algunas modalidades, la célula procariótica es una célula bacteriana de Escherichia coli . En algunas modalidades, un polinucleótido transfectado en la célula transformada comprende una secuencia de base de nucleótido de cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 3, 11, y 13. SEQ ID NOS: 1-4 y 11-14 exponen secuencias de nucleótidos y aminoácidos para un vertebrado de ejemplo, un humano. También proporcionados por la materia actualmente descrita están polinucleótidos de CPSI, homólogos o biológicamente equivalentes, y polipéptidos encontrados en otros vertebrados, particularmente vertebrados de sangre caliente, y de manera más particular rata. También proporcionados por la materia actualmente descrita son los polinucleótidos homólogos o biológicamente equivalente y polipéptidos de CPSI encontrados en invertebrados, incluyendo 'bacterias y levadura. Como se menciona anteriormente, en unión con la" expresión, modalidades para preparar proteínas y péptidos recombinantes de CPSI, se contempla que se usarán más frecuent-eméhte segmentos de ADN " más largos, en algunas modalidades, segmentos de ADN que codifican para la proteína completa de CPSI o dominios funcionales o productos de escisión de los mismos. Sin embargo, se apreciará que el .uso en segmentos más cortos de ADN para dirigir la expresión de péptidos de CPSI o regiones de núcleo epitópico, tal como se uede usar para generar anticuerpos anti-CPSI, también cae dentro del alcance de la materia actualmente descrita. Los segmentos de ADN que codifican para antígenos peptídicos, en algunas modalidades, de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, y en algunas modalidades de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos de longitud se contempla que son particularmente útiles. Los segmentos de ADN que codifican para péptidos tendrán en general una longitud mínima de codificación en el orden de aproximadamente 45 a aproximadamente 150, o a aproximadamente 90 nucleótidos. Los segmentos de ADN que codifican para proteína de longitud completa pueden tener una longitud codificante mínima en el orden de aproximadamente 4500 a aproximadamente 4600 nucleótidos para una proteína de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NOs: 2, 4, 12 y 14. Naturalmente, la materia actualmente descrita también abarca segmentos de ADN que son complementarios, o •esencialmente complementarios, a las secuencias expuestas en cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 3, 11 y 13. Los términos "complementario" y "esencialmente complementario" se definen anteriormente. Exceptuando las regiones intrónicas o flanqueadoras, los detalles de las cuales se describen gráficamente en la Figura 9, y permitiendo la degeneración del código genético, las secuencias que tienen en algunas modalidades entre aproximadamente 70% y aproximadamente 80%, en algunas modalidades entre aproximadamente 81% y aproximadamente 90% y en algunas modalidades entre aproximadamente 91% y aproximadamente 99%; los nucleótidos de los cuales son idénticos o funcionalmente equivalentes (es decir, que codifica para el mismo aminoácido) de nucleótidos en cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 3, 11 y 13 serán secuencias que son "una secuencia esencialmente como se expone en cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 3, 11, y 13". Las secuencias que son esencialmente las mismas como aquellas expuestas en cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 3, 11, y 13 también se pueden definir de manera funcional como secuencias que son capaces de hibridizar a un segmento de ácido nucleico que contiene el complemento en cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 3, 11, y 13 bajo condiciones relativamente severas. Las condiciones adecuadas de hibridación relativamente severas se describen en la presente y serán bien conocidas por aquellos expertos en la técnica C. 2. Equivalentes Biológicamente Funcionales Como se menciona anteriormente, se pueden hacer modificaciones y cambios en la estructura de las proteínas y péptidos de CPSI descritos en la presente y obtener aún una molécula que tiene características similares o de otro modo deseables. Por ejemplo, se pueden sustituir ciertos aminoácidos por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin pérdida apreciable de capacidad interactiva con estructuras tal como por ejemplo, en el núcleo de una célula. Puesto que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define la actividad funcional biológica de esa proteína, se pueden hacer ciertas sustituciones de secuencias de aminoácidos en una secuencia de proteína (o, por supuesto, su secuencia codificante de ADN fundamental) y obtener sin embargo una proteína con propiedades similares o aún compensatorias (por ejemplo, antagonista versus agonista) . De esta manera, se contempla por los solicitantes que se pueden hacer varios cambios en la secuencia de las proteínas y péptidos de CPSI (o ADN subyacente) sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. También se entenderá por la persona experta que, inherente en la definición de una proteína o péptido, equivalente, biológicamente funcional, es el concepto que hay un límite al número de cambios que se puede hacer dentro de una porción definida de la molécula y aún dar por resultado una molécula con un nivel aceptable de actividad biológica equivalente. De esta manera se definen en la presente péptidos equivalentes, ~ biológicamente funcionales, como aquellos péptidos en los cuales se pueden sustituir ciertos aminoácidos, no la mayoría ni todos. Por supuesto, una pluralidad de distintas proteínas/péptidos con diferentes sustituciones se puede hacer fácilmente y usar de acuerdo con la materia actualmente descrita. También es bien entendido que se muestra que son particularmente importante ciertos residuos a las propiedades biológicas estructurales de una proteína o péptido, por ejemplo, residuos en sitios activos, estos residuos no se pueden intercambiar en general. Éste es el caso en la materia actualmente descrita, donde si cualquier cambio, por ejemplo, en los dominios de fosforilación de un polipéptido de CPSI, puede dar por resultado una pérdida de un aspecto de la utilidad del péptido resultante para la materia actualmente descrita.

Las sustituciones de aminoácidos, tal como aquellas que se puedan emplear en la modificación de las proteínas y péptidos de CPSI descritos en la presente, se basan en general en la similitud relativa de los sustituyentes de aminoácidos de la cadena lateral, por ejemplo, su hidrofobicidad, carga, tamaño y similar. Un análisis de tamaño, forma y tipo de los sustituyentes de aminoácidos de cadena lateral revela que arginina, lisina e histidina son todos residuos positivamente cargados; que alanina, glicina y serina son todos de un tamaño similar; y que fenilalanina, triptofano y tirosina tienen todos una forma en general similar. Por lo tanto, en base a estas consideraciones, arginina, lisina e histidina; alanina, glicina y serina; y fenilalanina, triptofano y tirosina; se definen en la presente como equivalentes biológicamente funcionales. Al hacer estos cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos . Se ha asignado a cada aminoácido un índice hidropático en base a su hidrofobicidad y características de carga, estos son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8), cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptofano (-0.9); tirosina (- 1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5).

La importancia del índice hidropático de aminoácidos en conferir función biológica interactiva en una proteína se entiende en general en la técnica (Kyte & Doolittle, J. Mol . Biol . 157:105-132 (1982), incorporada en la presente como referencia) . Se conoce que se pueden sustituir ciertos aminoácidos por otros aminoácidos que tienen una puntuación o índice hidropático similar y retienen aún una actividad biológica similar. La sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están en algunas modalidades dentro de ±2 del valor original, en algunas modalidades dentro de ±1 del valor original, •' y en algunas modalidades dentro de ±0.5 del valor Original se puede emplear al hacer cambios en base al índice hidropático. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede hacer de forma efectiva en base a la hidrofilicidad. La patente de los Estados Unidos número 4,554,101, incorporada en la presente como referencia, señala que la hidrofilicidad promedio local más grande de una proteína, como se gobierna por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica • de la proteína. Se entiende que se puede sustituir un aminoácido por otro que tiene un valor similar de hidrofilicidad y aún obtener una proteína biológicamente equivalente.

Como se detalla en la patente de los Estados Unidos número 4,554,101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0±1); glutamato (+3.0+1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0) ; treonina (-0.4); prolina (-0.5±1); alanina. (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptofano (-3.4). La sustitución de aminoácidos cuyos valores de. hidrofilicidad están en algunas modalidades dentro de ±2 del valor original, en algunas modalidades dentro de ±1 del valor original, y en algunas modalidades dentro de ±0.5 del valor original se pueden emplear para hacer cambios en base a los valores similares de hidrofilicidad. En tanto que el análisis se ha enfocado en polipéptidos funcionalmente equivalentes que surgen de cambios de aminoácidos, se apreciará que estos cambios se pueden efectuar por alteración del ADN codificante, tomando en consideración también que se degenera el código genético y que dos o más codones se pueden codificar para el mismo aminoácido. C. 3. Técnicas de Modificación de Secuencia Se pueden llevar a cabo modificaciones a las proteínas y péptidos de CPSI, descritos en la presente, usando técnicas tal como mutagénesis dirigida al sitio. La mutagénesis específica del sitio es una técnica útil en la preparación de péptidos individuales, o proteínas o péptidos equivalentes biológicamente funcionales, a través de mutagénesis específica del ADN subyacente. La técnica proporciona además una capacidad disponible para preparar y probar variantes de secuencia, por ejemplo, incorporando uno o más de las consideraciones anteriores, al introducir uno o más cambios de la secuencia de nucleótidos en el AD . La mutagénesis específica del sitio permite la producción de mutantes a través del uso de secuencias de oligonucleótidos especificas que codifican para la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia de cebador de tamaño suficiente y complejidad suficiente de secuencia para formar un dúplex estable en ambos lados del empalme de supresión que se cambia. Típicamente, se puede emplear un cebador en algunas modalidades de aproximadamente 17 a 30 nucleótidos de longitud, con aproximadamente 5 a 10 residuos en ambos lados del empalme de la secuencia que se altera. En general, la técnica de mutagénesis específica del sitio es bien conocida en la técnica como se ejemplifica por publicaciones (por ejemplo, Adelman et al., 1983). Como se apreciará, la técnica emplea típicamente un vector de fago que existe tanto en la forma de hebra individual como de doble hebra. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida al sitio incluyen vectores tal como el fago M13 (Messing et al., 1981). Estos fagos están fácilmente disponibles de manera comercial y su uso se conoce en general por aquellos expertos en la técnica. Los plásmidos de doble hebra también se emplean rutinariamente en la mutagénesis dirigida al sitio lo que elimina el paso de transferir el gen de interés de un plásmido a un fago. - En general, la mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con la presente se realiza al obtener primero un vector de hebra individual o fusionar aparte las dos hebras de ' un vector de doble hebra que incluye dentro de su secuencia, una secuencia de ADN que codifica para, por ejemplo, un polipéptido humano de CPSI. Un cebador de oligonucleótido que tiene la secuencia mutada, deseada, se prepara, en general de manera sintética, por ejemplo por el método de Crea et al. (1978). Este cebador entonces se fija con el vector de hebra individual, se somete a enzimas polimerizantes de ADN tal como el fragmento Klenow de- polimerasa I de E. coli, a fin de terminar la síntesis de la hebra que tiene la mutación. De esta manera, se forma un heterodúplex en donde una hebra codifica para la secuencia original o mutada y la segunda hebra tiene la mutación deseada. Este vector de heterodúplex entonces se usa para transformar células apropiadas, tal como células de E. coli, y se seleccionan clones que incluyen vectores recombinantes que tienen el arreglo de la secuencia mutada . La preparación de las variantes de secuencia del gen seleccionada usando mutagénesis dirigida al sitio se proporciona como un medio para producir polipéptido de CPSI potencialmente útil u otras especies que tienen actividad en el ciclo de urea y no se propone para limitar estas otras maneras en las cuales se pueden obtener variantes -de secuencia de estos péptidos. (Por ejemplo, los vectores recombinantes que codifican para los genes deseados se pueden tratar por agentes mutagénicos para obtener variantes de secuencia (ver, por ejemplo, un método descrito por Eichenlaub, 1979) para la mutagénesis de ADN de plásmido usando hidroxilamina. C. 4. Otros Equivalentes Estructurales Además de los compuestos de peptidilo de CPSI descritos en la presente, los inventores también contemplan que se pueden formular otros compuestos estéricamente similares para imitar las porciones clave de la estructura peptídica. Estos compuestos se pueden usar de la misma manera como los péptidos dé la materia actualmente descrita por lo tanto también son equivalentes funcionales . La generación de un equivalente funcional estructural se puede lograr por las técnicas de modelado y diseño químico conocidas por aquellos expertos en la técnica. Se entenderá que todas estas construcciones estéricamente similares caen dentro del alcance de la materia actualmente descrita. - D. Introducción de Productos Génicos Donde se emplee el gen mismo para introducir los productos génicos, un método conveniente de introducción será a través del uso de un vector recombinante que incorpora al gen deseado, junto con sus secuencias de control asociadas. La preparación de vectores recombinantes es bien conocida por aquellos expertos en la técnica y se describe en muchas referencias, tal como por ejemplo Sambrook et al. (1989), específicamente incorporado en la presente como referencia. En los vectores, se entiende que las secuencias codificantes de ADN se van a expresar, en el caso de aquéllas que codifiquen para los productos génicos de CPSI, se colocan adyacentes a y bajo el control de un promotor. Se entiende en la técnica que para poner a una secuencia codificante bajo el control de este promotor, en general se coloca el extremo 5' del sitio de inicio de trascripción del cuadro de lectura transcripcional del producto génico que se va a expresar entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nucleótidos "en dirección 3' " de (es decir, 3' de) el promotor elegido. Se puede desear también incorporar en la unidad transcripcional del vector un sitio apropiado de poliadenilación (por ejemplo, 5' -AATAAA-3' ) , si no estuvo contenido dentro del ADN insertado, original. Típicamente, estos sitios de poli A- adición se colocan aproximadamente 30 a 2000 nucleótidos "en dirección 3'" de la secuencia codificante en una posición antes de la terminación de trascripción. En tanto que se puede emplear el uso de las secuencias de- control del gen específico (es decir, un promotor de CPSI para un gen de CPSI) , no hay razón por la que no se puedan emplear otras secuencias de control, en tanto que sean compatibles con el genotipo de la célula que se trata. De esta manera, se puede hacer mención de otros promotores útiles a manera de ejemplo, que incluye, por ejemplo, un promotor anticipado de SV40, un promotor de repetición terminal larga de retrovirus, un promotor de actina, un promotor de choque térmico, un promotor de metalotioneina, y similares. Como se conoce en la técnica, un promotor es una región de una molécula de ADN típicamente dentro de aproximadamente 100 pares de nucleótidos en frente de (en dirección 5' de) el punto en el cual empieza la trascripción (es decir, un sitio de inicio de trascripción) . Esa región contiene típicamente varios tipos de elementos de secuencia de ADN que se localizan en posiciones relativas similares en diferentes genes. Como se usa en la presente, el término "promotor" incluye lo que se refiere en la técnica como una región promotora en dirección 5' , una región promotora o un promotor de una unidad de trascripción de ARN-polimerasa II, eucariótica, generalizada.

Otro tipo de elemento discreto de trascripción de secuencia reguladora es un intensificador. Un intensificador proporciona especificidad de tiempo, ubicación y nivel de expresión para una región codificante particular (por ejemplo, gen) . Una función principal de un intensificador es incrementar el nivel de trascripción de una secuencia codificante en una célula que contiene uno o más factores de trascripción que se unen a este intensificador. Diferente de un promotor, un intensificador puede funcionar cuando se coloque en distancias variables desde los sitios de inicio de trascripción en tanto que esté presente un promotor. Como se usa en la presente, la frase "intensificador-promotor" significa una "unidad compuesta que contiene tanto elementos intensificadores como promotores. Un intensificador-promotor está enlazado operativamente a una región de codificación que codifica para al menos un producto génico. Como se usa en la presente, la frase "operativamente enlazado" significa que un intensificador-promotor se conecta a una secuencia codificante de una manera tal que la trascripción de esa secuencia codificante se controla y regula por ese intensificador-promotor. Son bien conocidos en la técnica los medios para enlazar operativamente un intensificador-promotor a una secuencia codificante. Como también se conoce en la técnica, la orientación y ubicación precisa con relación a una secuencia codificante cuya trascripción se controla, es dependiente inter alia de la naturaleza específica del intensificador-promotor. En esta manera, un promotor mínimo, de la secuencia TATA se localiza típicamente desde aproximadamente 25 a aproximadamente 30 pares de base en dirección 5' de un sitio de inicio de trascripción y un elemento promotor en dirección 5' se localiza típicamente desde aproximadamente 100 a aproximadamente 200 pares de base en dirección 5' de un sitio de inicio de trascripción. En contraste, se puede localizar un intensificador en dirección 3' del sitio de inicio y puede estar a una distancia considerable de ese sitio. Un intensificador-promotor usado en una construcción de vector de la materia actualmente descrita puede ser cualquier intensificador-promotor que active la expresión en una célula que se va a transformar. Al emplear un intensificador-promotor con propiedades bien conocidas, se puede optimizar el nivel y patrón de la expresión del producto génico. Para la introducción de, por ejemplo, el gen humano de CPSI que incluye variantes alélicas del mismo, se propone que será deseable emplear una construcción de vector que distribuya el gen deseado a las células afectadas. Esto por supuesto requerirá en general que la construcción se distribuya a las células buscadas, por ejemplo, células hepáticas de mamífero. Se propone que esto se pueda lograr en algunas modalidades por introducción del gen deseado a través del uso de un vector viral para transportar la secuencia de CPSI para infectar de manera eficiente las células. Estos vectores pueden ser en algunas modalidades un vector adenoviral, retroviral o viral de vaccinia, o un virus adeno- asociado. Estos vectores se prefieren debido a que se han usado exitosamente para distribuir secuencias deseadas a células y tienden a tener alta eficiencia de infección. Las construcciones adecuadas de vector-gen de CPSI se adaptan para la administración como composiciones farmacéuticas, como se describe más adelante en la presente. -Lo's promotores virales comúnmente usados para vectores de expresión se derivan de polioma, citomegalovirus, Adenovirus 2, y Virus Simiesco 40 (SV40) . Los promotores anticipado y retrasado del virus SV40 son particularmente útiles debido a que se obtienen ambos fácilmente a partir del virus como un fragmento que también contiene el origen viral de replicación de SV40. También se puede usar fragmentos más grandes o más pequeños de' SV40, con la condición que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio Bgl I localizado en el origen viral de replicación. Adicionalmente, también es posible, y frecuentemente deseable, utilizar las secuencias promotoras o de control normalmente asociadas con la secuencia génica deseada, con la condición que estas secuencias de control sean compatibles con los sistemas de las células hospedadoras . El origen de replicación se puede proporcionar ya sea por construcción del vector para incluir un origen exógeno," tal como se puede derivar de una fuente de SV40 u otra fuente viral (por ejemplo, Polioma, Adeno, VSV, BPV) , o se puede proporcionar por el mecanismo de replicación cromosómíca de la célula hospedadora. Si el vector se integra en el cromosoma de la célula hospedadora, este último frecuentemente es suficiente. Donde se emplea un gen de CPSI mismo será más conveniente usar simplemente de" forma directa un gen de CPSI tipo silvestre. De esta manera, el gen de CPSI puede comprender el alelo codificante* de treonina tal que el aminoácidos 1405 del polipéptido codificado comprende treonina. De manera alternativa, el gen de CPSI comprende el alelo codificante de arginina tal que el aminoácido 1405 del polipéptido codificado comprende arginina. Adicionalmente, se contempla que se pueden emplear ciertas regiones de un gen de CPSI de forma exclusiva sin emplear un gen de CPSI completo tipo silvestre o una variante alélica completa del mismo. En algunas modalidades, la región más pequeña necesaria para modular el ciclo de urea se emplea de modo que no está introduciendo ADN necesario en células que reciben una construcción de gen de CPSI. Las técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica, tal como el uso de enzimas de restricción, permitirán la generación de regiones más pequeñas de un gen de CPSI de ejemplo. La capacidad de estas regiones para modular el ciclo de urea se puede determinar fácilmente por los ensayos reportados en los ejemplos. En general, se conocen en la técnica las técnicas para valorar la modulación del ciclo de urea. D. 1. Animales Transgénicos También se .proporciona dentro del alcance de la materia actualmente descrita el preparar un animal no humano transgénico que expresa un gen de CPSI de la materia actualmente descrita o en el cual se "suprime" la expresión de un gen de CPSI. Los animales no humanos, transgénicos, proporcionados se expresan ya sea en la forma T1405 de CPSI o la forma de N1405 de CPSI. Un animal transgéníco de ejemplo es un ratón. Se conocen las técnicas para la preparación de animales transgénicos. Las técnica de ejemplo se describen en la patente de los Estados Unidos número 5,489,742 (ratas transgénicas) ; patentes de los Estados Unidos números 4,736,866; 5,550,316; 5,614,396; 5,625,125 y 5,648,061 (ratones transgénicos) ; patente de los Estados Unidos número ,573,933 (cerdos transgénicos); patente de los Estados Unidos número 5,162,215 (especies avícolas transgénicas) y patente de los Estados Unidos número 5,741,957 (especies bovinas transgénicas) , los contenidos completos de cada una de las cuales se incorporan en la presente como referencia. Con respecto a un método de ejemplo para la preparación de un ratón transgénico, las secuencias clonadas de ADN, recombinantes o sintéticas, o segmentos de ADN que codifican para un producto génico de CPSI se inyectan en huevos fertilizados de ratón. Los huevos inyectados se implantan en hembras pseudo-preñadas y se hacen crecer a término para proporcionar ratones transgénicos cuyas células expresan un producto génico de CPSI. En algunas modalidades, las secuencias inyectadas se construyen teniendo secuencias promotoras conectadas para expresar la proteína deseada en células hepáticas del ratón transgénico. D. 2. Terapia Génica Se pueden usar genes de CPSI para terapia génica de acuerdo con la materia actualmente descrita. Los métodos de terapia génica de ejemplo incluyen transfección liposomal de ácidos nucleicos en células hospedadoras, como se describe en las patentes de los Estados Unidos números 5,279,833; 5,286,634; 5,399,346; 5,646,008; 5,651,964; 5,641,484; y 5,643,567, los contenidos de cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. De forma concisa, se describe la terapia génica del CPSI dirigida hacia la modulación del ciclo de urea en una célula objetivo. Las células objetivo incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, células hepáticas y células intestinales. En algunas modalidades, un método terapéutico de la materia actualmente descrita proporciona un método para modular el ciclo de urea en una célula que comprende los pasos de: (a) distribuir a la célula una cantidad efectiva de una molécula de ADN que comprende un polinucleótído que codifica para un polipéptido de CPSI que modula el ciclo de urea; y (b) mantener la célula bajo condiciones suficientes para la expresión del polipéptido. " Se logra la distribución en algunas- modalidades al inyectar la molécula de ADN en la célula. Donde* la célula está en un sujeto, se puede lograr la distribución en algunas modalidades al administrar la molécula de ADN en el sistema circulatorio del sujeto. En algunas modalidades, la administración comprende los pasos de: (a) proporcionar un vehículo que contenga la molécula de ADN; y (b) administrar el vehículo al sujeto. Un vehículo es en algunas modalidades, una célula transformada o transfectada con la molécula de ADN o una célula transfectada derivada de esta célula transformada o transfectada. Una célula transformada o transfectada de ejemplo es una célula hepática. Se exponen anteriormente los medios para transformar o transfectar una célula con una molécula de ADN de la materia actualmente descrita. Como alternativa, el vehículo es un virus o un anticuerpo que infecta de manera específica o inmuno-reacciona de forma específica con un antígeno del tumor. Los retrovirus usados para distribuir las construcciones a los tejidos objetivo hospedadores en general son virus en los cuales se ha inactivado 3 ' -LTR (región de transferencia lineal). Esto es, estos son 3' -LTR sin intensificador, frecuentemente referidos como SIN (virus auto-inactivantes) debido a que después de la infección productiva en la célula hospedadora, el 3' -LTR se transfiere al extremo 5' y ambos LTR virales son inactivos con respecto a la actividad transcripcional. Es bien conocido por aquellos expertos en la técnica el uso de estos virus para clonar genes para los cuales los elementos reguladores del gen clonado se insertan en el espacio entre las dos LTR. Una ventaja de un sistema de infección viral es que permite un nivel muy alto de infección en la célula receptora apropiada. Se han usado anticuerpos para dirigir al objetivo y distribuir moléculas de ADN. Un conjugado de poli-L-lisina (NPLL) N-terminal modificado-anticuerpo forma fácilmente un complejo con ADN de plásmido. Se usó un complejo de anticuerpos monoclonales contra una trombomodulina de superficie celular conjugada con NPLL para dirigir el objetivo un ADN de plásmido extraño a una línea de células endoteliales de pulmón de ratón que expresan antígeno y pulmón de ratón. Estas células endoteliales seleccionadas como cultivo expresaron el producto codificado por ese ADN extraño.

