CN1943557A - 一种包裹大分子药物的纳米型脂质体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了包裹大分子药物的纳米型脂质体的制备方法,其步骤为将卵磷脂、CaCl2和大分子药物于生理盐水搅拌混匀,并在4℃下对混合液交替进行超声波振荡和静置,直至得到脂质体悬液,然后通过离心收集获得包裹大分子药物的纳米型脂质体。本发明具有以下优点:制得的纳米型脂质体对内包药物的包封率为45%,并可以在20min内即有效投递内包药物到细胞内,药物被投递到细胞后从脂质球中释放出来。同时,脂质体原液配方中不含任何不明或细胞毒性物质,制备获得的纳米脂质体对细胞没有任何毒害作用。
Description
技术领域
本发明涉及试验室研究和临床治疗中的给药领域,发明提供了一种能够快速,高效投递难透膜药物进入细胞的给药方法。
背景技术
试验室研究中,很多纯化获得的生物活性物质如藻蓝蛋白,超氧化物歧化酶,异硫氰酸荧光素(FITC)等不能有效进入细胞内部,这阻碍了对其的生物学活性的进一步研究;临床上,大多数肿瘤治疗药物如超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,以下简称SOD)等必须进入细胞内部,才能发挥其生物学作用,天然SOD由于其分子量较大而基本不能穿透细胞膜,这导致了SOD的给药量增加,容易造成过敏性反应和毒副作用。卵磷脂是一种脂溶性物质,它所形成的球状脂质体具有生物膜的特征,可以有效透过细胞膜,并在细胞内形成一个缓释的药库,有效提高内包物质的半衰期。
发明内容
针对现有临床或研究试验中给药中存在的不足之处,本发明的目的是提供一种能快速,高效投递大分子药物到细胞内部的纳米脂质体的制备方法。
本发明提供的包裹大分子药物的纳米型脂质体的制备方法,依次包括以下步骤:
(1)将卵磷脂、CaCl2和大分子药物于生理盐水搅拌混匀,4℃下静置,卵磷脂、CaCl2和大分子药物的质量比为20∶10∶0.5~1;
(2)4℃下,对上述混合液交替进行超声波振荡和静置,直至得到脂质体悬液;
(3)1000~2000rpm离心脂质体悬液,收集上清;30000~50000rpm离心上清液,沉积于底部的即为脂质体小囊,PBS缓冲液洗涤脂质体小囊并溶于PBS缓冲液中,得到包裹大分子药物的纳米型脂质体。
上述的大分子药物是任何透膜能力差的物质,如超氧化物歧化酶或者藻蓝蛋白。采用超声波振荡的功率一般为400W~800W。
包裹大分子药物的纳米型脂质体的细胞给药方法:
(1)接种细胞(悬浮或贴壁细胞均可,细胞密度为5×105个/ml培养基)于无血清培养基中,加入20%体积的脂质体药物,37℃二氧化碳(5%)培养箱中孵育1h,期间晃动细胞几次。
(3)PBS洗涤细胞两次,除去胞外未结合脂质体。
本发明与现有技术相比具有以下优点:(1)包裹大分子药物的纳米型脂质体,直径为90~110nm,对内包药物(如SOD)的包封率为45%。(2)制备获得脂质体能在20min内即有效投递内包药物到细胞内。(3)药物被投递到细胞后从脂质球中释放出来,进而发挥其药效,(4)脂质体原液配方中不含任何不明或细胞毒性物质,制备获得的纳米脂质体对细胞没有任何毒害作用。
附图说明
图1是400w和800w超声波功率下制备获得脂质体颗粒的直径分布曲线;
图2是脂质体投递荧光药物的时间依赖性效果,图a,b,c分别为包裹FITC的脂质体孵育细胞0min,20min,60min后的图片。脂质体内包的FITC的激发光波长和发射光波长分别为488nm和520nm;
图3是双重荧光探针标记的脂质体对SPC-A-1肺癌细胞投递后的单个细胞的示意图,图A、B、C、D分别为此细胞在各种不同激发波长下的显微图片。
具体实施方式
以下通过实例进一步对本发明进行描述:
实施例1、FITC荧光脂质体的制备
(1)混合100mg卵磷脂,46mg CaCl2,10mg FITC(发绿色荧光的水溶性分子探针,能自发分布于脂质体微球内部)于20ml生理盐水,搅拌混匀,4℃下放置30min;
(2)4℃下,800W超声波振荡脂质体原液,每次超声波持续时间为9sec,间隔时间为1sec,并重复60次。
(3)将悬液置于4℃,静止放置10min。
(4)依次重复(2),(3)操作两次,制备获得脂质体悬液。
(5)1000rpm离心脂质体悬液10min,收集上清;37000rpm超速离心上清液30min,沉积于底部的即为荧光脂质体小囊,PBS缓冲液洗涤脂质体小囊两次,并溶于20mL PBS中,得到包裹FITC的纳米型脂质体。
以力度仪测量获得脂质体的直径分布,直径分布为90nm-110nm(见图1)。
脂质体FITC的细胞投递:于RPM1640培养基中,接种200μl SPC-A-1肺腺癌细胞(5×105 cells/ml)于96孔板,37℃,二氧化碳(5%)培养箱中培养24h。PBS洗涤两次细胞,并溶于160ul无血清培养基,加入40ul脂质体FITC,37℃孵育1h,PBS洗细胞两次除去胞外未结合脂质体。