También se contempla que esta modalidad de la materia actualmente descrita se pueda practicar usando vectores virales o de fago, alternativos, incluyendo vectores retrovirales y virus de vaccinia cuyo genoma se ha manipulado de maneras alternativas para volver no patógeno al virus. Los métodos para crear esta mutación viral se exponen en detalle en la patente de los Estados Unidos número 4,769,331, incorporada en la presente como referencia. A manera de ejemplo especifico, un polinucleótido humano que codifica para CPSI o un homólogo de polinucleótido que codifica para CPSI de otro vertebrado de sangre caliente o un homólogo que codifica para CPSI de una fuente de invertebrado, tal como bacteria o levadura se -introduce en células hepáticas aisladas u otras células pertinentes. La re-inyección de las células que tienen el transgen en el hígado u otros tejidos pertinentes proporcionan tratamiento para la susceptibilidad a hiperamonemia u otras enfermedades pertinentes en humanos y animales. E. Terapia de Complementación Además de su papel en la depuración de nitrógeno, el ciclo de urea es la fuente intrínseca de arginina del cuerpo que actúa como un precursor de óxido nítrico (NO) , un potente vasodilatador. Se proporcionan métodos para tratar función sub-óptima del ciclo de urea de acuerdo con la materia actualmente descrita, que incluye tratamiento por administración de precursores de óxido nítrico tal como citrulina. Típicamente, la función sub-óptima del ciclo de urea se asocia con el polimorfismo descrito en la presente. La función sub-óptima del ciclo de urea puede comprender además hiperamonemia o producción disminuida de citrulina y/o arginina. El sujeto que se va a tratar puede estar sufriendo de un trastorno asociado con función sub-óptima del ciclo de urea, tal como de manera enunciativa y sin limitación un trastorno asociado con producción dañada de precursores de óxido nítrico. Estos trastornos incluyen de manera enunciativa y sin limitación trastornos que comprenden tejido dañado o lesionado de hígado y/o intestino. Los trastornos representativos incluyen de manera enunciativa y sin limitación hepatitis (incluyendo hepatitis A, B y C) , esclerosis, asma, hipertensión pulmonar (incluyendo primaria y secundaria) , toxicidad por trasplante de médula ósea, en un sujeto que se somete a trasplante de médula ósea, y combinaciones de los mismos. El sujeto que se va a tratar también se puede exponer o casi exponer a un estímulo ambiental asociado con función sub-óptima del ciclo de urea. Estos estímulos ambientales incluyen de manera enunciativa y sin limitación estímulos que comprenden el deterioro o daño al tejido hepático y/o de intestino. Los estímulos ambientales representativos incluyen de manera enunciativa y sin limitación quimioterapia u otra terapia farmacéutica, cirugía cardiaca (representada en algunas situaciones como tono vascular pulmonar post-operativo incrementado) , esfuerzo oxidativo incrementado, trasplante de médula ósea, sepsis, ataque agudo de asma, hipoxia, exposición a hepatotoxina, y combinaciones de los mismos. Las cirugías cardiacas representativas incluyen reparación de defectos congénitos del corazón, e incluye además derivación cardiopulmonar usada para corrección de defectos congénitos del corazón. Los defectos cardiacos asociados con flujo sanguíneo pulmonar excesivo, tal como un defecto septal atríoventricular (AVSD) o defecto septal ventricular no restrictivo grande (VSD) son efectos cardiacos representativos. La circulación pulmonar excesiva sostenida puede provocar hipertrofia e hiperactividad de músculo liso vascular pulmonar. De forma preoperativa, estos pacientes tienen frecuentemente falla cardiaca congestiva y pobre ganancia de peso. Se programa la reparación quirúrgica tan pronto como sea posible a fin de reducir esta complicación post-operativa. Los procedimientos adicionales de corrección de defectos cardiacos son procedimientos de Fontan modificados y de Glenn bidireccionales. En estos procedimientos, los pacientes con lesiones ventriculares individuales requieren procedimientos quirúrgicos donde el éxito depende del mantenimiento del bajo tono vascular, pulmonar, post- operativo. La corrección de una lesión ventricular individual requiere una serie de 3 procedimientos quirúrgicos que tienen como objetivo separar las circulaciones pulmonar y sistémica. El primero de estos procedimientos, frecuentemente realizado en el periodo neonatal, es una desviación de Blalock-Taussig para pacientes con un ventrículo derecho hipoplástico o un procedimiento Norwood I para aquellos pacientes con síndrome cardiaco izquierdo hipoplástico. La segunda cirugía es una desviación Glenn bidireccional donde el flujo de la vena cava superior se desvía directamente a la arteria pulmonar. La tercera y final etapa es un procedimiento Fontan modificado donde el flujo de la vena cava inferior se desvía a la arteria pulmonar, terminando de este modo la separación de las circulaciones pulmonar y sistémica. Con los procedimientos de Glenn y Fontan, el flujo sanguíneo pulmonar es completamente pasivo y depende de un gradiente adecuado de presión entre el sistema venoso (presión SVC i IVC) y la presión PA. Cualquier elevación en el tono vascular pulmonar en el periodo post-operativo inmediato puede conducir a flujo sanguíneo pulmonar disminuido y a una falla subsiguiente en el rendimiento cardiaco. A largo plazo, el tono vascular pulmonar elevado después de estos procedimientos puede conducir a efusiones pleurales persistentes, requerimiento prolongado de tubos de drenaje pleural o mediastinal, ventilación prolongada, y estancias prolongadas en ICU. Los procedimientos adicionales de corrección de defectos cardiacos son procedimientos Norwood I. El cuidado post-operativo de infantes con síndrome cardiaco izquierdo hipoplástico (HLHS) que se someten a procedimiento Norwood I depende con exceso del equilibrio del flujo pulmonar y sistémico. Las elevaciones abruptas en la resistencia vascular pulmonar pueden provocar hipoxemia significativa y desaturación. Raramente, la baja resistencia vascular pulmonar puede ser perjudicial si se desvía el flujo sanguíneo a los pulmones a costa de la circulación sistémica coronaria. Con técnicas quirúrgicas refinadas y dimensionamiento apropiado de la desviación central, esta complicación es mucho menos común que los problemas con flujo sanguíneo pulmonar inadecuado. Los procedimientos adicionales de corrección de defectos cardiacos son procedimientos de Cambio arterial. La transposición de las arterias grandes (TGA) es una lesión cardiaca compleja que requiere corrección quirúrgica en el periodo neonatal inmediato. La sincronización del procedimiento de cambio arterial para corrección de TGA toma en cuenta específicamente tejidos del tono vascular pulmonar. Frecuentemente, no se ha realizado cirugía hasta los 5-7 días de edad cuando el tono vascular pulmonar perinatal ha disminuido parcialmente. Debido a que el ventrículo derecho es el ventrículo sistémico antes de la corrección quirúrgica, 'usualmente son bien toleradas las elevaciones post-operativas en la resistencia vascular- pulmonar y usualmente no se mide la presión arterial pulmonar. Sin embargo, si se incrementa el tono vascular pulmonar post-operativo, puede explicar parcialmente por qué algunos infantes con anatomía favorable y tiempos cortos de derivación aún tienen' un curso post- operativo complicado. Se proporciona, de acuerdo con la materia actualmente descrita, un método para tratar o prevenir un trastorno relacionado a función sub-óptima del ciclo.de urea. El método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un precursor de óxido nítrico, por lo que se logra el tratamiento o prevención del trastorno. El precursor de óxido nítrico puede incluir, de manera enunciativa y sin limitación, citrulina, arginina y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, se puede tratar la formación sub-óptima de óxido nítrico que resulta de la función sub-óptima del ciclo de urea. También se describe un método para tratar o prevenir un trastorno seleccionado del grupo que consiste de hepatitis, cirrosis, hipertensión pulmonar (tanto primaria como secundaria) , enterocolitis necrotizante (NEC) , síndrome de esfuerzo respiratorio agudo, disfunción endotelial específica étnica, disfunción eréctil, asma y combinaciones de los mismos, en un sujeto. En algunas modalidades, el método comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un precursor de óxido nítrico. La administración puede ser administración intravenosa u oral. El precursor de óxido nítrico se puede seleccionar del grupo que consiste de citrulina, arginina y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el trastorno es enterocolitis necrotizante (NEC) y el sujeto es un infante prematuro. También se describe un método para aumentar un nivel de un precursor de ácido nucleico en un sujeto en necesidad del mismo. En algunas modalidades, el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un precursor de óxido nítrico, por lo que se aumenta un nivel de un precursor de óxido nítrico en el sujeto. La administración puede ser administración intravenosa u oral. El precursor de óxido nítrico se puede seleccionar del grupo que consiste de citrulina, arginina y combinaciones de los mismos. Opcionalmente, un método de terapia de complementación de la materia actualmente descrita comprende además el paso de detectar inicialmente un polimorfismo de un gen de carbamil-fosfato-sintasa I (CPSI) en el sujeto. El polimorfismo del polipéptido de carbamil-fosfato-sintasa comprende en algunas modalidades una transversión de C a A dentro del exón 36 de CPSI, comprende en algunas modalidades una transversión de C a A en el nucleótido 4340 de un ADNc que corresponde al gen de CPSI, y en algunas modalidades, la transversión de C a A en el nucleótido 4340 del ADNc que corresponde al gen de CPSI comprende además un cambio en el código de triplete desde AAC a ACC, que codifica para un polipéptido de CPSI que tiene una porción de treonina en el aminoácido 1405. Una disminución significativa en los productos intermedios del ciclo de urea (citrulina, arginina) se observó en sujetos que se someten a BMT asociado con el polimorfismo de CPSI de T1405N descrito en la presente. De acuerdo con la materia actualmente descrita, un método para el tratamiento o "profilaxis de toxicidad de BMT, tal como HVOD y/o lesión pulmonar aguda, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un precursor de NO, tal como citrulina y/o arginina, a un sujeto en necesidad del mismo también se proporciona de acuerdo con la materia actualmente descrita. En algunas modalidades, el polimorfismo de CPSI de T1405N descrito en la presente está presente en el sujeto. En algunas modalidades, una cantidad terapéuticamente efectiva de citrulina se administra al sujeto. De acuerdo con la materia actualmente descrita, de esta manera se proporciona un método para reducir la toxicidad y/o la ocurrencia de HVOD en un sujeto que se somete a BMT. Este método comprende administrar al sujeto de BMT, una cantidad efectiva de arginina y/o citrulina, en algunas modalidades citrulina, para reforzar la síntesis de arginina y NO en el sujeto. El refuerzo de la síntesis de arginina y NO en el sujeto reducirá y/o prevendrá sustancialmente la ocurrencia de HVOD asociada con el BMT. La citrulina es un agente representativo de complementación dado que se convierte más fácilmente a NO. Adicionalmente, se contempla que los sujetos que tienen el polimorfismo de CPSI de la materia actualmente descrita, son candidatos de ejemplo para complementación de acuerdo con este método. El sujeto tratado en la materia actualmente descrita en sus muchas modalidades es deseablemente un sujeto humano, aunque se va a entender que los principios de la materia actualmente descrita indican que la materia actualmente descrita es -efectiva con respecto a todas las especies vertebradas, incluyendo vertebrados de sangre caliente tal como mamíferos y aves, que se propone que se incluyan en el término "sujeto". En este contexto, un mamífero se entiende que incluye cualquier especie de mamífero en la cual sea deseable el tratamiento de hiperamonemia, toxicidad por BMT y otras enfermedades asociadas con función dañada del ciclo de urea, particularmente especies agrícolas y domésticas de mamíferos . De esta manera, se contempla el tratamiento de mamíferos tal como humanos, así como aquellos mamíferos de importancia debido a que están en peligro (tal como tigre Siberiano) , son de importancia económica (animales criados en granjas para consumo por humanos) y/o de importancia social (animales mantenidos como mascotas o en zoológico) a los humanos, por ejemplo, carnívoros diferentes de los humanos (tal como gatos y perros) , ganado porcino (cerdos, berracos, y jabalís) , rumiantes (tal como ganado vacuno, bueyes, ovejas, jirafas, ciervos, cabras, bisontes y camellos), y caballos. También se contempla el tratamiento de aves, incluyendo el tratamiento de aquella clase de aves que están en peligro, se mantienen en zoológicos, así como aves de corral, y de manera más particular, aves de corral domesticadas, es decir, aves de corral, tal como pavos, pollos, patos, gansos, gallinas de guinea y similares, puesto que también son de importancia económica a los humanos. De esta manera, se contempla el tratamiento de ganado, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, cerdos domesticados (marranos y berracos) , rumiantes, caballos, aves de corral y similares. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con los materiales portadores para producir una forma de dosis individual variará dependiendo del hospedadora tratado y del modo particular de administración. Por ejemplo, una formulación propuesta para administración a humanos puede contener desde 0.5 mg a 5 g de agente activo combinado con una cantidad apropiada y conveniente del material portador que puede variar desde aproximadamente 5 a aproximadamente 95 por ciento de la composición total. Por ejemplo, en un adulto humano, la dosis por persona por administración está en general entre 1 mg y 500 mg hasta varias veces por día. De esta manera, las formas de dosis unitarias contendrán en general de entre aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo, típicamente 25 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 800 mg, ó 1000 mg. El precursor de óxido nítrico se administra en algunas modalidades en una dosis que varía desde aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 1000 mg, en algunas modalidades en una dosis que varía desde aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 500 mg, y en algunas modalidades, en una dosis que varía desde aproximadamente 1.0 mg a aproximadamente 250 mg. El precursor de óxido nítrico también se puede administrar en algunas modalidades en la dosis que varía desde aproximadamente 100 mg a aproximadamente 30000 mg, y en algunas modalidades en una dosis que varía desde aproximadamente 250 mg a aproximadamente 1000 mg. Una dosis representativa es 3.8 g/m2/día de arginina o citrulina (equivalentes molares, peso molecular de L-citrulina de 175.2, peso molecular de L-arginina de 174.2). Las soluciones intravenosas representativas de citrulina comprenden una solución de 100 mg/ml (10%) . Las dosis intravenosas representativas de citrulina pueden comprender 200 mg/kg, 400 mg/kg, 600 mg/kg, y 800 mg/kg. En algunas modalidades, por ejemplo de manera enunciativa y sin limitación, una dosis de 600 u 800 mg/kg, la dosis se puede disminuir en una cantidad que varía desde 50 mg/kg y 100 mg/kg para mitigar los efectos indeseados observados en la presión sanguínea sistémica. En algunas modalidades, se pueden administrar dosis a un sujeto, antes de la exposición a un estímulo ambiental (por ejemplo una dosis 30 minutos antes del inicio de una cirugía cardiaca tal como derivación cardiopulmonar y/o hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó más dosis durante un periodo perioperativo, tal como cada 12 horas durante un periodo de tiempo antes déla cirugía) después de la exposición a un estímulo ambiental (por ejemplo en el arribo a una unidad de cuidados post-operativos, y/o hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó más dosis durante un periodo post-operativo, tal como cada 12 horas durante un periodo de tiempo después de la cirugía) . Sin embargo, se entenderá que el nivel específico de dosis para cualquier sujeto particular dependerá de una variedad de factores que incluyen la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, ruta de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos y la severidad de la enfermedad particular que se somete a la terapia. F. Composiciones farmacéuticas En algunas modalidades, la materia actualmente descrita proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido o polinucleótido de la materia actualmente descrita y un portador fisiológicamente aceptable. En algunas modalidades, una composición farmacéutica comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido de CPSI biológicamente activo. De manera alternativa, las composiciones " farmacéuticas proporcionadas comprenden citrulina o arginina en dosis como se describe anteriormente. Una composición de la materia actualmente descrita se administra típicamente de forma oral o parenteral en formulaciones de dosis unitarias que contienen portadores, adyuvantes y vehículos normales, bien conocidos, no tóxicos, fisiológicamente aceptables, conforme se deseen. El término "parenteral" como se usa en la presente incluye inyección intravenosa, intramuscular, intraarterial o técnicas de infusión. Las preparaciones inyectables, por ejemplo suspensiones acuosas u oleaginosas, inyectables, estériles, se formulan de acuerdo a la técnica conocida usando agentes adecuados de dispersión o humectación y agentes adecuados de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente parenteralmente aceptable, no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1, 3-butanodiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden emplear está agua, solución de Ringer, y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, convencionalmente se emplean aceites fijos, estériles como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite fijo insípido incluyendo mono- o di-sacáridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tal como ácido oleico pueden encontrar . uso en la preparación de productos inyectables . Los portadores de ejemplo incluyen soluciones salinas neutrales amortiguadas con fosfato, lactato, Tris, y similares. Por supuesto, en el caso de una composición farmacéutica proporcionada para el uso en terapia génica, se purifica el vector de manera suficiente para volverlo esencialmente libre de contaminantes indeseables, tal como partículas defectuosas de adenovirus de interferencia o endotoxinas - y otros pirógenos tal que no provoque ninguna reacción adversa en el individuo que recibe la construcción de vector. Un medio representativo para purificar el vector comprende el uso de gradientes de densidad flotante, tal como centrifugación con gradiente de cloruro de cesio. Una célula transfectada también puede servir como un portador. A manera de ejemplo, se puede remover la célula hepática de un organismo, transfectar con un polinucleótido de la materia actualmente descrita usando los métodos expuestos anteriormente y luego la célula transfectada se regresa al organismo (por ejemplo, se inyecta de forma intravascular) . G. Generación de anticuerpos En algunas modalidades, la materia actualmente descrita proporciona un anticuerpo inmunorreactivo con un polipéptido o polinucleótido de la materia actualmente descrita. En algunas modalidades, un anticuerpo de la materia actualmente descrita es un anticuerpo monoclonal. Son bien conocidos en la técnica los medios para preparar y caracterizar anticuerpos (ver por ejemplo, Antibodies A Laboratory Manual, E. Howell y D. Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). En algunas modalidades, los anticuerpos distinguen entre las diferentes formas de CPSI que comprenden el polimorfismo de CPSI. De forma concisa, se prepara un anticuerpo policlonal al inmunizar un animal con un inmunógeno que comprende un polipéptido o polinucleótido de la materia actualmente descrita, y recolectar antisueros de ese animal inmunizado. Se puede usar una amplia variedad de especie animales para la producción de antisuero. Típicamente, un animal usado para la producción de antisueros es un conejo, un ratón, una rata, un hámster o un caballo. Debido al volumen de sangre relativamente grande de los conejos, un conejo es una elección de ejemplo para la producción de anticuerpos policlonales . Como se conoce en la técnica, un polipéptido o polinucleótido dado puede variar en su inmunogenicidad. Por lo tanto frecuentemente es necesario acoplar el inmunógeno (por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido) de la materia actualmente descrita con un portador. Los portadores de ejemplo son hemocianina de lapa (KLH) y albúmina de suero bovino (BSA) . También se pueden usar como los portadores otras albúminas tal como ovalbúmina, albúmina de suero de ratón o albúmina de suero de conejo. Son bien conocidos en la técnica los medios para conjugar un polipéptido o un polinucleótido a una proteína portadora e incluyen glutaraldehido, - - éster de m-maleimidobencoil-N-hidroxisuccinimida, carbodiimida y bencidina bis-biazotizada. -" - Como también se conoce en la técnica, se puede mejorar la inmunogenicidad a un inmunógeno particular por el uso de estimuladores no específicos de la respuesta inmunitaria conocidos como adyuvantes . Los adyuvantes de ejemplo incluyen el adyuvante completo de Freund, los adyuvantes incompletos de Freund y adyuvante de hidróxido de aluminio. La cantidad de inmunógeno usada para la producción de anticuerpos policlonales varía, inter alia, dependiendo de la naturaleza del inmunógeno así como del animal usado para la inmunización. Se puede usar una variedad de rutas para administrar el inmunógeno, por ejemplo, de forma subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal. La producción de anticuerpos policlonales se monitoriza al muestrear la sangre del animal inmunizado en varios puntos después de la inmunización. Cuando se obtiene un nivel deseado de inmunogenicidad, el animal inmunizado se puede sangrar y se aisla y almacena el suero. En otro aspecto, la materia actualmente descrita proporciona un método para producir un anticuerpo inmunorreactivo con un polipéptido de CPSI, el método que comprende los pasos de (a) transfectar las células hospedadoras recombinantes con un polinucleótido que codifica para ese polipéptido; (b) cultivar las células hospedadoras bajo condiciones suficientes para la expresión del polipéptido; (c) recuperar el polipéptido; y (d) preparar los anticuerpos al polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido de CPSI es capaz de mediar el primer paso del ciclo de urea, reaccionar de forma cruzada con un anticuerpo anti-CPSI, u otra actividad biológica de acuerdo con la materia actualmente descrita. En algunas modalidades, la materia actualmente descrita proporciona anticuerpos preparados de acuerdo al método descrito anteriormente. Un anticuerpo monoclonal de la materia actualmente descrita se puede preparar fácilmente a través del uso de técnicas bien conocidas tal como aquéllas ejemplificadas en la patente de los Estados Unidos número 4,196,265, incorporada en la presente como referencia. Típicamente, una técnica comprende inmunizar primero un animal adecuado con un antígeno -seleccionado (por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido de la materia actualmente descrita) de una manera suficiente para proporciona una respuesta inmunitaria. Proveedores tal como ratones y ratas son animales de ejemplo. Las células del bazo del animal inmunizado entonces se fusionan con las cél las de una célula de mieloma inmortal. Donde el animal inmunizado es un ratón, una célula de mieloma "representativa es una célula de -mieloma.NS-1 murina. Las células de bazo/mieloma fusionadas se" cultivan en un medio selectivo para . seleccionar las células fusionadas de bazo/mieloma de las células parenterales. Las células fusionadas se separan de la mezcla de células parenterales no fusionadas, por ejemplo, por la adición de agentes que bloquean la síntesis de novo de los nucleótidos en el medio de cultivo de tejido. Los agentes de ejemplo son aminopterina, metotrexato, y azaserina. La aminopterina y el metotrexato bloquea la síntesis de novo tanto de purinas como de pirimidinas, en tanto que la azaserina bloquea sólo la 'síntesis de purina. Donde se usa aminopterina o metotrexato, el medio se complementa con hipoxantina y trimidina como una fuente de- nucleótidos. Donde se usa azaserina, el medio se complementa con hipoxantina. Este cultivo proporciona una población de hibridomas de las cuales se seleccionan hibridomas específicos. Típicamente, la selección de hibridomas se realiza al cultivar las células por dilución de clon individual en placas de microtítulo, seguido por la prueba de los sobrenadantes clónales individuales para reactividad con un antígeno-polipéptidos . Los clones seleccionados entonces se pueden propagar de manera indefinida para proporcionar el anticuerpo monoclonal. A manera de ejemplo específico, para producir un anticuerpo de la materia actualmente descrita, se inyectan ratones de manera intraperitoneal con entre aproximadamente 1-200 µg de un antígeno que comprende un polipéptido de la materia actualmente descrita. Se estimulan a crecer células de linfocito B al inyectar el antígeno en asociación con un adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund (un estimulador no específico de la respuesta inmunitaria que contiene Mycobacterium tuberculosis aniquilado) . En algún momento (por ejemplo al menos dos semanas) después de la primera inyección, los ratones se refuerzan por inyección con una segunda dosis del antígeno mezclada con el adyuvante incompleto de Freund. Unas pocas semanas después de la segunda inyección, los ratones se sangran por la cola y los sueros se titulan por inmunoprecipitación contra el antígeno radiomarcado. En algunas modalidades, -• se repite el proceso de refuerzo y titulación hasta que se logra un título adecuado. El bazo del ratón con el título más alto se remueve y se obtienen los linfocitos del bazo al homogenizar el bazo con una jeringa. De manera típica, un bazo de un ratón inmunizado contiene aproximadamente 5 x 107 a 2 x 1 8 .linfocitos. Las células mutantes de linfocitos conocidas cono células de mieloma se obtienen de animales de laboratorio en los cuáles se han introducido estas células para crecer por una variedad de métodos bien conocidos. Las células de mieloma carecen de la ruta de salvamento de la biosíntesis de nucleótidos. Debido a que las células de mieloma son células tumorales, se pueden propagar de manera indefinida en cultivos de tejido, de esta manera se denominan inmortales. Se han establecido numerosas líneas de células cultivadas de células de mieloma de ratones y ratas, tal como las células de mieloma murino NS-1. Las células de mieloma se combinan bajo condiciones apropiadas para fomentar la fusión con las células normales que producen anticuerpos a partir del bazo de ratón o rata inyectado con el antígeno/polipéptido de la materia actualmente descrita. Las condiciones de fusión incluyen, por ejemplo, la presencia de polietilenglicol. Las células fusionadas resultantes son células de hibridoma. Igual que las células de mieloma, las células de hibridoma crecen de manera indefinida en cultivo. Las células de hibridoma se separan de las células de mieloma no fusionadas al cultivar en un medio de selección tal como el medio de HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) . Las células de mieloma sin fusionar carecen de las enzimas necesarias para sintetizar los nucleótidos de la ruta de salvamento debido a que se aniquilan en la presencia de aminopterina, metotrexato, o azaserina. Los linfocitos no fusionados .tampoco continúan creciendo en el cultivo de tejido. De esta manera, sólo pueden crecer en el medio de selección las células que se han fusionado de forma exitosa (células de hibridoma) . Cada una de las células de hibridoma supervivientes produce un anticuerpo individual. Estas células entonces se prueban para la producción del anticuerpo específico inmunorreactivo con un antígeno/polipéptido de la materia actualmente descrita. Se aislan hibridomas celulares individuales al limitar las diluciones de los hibridomas. Los hibridomas se diluyen en serie muchas veces y después que se dejan crecer las diluciones, se prueba el sobrenadante para la presencia del anticuerpo monoclonal. Los clones que producen ese anticuerpo entonces se cultivan en grandes -cantidades para producir un anticuerpo de la materia actualmente descrita en una cantidad conveniente. Por el uso de un anticuerpo monoclonal de la materia actualmente descrita, se pueden reconocer como antigenos, y de esta manera identificar, los polipéptidos y polinucleótidos específicos de la materia actualmente descrita. Una vez identificados, estos polipéptidos y polinucleótidos se pueden aislar y purificar por técnicas tal como cromatografía por afinidad de anticuerpo. La cromatografía por afinidad de anticuerpo, se une a un anticuerpo monoclonal a un sustrato sólido y se expone a una solución que contiene el antígeno deseado. El antígeno se remueve de la solución a través de una reacción inmunoespecífica con el antígeno unido. El polipéptido o polinucleótido entonces se remueve fácilmente del sustrato y se purifica. H. Detección de un polinucleótido o un polipéptido de la materia actualmente descrita De manera alternativa, la materia actualmente descrita proporciona un método para detectar un polipéptido de la materia actualmente descrita, en donde el método comprende hacer inmunorreaccionar los polipéptidos con anticuerpos preparados de acuerdo a los métodos descritos anteriormente para formar conjugados de anticuerpo-polipéptido, y detectar los conjugados. En algunas modalidades, la materia actualmente descrita proporciona un método para detectar transcriptos de ARN mensajer que codifica para un polipéptido de la materia actualmente descrita, en donde el método comprende hibridizar los transcriptos de ARN mensajero con secuencias de polinucleótido que codifican para el polipéptido para formar dúplex; y detectar el dúplex. De manera alternativa, la materia actualmente descrita proporciona un método para detectar moléculas de ADN que codifican para un polipéptido de la materia actualmente descrita, en donde el método comprende hibridizar moléculas de ADN con un polinucleótido que codifica para este polipéptido para formar dúplex; y suprimir los dúplex. Los ensayos de detección y valoración descritos 'en la presente se pueden usar como una herramienta de prognosis. Los polinucleótidos humanos que codifican para CPSI así como sus productos de proteína se pueden usar fácilmente en establecimientos clínicos como un indicador de prognosis para detectar la susceptibilidad a hiperamonemia y otras enfermedades hereditables relacionadas a CPSI, en humanos. Los ensayos de detección y valoración descritos en la presente también se pueden usar como una parte de un método de diagnóstico. Los polinucleótidos humanos que codifican para CPSI así como sus productos de proteína se pueden usar fácilmente en establecimiento clínico para diagnosticar la susceptibilidad a hiperamonemia y a otras enfermedades hereditables relacionadas a CPSI, en humanos. H. 1. Ensayos de detección de un polipéptido de la materia actualmente descrita La materia actualmente descrita proporciona un método para valorar una muestra biológica para la presencia de un polipéptido de CPSI. En algunas modalidades, el polipéptido de CPSI posee actividad en el ciclo de urea, que reacciona de forma cruzada con un anticuerpo anti-CPSI, u otra actividad biológica de acuerdo con la materia actualmente descrita. Una muestra biológica que se va a valorar puede ser un fluido biológico tal como un fluido intracelular o intracelular o un extracto u homogenado de células o tejido. Una muestra biológica también puede ser una célula aislada (por ejemplo, en cultivo) o una colección de células tal como en una muestra de tejido o muestra histológica. Se puede suspender una muestra de tejido en un medio líquido d fijar en un soporte sólido tal como un portaobjetos de microscopio. Los tejidos hepáticos comprenden tejidos particularmente contemplados. En algunas modalidades,- los anticuerpos que distinguen entre el polipéptido de CPSI de N1405 y el polipéptido de CPSI de T1405 se proporciona. Estos anticuerpos pueden comprender anticuerpos policlonales pero son en algunas modalidades anticuerpos policlonales preparados como se describe anteriormente en la presente. De acuerdo con un método de ensayo de detección, se expone una muestra biológica a un anticuerpo inmunorreactivo con el polipéptido cuya presencia se está valorando. Típicamente, se logra la exposición al formar una mezcla en un medio líquido que contiene tanto el anticuerpo como el polipéptido candidato. Ya sea el anticuerpo o la muestra con el polipéptido se puede fijar a un soporte sólido (por ejemplo, una columna o una placa de microtítulo) . La muestra biológica se expone al anticuerpo bajo condiciones de reacción biológica y durante un periodo de tiempo suficiente para la formación del conjugado de anticuerpo-polipéptido. Las condiciones de reacción biológica incluyen composición y concentración iónica, temperatura, pH y similares . La composición y concentración iónica pueden variar de aquélla del agua destilada a una solución 2 molar de NaCl. En algunas modalidades, la osmolaridad es de aproximadamente 100 mosmoles/1 a aproximadamente 400 mosmoles/1 y, en algunas modalidades, de aproximadamente 200 mosmoles/1 a aproximadamente 300 mosmoles/1. La temperatura es en algunas modalidades de aproximadamente 4°C a aproximadamente 100 °C, en algunas modalidades de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 50 °C, y en algunas modalidades de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40°C. El pH es en algunas modalidades de aproximadamente un valor de 4.0 a un valor de aproximadamente 9.0, en algunas modalidades de aproximadamente un valor de 6.5 a un valor de aproximadamente 8.5 y en algunas modalidades de aproximadamente un valor de 7.0 a un valor de aproximadamente 7.5. El único límite en las condiciones de reacción biológica es que las condiciones seleccionadas permitan la formación del conjugado de anticuerpo-polipéptido y que las condiciones no afecten de manera adversa ya sea al anticuerpo o al polipéptido. El tiempo de exposición variará inter alia con las condiciones biológicas usadas, la concentración del anticuerpo y polipéptido y la naturaleza de la muestra (por ejemplo, muestra de tejido o fluido) . Se conoce por un experto en la técnica los medios para determinar el tiempo de exposición. Típicamente, donde la muestra es fluida y la concentración del polipéptido én esta muestra es de aproximadamente 10_10M, el tiempo de exposición es de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 200 minutos. La presencia de polipéptido en la muestra se detecta al detectar la formación y presencia de conjugados de anticuerpo-polipéptido. Son bien conocidos en la técnica los medios para detectar estos conjugados o complejos de anticuerpo-antígeno (por ejemplo, polipéptido de receptor) e incluyen procedimientos tal como centrifugación, cromatografía de afinidad y similares, unión de un anticuerpo secundario a un complejo de anticuerpo-receptor candidato. En algunas modalidades, se logra la detección al detectar un indicador fijado al anticuerpo. Los indicadores de ejemplo son bien conocidos e incluyen marcas radioactivas (por ejemplo 32P, 125I, 14C) , un segundo anticuerpo o una enzima tal como peroxidasa de rábano. Son bien conocidos en la técnica los medios para fijar indicadores a los anticuerpos. Están disponibles equipos comerciales. H. 2. Ensayo de detección para anticuerpo anti-pollpéptido En otro aspecto, la materia actualmente descrita proporciona un método para valorar una muestra biológica para la presencia de anticuerpos inmunorreactivos con un polipéptido de CPSI . En algunas modalidades, el polipéptido de CPSI tiene actividad en el ciclo de urea, reactividad cruzada con un anticuerpo anti-CPSI, u otra actividad biológica de acuerdo con la materia actualmente descrita. De acuerdo con este método, se expone una muestra biológica a un polipéptido de CPSI bajo condiciones biológicas y durante un periodo de tiempo suficiente para la formación del conjugado de anticuerpo-polipéptido y se detectan los conjugados formados. H. 3. Ensayo de detección para polinucleótido que codifica para un polipéptido de CPSI de la materia actualmente descrita Se puede usar una molécula de ácido nucleico, y de manera particular una molécula de sonda, para hibridizar como una sonda de oligonucleótido a una fuente de ácido nucleico sospechosa de codificar para un polipéptido de CPSI de la materia actualmente descrita. De manera óptima, el polipéptido de CPSI tiene actividad en el ciclo de urea, reactividad cruzada con un anticuerpo anti-CPSI, u otra actividad biológica de acuerdo con la materia actualmente descrita. El sondeado se logra usualmente al hibridizar el oligonucleótido a una fuente de ADN sospechosa de poseer un gen de CPSI. En algunos casos, las sondas constituyen sólo una sonda individual, y en otras, las sondas constituyen una colección de sondas basadas en ciertas secuencias de aminoácidos o secuencias del polipéptido y dan cuenta de su densidad por la redundancia evidente en el código genético. Una fuente adecuada de ADN para el sondeo de esta manera es capaz de expresar un polipéptido de la materia actualmente descrita y puede ser una biblioteca genómica de una línea celular de interés. De manera alternativa, una fuente de ADN puede incluir ADN total de la linea celular de interés. Una vez que el método de hibridación de la materia actualmente descrita ha identificado un segmento de ADN candidato, confirma que se ha obtenido un clon positivo por hibridación adicional, correlación por enzimas de restricción, secuenciación y/o expresión y prueba. De manera alternativa, estas moléculas de ADN se pueden usar en varias técnicas que incluyen su uso como: (1) herramienta de diagnóstico para detectar secuencias normales y anormales de ADN en ADN derivado de células de sujeto, tal como un polimorfismo de CPSI descrito en la presente; (2) un medio para detectar y aislar otros miembros de la familia de polipéptidos y polipéptidos relacionados de una biblioteca de ADN que contiene potencialmente esas secuencias; (3) cebadores para hibridizarse a las secuencias relacionadas para el propósito de amplificar estas secuencia; (4) cebadores para alterar las secuencias de ADN nativas de CPSI; así como otras técnicas que dependen de la similitud de las secuencias de ADN a aquéllas de los segmentos de ADN descritos en la presente. Como se expone anteriormente, en ciertos aspectos, la información de secuencia de ADN proporcionada por la materia actualmente descrita permite la preparación de secuencias relativamente cortas (por ejemplo sondas) de ADN (o ARN) que "hibridizan específicamente a secuencias codificantes de un gen seleccionado de CPSI.- En estos aspectos, las sondas _ de ácido nucleico de una longitud apropiada se preparan en base a la consideración de la secuencia codificante de un polipéptido de la materia actualmente descrita. La capacidad de estas sondas de ácido nucleico para hibridizar de manera específica a otras secuencias codificantes les otorga utilidad particular en una variedad de modalidades. De manera más importante, las sondas se pueden usar en una variedad de ensayos para detectar la presencia de secuencias complementarias en una muestra dada. Sin embargo, se contemplan otros usos, incluyendo el uso de información de secuencia para la preparación de cebadores de especies mutantes, o cebadores para el uso en la preparación de otras construcciones genéticas. Para proporcionar ciertas ventajas de acuerdo con la materia actualmente descrita, una secuencia representativa de ácido nucleico empleada para estudio de hibridación o ensayos, incluye secuencias de sonda que son complementarias a al menos un tramo de nucleótidos de 14 a 40 o más largo de una secuencia de ácido nucleico de la materia actualmente descrita, tal como la secuencia mostrada en cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 3, 11, y 13. Un tamaño de al menos 14 nucleótidos de longitud ayuda a asegurar que el fragmento sea suficientemente largo para formar una molécula dúplex que es tanto estable como selectiva. Se pueden emplear moléculas que tienen secuencias complementarias, en algunas modalidades sobre tramos mayores de 14 bases de longitud, para incrementar la estabilidad y selectividad del híbrido, y de este modo mejorar la calidad y grado de las moléculas híbridas específicas obtenidas. En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico que tienen tramos complementarios al gen de 14 a 20 nucleótido o aún más largos se pueden emplear. Estos fragmentos se pueden preparar fácilmente por ejemplo al sintetizar directamente el fragmento por medios químicos, por aplicación de tecnología de reproducción de ácido nucleico, por ejemplo tecnología de PCR de la patente de los Estados Unidos número 4, 683,202, incorporada en la presente como referencia, o por introducir secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para producción recombinante. Por consiguiente, se puede usar una secuencia de nucleótidos de la materia actualmente descrita por su capacidad para formar selectivamente moléculas dúplex con tramos complementarios del gen. Dependiendo de la aplicación contemplada, se emplean condiciones variables de hibridación para lograr grados variables de selectividad de la sonda hacia la secuencia objetivo. Para aplicaciones que requieren un alto grado de selectividad, una emplea típicamente condiciones relativamente severas o rigurosas para formar los híbridos. Por ejemplo, se seleccionan condiciones de relativamente poca sal y/o alta temperatura, tal como se proporciona por la sal 0.02M-0.15M a temperaturas de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C incluyendo particularmente temperaturas de aproximadamente 55 °C, aproximadamente 60 °C y aproximadamente 65 °C. Estas condiciones son particularmente efectivas, y toleran poco malapareamiento, si lo hay, entre la sonda y la plantilla o hebra objetivo. Por supuesto, para algunas aplicaciones, por ejemplo, donde se desee preparar mutantes empleando una hebra de cebador mutante hibridizada a una plantilla subyacente o donde se busca aislar secuencias codificantes de polipéptidos de especies relacionadas, equivalentes funcionales o similares, se necesitan típicamente condiciones de hibridación menos severas para permitir la formación del heterodúplex. Bajo estas circunstancias, se emplean condiciones tal como sal 0.15M-0.9M, a temperaturas que varian desde aproximadamente 20 °C a aproximadamente 55 °C, incluyendo particularmente temperaturas de aproximadamente 25 °C, aproximadamente 37 °C, aproximadamente 45 °C, y aproximadamente 50 °C. Las especies de hibridación cruzada se pueden identificar de este modo fácilmente como señales positivamente hibridizantes con respecto a hibridaciones de control. En cualquier caso, se aprecia en general ."que las condiciones se pueden volver más severas por la adición de cantidades crecientes de formamida, que sirve para desestabilizar el dúplex híbrido de la misma manera como para incrementar la temperatura. De esta manera, las condiciones de hibridación se pueden manipular fácilmente, de tal manera será en general un método de elección dependiendo de los resultados deseados. En algunas modalidades, es ventajoso emplear una secuencia de ácido nucleico de la materia actualmente descrita en combinación con un medio apropiado, tal como una marca, para determinar la hibridación. Se conoce en la técnica una amplia variedad de medios indicadores apropiados, que incluyen ligandos radioactivos, enzimáticos u otros, tal como avidina/biotina, que son capaces de dar una señal detectable. En algunas modalidades, se emplea igualmente una marca de enzima tal como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en lugar de radioactivos u otros ambientalmente indeseables. En el caso de marcas enzimáticas, se conoce que los sustratos indicadores calorimétricos se pueden emplear para proporcionar un medio visible al ojo humano o de manera espectrofotométrica, para identificar hibridación específica con muestras que contienen ácido nucleico complementario. En general, se contempla que las sondas de hibridación descritas en la presente son útiles tanto como reactivos en hibridación en solución así como en algunas modalidades que emplean una fase sólida. En algunas modalidades que emplean una fase sólida, la muestra que contiene ADN (o ARN) de prueba se adsorbe o se fija de otro modo a una matriz o superficie seleccionada. Este ácido nucleico fijo, de hebra individual, entonces se somete a hibridación específica con sondas seleccionadas bajo condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas dependen inter alia délas circunstancias particulares en base a los criterios particulares requeridos (dependiendo, por ejemplo, de los contenidos de G + C, el tipo de ácido nucleico objetivo, fuente de ácido nucleico, tamaño de sonda de hibridación, etc.). Después del lavado de la superficie hibridizada para remover moléculas de sonda no específicamente unidas, se detecta hibridación específica, o aún se cuantifica, por medio de la marca. H. 4. Equipos de ensayo En otro aspecto, la materia actualmente descrita proporciona un equipo de ensayo para detectar la presencia de un polipéptido de la materia actualmente descrita en muestras biológicas, donde el equipo comprende un primer recipiente que contiene un primer anticuerpo capaz de inmunorreaccionar con el polipéptido, con el primer anticuerpo presente en una cantidad suficiente para realizar al menos un ensayo. En algunas modalidades, los equipos de ensayo de la materia actualmente descrita comprenden además un segundo recipiente que contiene un segundo actividad que in unorreacciona con el primer anticuerpo. En algunas modalidades, los anticuerpos usados en los equipos de ensayo de la materia actualmente descrita son anticuerpos monoclonales. En algunas modalidades, el primer anticuerpo se fija a un soporte sólido. En algunas modalidades, el primer y segundo anticuerpos comprenden un indicador, y en algunas modalidades, el indicador es una etiqueta radioactiva o una enzima. La materia actualmente descrita también proporciona un equipo de diagnóstico para detectar agentes. Este equipo puede contener un polipéptido de la materia actualmente descrita. El equipo puede contener reactivos para detectar una interacción entre un agente y un receptor de la materia actualmente descrita. El reactivo proporcionado puede estar radiomarcado. El equipo puede contener un agente radiomarcado conocido capaz de la unión o interacción con un receptor de la materia actualmente descrita. En un aspecto alternativo, la materia actualmente descrita proporciona equipos de ensayo de diagnóstico para detectar la presencia, en muestras biológicas, de un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la materia actualmente descrita, los equipos que comprenden un primer recipiente que contiene un segundo polinucleótido idéntico o complementario a un segmento de al menos 10 bases contiguas de nucleótidos de, en algunas modalidades, cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 3, 11, y 13. En algunas modalidades, la ""materia actualmente descrita proporciona equipos de ensayo de diagnóstico para detectar la presencia, en una muestra biológica, de anticuerpos inmunorreactivos con un polipéptido de la materia actualmente descrita, los equipos que comprenden un primer recipiente que contiene un polipéptido de CPSI, que inmunorreacciona con los anticuerpos, con el polipéptido presente en una cantidad suficiente para realizar al menos un ensayo. En algunas modalidades, el polipéptido de CPSI tiene actividad en el ciclo de urea, reactividad cruzada en un anticuerpo anti-CPSI, u otra actividad biológica de acuerdo con la materia actualmente descrita. Los reactivos del equipo se pueden proporcionar como una solución líquida, unidos a un soporte sólido o como un polvo seco. En algunas modalidades, cuando el reactivo se proporciona en una solución líquida, la solución líquida es una solución acuosa. En algunas modalidades, cuando el reactivo proporcionado se une a un soporte sólido, el soporte sólido puede ser un medio cromatográfico o un portaobjeto de microscopio. Cuando el reactivo proporcionado es un polvo seco, el polvo se puede reconstituir por la adición de un solvente adecuado. El solvente se puede proporcionar. Ejemplos Los siguientes ejemplos se han incluido para ilustrar modos representativos de la materia actualmente descrita. Se describen ciertos aspectos de los siguientes ejemplos en términos de técnicas o procedimientos encontrados o contemplados por los presentes inventores como que trabajan bien en la práctica de la materia actualmente descrita. Estos ejemplos se -ejemplifican a través del uso de prácticas normales de laboratorio de los inventores. En vista de la presente descripción y del nivel general de habilidad en la técnica, aquellos expertos en la técnica apreciarán que los siguientes ejemplos se proponen para ser sólo de ejemplo ya que se pueden emplear numerosos cambios, modificaciones y alteraciones sin apartarse del espíritu y alcance de la materia actualmente descrita. Materiales y métodos usados en los ejemplos 1-3 Los siguientes materiales y métodos se emplearon en cada uno de los ejemplos 1-3. También se describen en cada ejemplo materiales y métodos adicionales. Reclutamiento clínico/paciente: se han enrolado más de 200 pacientes que se someten a BMT en el Vanderbilt University Medical Center, Nashville, Tennessee, en el estudio de lesión pulmonar por BMT después de injerto (LIFE) que tiene como objetivo entender los mecanismos de lesión pulmonar aguda y falla de múltiples órganos después de trasplante. Se buscó el consentimiento de los pacientes consecutivos que se someten a BMT o PBSCT para tratamiento de malignidad. Las definiciones de falla de órgano (incluyendo HVOD) e inversión se definieron de manera eventual y se recolectaron datos de forma concurrente durante la hospitalización. Se recolectaron plasma, plaquetas celulares y urina en el enrolamiento en el estudio (antes de recibir la quimioterapia) y en el día del trasplante (antes de la infusión de la médula) después de terminar la quimio-radioterapia ablativa. Análisis de aminoácidos.- La sangre y orina se centrifugaron inmediatamente después de la recolección. Todas las muestras se tomaron en hielo, luego se almacenaron a -70°C hasta que se analizan. Bajo estas condiciones de estudio, se conoce que glutamina, cisteína y homocisteína disminuyen, de modo que no se usaron en el análisis. Se midieron los aminoácidos plasmáticos en el Vanderbilt Diagnostic Laboratories, Vanderbilt University, Nashville, Tennessee. De forma concisa, se preparó un extracto de plasma libre de proteína por precipitación de proteína con ácido sulfosalicílico y filtración a través de un filtro de 0.45 µm ?CRODISC1^ (Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan) . Los aminoácidos se separaron por cromatografía e intercambio catiónico usando un sistema amortiguador de citrato de litio clasificado por concentración iónica y pH, de cuatro componentes en un analizador de aminoácidos Beckmann 7300 (Beckman, , Palo Alto, California) . La derivatización postcolumna de los aminoácidos con ninhidrina permitió la detección de aminoácidos de amina primaria a 570 nm, y amina secundaria a 440 nm. Se logró la cuantificación por calibración de instrumentos con materiales de referencia normales (Sigma, St. Louis, Missouri). - Estadísticas . Se expresaron los valores plasmáticos de aminoácidos como media ± SEM. Se hicieron comparaciones entre los valores de línea base y de post-quimioterapia de los aminoácidos usando la prueba t de Student . Se comparó la frecuencia alélica entre los pacientes con y sin HVOD usando análisis Chi-cuadrado. Pacientes . Se identificaron pacientes de aquellos enrolados en el estudio de levantamiento de BMT en la Universidad de Vanderbilt. Se aisló ADN de sangre de pre-trasplante o muestras de urina centrifugadas. Se determinó el estado de HVOD usando los criterios de Baltimore: - Bilirrubina > 2.0 mg/dl - Hepatomegalia - Ganancia súbita de exceso de 2% Genotipificación . Se aisló ADN usando un equipo sanguíneo QIAMPMR (Qiagen) . El polimorfismo T1405N cambia la secuencia de ADN como sigue: CCT-GCC-ACC-CCA-GTG Normal CCT-GCC-AAC-CCA-GTG Cambio La transversión de C a A recoloca la pirimidina C con la Purina A que destruye un sitio Ms/1. El uso de un cebador dentro del 35_es;Lmo entrón de CPSI y un cebador exótico del exón 36 del gen de CPSI de manera confiable en PCR amplifica un -fragmento de 387 pb que abarca la región que contiene el cambio. Esta combinación da una amplificación fuerte. También se usan cuentas Ready-to-GoMR para PCR en la amplificación (farmacia) . El polimorfismo se detectó usando un gel no desnaturalizante para aprovechar las estructuras secundarias creadas por la transversión de C a A. Este cambio crea suficiente estructura secundaria para impedir la digestión confiable por encima de restricción (Msl I) para detectar el polimorfismo. Este cambio también interfiere con el análisis directo de secuencia a menos que ITP se sustituya por GTP en la reacción. Los geles no desnaturalizantes aprovechan las estructuras secundarias creadas por este cambio. Se compararon quince (15) individuos por este método y análisis de secuencia. Para detectar los fragmentos de ADN en el gel, se adaptó una técnica de tinción con plata. Este método rápido económico permitió la visualización de bandas de forma breve después de la electroforesis. Análisis estadístico. Se obtuvo un tamaño suficiente de muestra para realizar el análisis de Chi-cuadrado en los resultados. Se usó la ecuación de Hardy-Weinburg para calcular las frecuencias esperadas para los genotipos (p2 + 2pq + q2) . Se obtuvieron valores P de una tabla normal de Chi-cuadrado usando 2 grados de libertad. Ejemplo 1 Alelos de polimorfismo exónico de CPSI (T1405N) no están en equilibrio Hardy-Weinburg con la presencia o ausencia de HVOD De acuerdo con la materia actualmente descrita, se ha identificado un polimorfismo común cerca del extremo 3' del ARNm de CPSI (aproximadamente heterocigosidad . 44 ) . El análisis de secuencia de este cambio reveló una transversión de C a A en la base 4340 que cambia el código de triplete desde ACC hacia AAC. Esto da por resultado una sustitución de asparagina por trionina en el aminoácido 1405 (referido en la presente como "T1405N") . La trionina está dentro del dominio alostérico, precediendo a la secuencia de signatura PV(A/S) P (T/S) (A/Q)E, una secuencia que es importante en la unión del co-factor n-acetil-glutamato (NAG) . En todas las CPSI conocidas activadas por NAG, un residuo de trionina está entre los dos residuos que preceden a la secuencia de signatura. (Rubio, Biochemical Society Transactions 21:198-202 (1998)). En base a los estudios de estructura-función, la formación unida a hidrógeno con el oxígeno de carbonilo del grupo acetamido de NAG se percibe que juega un papel en la unión de este activador. (Stapleton et al., Biochemistry 35:14352-14361 (1996); Javid-Majd et al., Biochemistry 35:14362-14369 (1996)). La sustitución de la cadena lateral de trionina por asparagina se contempla que altera la formación unida a hidrógeno con NAG y da por resultado un cambio cualitativo en la función enzimática de CPSI y en la sensibilidad a la mezcla disponible de NAG. Aunque los solicitantes no desean unirse por ninguna teoría de operación, se especula que en base al precedente de los efectos de otros xenobióticos, que la disponibilidad limitada de NAG después de una quimioterapia de dosis en escala es uno de los mecanismos promotores de la disfunción del ciclo de urea. Se genotipificaron 126 individuos del grupo de estudio de levantamiento de BMT. 30 individuos manifestaron evidencia de HVOD en este grupo (24%) . Se genotipificaron 70 pacientes de las muestras sanguíneas y 56 de los sedimentos de las células de urina. Se reamplificaron muestras de 15 pacientes mediante PCR y se secuenciaron para confirmar la consistencia de los resultados. Las tablas 2 y 3 muestran los resultados del análisis de genotipos para el polimorfismo T1405N entre pacientes HV0D+ y HVOD-. El alelo C, también referido en la presente como el alelo de CPSIa o el alelo codificante de trionina, tiene la frecuencia de .62 en la población examinada, y el alelo A, también referido en la presente como el alelo de CPSIb o el alelo codificante de asparagina, tiene una frecuencia de 0.38. El valor de Chi-cuadrado para la tabla es 4.3 (P = 0.1) indicando que el polimorfismo probablemente no está en equilibrio de Hardy-Weinburg con la presencia de HVOD. De esta manera, estos resultados proporcionan evidencia para el desequilibrio en la distribución de los alelos T1405N y en los pacientes con BMT con HVOD, indicando que el polimorfismo se puede usar para identificar sujetos quienes son susceptibles a la toxicidad de BMT Tabla 2 Genotipo HVOD+ HVOD- CC 13 esperado 11.4) 32 (esperado 36.5) AC 16 (esperado 14.1) 50 (esperado 45.1) AA 1 (esperado 4.5) 14 (esperado 14.4) Tabla 3 Alelos totales Frecuencias esperadas A: 96 AA 0.15 C: 62 AC 0.47 CC 0.38 Los datos adicionales obtenidos de un estudio de aproximadamente 200 pacientes proporcionó evidencia estadística adicional que soporta el uso del polimorfismo en la detección de la susceptibilidad a función sub-óptima del ciclo de urea. Estos datos se someten a los métodos estadísticos descritos anteriormente. La toxicidad de trasplante de médula ósea da por resultado morbilidad y mortalidad significativa. La HVOD se asocia con una pobre prognosis en pacientes con BMT. Este estudio se entendió para valorar una asociación entre la enzima de CPSI y la ocurrencia de HVOD. El polimorfismo T1405N afecta la función de CPSI. Su amplia distribución en la población sugiere que ambas formas proporcionan función adecuada del ciclo de urea bajo condiciones normales. La adición de factores estresantes metabólicos (tal como quimioterapia a alta dosis) sirve para disminuir la eficiencia de CPSI por debajo de un umbral efectivo. El análisis de los datos sugiere de esta manera que HVOD va a presentarse más probablemente en pacientes con el alelo codificante de trionina que aquellos con asparagina. El alelo codificante de trionina se comparte por la forma de roedor de CPSI . Ejemplo 2 Alteraciones bioquímicas y genéticas en carbamil-fosfato-sintasa I en pacientes con complicaciones post-trasplante de médula ósea El trasplante de médula ósea (BMT) y el trasplante de células madre de sangre periférica (PBSCT) se están usando cada vez más como terapia primaria para malignidades seleccionadas. El uso del soporte con células madre para reconstitución hematopoiética permite la puesta en escala sustancial en la dosis de la quimioterapia en un intento para erradicar cánceres potencialmente letales. Con mejoras en la profilaxis para la infección y prevención para deshabilitar le enfermedad del injerto versus huésped, la disfunción de órgano inducida por quimioterapia permanece como una barrera significativa para usar más extendidamente este tratamiento. La enfermedad veno-oclusiva hepática (HVOD) , un síndrome clínico de hiperbilirrubinemia (bilirrubina en suero > 2.0 mg/dL), hepatomegalia y retención anticipada de fluidos después de BMT, es una toxicidad principal limitante de la dosis después de BMT, que aflige hasta a 54% de los pacientes. Muchos pacientes que desarrollan HVOD después de BMT también cumplirán con los criterios de lesión pulmonar aguda (ALI) . Cerca de la mitad de los pacientes con HVOD severa requieren ventilación mecánica, con una mortalidad acompañante de más de 90%. Estos datos subrayan el gran impacto en la mortalidad de la disfunción subsiguiente de órgano, aún en una población de pacientes jóvenes, y refuerza la asociación clínicamente importante de prognosis pobre después de lesión pulmonar aguda en pacientes con disfunción hepática. Los mecanismos responsables de esta interacción de órganos permanecen incompletamente entendidos. En este ejemplo, se analizó si la quimioterapia acondicionante administrada antes del BMT puede afectar anticipadamente las enzimas en el UC y predisponen de forma secundaria a los pacientes a disfunción hepática y falla de múltiples órganos. El análisis de aminoácidos plasmáticos soportó las nociones tanto de una función dañada de UC como de producción disminuida de óxido nítrico (N0X) . En vista de estos hallazgos, se evaluaron los pacientes para el polimorfismo de nucleótido individual (SNP) exónico en CPS-I descrita en la presente. Se encontró que la homocigosidad para el SNP se asoció con una incidencia disminuida de HVOD y supervivencia anticipada, mejorada después de BMT, consistente con una interacción farmacogenética significativa. Métodos Reclutamiento clínico/paciente: durante los últimos tres años, se han enrolado de manera secuencial 200 pacientes que se someten a BMT en Vanderbilt University Medical Center en el estudio de lesión pulmonar por trasplante de médula ósea después de injerto (BMT-LIFE) , una exploración indagatoria clínica-bioquímica coordinada que tiene como objetivo el entendimiento de los mecanismos de la lesión pulmonar aguda y falla de múltiples órganos después de trasplante. Se definieron de forma eventual las definiciones de falla de órgano de inversión y se recolectaron datos de forma concurrente durante la hospitalización y hasta 60 días después de BMT. Los criterios de exclusión incluyeron terapia de dosis en escala, anterior, y viral activa con soporte de células madre hematopoiéticas (ya sea PBSCT o BMT) . Se identificó la enfermedad veno-oclusiva hepática (HVOD) en pacientes con bilirrubina > 2 mg/dL después de 21 días después del trasplante con ya sea ganancia de peso > 5% desde la línea base o nuevo comienzo de hepatomegalia blanda. Se diseñó la lesión pulmonar aguda (ALI) como infiltrados bilaterales en roentgenograma de pecho durante tres fechas consecutivas con una relación de presión parcial de oxígeno en sangre arterial a la fracción de concentración de oxígeno inspirada (Pa02/Fi02) de menos de 300 en ausencia de disfunción cardiaca clínica. Se definieron como supervivientes los pacientes vivos 60 días después del trasplante. Se recolectaron plasma, elementos celulares en circulación y urina en el enrolamiento en el estudio (antes de recibir la quimioterapia) y en el día del BMT, varios días después de terminar la quimioterapia de alta dosis pero antes de la infusión de la médula. Se tomaron en alícuota muestras, y se colocaron inmediatamente en hielo antes del almacenamiento a -80 °C antes del análisis. Análisis de aminoácidos. Se realizó el análisis de aminoácidos en muestras plasmáticas crioconservadas de los días -8 y 0 (pre-tratamiento y día de trasplante) en 60 pacientes. Las muestras de los pacientes se seleccionaron inicialmente al azar para estudios piloto; se ' enriquecieron específicamente de forma subsiguiente las muestras analizadas para incluir agentes adicionales con el genotipo AA de SNP de la CPSI (ver más adelante) y pacientes adicionales con complicaciones post-BMT de HVOD y ALI . Se preparó un extracto de plasma libre de proteína por precipitación de proteína con ácido sulfosalicílico y filtración a través de un Acrodisc 4 de 0.45 µm (Gelman Sciences, Ann ARbor, Michigan). Se separaron los aminoácidos por cromatografía de intercambio catiónico usando un sistema de amortiguador de citrato de litio, clasificado con concentración iónica y pH de cuatro componentes en un analizador de aminoácidos Beckmann 7300 (Beckmann, Palo Alto, California) . La derivatización post-columna de los aminoácidos con ninhidrina permitió la detección de aminoácidos de amina primaria a 570 nm, y aminas secundarias a 440 nm. Se logró la cuantificación por calibración de instrumentos con materiales normales de referencia (Sigma, St. Louis, Missouri). Se examinaron citrulina, arginina y ornitina como índices de flujo medibles de los productos intermedios a través del ciclo de urea. Medición de metabolitos plasmáticos de óxido nítrico (NOx) . Se midió el NOx plasmático en un sub-grupo de pacientes usando reactivos de Griess modificados después que las muestras se desproteinaron e incubaron con cuentas de cadmio para convertir nitrato a nitrito. Detección de polimorfismo T1405N. Los cebadores de oligonucleótido desde dentro del g-es?mo exón (CGGAAGCCACATCAGACTGG (SEQ ID NO: 15) y el intrón (GGAGAGTGAAACTTGACAATCATC (SEQ ID NO: 16)) de CPSI y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar confiablemente un fragmento de 251 pb que abarca la región que contiene el cambio de ADN genómico obtenido de preparaciones de capa leucocitaria o sedimento urinario. Esta combinación de cebadores dio amplificación reproducible usando las cuentas.

- Ready-to-Go de PCR (Pharmacia) y las condiciones del ciclo de PCR como sigue: 35 ciclos de 1 minuto fijación a 55 °C, extensión de 1 minuto a 72 °C, y desnaturalización de 1 minuto a 94°C. Después del tratamiento con formamida, se sometieron las muestras a electroforesis durante 4 horas a 4°C en un gel MDEm no desnaturalizante (FMC, Rockland, Maine) , luego se tiñeron con nitrato de plata para detectar fragmentos de ADN. La genotipificación confirmadora de 17 individuos usando tanto electroforesis en gel no desnaturalizante como análisis directo de secuencia produjo resultados idénticos. Los paciente se clasificaron como que tienen los genotipos homocigosos de SNP de CC o AA, o como que son heterocigosos (AC) . Por comparación, usando métodos idénticos, un cohorte de 100 pacientes con enfermedad de Alzheimer se analizó para valorar la distribución de los genotipos de SNP de CPSI. Análisis estadístico. Los niveles plasmáticos de aminoácidos antes y después de la quimioterapia, y los niveles entre los grupos de pacientes, se compararon usando la prueba T de Student o la prueba de suma de condición de Wilcoxon (si los datos no se distribuyeron de forma normal) . Se comparó la distribución de los genotipos de CPSI a través de grupos al calcular la frecuencia alélica para el grupo completo y al buscar evidencia del desequilibrio de ardí-Weinberg en los subgrupos específicamente seleccionados usando análisis de P2. Se generaron valoraciones de sensibilidad, especificidad, valores predictivos y riesgo relativo a partir de tablas de contingencia de dos por dos construidas usando los valores específicos de los aminoácidos en los grupos de pacientes divididos por presencia y ausencia de resultados clínicos específicos (por ejemplo, HVOD, ALI, y muerte) . Resultados Se enrolaron doscientos pacientes en el estudio de BMT-LIFE . 52% se sometieron a trasplante autólogo (edad media 46 + 1 año) ; 48% recibieron injertos alogénicos (edad media 40 ± 1 año) . De los pacientes que se sometieron a trasplantes alogénicos, 24% recibieron injertos de donadores no relacionados correspondidos en HLA. Casi dos tercios de los pacientes en el grupo autólogo fueron mujeres, reflejando la prevalencia incrementada de cáncer de mama en esta población. Las indicaciones para trasplante fueron diversas, pero 79% de los pacientes se trasplantaron para cáncer de mama, leucemia, o linfoma no de Hodgkin. Los diferentes regímenes preparativos usados antes de BMT- se incluyeron CTC (ciclofosfamida, tiotepa, carboplatina) , BuCy (busulfan, ciclofosfamida) , CVP16TBI (ciclofosfamida, etopósido, irradiación corporal total) , CBVP16 (ciclofosfamida, bis-cloroetilnitrosourea-r etopósido) y TC (tiotepa, ciclofosfamida) . Tanto la morbilidad como la mortalidad no son raros después de BMT. En tanto que la mortalidad total a los 60 días en el estudio fue de 14%, fue de 20% en pacientes que reciben aloinjerto-s . Las complicaciones de la lesión pulmonar aguda (ALI) y enfermedad veno-oclusiva hepática (HVOD) se presentaron cada una en 19% de los pacientes. De estas combinaciones fueron más de dos veces tan comunes en pacientes que reciben aloinjertos. En el grupo de pacientes que desarrollan HVOD, 62% (24/38) también cumplen los criterios para ALI durante la hospitalización. Sólo 38% (14/38 de los casos de ALI se presentaron en pacientes que nunca cumplieron con los criterios para HVOD. Un subconjunto (60/200) de los pacientes, específicamente enriquecidos durante la selección de muestras con pacientes adicionales con el genotipo AA SNP de CPSI y pacientes adicionales con complicaciones post-trasplante, tuvieron determinaciones plasmáticas de aminoácidos antes de la administración de quimioterapia y en el día de trasplante. La comparación de los niveles de aminoácidos seleccionados que participan en el UC (citrulina, ornitina y arginina) antes y después de la quimioterapia reveló diferencias significativas. Los niveles de citrulina cayeron en virtualmente todos los pacientes con una disminución media por grupo de 23.4 ± 1.3 µM a 9.1 ± 0.7 µM (P < 0.05). Los niveles de arginina se elevaron por aproximadamente 3.5% (P < 0.05), los niveles de ornitina se elevaron por 21% (P < 0.05). La relación de ornitina/citrulina (relación de o/C) , un Índice de flujo a través de los pasos tempranos del UC (es decir, valores menores indican mejor flujo de ciclo) , se incrementaron desde 3.9 ± 0.7 en el enrolamiento al estudio a 11.8 ± 1.8 después de la quimioterapia de inducción (p < 0.05). También se presentaron desplazamientos en los aminoácidos que no son parte del UC. Los niveles de glicina y alanina, dos aminoácidos alifáticos, cayeron significativamente por 11% y 19%, respectivamente, en un patrón no consistente con el flujo disminuido de productos intermedios a través del ciclo simplemente debido a ingestión disminuida de proteína (crónica o aguda) . Los niveles de fenilalanina y metionina se elevaron por 43% y 23%, respectivamente, sugiriendo - disfunción hepática subclínica. Los niveles plasmáticos de linea base de citrulina y las relaciones de O/C tuvieron importancia de prognosis. Los supervivientes de sesenta días de BMT tuvieron mayores niveles de línea base de citrulina que los no supervivientes (24.4 ± 1.3 vs 17.7 ± 2.9 µM, respectivamente; P < 0.05). El riesgo relativo de muerte antes de los 60 días después de BMT fue de 2.92 para pacientes con un nivel de cítrulina en el enrolamiento menor a 20. El valor predictivo negativo para muerte de nivel plasmático de citrulina mayor _:de 20 µM fue de 90%. Las relaciones de O/C en el enrolamiento fueron significativamente menores en pacientes que nunca desarrollaron ni HVOD (2.8 ± 0.2) ni ALI (2.9 ± 0.2) en comparación a pacientes quienes desarrollaron de manera subsiguiente estas complicaciones (5.8 ± 1.9 y 6.5 ± 2.7, respectivamente; P < 0.05). La comparación de las relaciones de O/C entre los supervivientes de 60 días y los no supervivientes de BMT en el enrolamiento en el estudio mostró una tendencia hacia valores menores en los supervivientes (3.3 ± 0.2 vs 6.9 ± 3.9; P = 0.06). El valor predictivo negativo para muerte dentro de los 60 días después de BMT asociado con una relación de O/C de línea base menor de 2.5 fue de 92%. Varios niveles de los productos intermedios de aminoácidos del ciclo de urea, después de la terapia preparativa, en el día del BMT, también tienen importancia. Los valores plasmáticos de arginina fueron mayores en los supervivientes (114.5 ± 5.9 µM) en comparación a los no supervivientes (92.3 ± 10.4 µM) (P < 0.05). Las relaciones de O/C fueron significativamente mayores, sugiriendo más UCF dañada, en pacientes quienes desarrollaron posteriormente ALI en comparación a aquellos que nunca desarrollaron disfunción pulmonar severa (18.4 + 5.9 vs 9.5 ± 0.7; P < 0.05). Aunque el valor predictivo negativo para desarrollo de ALI de una relación de O/C en post-quimioterapia menor de diez fue alta (86%) , el riesgo relativo para mortalidad asociada con este umbral fue de sólo 1.44. Hubo una tendencia hacia mayores relaciones de O/C en pacientes en el dia del BMT en pacientes quienes desarrollaron de manera subsiguiente HVOD (P = 0.09). En 62 pacientes se midieron los niveles de los metabolitos de óxido nítrico (NOx) en plasma. Los niveles en plasma de N0X cayeron 20% después de la terapia de inducción, desde 40 ± 2 µM en el enrolamiento al estudio a 32 ± 2 µm en el día de BMT (P < 0.05). El valor medio de NOx en el día de BMT en 20 pacientes que desarrollan ya sea HVOD o ALI fue de 28 µM; para pacientes sin esas complicaciones el NOx plasmático fue de 35 µM. No se observaron diferencias claras entre NOx plasmático cuando se compararon pacientes con diferentes genotipos de SNP de CPSI .