脂质体FITC的细胞投递效果观察:200ul胰酶消化以上贴壁细胞,2000rpm离心细胞5min,收集细胞,并溶于200ul PBS,置于激光共聚焦显微镜下观察脂质体的FITC投递效果(见图2c)。由图可见包内绿色FITC荧光,表明FITC已经被投递到细胞内部。
实施例2、同实施例1步骤,其中超声波功率为400w,摸索超声波功率对脂质体制备的影响。力度仪测量结果表明800w超声波功率下制备获得脂质体大小更为均一,主要分布在90~110nm区间(见图1)。
实施例3、同实施例1步骤,其中脂质体FITC的细胞孵育时间为20min,摸索孵育时间对脂质体给药效率的影响。脂质体孵育后的胞内荧光含量分析表明,此纳米脂质体在约20min后开始投递FITC到细胞内部,并在60min后大量投递FITC到细胞内部(见图2a,b,c)。
实施例4、同实施例1步骤,其中脂质体配方为100mg卵磷脂,46mg CaCl2,5mg FITC和5mg罗单明B(简称Rh B,是一种发红色荧光的脂溶性分子探针,能自发结合到脂质体微球表面)。制备双重荧光脂质体,摸索脂质体透膜方式和透膜后内包药物的细胞分布情况。结果表明脂质体的透膜方式不是融合,而是内吞;且脂质体内包物质在进入细胞后能从脂质体中逃逸,并释放到细胞质中(图3)。图3A显示Rh B在细胞内的分布,图3B显示FITC在细胞内的分布,图3C显示投递药物以后的细胞外形,图4D显示Rh B和FITC在细胞内的共同分布。细胞大小约20uM,切片厚度为2uM。分布于脂质球内部的绿色荧光FITC的激发光波长和发射光波长分别为488nm和520nm,分布于脂质球表面的红色荧光Rh B的激发光波长和发射光波长分别为543nm和560nm。
在双重激发光同时激发下,细胞内出现Rh B表明脂质体在投递药物同时,外层的卵磷脂也进入细胞,暗示脂质体的药物投递过程不是融合,而是内吞。细胞内Rh B和FITC并不重合,说明透膜后FITC不再局限于脂质球的内部,而是释放到细胞质中,均匀分布。细胞内Rh B分布不均匀,说明脂溶性卵磷脂在胞内相互融合;细胞内均匀分布的FITC说明水溶性FTIC逃脱脂质球后在细胞内均匀分布。
实施例5
(1)同实施例1步骤制备脂质体SOD并投递到肿瘤细胞内部,其中脂质体配方为100mg卵磷脂,46mg CaCl2,5mg SOD(8000U/mg),制备内包大分子临床药物(SOD)的脂质体。
(2)脂质体SOD的包埋率计算:以100g/L Triton-100溶解20ml脂质体悬液离心获得的脂质体小囊,Folin-酚法测定其中蛋白含量,包埋率=脂质体小囊SOD蛋白含量/总SOD投入量(8mg)×100%。结果表明此纳米型脂质体对SOD的包埋率为45%。
以上列举的分别是试验室研究和临床给药中最具代表性的FITC和SOD的脂质体制备和应用方法,所选用的细胞为目前国内发病较多的SPC-A-1肺癌细胞。显然,本发明制备的脂质体包裹对象不限于以上大分子物质,它还包括了所有透膜能力差的大分子药物;投递对象也不限于以上细胞株。在实验室研究中的细胞给药领域和临床治疗的给药领域,利用此法进行任何相关或相似的给药,均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1、一种包裹大分子药物的纳米型脂质体的制备方法,其特征是依次包括以下步骤:
(1)将卵磷脂、CaCl2和大分子药物于生理盐水搅拌混匀,4℃下静置,卵磷脂、CaCl2和大分子药物的质量比为20∶10∶1;
(2)4℃下,对上述混合液交替进行超声波振荡和静置,直至得到脂质体悬液;
(3)1000~2000rpm离心脂质体悬液,收集上清;30000~50000rpm离心上清液,沉积于底部的即为脂质体小囊,PBS缓冲液洗涤脂质体小囊并溶于PBS缓冲液中,得到包裹大分子药物的纳米型脂质体。
2.根据权利要求1所述的包裹大分子药物的纳米型脂质体的制备方法,其特征是超声波振荡的功率为400W~800W。
3.根据权利要求1所述的包裹大分子药物的纳米型脂质体的制备方法,其特征在于所说的大分子药物是超氧化物歧化酶或者藻蓝蛋白。
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CN106214663A (zh) * | 2016-07-26 | 2016-12-14 | 中山大学 | 藻蓝蛋白纳米脂质微粒及其制备方法 |
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2006
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