Para valorar si ciertos pacientes pueden tener una predisposición genético a desarrollar complicaciones mórbidas después de la terapia de inducción y BMT, todos los pacientes en el estudio se genotipificaron para un SNP de CPSI . De los 200 pacientes, se analizaron los datos de 196 pacientes (es decir, 2 exclusiones clínicas; 2 amplificaciones' no exitosas por PCR) para determinar si el SNP C4340A de CPSI estaba en equilibrio de Hardy-Weinberg con el desarrollo de HVOD. La distribución de los genotipos de SNP de CPSI en pacientes que se someten a BMT fue idéntica a aquella del grupo de control (100 pacientes con enfermedad de alzheimer) : 44% CC (tipo silvestre) , 45% AC (heterocigoto) , y 11% AA (homocigoto para la transversión) . La velocidad de ataque de la HVOD en aquellos con el genotipo CC o AC fue de 18% y 24%, respectivamente. No hubo casos de HVOD en pacientes con el genotipo AA. El hallazgo que esta distribución alélica no estaba en equilibrio de Hardy-Weinburg con el desarrollo de HVOD (P2 = 5.06, P < 0.05) sugiere que los genotipos AA de SNP alteran la susceptibilidad a toxicidad hepática después de la quimioterapia de inducción. También hubo tendencias hacia diferencias en la mortalidad 60 días después de BMT entre los genotipos de SNP-. Ningún superviviente sustituyó 15% y 20% de los grupos de los genotipos AC y CC, respectivamente. De manera interesante, todos los pacientes con el genotipo AA sobrevivieron 60 días después de BMT (p2 = 3.36; p = 0.06). De interés, casi toda la clasificación de P2 vino de la célula superviviente/AA. No hubo diferencias significativas entre los pacientes con diferentes genotipos C4340A de SNP en la velocidad de ataque de ALI (16%, 15%, y 25% en los grupos AA, AC, y CC, respectivamente) . En tanto que la ALI se asoció con mortalidad significativa en pacientes con ya sea los genotipos AC o CC (71% y 66%, respectivamente) , todos los pacientes con el genotipo AA quienes desarrollaron ALI tuvieron eventualmente resolución de ambos infiltrados pulmonares bilaterales en CXR e intercambio dañado de gases y sobrevivieran 60 días después de BMT. Análisis Los datos presentados en este ejemplo reflejan una asociación cercana entre HVOD y ALI en pacientes después de BMT, con casi dos tercios de los pacientes con HVOD que cumplen los criterios para ALI . En este estudio, 68% (26/38) de los pacientes que desarrollaron ALI requirieron ventilación mecánica. Rubenfelt y Crawford han reportado una supervivencia significativa, definida como extubación seguida por despido del hospital con supervivencia de treinta días, de sólo 6% en pacientes que requieren ventilación mecánica después de BMT. Ver Rubenfeld, G. D. Y Crawford, S. W. , Annals of Internal Medicine (1996) 125:625-33. La HVOD permanece como la principal toxicidad limitante de la dosis de la quimioterapia con dosis en escala. Se caracteriza clínicamente por retención de fluidos, ictericia, ascitis, y agrandamiento hepático doloroso que se presenta en el espacio de 3 semanas de BMT. Los estudios de autopsia de aquellos pacientes que no sobreviven que cumplen con estos criterios clínicos proporcionan confirmación histológica en > 80% de los casos y son consistentes con la idea que la trombosis local mejorada puede ser un evento iniciador en la patogénesis de HVOD. La falla significante en los niveles de citrulina y el aumento en los niveles plasmáticos de ornitina de los pacientes que se someten a BMT sugieren una perturbación significativa en el flujo de compuestos intermedios de carbono a través del UC hepático en pacientes después de quimioterapia de inducción. El análisis de los patrones de otros aminoácidos sostienen la opinión que este efecto no es simplemente debido a ingestión disminuida de proteína. En contraste a los patrones vistos en pacientes con inanición, donde los niveles de glicina y aminoácidos de cadena ramificada (BCAA) están usualmente elevados de forma significativa, se observó una caída en glicina y ningún cambio significativo en los BCAA. Adicionalmente, la inanición tiende a incrementar la actividad de la CPSI en el hígado y no debe conducir incrementos en ornitina plasmática. La capacidad de pretratamiento de los pacientes que se someten a BMT para mantener el flujo de compuestos intermedios a través del UC tiene importancia particular de prognosis. Los no supervivientes de sesenta días después de BMT y aquellos pacientes que desarrollan HVOD o ALI tuvieron niveles significativamente menores de citrulina y altas relaciones de O/C en comparación a pacientes quienes no desarrollaron estas complicaciones. De interés fue la observación que los no supervivientes de BMT tuvieron menores niveles plasmáticos de arginina después de la terapia de inducción en comparación a los pacientes sobrevivientes. En vista de la agrupación de las células que contienen enzimas anticipadas de UC alrededor de las vénulas hepáticas terminales, las concentraciones locales tanto de arginina como de óxido nítrico (NO) pueden ser mucho mayores y pueden jugar un papel importante en el mantenimiento de la abertura de estos bazos y la regulación del flujo sanguíneo hepático regional. Los estudios que muestran una reducción significativa en los niveles plasmáticos de NOx después de la quimioterapia de inducción soportan la idea que se altera la producción de NO durante el BMT. La discrepancia aparente entre niveles plasmáticos aparentemente normales de arginina en el día de trasplante y NOx plasmático marcadamente reducido acentúa la cinética in vivo compleja del flujo de arginina y citrulina a través de los diferentes alojamientos de los órganos. Los estudios de isótopos estables de la homeostasis de arginina en cuerpo completo han indicado que sólo aproximadamente 15% de la producción de arginina plasmática se asocia con formación de urea, y que sólo 1.2% de la producción de arginina plasmática se asocia con formación de NO. " Adicionalmente, los estudios in vitro han documentado canalización sustancial de compuestos intermedios del cicló de urea, desde citrulina a arginina, que no se ve influenciado por provisión exógena del sustrato. La capacidad de un paciente individual para mantener la función del ciclo de urea y la producción hepática de NO durante las tensiones de la quimioterapia de inducción pueden, en parte, tener influencia en su resistencia a complicaciones después de BMT. Puesto que no hay disparidad de género en la ocurrencia de HVOD, se concentraron en cuestiones farmacogenéticas potenciales relacionadas a CPSI, un gen autoso almente codificado, en lugar de un gen de ornitina-transcarbamilasa X-enlazado. En tanto que caracterizando los cambios moleculares que fundamentan las causas de la deficiencia de CPSI neonatal y de comienzo tardío, un SNP común cerca del extremo 3' del ARNm de CPSI (heterocigosidad 0.44) se identificó. Esta transversión C4340A se codifica para una sustitución prevista de asparagina (AAC) por treonina (ACC) en el aminoácido 1405 (T1405N) . Esta treonina está dentro del dominio alostérico, que precede a la secuencia PV(A/S)WP(T/S) (A/Q)E importante en la unión de un co-factor, n- acetil-glutamato (NAG) , que incrementa la actividad enzimática. Aunque los solicitantes no desean que se una por ninguna teoría particular de operación, se especula que en base al precedente de los efectos de otros xenobióticos, que la disponibilidad limitada de NAG después de la quimioterapia de dosis en escala es uno de los mecanismos que promueven la disfunción del ciclo de urea. Sin embargo, parece que la presencia del genotipo AA de SNP de CPSI se asocia con protección contra el desarrollo de HVOD, resolución de ALI si se presenta, y supervivencia mejorada en 60 días después de BMT. De esta manera, los datos sugieren que la alteración en la función de UC son un papel en la modificación de la interacción hígado-pulmón durante la sepsis y lesión pulmonar aguda. En resumen, este ejemplo documenta deterioro significativo en la función .hepática de UC en pacientes quienes recibieron quimioterapia de dosis en escala antes de BMT. Los pacientes con trastorno mental severo en la función del ciclo van a desarrollar más probablemente complicaciones mórbidas después de BMT. Adicionalmente, se ha encontrado una asociación significativa entre un SNP C4340A de CPSI y ambas complicaciones post-BMT y supervivencia a corto plazo. Estos datos son útiles en la valoración del riesgo de pacientes que se someten a BMT y proporcionar un fundamento para los intentos terapéuticos para dar soporte a la función de UC durante la quimioterapia de alta dosis.

Ejemplo 3 Terapia de complementación de arginina/citrulina La disminución adicionada en los productos del ciclo de urea (arginina y citrulina) y el incremento en los precursores (amoniaco, glutamina, etc.) que resulta del polimorfismo contribuyen a toxicidad asociada a BMT. Como parte del estudio de levantamiento de BMT, se midieron los niveles de citrulina y arginina en 10 pacientes que se someten a BMT. La quimioterapia de alta dosis usada en BMT interrumpe las funciones normales de las enzimas del ciclo de urea y contribuye ya sea a la ocurrencia de toxicidad asociada con HVOD. Para evaluar adicionalmente esta información, se realizó un análisis del plasma almacenado de diez pacientes que se someten a BMT antes del tratamiento y después de la terminación de la quimioterapia de inducción. Se determinaron los perfiles de aminoácidos de todas las muestras. Se puso atención particular a los compuesto intermedios del ciclo de urea, citrulina, arginina y ornitina. Como se muestra en la tabla 4, una disminución marcada en los niveles de citrulina de todos los pacientes desde una media de línea base de pretratamiento de 24 ± 3 µmol/L a una media post-tratamiento de 8 ± 1 µmol/L (P < 0.001). Los niveles plasmáticos de arginina cayeron desde una media de 91 ± 6 µmol/L a 70 ± 6 µmol/L (P < 0.05), a pesar del' uso de la nutrición parenteral que contiene arginina en varios pacientes: Tabla 4 Aminoácidos ' Pre-quimio Post-quimio Valor P - Citrulina 24 ±3 µM 8 ± 1 µM < 0.001 Arginina 91 ± 6 µM 70 ± 6 µm 0.03 La caída en citrulina y arginina fue similar en pacientes quienes - .recibieron y no recibieron nutrición parenteral total y fue la misma en hombres y mujeres. Las disminuciones en la citrulina sugieren que hay una disminución en el flujo a través- de los primeros pasos del ciclo de urea (figura 1) . De esta manera, de acuerdo con la materia actualmente descrita, se proporciona un método para reducir la toxicidad y/o la ocurrencia de HVOD en un paciente que se somete a BMT. Éste método comprende administrar al paciente con BMT, arginina y/o ceitrulina, en algunas modalidades citrulina, en una cantidad efectiva para estimular la síntesis de arginina NO en el paciente. La estimulación de la síntesis de arginina y NO en el paciente reduce y/o previene sustancialmente la ocurrencia de HVOD asociada con BMT. La citrulina es un agente de complementación de ejemplo dado que se convierte más fácilmente a NO.

Ejemplo 4 Construcción de un clon de expresión funcional de CPSI de longitud completa Después de intentar varias estrategias, se construyó un clon de expresión de ADNc de CPSI de humano que contiene la región codificante completa. Las figuras 6 y 7 presentan diagramas esquemáticos que ilustran el método usado para construir el clon -de expresión. Este clon se ha secuenciado completamente y no contiene ningún cambio de la secuencia de consenso de CPSI que se ha caracterizado en la técnica. La capacidad del clon para elaborar proteína de CPSI se probó que células COS-7. Se eligieron células COS-7 por sugerencia de actividad o producción nativa de CPSI. Se preparó un análisis por transferencia western de las células COS-7 transfectadas con la construcción Í1CPSI-PCDNA3.1. Se usaron extractos de células HepG2 como un control puesto que estas células derivadas del hígado tienen actividad retenida de CPSI. Se usaron células COS-7 no transfectadas como un control negativo. Diferente de las células COS-7 no transfectadas, las células HepG2 y COS-7-flCPSI demostraron la banda esperada de 160 kD usando un anticuerpo de conejo anti-CPSI de rata. Adicionalmente, se realizó un ensayo colorimétrico para detectar la producción de carbamil-fosfato a partir de amoniaco. Como se muestra gráficamente en la figura 8, las células cortadas demostraron actividad similar a las células HepG2 en tanto que no lo hicieron las células COS- 7 no transfectadas. Se ha realizado la mutagénesis dirigida al sitio en el inserto de CPSI que contiene T1405 y se ha creado una copia con un codón polimórfico N1405. El codón polimórfico N1405 se secuenció para su longitud completa y no se detectaron otros cambios. El sistema QUIKCHANGEMR (Stratagene), que aprovecha la metilación introducida en el ADN por la - bacteria hospedadora, se usó para preparar esta construcción. Estas construcciones se usan para proporcionar un suministro sostenido de proteína recombinante de CPSI como se codifica por ambos alelos, (T1405, N1405) usando células COS y las construcciones respectivas de ADN 3.1 de CPSI/PC como un sistema de expresión. Se ha producido CPSI enzimáticamente activa usando este sistema como se muestra por la gráfica en la Figura 8. Un componente de estos experimentos es determinar el efecto in vitro del polimorfismo T1405N en la función de CPSI . Como se analiza en los Ejemplos 1 y 2, este cambio afecta la sensibilidad de la enzima a las concentraciones de NAG. La evaluación de 20 individuos para el cambio de C a A mostró una proporción de heterocigosidad de 50% con 25% del grupo homozigoto AA. Esto sugiere que una porción significativa de la población general tiene una anormalidad cualitativa potencial en la función de CPSI. Esta anormalidad, en tanto que esta ausente bajo condiciones normales, se descubre por condiciones estresantes y toxinas tal como quimioterapia de alta dosis o administración de ácido valproico. Entonces se realiza en etapas la comparación de los productos de proteína. La primera etapa examina las características físicas del ARNm expresado y la proteína. Usando el inserto Northern como una sonda, se sondearon transferencias Northern de mensaje preparado de líneas de células COS-7 expresantes. Los controles positivos incluyen HepG2 y mensaje de hígado de humano. Los controles negativos fueron células COS-7 transfectadas con el cásete vacío pcDNA3.1. El mensaje derivado de flCPSI expresado es algo más pequeño que la CPSI nativa (4.9 kb vs . 5.7 kb) puesto que el clon no contiene la región 3' no traducida de 1 kb. Usando los mismos controles, se realizaron análisis de transferencia Western de los lisados celulares por SDS-PAGE. Se uso la tinsión con azul de Comassie para examinar la producción total de proteína. Para detección específica de CPSI, se usa un anticuerpo policlonal de conejo anti-CPSI de rata. Este anticuerpo detecta la CPSI expresada a partir de células COS-7 así como las muestras de control. Finalmente, se determinan los cambios en la estructura de la proteína al examinar el patrón de movilidad por electroforesis 2-D, una herramienta útil para detectar cambios de conformación. Cualquier cambio grande en la confirmación explica igualmente la alteración de la función de CPSI para esta mutación. La siguiente etapa comprende la medición de las características funcionales de las enzimas expresadas. Se ha modificado un ensayo colorimétrico sensible para este propósito (Pierson, D. L., J. Biochem . Biophys . Methods, 3:31- 37 (1980) ) . El ensayo modificado permite 4-5 análisis de 20-50 mg de tejido o células. El tejido se homogeniza primero en KCl 0.75M. Se remueven las moléculas pequeñas, incluyendo ATP y NAG, a través de una columna SEPHADEXMR G25 (Boehringer) . La mezcla de reacción contiene bicarbonato de amonio, ATP, DTT de magnesio, n-acetilglutamato (NAG) , y trietanolamina. La concentración de cualquier reactivo se puede variar, y los experimentos en las células HepG2 muestran actividad disminuida tanto con baja como alta concentración de NAG (0.50 M) . La ausencia de NAG en los experimentos preliminares de expresión de células COS-7 no produce actividad enzimática medible . Puesto que la CPSI es una enzima alostérica, no sigue la cinética de Michaelis-Menton bajo concentraciones variables de NAG; sin embargo, cuando se fija la cantidad de NAG, es estable la producción de carbamil-fosfato. Como se muestra en la Figura 8, se mide la producción de carbamil-fosfato por la adición de hidroxilamina a la solución después de la incubación a 37 °C durante periodos variables de tiempo (0, 5, 10, 20, 25, 30 minutos) . Este paso, llevado a cabo a 95 °C, también sirve para inactivar la enzima y prevenir la producción adicional de carbamíl-fosfato. La hidroxilamina convierte el carbamil-fosfato a hidroxiurea que subsecuentemente se trata con una solución de ácido sulfúrico/acético con butanodiona para derivar un compuesto con adsorción pico a 458 nm. La reacción entonces se centrifuga a 12 000 X g durante 15 minutos para remover la proteína precipitada. A continuación, se mide la absorbancia 458 nm para cada reacción. La actividad empieza típicamente a disminuir después de 20-30 minutos de reacción. Se mezclan para análisis varios sedimentos de células expresantes. Para medir estas actividad, las mediciones se basan en cantidades consistentes de enzima, la CPSI expresada se cuantifica por análisis de transferencia Western de la a mezclada usando un anticuerpo de CPSI tal como el anticuerpo de conejo anti-CPSI de rata descrito anteriormente en la presente. Se determina primero la actividad basal usando cantidades fijas de sustrato y cofactor y un análisis de transcurso de tiempo. Entonces se usan cantidades variables de bicarbonato de amoniaco, ATP, y NAG para determinar la eficiencia de unión para estos elementos . Estos elementos se varían desde 0 a 10 veces la cantidad normal. También se mide la actividad de la enzima después del tratamiento térmico del homogenado. Se realizan experimentos de marcación de proteína (pulso-búsqueda) para determinar la estabilidad de la proteína durante el tiempo. Se obtiene la expresión estable de proteína de CPSI usando los métodos descritos anteriormente. El establecimiento de líneas celulares transfectadas, permite la producción de suficientes cantidades de ambas variedades de CPSI para llevar a cabo estos estudios. En los estudios de actividad, se señala los cambios en la actividad para el N1405 en comparación al tipo T1405 de CPSI. También se señala un cambio en la actividad de la enzima bajo concentraciones variables de NAG. Estos resultados soportan el papel de este polimorfismo de la materia actualmente descrita al predecir la susceptibilidad a función sub-óptima del ciclo de urea e hiperamonemia y producción disminuida de arginina asociada con esta. Ejemplo 5 Relación del Polimorfismo T1405N y Productos Intermedios del Ciclo de Urea a la Elevación de Amoniaco Vista en Pacientes en Terapia con Ácido Valproico El ácido valproico (VPA) es un medicamento de convulsión comúnmente usado, particularmente para el tratamiento de convulsiones ausentes o como una terapia adjunta de otros trastornos de convulsión. La toxicidad del tratamiento de VPA es un proceso complejo y de múltiples variantes y refleja probablemente varias interrupciones metabólicas. La hiperamonemia y la esteatosis micro-vesicular hepática y necrosis son las complicaciones médicas, serias, más comúnmente reportadas . Aunque el desarrollo de hiperamonemia tóxica comprende solo un pequeño número de pacientes, tiene una morbididad y mortalidad significativa, y se han atribuido varias muertes a esta complicación. El desarrollo de la hiperamonemia asintomática (nivel plasmático de amoniaco mayor de 60 µmol/L) se presenta en el espacio de una hora de la administración de VPA, y es sin embargo, relativamente común. Mecanismos de Hiperamonemia Inducida por VPA. Los mecanismos por los cuales VPA provoca hiperamonemia han sido el sujeto de algunos debates, y varias teorías diferentes tienen actualmente soporte en la técnica. Un modelo renal propuso que el metabolismo cambiado en glutamina da por resultado una carga incrementada de amoniaco al hígado, en tanto que otras teorías se concentran en diferentes aspectos de la función del ciclo de urea. Ver, por ejemplo Warter et al . , Revue Neurologique, 139:753-757 (1983). Puesto que el ciclo de urea es el mecanismo principal para la remoción de amoniaco en humanos, se piensa que la hiperamonemia surge de alguna manera de las interacciones inhibitorias de VPA y/o sus metabolitos con la función del ciclo de urea y la capacidad. La evidencia de la disfunción del ciclo de urea en la terapia de VPA viene de varias observaciones experimentales y clínicas además de las elevaciones en amoniaco plasmático descrito anteriormente. Por ejemplo, Marrini et al., midieron una reducción en la actividad de CPSI de línea base y estimulada en animales no nefrectomizados después de una carga de aminoácidos y VPA (Marrini et al., Neurology 38:365-371 (1988)). Marrini et al también observaron que las ratas nefrectomizadas inyectadas con una carga de aminoácidos y VPA también desarrollaron hiperamonemia. Otro grupo, Castro-Gago et al., midieron aminoácidos en suero en 22 niños epilépticos tratados con VPA, y encontraron reducción en el ácido aspártico y -ornitina, implicando una disminución en la eficiencia del ciclo de urea en lugar de un incremento en los precursores (Castro-Gago et al., Childs Neurons System 6:434-436 (1990) ) . Importancia de Carbamil-Fosfato-Sintasa I. Los mecanismos de los déficit del ciclo de urea inducidos por VPA dan un giro típicamente alrededor de carbamil-fosfato-sintasa I (CPSI). Mitocondrial. Un paciente con toxicidad severa después de una sobredosis de VPA se encontró que tiene 50% de actividad normal de CPSI (Bourrier et al., Prese Medícale 17:2063-2066 (1988)). Los solicitantes han observado varios pacientes deficientes de CPSI moderada quienes se deterioraron cuando se les dio ácido valproico con una pronta inversión después de la descontinuación. Papel de NAG. El N-acetilglutamato (NAG) es un co-factor alostérico requerido para CPSI . Se sintetiza NAGA para glutamato y acetil-CoA en las mitocondrias, con una distribución celular que refleja aquella de CPSI (Shigesada et al., Journal of Biological Chemistry 246:5588-5595 (1971)). Se sintetiza a partir de glutamato (catabolismo de aminoácido) y acetil-CoA. Hay varias maneras en las cuales se contempla que una alteración de la disponibilidad de NAG reduce la actividad de CPSI. Se han observado deficiencias genéticas en NAG-sintetasa, y esta enzima se conoce que se inhibe de manera competitiva por sustratos alternativos tal como propionil-CoA ó succinato (Bachmann et al., New England Journal of Medicine 304:543 (1981); Kamoun et al., Lancet 48 (1987); Coude et al., J. Clin . Invest. 64:1544-1551 (1979); Rabier ' et al., Biochemie . And Biophys . Research Comm . 91:456-4"60 (1979); Rabier et al., Biochimie 68:639-647 (1986)). Se ha mostrado de manera experimental que CPSI se inhibe de una manera competitiva por la presencia de cantidades incrementadas de propionil-CoA, y que la terapia de VPA provoca un incremento en la concentración sanguínea de propionato (Coulter et al., Lancet 1 (8181): 1310-1311 (1980); Gruskay et al., Ped. Res. 15:475 (1981); Schimidt, R. D., Clin Chim. Acta. 74:39-42 (1977)). También se ha mostrado que una exposición de VPA disminuye concentraciones de NAG en hepatocitos intactos, al disminuir las concentraciones tanto en acetil-CoA y glutamina (Coude et al., Biochem . J. 216:233-236 (1983)). La disminución en la concentración de glutamina se atribuye a la inhibición tanto de piruvato-deshidrogenasa como de piruvato-carboxilasa. De manera alternativa, se ha sugerido que el agotamiento de acetil-CoA mitocondrial se presenta debido a que CoA se desvía en la terapia de VPA para la elaboración de valproil-CoA (Becker et al., Archives of Biochemistry & Biophysics 223:381-392 (1983)). Es bien conocido que VPA también interrumpe la ß-oxidación de ácidos grasos, con disminución resultante de acetil-CoA (Eadie et al., Med. Toxicol . 3:85-106 (1998)). Todos estos mecanismos pueden conducir a una escasez de NAG puesto que se sintetiza a partir de acetil-CoA. Dados los efectos de VPA en la disponibilidad de NAG se deduce que cualquier cambio en las propiedades de unión de CPSI por NAG afectará su actividad. De esta manera, este Ejemplo expone experimentación para determinar la correlación entre la presencia o ausencia del polimorfismo de la materia actualmente descrita en el gen de CPSI con susceptibilidad a hiperamonemia usando VPA como un agente modelo para la producción de hiperamonemia. Inicialmente, se aisla ADN genómico de pacientes quienes están empezando terapia con ácido valproico para genotipificación del polimorfismo T1405N de acuerdo con los métodos descritos en la presente, tal como amplificación por PCR y el uso de geles no desnaturalizantes. Después de la genotipificación de estos pacientes, se realiza la determinación pre- y post- tratamiento de aminoácidos y amoniaco para estos pacientes. De manera particular, se aisla ADN de la sangre entera usando el equipo QIAmp1^ (Qiagen) descrito en el Ejemplo 1. Entonces, se determina la concentración total plasmática de VPA por una técnica de inmunoensayo mediado por enzimas (EMITMR Syva-Behring, San José California en un analizador Syva 30RMR) . Esta técnica utiliza unión competitiva para los sitios de unión del anticuerpo de VPA entre VPA en el plasma del paciente y aquel vuelto complejo con la enzima G6PDH. La liberación del complejo de la enzima de VPA del anticuerpo reactiva la enzima, y se valora su actividad por la velocidad de formación de NADH en la adición del sustrato. Se monitoriza la producción de NADH mediante espectroscopia a 340 nanómetros (nm) . Se aisla VPA libre (no unido a proteína) del plasma usando un dispositivo de filtración de micro división centrífuga con un corte de 3000 Dalton (CENTRIFREE, Amicon, Beverley, Masschusetts) . Se mide la concentración de VPA en el ultrafiltrado plasmático como se describe para VPA total. Se analizan los datos recolectados de los pacientes con VPA para correlaciones entre el genotipo y el fenotipo. Adicionalmente, se comparan el fraccionamiento de VPA libre y conjugado para evaluar los efectos en la producción y disponibilidad de NAG. Esta última comparación se prepara dado que hay efectos conocidos d VPA en la disponibilidad de NAG. Por ejemplo, se ha mostrado que la exposición de VPA disminuyen las concentraciones de NAG en hepatocitos intactos al disminuir las concentraciones tanto de acetil-CoA como de glutamina. Ver Coude et al., Biochem . J., 216:233.236 (1983). De esta manera, esta comparación refleja que los cambios en las propiedades de unión de CPSI para NAG afecta la actividad de CPSI. Ejemplo 6 Detección de Polimorfismos Adicionales en CPSI Usando las técnicas desarrolladas para análisis de mutación del mensaje de CPSI, se valoraron 10 pacientes no relacionados, no deficientes de CPSI para polimorfismos adicionales en la región codificante. Esto se hace usando transcriptos "ilegítimos" de las líneas de células de fibroblasto y linfoblastoides . Los polimorfismos con un efecto extendido en la población deben ser evidentes en este tamaño de muestra. Como se usa en la presente y en las reivindicaciones, el término "polimorfismo" se refiere a la ocurrencia de dos o más secuencias o alelos alternativos genéticamente alternativos, en una población. Un marcador polimórfico es el sitio que en el cual se presenta la divergencia. Los marcadores del ejemplo tienen al menos dos alelos, cada uno que se presenta a la frecuencia de más de 1%. Un sitio polimórfico puede ser tan pequeño como un par de bases. Loas marcadores polimórficos proporcionados incluyen de esta manera los polimorfismos con una longitud de fragmento de restricción, un número variable de repeticiones en tándem (VNTR) , regiones hipervariables, minisatélites, repeticiones de binucleótidos y repeticiones de tetranucleótidos . Se han llevado a cabo varias técnicas de detección de "mutación" todas las cuales se basan en cambios detectables en la movilidad del ADN de hebra individual no desnaturalizado, como se describe por Summar, M., J. Inherited Metabolic Disease 21:30-39 (1998). Los ejemplos de las mutaciones de CPSI identificadas por estas técnicas se describen en la Figura 3. Debido al gran tamaño del mensaje de CPSI (aproximadamente 5700 bases) se puede emplear un método para detectar una gran cantidad de ADN en unas pocas reacciones. La huella distintiva de endonucleasa de restricción (REF) proporciona la detección de grandes fragmentos de ADN, de hasta aproximadamente 2 000 pb con excelentes sensibilidad. Se llevan a cabo reacciones de transcriptasa invertida (RT) usando 1 µg de ADN total y ya sea un sevador oligo-dT o un sevador antisentido del punto medio del mensaje de CPSI. Usando -el producto de RT como plantilla, se realizan reacciones de PCR con 4 diferentes conjuntos de cebadores creando 4 fragmentos traslapados que abarcan la región codificante de 4600 bases. Se corren reacciones de PCR de control con cada conjunto de experimentos, para asegurar que no se amplifique una plantilla contaminante. El ADN genómico no se prefiere para este estudio debido al tamaño del gen (80 000+pb) , el número de intrones (36) , y que no se ha acompletado la secuenciación de los límites intrón-exón para CPSI. Sin embargo, en la Figura 9 se caracterizan gráficamente ubicaciones intrónicas. Los 4 productos de RT/PCR traslapados, descritos anteriormente, se usan para detección de mutación. El análisis cuidadoso de los mapas de restricción conduce, a la selección de tres enzimas de restricción para cada fragmento que los escinde en piezas que varían desde 100-250 bp. Los fragmentos de este tamaño son ideales para análisis de polimorfismo de conformación" de hebra individual (SSCP). Las enzimas se seleccionan tal que cada fragmento se puede evaluar de manera uniforme a través de su longitud. Antes de la digestión, los productos de PCR se purifican por electroforesis en gel y aislamiento de los cortes de agarosa. Después de 3 horas, se precipitan con etanol los fragmentos digeridos. Estos fragmentos se separan en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 6%, a 4°C que corre a 35 watios constantes. Estas condiciones aumentan al máximo la detección de los cambios conformacionales en los fragmentos de hebra individual, como se describe por Liu, Q, and Sommer, S. S., Biteaníg/ues 18 (3) : 470-477 (1995). Se realiza la detección de ADN por tinción con plata y los geles se marcan para desplazamiento de movilidad. En base a la ubicación de cualquier fragmento desplazado, el análisis directo de la secuencia del producto de RT/PCR se realiza usando un protocolo de secuenciación de ciclo.' Para eliminar la posibilidad de una mutación que resulta de errores de Taq de polimerasa, se amplifica un producto de RT reciente y se secuencia en cada caso. Las 4600 bases completas del mensaje codificante se evalúan rápidamente de esta manera. Se secuencian cualquiera de las regiones que contengan áreas no claras, buscando cambios en la secuencia esperada. Los productos de digestión por restricción de cada fragmento de RT/PCR se aislan. Estos fragmentos individuales" entonces se corren contra la digestión combinada en un gel no desnaturalizante como se describe anteriormente. Al caracterizar el patrón de fragmento de esta manera, se identifican fácilmente las porciones del mensaje de CPSI comprendidas en cualquiera de los desplazamientos observados de movilidad. Los polimorfismos detectados en estos experimentos se genotipifican contra el panel de origen de Centre d'Estude Polymorphsim Humanise (CEPH) para establecer la frecuencia. Se examinan todos los cambios para su efecto en el uso de codones y aquellos que dan por resultado mutaciones sustitutivas usando los datos de caracterización de CPSI descritos en la presente.

Se usan las técnicas descritas en el Ejemplo 3 para expresar mutantes dirigidos al sitio que contienen estos cambios. Usando este sistema, se observan los efectos de los cambios en la producción de actividad de CPSI . Se detectó un polimorfismo AT344A en CPSI . Se usaron cebadores de oligonucleótidos del 10-es exón (U1119 : tactgctcagaatcatggc - SEQ ID NO : 17) e intrón (LllO+37 : tcatcaccaactgaacagg - SEQ ID NO : 18) para amplificar un fragmento de 91 pb que contiene el cambio. Las condiciones del ciclo de PCR fueron: 35 ciclos de 1 minuto de fijación a 59°C, extensión de un minuto a 72°C, y 1 minuto de desnaturalización a 94°C. Los pacientes se clasificaron como que tienen ya sea genotipos homozigotos de S?P de AA ó TT, o como que son heterocigotos (AT) . La distribución de población adulta de este polimorfismo es 35% de AA, 44% de AT, y 21% de T. También se detectó en CPSI un polimorfismo 118-CTT. Se usaron cebadores de oligonucleótido de la región 5 '-no traducida (U5 ' 74 : ggttaagagaaggaggagctg - SEQ ID NO:19) e intrón (L175 raaccagtcttcagtgtcctca - SEQ ID NO : 20) para amplificar un fragmento de 249 pb que contiene el cambio. Las condiciones del ciclo de PCR fueron: 35 ciclos de 1 minuto de fijación a 59°C, 1 minutos de extensión a 72°C y 1 minuto de desnaturalización a 94°C. Se clasificaron los pacientes como que tienen ya sea un genotipo homocigoto con la inserción o supresión de 118 trinucleótidos o como que son heterocigotos. La distribución en población adulta de este polimorfismo es 34% de CTT-, 43% heterocigotos, y 23% CTT+. Ejemplo 7 Alteraciones Bioquímicas y Genéticas en Carbamil-Fosfato- Sintetasa I en Pacientes Neonatales con Hipertensión Pulmonar Persistente. Este ejemplo investiga el papel de la limitación de la producción endógena de NO en la patogénesis de hipertensión pulmonar persistente (PPHN) en neonatos de término, enfermos. El NO endógeno es el producto del compuesto intermedio de ciclos de urea, arginina. La producción de arginina depende de la enzima determinante de la velocidad del ciclo de urea, la carbamil-fosfato-sintetasa (CPSI) . Los recién nacidos poseen menos de la mitad de la función normal del ciclo de urea lo que los hace particularmente susceptibles a cambios menores en la forma y función de la enzima. Se ha observado un polimorfismo exónico común (T1405N) en CPSI que afecta el flujo a través del primer paso del ciclo de urea. En este ejemplo, se probó si los recién nacidos quienes desarrollaron PPHN tuvieron menos precursores de NO (arginina y_ citrulina) que los controles correspondidos.

También se analizó si' los pacientes de PPHN tienen predominantemente los genotipos CC (treonina/treonina) o AC (asparagina/treonina) . de CPSI que están asociados con menor función que el genotipo AA (asparagina/asparagina) de CPSI. Métodos . Se enrolaron cuarenta y siete neonatos de > 2 kilos, de > 35 semanas, y de < 72 horas de edad quienes se admitieron a la Unidad de Cuidados Intensivos Neonatal 5 Vanderbilt con (n=22) y sin (n=25) hipertensión pulmonar ecocardiográficamente documentada. Se grabaron las mediciones clínicamente importantes de la severidad y esfuerzo respiratorio. Se obtuvieron los niveles de amoniaco y los perfiles plasmáticos de aminoácidos. Se determinaron los 10 genotipos al correr el ADN amplificado por PCR en los geles no desnaturalizantes MDEMR. Resultados. Los pacientes quienes desarrollaron PPHN tuvieron una arginina promedio de 21.5 µmol/l en tanto que aquellos que no tuvieron promediaron 38.3 µmol/l (p=0.0004).

Los promedios de citrulina fueron 6.1 µmol/l y 10.3 µmol/l respectivamente (p=0.02). Los niveles de arginina y citrulina se correlacionaron de forma inversa con la severidad e hipoxemia como se mide por índice de oxigenación, días de ventilación mecánica, y días que requieren 02 complementario.

El análisis del genotipo de los pacientes con PPHN para T1405N mostró 5CCs, 17ACs y OAAs, en tanto que los controles tuvieron 7CCs, 16ACs y 2AAs (Chi-cuadrado p=0.005 usando la frecuencia de alelo de la población esperada) . Los infantes con el genotipo CC tuvieron una media menor de arginina y citrulina . (21.5 µmol/l y 5.8µmol/l) que los infantes con el genotipo AA (31.5 µmol/l y 13.5 µmol/l) consistente con una diferencia funcional entre las dos formas de la enzima. Conclusiones. Este ejemplo muestra que el desarrollo de PPHN en recién nacidos enfermos se asocia con disponibilidad inadecuada de los compuestos intermedios del ciclo de urea, arginina y citrulina. El polimorfismo T1405N en el AD? de CPSI conduce a una función disminuida de la enzima y subsiguientes niveles inferiores de precursores de NO . Discusión. La carbamil-fosfato-sintetasa (CPSI) cataliza el paso determinante de la velocidad en el ciclo de urea, determinando de este modo los niveles en tejido de los compuestos intermedios de ciclos de urea que incluyen arginina y citrulina. Como se describe en la presente, un polimorfismo exónico de C a A, ampliamente distribuido, en el gen de CPSI cambia una treonina conservada a una asparagína en la posición 1405 cerca del dominio crítico de unión de N-acetil-glutamato . Los datos han mostrado que la agresión que contiene asparagina de CPSI exhibe cinética más eficiente en los estudios de función enzima. El alelo T1405N exhibe 50% de heterocigosidad y parece ser una variante poco notoria en adultos saludables normales. Las consecuencias del cambio cualitativo se pueden descubrir por condiciones estresantes . Como se describe en los Ejemplos 1-3, los adultos expuestos a quimioterapia de alta dosis en la preparación para transplante de médula ósea, que la enzima que contiene treonina produce niveles adecuados de arginina y citrulina y se asocia con una incidencia incrementada de enfermedad veno-oclusiva hepática, lesión pulmonar agudo y muerte. Con forma se genera óxido nítrico (NO) en las células endoteliales a partir de L-arginina por óxido nítrico-sintetasa (NOS) , pueden estar predispuestos los niveles disminuidos de los compuestos intermedios de ciclos intermedio de ciclos de urea _ a perturbaciones en el tono-vascular al limitar la producción de NO endógeno. En el estudio cohorte prospectivo de este Ejemplo, se investigó la posibilidad que pudiera estar comprendido un proceso similar en la patogénesis de hipertensión pulmonar persistente del recién nacido (PPHN) . El NO endógenamente producido funciona en la regulación de resistencia vascular pulmonar y en la transición de la circulación fetal a neonatal. Lipsitz, E. C, et al. J Pediatr Surg (1996) 31:137-140; Abman, S.S., et al. Am J Physiol (1990) 259 :H1921-H1927. Entre las 20 semanas de gestación y el nacimiento, la producción y función de CPSI es menor de 50% de los niveles en adulto. Esta deficiencia fisiológica puede descubrir el efecto de la mutación del gen T1405N particularmente si se acopla con otras tensiones neonatales que afectan la función hepática; por ejemplo, asfixia o sepsis.

Los pacientes elegibles para este estudio incluyeron neonatos apropiadamente crecidos > 35 semanas de gestación y > .2 kg de peso al nacer quienes se admitieron a la Unidad de Cuidados Intensivos Neonatal del Vanderbilt University Medical 5 Center (NICU) entre el 1 de Julio de 1999 y el 29 de Febrero de 2000 para síntomas de esfuerzo respiratorio. Se excluyeron los infantes con múltiples anomalías congénicas, síndromes genéticos conocidos y causas anatómicas de hipertensión pulmonar (hernia diafragmática congénica, síndrome de Potter, distrofia torácica asfixiante, etc) . Se obtuvo el consentimiento' de los padres para todos los enrolados. Cincuenta y un neonatos se les extrajo "13 ce de sangre en las primeras 72 horas de vida para los perfiles plasmáticos de aminoácidos, niveles de amoniaco y BUN, determinación de . metabolito de óxido nítrico, y genotipificación de CPS1. Se extrajo sangre antes de la transfusión sanguínea, ingestión de proteínas entérales o parenterales, administración de óxido nítrico inhalado, o canulación de ECMO. Los datos recolectados de los enrolados o matriculados incluyeron (1) características de línea base (peso al nacer, edad de gestación, sexo, raza, puntuaciones Apgar, diagnosis primario, cualquier complicación pulmonar, y edad ¿postnatal en el momento en que se retira la sangre) y (2) medidas de soporte respiratorio (Fi02, MAP, iNO, ECMO) y 5 respuesta clínica (ABG, duración de ventilación mecánica y 02 complementaria, supervivencia. Se usó el- Índice de oxigenación máximo [01 = Fi02 x MAP/Pa02] como una medida de la severidad del esfuerzo respiratorio. La diagnosis primaria predominante incluyo (1) asfixia al nacer: puntuación Apgar de 5 minutos <5 con acidosis mezclada en primer ABG o gas en sangre de cordón más evidencia o disfunción neurológica y otra lesión de órganos terminales, (2) síndrome de esfuerzo respiratorio (RDS) ; síntomas clínicos de esfuerzo respiratorio con campos de pulmón de vidrio esmerilado y broncogramas _aéreos en rayos X de pecho más hipercarbia/hipoxia combinada 'en ABG (Nota: dada la edad de gestación de estos neonatos, los infantes con esta imagen tendrían que haber tenido ya sea deficiencia de agente tensioactivo o neumonía congénita; sin embargo, en ningún caso se obtuvo cultivo positivo de aspiración traqueal) , y (3) síndrome de aspiración de meconio (MAS) ; historia de tinsión de meconio en la distribución más síntomas clínicos de esfuerzo respiratoria, hipoxemia e infiltrar los huesos en rayos X de pecho. Los infantes se definieron como que tienen hipertensión pulmonar (PPHN) si desarrollaron hipoxemia significativa- (Pa02 < 100 en 100% 02 > 6 horas) con anatomía intracardiaca normal y evidencia ecocardiográfica de presión arterial pulmonar elevada. Esta última se definió como (1) ductal de derecha a izquierda o bidirección de flujo ovalado de abertura o (2) presión arterial pulmonar elevada (>35 mm de Hg) en base al estimado Doppler del chorro de regurgitación tricúspide como se lee por una tercera parte sin conocimiento. Se realizó el análisis de aminoácidos en las muestras frescas de plasma en 47 pacientes. Se preparó un extracto de plasma libre de proteína por precipitación de proteína con ácido sulfósalicílico y filtrado a través de un Acrodisc 4 de 0.45 µm (Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan). Los aminoácidos se separaron por cromatografía de intercambio catiónico usando un sistema de amortiguador de citrato de litio graduado en concentración iónica a pH de cuatro componentes en un analizador de aminoácidos Beckmann 7300 (Beckmann, Palo Alto, California) . La derivatización postcolumna de aminoácidos con ninhidrina permitió la detección de aminoácidos de amina primaria a 570 nm, y aminas secundarias a 440 nm. Se logró la cuantificación por calibración de instrumentos con materiales normales de referencia (Sigma, St. Louis Missouri) . Se detectaron citrulina y arginina como índices medibles de flujo de los compuestos intermedio a través del ciclo de urea. Medición de metabolitos plasmáticos de óxido nítrico (NOx) . Se midió el N0X plasmático en un subgrupo de pacientes usando reactivos Griess modificados después de que las muestras se desproteinaron e incubaron con cuentas de cadmio para convertir nitrato a nitrito. Detección de SNP. Los sevadores de oligonucleótido desde dentro del 36esimo exón (U4295 - SEQ ID NO: 15) e intrón (LI36 - SEQ ID NO: 16) de CPSI y la. reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar de manera confiable un fragmento de 251 pb que abarca la región que contiene el cambio del ADN genómico obtenido de preparaciones de sangre entera. Esta combinación de cebadores da amplificación reproducible usando Taq-polimerasa (Promega) y las condiciones del ciclo de PCR como sigue: 35 ciclos de 1 minuto de fijación a 67 °C, un minuto de extensión a 72 °C, y 1 minuto de desnaturalización a 94 °C. Después del tratamiento con formamida, las muestras se sometieron a electroforesis durante 5 horas a 4°C en gel MDEMR no desnaturalizante (FMC. Rockland, Maine) , luego se tiñeron con nitrato de plata para detectar fragmentos de ADN. Los pacientes se clasificaron como que tienen genotipos SNP homocigotos de CC ó AA, o como que son heterocigotos (AC) . La genotipificación usando- electroforesis en gel no desnaturalizante y análisis directo de secuencia produjo resultados idénticos como aquellos descritos anteriormente. De esta manera, la distribución en población adulta del polimorfismo T1405N se determinó que es: 45% CC, 44% AC y 11% AA. Se usó una técnica idéntica a aquella descrita anteriormente para detectar el polimorfismo T344A. Se usaron cebadores de oligonucleótidos desde el oes?mo exón (U1119:tactgctcagaatcatggc - SEQ ID NO: 17) e intrón (LI10+37 : tcatcaccaactgaacagg - SEQ ID NO: 18) para amplificar un fragmento de 91 pb que contiene el cambio. Las condiciones del ciclo de PCR fueron: 35 ciclos de 1 minuto de fijación al 59, 1 minuto de extensión a 72 °C, y 1 minuto de desnaturalización a 94 °C. Los pacientes se clasificaron como que tienen ya sea genotipos SNP homocigotos de AA ó TT, o como que son heterocigotos (AT) . La distribución en población adulta de este polimorfismo es 35% AA, 44% AT, y 21% TT. - Se usó una técnica idéntica a aquella descrita anteriormente para detectar el polimorfismo 118-CTT. -Se usaron cebadores de oligonucleótido desde la región 5' no traducida (U5' -74: ggttaagagaaggaggagctg - SEQ ID NO: 19) e intrón (L175: aaccagtcttcagtgtcctca - SEQ ID NO: 20) para amplificar un fragmento de 249 pb que contiene el cambio. Las condiciones del ciclo de PCR fueron: 35 ciclos de 1 minutos de fijación a 59°C, 1 minuto de extensión a 72 °C, y 1 minuto de desnaturalización a 94 °C. Los pacientes se clasificaron como que tienen ya sea un genotipo homocigoto con la inserción o supresión de 118 trinucleótidos, o como que son heterocigotos. La distribución en población adulta de este polimorfismo es 34% de CTT-, 43% heterocigoto y 23% de CTT+. Se compararon los niveles de amoniaco y plasmáticos de aminoácidos entre los grupos de pacientes usando la prueba T de Student. Se compararon las distribuciones de los genotipos de CPSI a través de grupos al calcular la frecuencia alélica para el grupo completo y buscar evidencia del desequilibrio de Hardy-Weinberg en grupos secundarios específicamente seleccionados usando el análisis de Chi-cuadrado. De los 51 neonatos originalmente matriculados o enrolados, 25 desarrollaron PPHN en tanto que 26 no lo hicieron..No hubo diferencias estadísticamente significativas en las caracteristicas de línea base' de los dos grupos incluyendo el peso del nacimiento, edad de gestación, raza, o la edad postnatal en horas de los infantes en el enrolamiento. Sin embargo,"" hubo una ligera predominancia de varones en el grupo de control . La distribución de la diagnosis primaria se distribuyó de manera uniforme. En el grupo de PPHN, 5 infantes tuvieron asfixia de nacimiento, 9 infantes tuvieron RDS, 5 infantes tuvieron síndromes de aspiración de meconio, y 6 infantes tuvieron otros diagnósticos, incluyendo 4 infantes con PPHN primaria. En el grupo de control, 4 infantes tuvieron asfixia de nacimiento, 4 infantes tuvieron RDS, 3 infantes tuvieron MAS, y 11 infantes tuvieron otros diagnósticos. Las otras diagnosis incluyeron taquicardia supraventricular, anemia, trauma de nacimiento y sepsis viral. Ningún infante en el estudio tuvo un cultivo sanguíneo bacteriano positivo. Como se esperó, los infantes que tuvieron PPHN se les complicó su patología primaria para desarrollar enfermedad más severa que los controles por algunos criterios clínicos. Ocho de los infantes con PPHN requirieron tratamiento con NO inhalado (iNO) , 2 requirieron ECMO, y 2 murieron (un infante con asfixia y la falla del sistema de múltiples órganos en iNO; otro infante con displasia capilar alveolar se retiró de ECMO) . Obviamente, ninguno de los controles se trató con iNO o ECMO; y no hubo mortalidad en el grupo de control. Tres infantes en el grupo de PPHN se excluyeron del análisis. El infante que se le encontró que tiene displasia capilar alveolar en la biop-sia de tumor se consideró que tiene una etiología anatómica de hipertensión pulmonar. Otro infante se enroló equivocadamente con una hernia diafragmática congénita, y el tercero se enroló a las 119 horas de edad después de que ha iniciado TPN. Un infante del grupo de control sé excluyó del análisis después de que el análisis de los cariotipos reveló que la etiología de su hipotonía es el síndrome de Prader-Willi . Los infantes quienes desarrollaron PPHN tuvieron niveles significativamente menores en suero de arginina y citrulina en el análisis de aminoácidos. El nivel medio de arginina en los casos de PPHN fue de 21.5 ± 9.2 µmol/l en tanto que la citrulina media en los' casos de PPHN fue de 6.1 ± 3.6 µmol/l en comparación a 10.3 + 1 µmol/l en el grupo de control 6p = 0.02). No hubo diferencia significativas en los niveles de otros aminoácidos entre los dos grupos, incluyendo glutamina, glicina, alanina, lisina, valina, ornitina y leucina. El nivel de los aminoácidos esenciales totales (TEAA) fue ligeramente menor en los casos de PPHN, aproximadamente 537 µmol/l versus aproximadamente 654 µmol/l, pero esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p = 0.08), por el peso de nacimiento, edad gestacional, o número de horas de vida posnatal. Se encontró que el nivel de TEAA es significativamente mayor en los cuatroinfantes cuya sangre se retiro antes de las seis horas de edad (aproximadamente 1021.5 µmol/l versus aproximadamente 542 µmol/l, p = 0.0026). Esta diferencia se presume que refleja el cese reciente del influjo de proteína parenteral en estos infantes de la circulación placentaria. No se encontraron diferencias en los niveles de arginina y citrulina cuando se analizaron de manera separada las categorías de las diagnosis primarias de asfixia, RDS, MÁS y "otros". En cada grupo, los infantes con hipertensión pulmonar tendieron a tener menos dolores, pero los resultados no fueron estadísticamente significativos dado los pequeños números de infante en cada grupo. Por ejemplo, los infantes asfixiados con PPHN tuvieron una arginina media de aproximadamente 18.5 µmol/l en comparación a aproximadamente 52.7 µmol/l en controles asfixiados (p = 0.06) y una citrulina media de aproximadamente 6.8 µmol/l en comparación a aproximadamente 14.3 µmol/l (p = 0.04). Hubo una relación invertida entre los niveles de arginina y citrulina en suero y la severidad de la hipoxemia. Los valores de arginina y citrulina cayeron progresivamente _ conforme se incrementaron los dias de ventilación mecánica, y _ 'se incrementaron los días que requieren oxígeno complementario, peso de nacimiento, edad gestacional o número de horas de vida posnatal. Los niveles de NH3 en infantes con PPHN tendieron a ser ligeramente mayores que en los controles (54 ± 18.1 µmol/l versus 45.6 + 12 µmol/l) pero estos valores no fueron estadísticamente significativos (p = 0.08). En el análisis del genotipo T1405N de CPSI, de los 22 infantes quienes desarrollaron PPHN, 5 fueron de CC y 17 fueron de AC. No hubo AA en los casos de PPHN. En los 25 controles, hubo 7 de CC, 16 de AC y 2 de AA. Estas distribuciones de los genotipos entonces se compararon al calcular la frecuencia alélica esperada para el grupo completo revelando evidencia del desequilibrio de Ardí-Weinberg en el grupo de PPHN. En el análisis chi-cuadrado, estos dos grupos son significativamente diferentes entre sí con un valor p = 0.005. De los dos infantes con el fenotipo AA, un infante tuvo RDS en tanto que el otro sufrió de asfixia de nacimiento. Ningún infante logró aún una 01 = 15; ambos pasaron menos de una semana en el ventilador y < 10 días en el oxígeno. Los infantes con el genotipo CC tuvieron niveles medios de arginina de 21.9 + 7 µmol/l y niveles de citrulijna de 5.8 ± 1.8 µmol/l en tanto que los infantes con el genotipo AA tuvieron un nivel medio de arginina de 31.5 ± 3.5 µmol/l y un nivel medio de citrulina de 13.5 + 6.4 µmol/l. nuevamente, dado el pequeño número de AA, estos datos tienen dificultad en alcanzar significado estadístico con valores p de 0.1 y 0.006, respectivamente . Ejemplo 8 Incrementos de complementación intravenosa de citrulina Niveles plasmáticos de arginina en lechones La citrulina intravenosa no se ha usado anteriormente en un modelo clínico. Este ejemplo valoró la seguridad de citrulina IV y su efecto de los niveles de suero de arginina en lechones. Se utilizaron un total de 9 cerdos Duroc, con una edad de 5-21 días, con un peso mínimo objetivo de 4 kg. Todos los lechones se sometieron a inducción anestésica y traqueostomía. Se colocaron líneas centrales en la arteria femoral y vena femoral y la hemodinámica se monitor!zó de forma continua. Se administró citrulina (600 mg/kg IV) a 5 lechones. Se dio solución salina a animales de control. Se retiraron los aminoácidos de suero antes y cada hora después de la administración de citrulina. Los niveles en suero de arginina puntearon a 1-2 horas después de la administración IV de citrulina y permanecieron sostenidos por arriba de la línea base tres horas después, alcanzando significado en todos los puntos de tiempo en comparación a los controles (p < 0.001). No se observó inestabilidad hemodinámica. Niveles de arginina (µmol/L) después de citrulina IV Presión sanguínea arterial meria (mmHg) después de citrulina IV P > 0.05 en todos los puntos de tiempo. Farmacocinética : En base a los datos anteriores, se calculó la farmacocinética tanto para los niveles plasmáticos de citrulina como de arginina después de la dosis individual de citrulina IV. Los datos farmacocinéticos incluyeron vida media en plasma (t ) , constante de eliminación (Kel) , volumen de distribución (Vd) , y depuración plasmática (CLp) . Los niveles plasmáticos de citrulina se incrementaron rápidamente y demostraron a t = 1.5 hrs, Kel = .462 HR"1, Vd = 2.25 L, y CLp = 1.05 L/hr. Sin embargo, el efecto de la citrulina en arginina plasmática fue de interés debido a que ese substrato para NO-sintasa. La curva de concentración de los niveles plasmáticos de arginina se representa en la Figura 13. En base a" esta -curva, la farmacocinética de la arginina en plasma es como sigue: t = 18 hrs; Kel = 0.39 HR""1; Vd = 2.85 L; CLp = 0.11 L/hr. La vida media prolongada y la lenta depuración indican que una dosis individual de citrulina IV es efectiva para mantener los niveles incrementados de arginina plasmática durante un intervalo de tiempo bastante prolongado sin efectos perjudiciales en la hemodinámica. Ejemplo 9 Complementación con citrulina oral en cirugía cardiaca congénita Este ejemplo se refiere a la valoración de si la complementación de citrulina incrementa los niveles en suero de citrulina, disminuye el riesgo de hipertensión pulmonar post-operativa a través de la producción endógena de NO. De manera más particular, este ejemplo ' se refiere a la alternación si la complementación perioperativa de citrulina oral incrementa los niveles en suero de citrulina conduciendo a mayor producción de óxido nítrico mediante el ciclo de urea, disminuyendo de este modo el riesgo de hipertensión pulmonar post-operatoria . Se llevó a cabo un estudio de doble testigo, controlado con placebo, aleatorizado. Cuarenta infantes/niños, que se someten a corrección quirúrgica de sus lesiones cardiacas congénitas y en riesgo a desarrollar hipertensión pulmonar post-operatoria, recibieron ya sea citrulina oral o placebo. Se administraron de forma pre-operativa cinco dosis (1.9 g/m2/dosis) de citrulina o placebo, de una manera inmediatamente post-operativa, luego cada 12 horas durante tres dosi. El punto final primario de la citrulina en suero se midió en cinco puntos de tiempo. Se obtuvieron las mediciones resultantes secundarias de la presión sanguínea sistémica, metabolitos en suero de arginina y óxido nítrico, genotipo de CPSI, y presencia/ausencia de hipertensión pulmonar. Se enrolaron exitosamente cuarenta pacientes, y se aleatorizaron en grupos iguales de veinte que reciben citrulina o placebo. No hubo diferencia en mediciones repetidas de las presiones sanguíneas medias entre el grupo de citrulina en control durante el periodo de estudio de 48 horas (P = 0.53) . Los niveles medios de citrulina fueron significativamente mayores en el grupo de citrulina en comparación con el placebo inmediatamente después de la operación (36 µmol/L IQR 28-48 µmol/L vs 26 µmol/L IQR 24-35 µmol/L, P = 0.012) y 12 horas después de la operación (37 µmol/L IQR 18-83 µmol/L vs 20 µmol/L IQR 15-29 µmol/L, P 0.015). Los niveles de citrulina declinaron de manera significativa a todo lo largo de la fase post-operativa en el grupo de. placebo (P = 0.001), en tanto que los niveles aumentaron significativamente con complemento de citrulina (P = 0.014) . Los niveles medios de arginina en suero fueron significativamente mayores en el grupo de citrulina por 12 horas después; de la operación (36 µmol/L +/- 24 µmol/L vs 23 µmol/L +/- 13 µmol/L, P = 0.037) . Los niveles de arginina declinaron de manera significativa a todo lo largo de la fase post-operativa en el grupo de placebo (P < 0.001), en tanto que los niveles se mantuvieron en la línea base con complementación de citrulina (P > 0.533). Nueve pacientes desarrollaron hipertensión pulmonar post-operativa (6 placebo, 3 citrulina) , todos los cuales tuvieron niveles en suero de citrulina menores del nivel medio obtenido con complementación de citrulina (37 µmol/l) (P = 0.036). Ninguno de los pacientes con hipertensión pulmonar tuvieron el genotipo AA para el polimorfismo de CPSI (P = 0.743). Los pacientes toleran la administración de citrulina sin evidencia de efectos secundarios significativos. La complementación oral de citrulina incrementa de manera significativa la citrulina y arginina en suero después de la derivación cardiopulmonar . Los niveles en suero de citrulina por arriba de los normales se asocian con un riesgo disminuido de hipertensión pulmonar post-operativa. Métodos Enrolamiento de Pacientes. Se rolaron 40 pacientes en este estudio de doble testigo, controlado, aleatorizado. Se consideraron para el enrolamiento todos los infantes o niños menores de 6 s de edad se sometieron a uno de seis procedimientos quirúrgicos para corrección de su lesión cardiaca congénita. Los procedimientos quirúrgicos elegibles incluyeron: 1) procedimiento de Norwood para síndrome cardiaco izquierdo hipoplástico (HLHS) o variante de HLHS, 2) el Glenn bidireccional, 3) Montan modificado, 4) reparación de defecto septal atrioventricular (AVSD) , 5) reparación de defecto ventrículo septal (VSD) , o 5) el procedimiento de cambio arterial. Los criterios de exclusión incluyeron: 1) estrechamiento significativo de arteria pulmonar no dirigido quirúrgicamente 2) colocación anterior de endoprótesis de arteria pulmonar, 3) angioplastía anterior de arteria pulmonar, 4) regurgitación de válvula AV del lado izquierdo, significativa, 5) anormalidades de retorno venoso pulmonar, o 6) estenosis de vena pulmonar. Se obtuvieron los consentimientos escritos informados de los padres de los niños enrolados o matriculados durante la valoración pre-operativa en la clínica de cirugía cardiotorácica (pacientes no hospitalizados) o en el hospital de niños de Vanderbilt (pacientes hospitalizados) . Uno de 3 cirujanos cardiacos en el Hospital de "Niños Vanderbilt realizó los procedimientos quirúrgicos usando preparaciones idénticas de cardioplegía y derivación cardiopulmonar. De definió la hipertensión pulmonar como presiones pulmonares medias de al menos *í de presiones sanguíneas medias sistémicas y mayores de 25 mm de Hg. Se obtuvieron mediciones directas de la presión arterial pulmonar de ya sea las líneas centrales de la vena cava superior de manera especifica en pacientes con un estado de procedimiento Glenn bidireccional o Montan modificado, o catéteres de arteria pulmonar transtorácica en todos los otros pacientes excepto en aquellos que se someten a un procedimiento Norwood de etapa I . Se colocaron líneas centrales por anestesiólogos cardiacos, y se colocaron líneas pulmonares directamente por los cirujanos cardiotorácicos . Además de las mediciones directas, se estimaron presiones pulmonares mediante evaluación ecocardiográfica en todos los pacientes con anatomía de dos ventrículos. Los hallazgos en el eco confirmaron la presencia de hipertensión pulmonar incluyeron: 1) regurgitación tricúspide significativa, 2) entrículo derecho agrandado o hipertrofiado sin evidencia de estenosis pulmonar, y/o 3) aplanamiento septal intraventricular . Todos los ecocardiogramas se interpretraron por cadiólogos pediátricos en el Hospital de Niños Vanderbilt. Todos los facultativos (cirujanos, cardiólogos, doctores de cuidados intensivos, y Pl) , enfermeras de investigación, personal de enfermería de PCCU no supieron nada ni del esquema de aleatorización ni de las asignaciones en el brazo de tratamiento. Los datos clínicos y las características de los pacientes se obtuvieron de registros médicos antes del conocimiento de los resultados del estudio. Evento adverso. La administración de citrulina tiene un riesgo teórico de hipotensión sistémica. Se monitorizó la presión sanguínea sistémica cada hora durante el periodo de estudio de 48 horas. Se definió un evento adverso como mayor de veinticinco por ciento de caída en presión sanguínea media desde la línea base. Los pacientes se trataron de manera sintomática con resucitación de volumen y/o soporte inotrópico/vasopresor . Los pacientes no se retiraron del estudio a menos que la hipotensión fuera insensible a las intervenciones . Protocolo de estudio. Se aleatorizaron cuarenta pacientes para recibir ya sea placebo o citrulina de manera inmediata antes de la cirugía. Se realizó la aleatorización por el servicio de fármacos de investigación de la Farmacia Clínica del Hospital Vanderbilt, usando números aleatorios generados por computadora, de acuerdo a bloques de cuatro, permutados, aleatorios, anteriormente generados. Los pacientes se enrolaron con la intención de tratar el modelo (ITT) . Se administró citrulina con una solución de 100 mg/ml (10%) usando agua destilada como un agente de suspensión. El fármaco y el placebo se mezclaron y distribuyeron por el Servicio de Fármacos de Investigación. Se hicieron corresponder en volumen y color la citrulina y el placebo. La citrulina se administró en cinco dosis de 1.9 g/m2 dadas cada 12 horas para una dosis diaria de 3.8 g/m2 y para una dosis total de 9.5 g/m2. Esta dosis se determinó por terapia corriente de reemplazo de citrulina administrada a infantes/niños con defectos en el ciclo de urea, y es idéntica a la dosis administrada en un ensayo clínico corriente de pacientes adultos con trasplante de médula ósea en riesgo de desarrollo de lesión pulmonar aguda (Vanderbilt University Medical Center, Brian Christman MD) . La primera dosis de placebo/citrulina se administró mediante un tubo de alimentación orogástrica colocado por la enfermera o facultativo de investigación subsiguiente a la introducción de anestesia e intubación en el cuarto de operación. La segunda dosis se dio inmediatamente en el arribo a la unidad de cuidados críticos pediátrica (PCCU) para recuperación. La 3a, 4a y 5a dosis se administraron a las 12, 14 y 36 horas de manera post-operativa en la PCCU respectivamente. Las dosis post-operativas -se dieron de manera enteral mediante un tubo de alimentación nasogástrico colocado por la enfermera de cabecera en la PCCU, o por la boca una vez que se extubó al paciente. Recolección de Muestras. Se obtuvieron tres mililitros de sangre de cada paciente en cinco puntos de tiempo; inmediatamente antes de y después de la operación, luego 12, 24 y 48 horas después de la operación. La muestra sanguínea pre-operativa se recolectó después de tanto la inducción de anestesia como de la colocación de ya sea el catéter venoso central o arterial pero antes de la incisión quirúrgica. La muestra post-operativa inmediata se recolectó en el arribo a la unidad de cuidados críticos pediátricos (PCCU) , y se recolectaron muestras subsiguientes a los intervalos de tiempos respectivos después del arribo en la PCCU. Se recolectaron muestras en tubos tratados con citrato, se colocaron en hielo y se almacenaron a 4°C hasta el procesamiento. Las muestras se centrifugaron en el espacio de 3 horas de la recolección para la separación del plasma y para componentes celulares. Las muestras plasmáticas se congelaron a -70 °C hasta análisis de laboratorio adicional. El factor critico para la determinación de los datos de resultado fue accesibilidad a las líneas arteriales (AL) o venosas centrales (CVL) . Los padres de los pacientes enrolados se aseguraron que las muestras sanguíneas se obtuvieran de las líneas necesarias para cirugía, y no se presentaron extracciones adicionales de sangre una vez que el acceso vascular central no fue por más tiempo una necesidad médica. La administración - del fármaco de estudio no se continuó una vez que se agotaron las mdidas de las variables resultantes. Mediciones de laboratorio. Se determinaron las concentraciones en suero de citrulina, arginina y todos los otros aminoácidos por análisis de aminoácidos en los extractos libres de proteina. Se separaron los aminoácidos por cromatografía de intercambio catiónico usando un analizador de aminoácidos Beckmann 7300 (Beckmann, Palo alto, California, Estados Unidos de América) . La calibración del analizador se realizó antes de la prueba de las muestras de los pacientes. Se analizaron las concentraciones de los metabolitos de óxido nítrico mediante ensayo no enzimático colorimétrico (Oxford Biomedical Research, Oxford, Michigan, Estados Unidos de América) . Las muestras plasmáticas se desproteinaron primero con una solución de sulfato de zinc. Los nitratos entonces se redujeron a nitritos por incubación con cuentas de cadmio después de la centrifugación, se adicionaron secuencialmente los reactivos de Griess, sulfanilamida y N-(l-naftil) etilendiamina a los sobrenadantes (14). Entonces se midió a 540 nM la absorbancia de cada muestra, y entonces se determinaron las concentraciones de los metabolitos de óxido nítrico utilizando una curva normal de nitrito de sodio diluido como el control. Se logró como se describe anteriormente en la presente la genotipificacion de CPSI paa el polimorfismo T1405N. Se obtuvo el aislamiento de la capa leucocitaria de las muestras sanguíneas, tratadas con citrato, preoperativas por centrifugación a 1000 g durante 5 minutos, luego se almacenaron a -70°C. Entonces se utilizó un equipo de aislamiento de ADN genómico para la extracción de ADN de células sanguíneas blancas (Promega Corp, Madison, Wisconsin, Estados Unidos de América) . Entonces se usaron los cebadores de T1405N como se describe en la presente anteriormente para terminar la amplificación por PCR en las muestras de ADN aisladas. Entonces se categorizáron los productos de PCR por electroforesis de mejoramiento de detección de mutación (MDE) - utilizando un equipo de heteroduplex MDE (AT Biochem, Malvern, Pennsylvania, Estados Unidos de América) . La utilización de este método permite la visualización de sustituciones individuales de base con exactitud en comparación a controles. Análisis estadístico. El nivel medio de citrulina en infantes y niños en un estado de derivación pos- cardiopulmonar, se ha reportado anteriormente como 20.7 +/- 13.0 µmol/L a las 12 horas post-operativas . Un tamaño de muestra de 40 pacientes tiene una potencia (1-ß) de 87% para detectar una diferencia de 13 µmol/L (1 SD) entre citrulina (n = 20) y placebo (n = 20) usando significativo bilateral y un = 0.05 {Se calculó el tamaño de muestra usando el programa del tamaño de muestra y potencia de PS (Dupont WD y Plummer WD: Programa de tamaño de muestra y potencia de PS disponible gratuito en la Internet. Controlled Clin Triáis, 1997; 18:274; Versión 2.1.30} . La seguridad del fármaco, representada por múltiples mediciones secuenciales de la presión sanguínea media durante el periodo de estudio de 48 horas, se valoró mediante ANCOVA multivariable. Se reportaron niveles variables resultantes continuos de los metabolitos de óxido nítrico y aminoácidos como las medias con intervalos intercuartiila" (IQR) para distribución uno-normal, o media con +/- SD cuando es apropiado. La prueba de U de Mann-Whitney se usó para comparar variables continuas entre grupos para dar cuenta de los valores exteriores, de otro modo se usó la prueba t de Student. Se terminó el análisis de valores continuos apareados con la prueba de clasificación signada de Wilcoxon los resultados dicotómicos para éxito de aleatorización y la presencia o ausencia de hipertensión pulmonar se reportaron como proporciones y se valoraron con la prueba exacta de Fisher. Todos los análisis fueron bilaterales, y se consideró significado estadístico de las diferencias con un valor P < 0.05. El programa estadístico STATA (versión 6.0, STATA Corporation, Collage Station, Texas) y SPSS (Copyright 2004, SPSS Inc.) se usaron en el análisis de datos dirigido por Jeff Canter, MD en Center for Human Genetics Research. Resultados Enrolamiento de pacientes. Se enrolaron exitosamente cuarenta pacientes y se aleatorizaron ya sea para recibir ya sea citrulina (n = 20) o placebo (n = 20) . La aleatorización concluyó sin diferencia significativa entre los grupos de citrulina y placebo en la línea base (Tabla 1) . La edad media de la población de estudio (N = 40) fue de 8.5 meses (IQR 4-29 mo) , con 55% de varones, y 90% caucásicos. Las intervenciones quirúrgicas incluyeron la etapa I de Norwood (8%), BDG o Fontan (53%), preparación de VSD o AVSD (25%) , y reparación de cambio arterial (15%) . La distribución del genotipo de CPSI para el polimorfismo T1405N en el grupo de estudio, 5AA (12.5%) 23 AC (57.5%) 12 CC (30%), fue similar a aquella esperada para la población en general. Seguridad. La presión sanguínea media no difiere de los grupos de citrulina y placebo (P = 0.530) (Figura 14). Aunque no se presentaron muertes dentro del periodo de estudio de 48 horas, tres pacientes murieron de complicaciones postoperatorias en el espacio de treinta días de reparación quirúrgica, sin diferencia significativa entre los grupos de citrulina y placebo (2 vs 1, P = 0.487). Se encontró que todas las muertes no estuvieron relacionadas a la administración de los fármacos de estudio. Un paciente aleatorizado para recibir citrulina se retiró inmediatamente después de la operación debido a complicaciones quirúrgicas significativas que requieren soporte mediante oxigenación de membrana extracorporal (ECMO) y retornó al OR para reparación adicional dentro del periodo de estudio de 48 horas. Se mantuvo la intención de tratar. El paciente se volvió a presentar en el grupo de citrulina con inclusión de las mediciones de resultados pre-operativos en el análisis de datos, sin embargo estuvo ausente del análisis de resultados post-operativos debido a la ausencia de datos del paciente. Citrulina en suero. Los niveles medios de citrulina en suero fueron significativamente mayores en los pacientes quienes recibieron citrulina oral en comparación a placebo tanto de manera inmediatamente post-operatoria (36 µmol/L IQR 28-48 µmol/L vs 26 µmol/L IQR 24-35 µmol/L, P = 0.012) y 12 horas después de la operación (37 µmol/L IQR 18-83 µmol/L vs 20 µmol/L IQR 15-29 µmol/L, P = 0.015) (Figura 15). Los niveles en suero de citrulina cayeron de manera significativa desde la línea base en el grupo de placebo tanto inmediatamente después de la operación como 12 horas después de la operación (32 µmol/L IQR 25-44 µmol/L vs 26 µmol/L IQR 24-35 µmol/L y 20 µmol/L IQR 15-29 µmol/L, P = 0.020 y P < 0.001, respectivamente). Entre tanto, los niveles en suero de citrulina aumentaron de forma significativa desde la línea base con complementación de citrulina inmediatamente después de la operación y se mantuvieron niveles elevados a las 12 horas después de la operación (29 µmol/L IQR 25-34 µmol/L vs 36 µmol/L IQR 28-48 µmol/L y 37 µmol/L IQR 18-83 µmol/L, P = 0.014 y P = 0.184, respectivamente). Las mediciones resultantes más allá de las 12 horas después de la operación se perturbaron por la pérdida de los puntos de ' datos. Nueve pacientes sé recuperaron y transfirieron al piso pediátrico general a las 24 horas después de la operación. Metabolitos de óxido nítrico y arginina. Los niveles medios en suero de arginina fueron significativamente mayores en pacientes quienes recibieron citrulina oral en comparación con placebo a las 12 horas después de la operación (36 +/- 24 µmol/L vs 23 +/- µmol/L, P = 0.037) (Figura 16) . Los niveles en suero de arginina cayeron de manera significativa desde a línea base en el grupo de placebo a las 12 horas después de la operación (38 µmol/L IQR 30-52 µmol/L vs 34 µmol/L IQR 15-45 µmol/L y 22 µmol/L IQR 13-33 µmol/L, P = 0.077 y P = < 0.001, respectivamente) . Entre tanto, los niveles en suero de arginina no declinaron de manera significativa desde la línea base en el grupo de citrulina (33 µmol/L IQR 25-54 µmol/L vs 33 µmol/L IQR 22-41 µmol/L y 30 µmol/L IQR 15-56 µmol/L, P = 0.533 y P = 0.533, respectivamente). Las concentraciones de metabolitos de óxido nítrico o fueron diferentes entre los grupos de citrulina y placebo, inmediatamente después de la operación (43 µmol/L IQR 27-72 vs 40 µmol/L IQR 27-55 µmol/L, P = 0.430) o a las 12 horas después de la operación (45.µmol/L IQR 28-81 vs 43 µmol/L IQR 20-68 µmol/L, P = 0.518). Se administró óxido nítrico inhalado a 5 pacientes en el periodo- post-operativo, todos los cuales demostraron desaturaciones e hipotensión inmediatamente después de la operación. Tres de los cinco pacientes tienen hipertensión pulmonar documentada por medición directa de presión pulmonar. Se colocaron en ensayos de iNO a dos de los cinco pacientes (1 de Fontan, 1 de Norwood) . Los pacientes quienes experimentaron el procedimiento de Fontan se exploraron dos veces inmediatamente después de la operación para alivio del taponamiento cardiaco y hemotorácico severo y regresaron más tarde a la OR para agrandamiento por fenestración. El paciente quien se sometió a procedimientos Norwood se colocó en iNO como un intento para venir de la derivación en la OR después de múltiples intentos fallidos debido a la depresión miocardiaca. Ambos pacientes se separaron de iNO con protocolo en el espacio de 12 horas después de la operación Hipertensión pulmonar. Nueve pacientes desarrollaron hipertensión pulmonar post-operativa, seis (67%) en el grupo de placebo y tres (33%) en el grupo de tratamiento P = 0.451) . Todos los pacientes con hipertensión pulmonar tuvieron niveles en suero de citrulina menores de las normas anteriormente reportadas para concentraciones de citrulina en niños menores de 6 años de edad (30 µmol/L IQR 23-37 µmol/L) y menos de la concentración media obtenida con complementación de citrulina (37 µmol/L P = 0.036). Los pacientes con hipertensión pulmonar no tuvieron la distribución esperada del genotipo de CPSI para el polimorfismo T1405N, O AA (0%) 6 AC (67%) 3 CC (33%), sin embargo, no fue significativo debido al pequeño número de pacientes con hipertensión pulmonar (P = 0.743). Con la administración de citrulina, se previene la declinación significativa en los precursores de NO. Se mostró que el grupo de placebo continua exhibiendo disminuciones significativas en las concentraciones de citrulina y arginina después de la derivación. En contraste, no hay incremento significativo en las concentraciones de citrulina y mantenimiento de concentraciones pre-operativas de arginina en pacientes quienes recibieron citrulina oral. La capacidad para invertir los efectos de la derivación cardiopulmonar en las concentraciones del precursor de NO es impertinente si se emplea producción endógena de NO para prevenir la hipertensión pulmonar. Los pacientes quienes desarrollaron hipertensión pulmonar post-operativa tuvieron concentraciones de citrulina menores de las esperadas por las normas, y menos de la concentración media de 37 µmol/L obtenida con complementación de citrulina. El desarrollo de hipertensión pulmonar fue dependiente de la concentración de citrulina en suero obtenida ya sea por complementación por citrulina u otros factores predispuestos (genética, quirúrgicos, ambientales) . En conjunto, 18 de 20 (90%) pacientes en el grupo de placebo tuvieron niveles de citrulina por debajo de 37 µmol/L versus 9 de 20 (47%) pacientes en el grupo de tratamiento. De aquellos con bajos niveles de citrulina, 9 de 27 (33%) desarrollaron hipertensión pulmonar. Los pacientes con hipertensión pulmonar tuvieron los niveles más bajos de citrulina en comparación al grupo de estudio (P = 0.03) inmediatamente después de la operación. Por lo tanto, los factores que afectan la absorción de citrulina o producción endógena de NO incrementaron el riesgo, de desarrollar hipertensión pulmonar. Los polimorfismos en los genes específicos pueden jugar un papel en la conservación de la disponibilidad del precursor de NO. Esta enzima, carbamil-fosfato-sintetasa I, es la enzima limitadora de la diversidad al ciclo de urea y de esta manera determina la producción de citrulina y arginina. Se ha asociado la disfunción del ciclo de urea con el desarrollo de hipertensión pulmonar persistente neonatyal (PPHN) e hipertensión pulmonar post-operativa en infantes/niños después de la derivación anteriormente en la presente. El polimorfismo T1405N de CPSI se asoció de manera significativa con niveles inferiores de arginina y óxido nítrico en neonatos con PPHN, y pacientes cardiacos congenióos después de la derivación. El genotipo AA de este polimorfismo estuvo sub-representado tanto en poblaciones pediátricas quienes desarrollaron hipertensión pulmonar. Nuevamente se mostró la ausencia del genotipo A? en los nueves pacientes quienes desarrollaron hipertensión pulmonar en este estudio. Conclusión. Los pacientes toleran administración de citrulina sin evidencia de efectos secundarios significativos. La complementación con citrulina oral incrementa de manera significativa ias concentraciones de citrulina y conserva las concentraciones de arginina pre-operatorias, en comparación con aquella significativa de los precursores de NO en pacientes que reciben placebo. Los pacientes-, .quienes mantuvieron concentraciones en suero de citrulina por arriba de lo normal, ya sea por administración de citrulina o factores predispuestos, no desarrollaron hipertensión pulmonar post-operativa . Tabla 1. Comparación de características de grupo de citrulina versus placebo Placebo Citrulina valor P n=20 n=20 Edad en meses 0.892 (media, cuartillas) 8 (4-29) 12 (0-29) Género Masculino 1 122 ( (6600%%)) 1 100 ((5500%%)) 0.751 Femenino 8 (40%) 10 (50%) Etnia Caucásico 1 188 ((9900%%)) 1 188 ((9900%%)) 1.000 No Caucásico 2 (10%) 2 (10%) Placebo Citrulina valor P n=20 n=20 Diagnosis Ventrículo solo 11 (55%) 13(65%) 0.901 VSD/AVSD 6 (30%) 4 (20%) TGA 3(15%) 3(15%) Cirugía Norwood 0 (0%) 3 (15%) BDG/Fontan 11 (55%) 10(50%) 0.452 VSD/AVSD 6 (30%) 4 (20%) Cambio arterial 3(15%) 3(15%) Trisomía 21 Presente 4 (20%) 18(90%) 0.661 Ausente 16(80%) 2(10%) Genotipo CPSI AA 2(10%)" 3 (15%) 0.663 AC 13(65%) '- 10(50%) CC 5 (25%) 7 (35%) Tiempo de derivación 0.520 (media+/-SD) 112+/- 42 121 +/-47 Tabla 2. Bajo riesgo de hipertensión pulmonar cuando se eleva citrulina Hipertensión Citrulina en suero Hipertensión pulmonar pulmonar 12-hourpostop AUSENTE PRESENTE Valor P < 37 umol/L 18 >1=37umol/L 12 0.036 Referencias Las referencia citadas a continuación así como las referencia citadas en la especificación se incorporan en la presente como referencia al grado que complementan, explican, proporcionan un antecedente para cada metodología enseñada y/o composiciones empleadas en la presente, Abman, S. H., et al., Am J Physiol (1990) 259:H1921-H1927. _„ . Adelman et al., DNA 2:183 (1983). Alonso, E. y Rubio, V., European Journal of Biochemistry 229:377-384 (1995). Artymiuk, P. J. et al . , Nature Struct . Biol . 3:128-132 (1996) . Bachmann et al., New England Journal of Medicine 304:543 (1981) . Batshaw ML, Brusilow SW. Annals of Neurology 1982; 11:319-21. Bearman SI, Journal of Clinical Oncology 1993; 11:1729-36. Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22:1859-1862 (1981) . Beaumier L, Biomedical & Environmental Sciences 1996; 9:296-315. Becker et al., Archives of Biochemistry & Biophysics 223:381-392 (1983).

Bernard GR, Artigas A, Brigham KL, et al. Intensive Care Medicine 1994; 20:225-32. Blau N, Duran, M. , y Blaskovics, M.E. Physician ' s Guide to the Laboratory Diagnosis of Metabolic Diseases London: Chapman & Hall Medical, 1996. Bourrier et al., Prese Medícale 17:2063-2066 (1988). Castillo, L., et al., Pediatr Res (1995) 38:17-24. Castillo L, et al., Journal of Bíological Chemistry 1989; 264:4038-44. Castro-Gago et al., Child Neuro Systems 6:434-436 - (1990) . Cervera, J. et al., Biochemistry 35:7247-7255 (1996) . Cohén PP. Current Topics in Cellular Regulation 1981; 18:1-19. Coude et al., Biochem . J. 216:233-236 (1983). Coude et al., J. Clin . Invest . 64: 1544-1551 (1979). Coulter et al., Lancet 1 (8181): 1310-1311 (1980). Crea et al., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 75:5765 (1978). Davies et al., Bone Marrow Transplantation 17:1119-1125 (1996) . de Groot, C. J. , et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 124:882-888 (1984). Eadie et al., Med. Toxicol . 3:85-106 (1998).

Eichenlaub et al., J. Bacteria 138:559-566 (1979). Faber-Langendoen K, et al. Bone Marrow Transplantation (1993) 12:12501-7. Gribskov et al., Nucí . Acids . Res . 14:6745 (1986). Gruskay et al., Ped. Res . 15:475 (1981). Guillou, F., et al. Proc Nati Acad Sci 86:8304-8308 (1989) . Guy, H. I. et al . , Journal of Biological Chemistry 270:2190-2197 (1995). Hauser ER, et al., New England Journal of Medicine 19-90; 322:1641-5. Hebert PC, Chest 1993; 104:230-5. Howell et al., Antibodies A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, (1988) . Jackson, M. J. et al., Annual Review of Genetics :431-464 (1986). Jackson MJ, Annual Review of Genetics 1986; 20:431- 64. Javid-Majd et al., Biochemistry 35:14362-14369 (1996) Jones RJ, et al. Transplantation 1987; 44:778-83. Kamoun et al., Lancet 48 (1987). Kinsella, J. P., et al., Lancet (1992) 340:819-820. Kyle & Doolittle, J. Mol . Biol . 157:105-132 (1982). Lagace, M. et al., Journal of Biological Chemistry 262:10415-10418 (1987). Lipsitz, E. C, et al., J Pediatr Surg (1996) 31:137-140. Liu, Q. y Sommer, S. S., Biotechniques 18 (3) : 470-477 (1995) . Maniatis et . al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor, N.Y., p 280-281 (1982). Marrini et al., Neurology 38 : 365-371 (1988) . Marshall JC, et al., Critical Care Medicine (1995) 23:1638-52. Matuschak, G. M. , Clinics in Chest Medicine (1996) 17:83-98. Matuschak, G. M. y Rinaldo, J. E., Chest (1988) 94:400-6. Matuschak et al., American Review of Respiratory Disease 1990; 141:1296306. McCaffrey, M. J. , et al., Biol Neonate (1995) 67:240-243. McDonald, G. B., et al., Annals of Internal Medicine 1993; 118:255-67. Meister, A., Adv. Enzymol . Relat . Áreas Mol . Biol . 62:315-374 (1989). Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macro Molecular and Recombinant DNA Ed. Walton, A., (Elsevier, Amsterdam) (1981) .

Mitchell RB, Wagner JE, Karp JE, et al. American Journal of Medicine 1988 ; 85:662-7. Mitchell et al., Amer. J. Med. 85:662-667 (1988). Moneada S, Higgs A. New England Journal of Medicine 1993; 329:2002-12. Moorman, A. F. et al. Histochemical Journal 22:457-468 (1990) . ?eedleman et al., J. Mol . Biol . 48:443 (1970). ?uzum, C. T. and Snodgrass, P. J. , Science 1971; 172:1042-3. ?yunoya, H. , et al . , Journal of Biological Chemistry 260:9346-9356 (1985) . Palmer RMJ, et al., Biochem Biophys Res Commun (1988) 153:1251-1256. PCR. A Practical Approach, ILR Press, Eds. McPherson, et al. (1992). Pierson, D.L., J. Biochem . Biophys . Methods 3:31-37 (1980) . Price, K. J. , et al., American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine 1998; 158:876-84. Rabier et al., Biochem . & Biophys . Research Comm . 91:456-460 (1979) . Rabier et al., Biochimie 68:639-647 (1986). Raiha, ?. C. R. and Suihkonen, J. Acta Paediatrica Scand 51 : 121-121 (1968). Richardson, P. and Bearman, S. I., Leukemia & Lymphoma (1998) 31:267-77. Rinaldo JE, et al., American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology 1994; 11:625-30. Roberts, J. D., et al., Lancet (1992) 340:818-819. Rodríguez-Aparicio, L. B. et al., Biochemistry 28:3070-3074 (1989). Rubenfeld GD, Crawford SW. Annals of Internal Medicine 1996; 125:625-33. Rubio, V. , (Review) Biochemical Society Transactions 21:198-202 (1993) . Rubio, V. y Grisolia, S., Enzyme 26:233-239 (1981). Saiki et al., Bio/Technology 3 : 1008-1012 (1985). Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) (1989). Schmidt, R. D., Clin . Chim . Acta . 74:39-42 (1977). Schwartz et al., eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 357-358 (1979) . Shulman HM, et al., Hepatology 1994; 19:1171-81. Smith et al., Adv. Appl . Math . 2:482 (1981). Stapleton et al., Biochemistry 35:14352-14361 (1996) . Summar ML. Journal of Inherited Metabolic Disease 1998; 21 Suppl 1:30-9. Summar, M., J. Inherited Metabolic Disease 21:30-39 (1998) . Summar ML, et al., Cytogenetics & Cell Genetics 1995; 71:266-7. Takiguchi MaM, M. , Biochem J. (1995) 312:649-659. Toh, H. et al., European Journal of Biochemistry 215:687-696 (1993) . Tse et al., American Journal of Hematology 38:140-141 (1991) . Patente de los Estados Unidos No. 5,399,346 Patente de los Estados Unidos No. 5,162,215 Patente de los Estados Unidos No. 5,279,833 Patente de los Estados Unidos No. 5,643,567 Patente de los Estados Unidos No. 4,683,202 Patente de los Estados Unidos No. 4,683,195 Patente de los Estados Unidos No. 5,286,634 Patente de los Estados Unidos No. 5,646,008 Patente de los Estados Unidos No. 4,196,265 Patente de los Estados Unidos No. 5,489,742 Patente de los Estados Unidos No. 5,550,316 Patente de los Estados Unidos No. 5,573,933 Patente de los Estados Unidos No. 5,614,396 Patente de los Estados Unidos No. 5,625,125 ^Patente de los Estados Unidos No. 5,641,484 Patente de los Estados Unidos No. 5,648,061 Patente de los Estados Unidos No. 5,651,964 Patente de los Estados Unidos No. 4,965,188 Patente de los Estados Unidos No. 4,769,331 Patente de los Estados Unidos No. 5,741,957 Patente de los Estados Unidos No. 4,458,066 Patente de los Estados Unidos No. 4,554,101 Patente de los Estados Unidos No. 4,736,866 van den Hoff, M. J. et al, Journal of Molecular Evolution 41:813-832 (1995). Vosatka RJ, et al., Biol Neonate (1994) 66:65-70. Warter et al., Revue Neurologique 139:753-757 (1983) . Wingard JR, et al. Bone Marrow Transplantation 1989; 4:685-9, Zamora, S. A., et al., Crit Care Med (1998) 26: 1271-1276. Se entenderá que se pueden cambiar varios detalles de la materia actualmente escrita sin apartarse del alcance de la materia actualmente descrita. Adicionalmente, la descripción anterior es para el propósito de solo ilustración, y no para el propósito de limitación, la materia actualmente descrita que se define por estas reivindicaciones. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (33)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Método para tratar o prevenir formación disminuida de óxido nítrico que resulta de función sub-óptima del ciclo de urea en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un precursor de óxido nítrico, por lo que se logra el tratamiento o prevención de la formación disminuida de óxido nítrico que resulta de la función sub-óptima del ciclo de urea. 2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la administración es de forma intravenosa u oral .
3. 3. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la función sub-óptima del ciclo de urea comprende además producción disminuida de los productos intermedios del ciclo de urea.
4. 4. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto está sufriendo de un trastorno asociado con producción disminuida de productos intermedios del ciclo de urea o en donde el sujeto se expone o se va a exponer a un estímulo ambiental asociado con producción disminuida de los productos intermedios del ciclo de urea.
5. 5. Método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el trastorno se selecciona del grupo que consiste de hepatitis, cirrosis, hipertensión pulmonar, enterocolitis necrotizante (NEC) , síndrome de esfuerzo respiratorio agudo, disfunción endotelial específica étnica, disfunción eréctil, toxicidad por transplante de médula ósea en un sujeto que se somete a transplante de médula ósea, sepsis, asma y combinaciones de los mismos.
6. 6. Método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el estímulo ambiental se selecciona del grupo que consiste de quimioterapia, cirugía cardiaca, esfuerzo oxidante incrementado, transplante de médula ósea, choque séptico, ataque agudo de asma, hipoxia, exposición a hepatotoxinas y combinaciones de los mismos.
7. 7. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el precursor de ácido nítrico se selecciona del grupo que consiste de citrulina, arginina y combinaciones de los mismos .
8. 8. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el precursor de óxido nítrico se administra en una dosis que varía desde aproximadamente 100 mg a aproximadamente 30,000 mg.
9. 9. Método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el precursor de oxido nítrico se administra en una dosis que varía desde aproximadamente 250 mg a aproximadamente 1000 mg.
10. 10. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto es un humano.
11. 11. Método para tratar o prevenir toxicidad por transplante de médula ósea en un sujeto que se somete a transplante de médula ósea, caracterizado porque comprende administrar de manera intravenosa u oral al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un precursor de óxido nítrico, por lo que la toxicidad por transplante de médula ósea se trata o previene en el sujeto.
12. 12. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la administración es de manera intravenosa u oral .
13. 13. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el precursor de óxido nítrico se selecciona el grupo que consiste de citrulina, arginina, y combinaciones de las mismas .
14. 14. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el precursor de óxido nítrico se administra en una dosis que varía desde 100 mg a aproximadamente 30000 mg.
15. 15. Método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado, porque el precursor de óxido nítrico se administra en una dosis que varía desde aproximadamente 250 mg a aproximadamente 1000 mg.
16. 16. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la toxicidad por transplante de médula ósea comprende enfermedad veno-oclusiva hepática y/o lesión pulmonar aguda.
17. 17. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el sujeto es un humano.
18. 18. Método para tratar o prevenir un trastorno seleccionado del grupo que consiste de hepatitis, cirrosis, hipertensión pulmonar, enterocolitis necrotizante (NEC) , síndrome de esfuerzo respiratorio agudo, disfunción endotelial específica étnica, disfunción eréctil, asma y combinaciones de los mismos en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo de una cantidad terapéuticamente efectiva de un precursor de óxido nítrico.
19. 19. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la administración es de manera intravenosa u oral .
20. 20. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el precursor de óxido nítrico se selecciona el grupo que consiste de citrulina, arginina, y combinaciones de las mismas .
21. 21. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el precursor de óxido nítrico se administra en una dosis que varía desde aproximadamente 100 mg a aproximadamente 30000 mg.
22. 22. Método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el precursor de óxido nítrico se administra en una dosis que varía desde aproximadamente 250 mg a aproximadamente 1000 mg.
23. 23. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el sujeto es un humano.
24. 24. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el trastorno es enterocolitis necrotizante (NEC) y el sujeto es un infante prematuro.
25. 25. Método para aumentar un nivel de un precursor de ácido nítrico en un sujeto en necesidad del mismo, el método está caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un precursor de ácido nítrico, por lo que se aumenta un nivel de un precursor de óxido nítrico en el sujeto.
26. 26. Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la administración es de forma intravenosa u oral .
27. 27. Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el precursor de óxido nítrico se selecciona del grupo que consiste de citrulina, arginina y combinaciones de las mismas .
28. 28. Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el precursor de óxido nítrico se administra en una dosis que varía desde aproximadamente 100 mg a aproximadamente 30000 mg.
29. 29. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el precursor de óxido nítrico se administra en una dosis que varía desde aproximadamente 250 a aproximadamente 1000 mg.
30. 30. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un portador farmacéuticamente aceptable de una cantidad terapéuticamente efectiva de un precursor de óxido nítrico, en donde la composición farmacéutica se adapta para administración intravenosa u oral .
31. 31. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque el precursor de óxido nítrico se selecciona del grupo que consiste de citrulina, arginina y combinaciones de los mismos.
32. 32. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque el precursor de óxido nítrico se presenta en una dosis que varía desde aproximadamente 100 mg a aproximadamente 30000 mg.
33. 33. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque el precursor de óxido nítrico se administra a 250 mg a aproximadamente 1000 mg.