CN1942102A - 细胞展示文库 - Google Patents

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A·M·贝尔彻
K·D·维特鲁普
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Abstract

用于淘选方法的真核细胞展示文库，其包含用以特异性和选择性结合于和富集到固体材料表面，例如金属表面、磁性材料表面和半导体表面的表达生物分子。可对展示进行调节。优选酵母细胞上展示的肽和蛋白质。固体材料可在已针对固体材料进行淘选的细胞展示文库存在下制造。纳米颗粒可在生物分子存在下从反应前体生长而成。纳米颗粒可显示量子局限效应。可制备自体愈合薄膜。

Description

细胞展示文库
                   相关申请
本申请要求2004年2月5日提交的Belcher和Peele等的临时专利申请系列号60/541,757(“细胞展示文库”)的优先权，所述专利申请整体通过引用结合到本文中并支持本文。
                    政府资助声明
本文描述的各发明是在美国联邦政府的资助下开发出来的，包括国家科学基金会纳米尺度跨学科研究组(National Science FoundationNanoscale Interdisciplinary Research Team NIRT)的第＿＿＿＿号基金。美国联邦政府保留对各发明的某些权利。
                        背景
组合文库和“淘选”方法是生物技术的重要工具。尽管组合文库和“淘选”方法不断取得进展，但仍需要进一步的进展，特别是能促进商业化和提供更佳多方适应性的进展。例如，为生物技术(包括免疫学和蛋白质化学)研究和应用目的而产生的组合文库可能被认为不适用于材料应用。特别是，无机材料(例如半导体、磁性材料或金属材料)的加工和商业化并不经常涉及生物技术或免疫学。大体上，生物自组装、特异性识别和其他仿生类型过程的应用一直局限在材料领域。
早期的研究成果，例如Brown的美国专利第5,316,922号意图描述鉴定和表达能识别和黏着特异性探针的蛋白质的方法。另参见Brown，S.，Proc.Nat’l Acad.Sci.，89，8651(1992)。不过，以上研究工作只集中于革兰氏阴性细菌表面展示。Belcher等的其他研究成果描述了应用噬菌体展示系统来选择性识别结晶无机表面，更普遍地说具有技术有用性的表面。虽然噬菌体系统有其优点，但细胞系统却能提供胜过噬菌体系统的优点，包括例如以相对较高的拷贝数展示相对较大的复杂生物分子。另外，生长和表达通常可更好地得到调节，细胞生长可更具多功能性。
                        概述
在本节中，仅仅用许多不同的实施方案概述本发明，而不是限制本发明的范围。
在一个实施方案中，本发明提供包含众多真核细胞的真核细胞组合物，所述真核细胞能选择性结合具有表面的固体材料。
在另一个实施方案中，本发明提供真核细胞组合物，所述真核细胞组合物基本由能特异性结合具有表面的固体材料的真核细胞和不能特异性结合所述具有表面的固体材料的真核细胞组成。能发生特异性结合的细胞的比例可足够高，而不能发生特异性结合的细胞的比例可足够低，以便在商业上为特定应用而充分利用所述组合物。在优选的情况下，能发生特异性结合的真核细胞的比例大于不能发生特异性结合的细胞的比例。例如，发生结合的比例可超过60％，或者超过80％。
在另一个实施方案中，本发明提供宿主真核细胞，所述宿主真核细胞包含一种或多种能选择性结合具有表面的固体材料的生物分子。
在另一个实施方案中，本发明提供真核细胞，所述真核细胞能分泌一种或多种能选择性结合具有表面的固体材料的生物分子。
另外，本发明还提供能选择性结合固体材料表面的表达生物分子组合物，其中所述生物分子由真核细胞表达。
另外在其他实施方案中，本发明还包括能选择性结合固体材料表面的表达肽组合物，其中所述肽由真核细胞表达。
在另一个实施方案中，本发明提供细胞覆盖的材料，所述材料包含一种或多种选择性结合具有表面的固体材料的真核细胞。
本发明还提供制品，所述制品包括固体底物和一种或多种通过其表面上的蛋白质或肽选择性结合至固体底物的真核细胞。
另一个实施方案是制品，所述制品包括具有表面的固体材料和选择性结合所述表面的来自组合真核细胞展示文库的表达生物分子。
在另一个实施方案中，本发明提供使来自细胞展示文库的生物分子选择性结合固体材料表面的方法，所述方法包括以下步骤：
提供真核组合细胞展示文库，其中所述文库包含众多表达生物分子；
提供具有表面的固体材料；
使所述细胞展示文库与所述具有表面的固体材料在能导致所述来自真核细胞展示文库的众多表达生物分子选择性结合所述表面的条件下相接触。
在另一个方面，本发明提供生长固体颗粒材料的方法，所述方法包括以下步骤：
将固体颗粒材料的一种或多种前体试剂，与一种或多种与所述固体颗粒材料特异性结合的所选真核组合细胞展示文库成员，在能使所述固体颗粒材料在所述一种或多种真核组合展示文库成员存在下得以形成的条件下混合。
在另一个实施方案中，本发明提供生长固体颗粒材料的方法，所述方法包括以下步骤：
从真核细胞展示文库中鉴定出能选择性结合固体材料的生物分子；
将所述固体材料的一种或多种前体试剂与所述生物分子在能使所述固体材料成为固体颗粒材料的条件下混合。
本发明还提供生物分子，所述生物分子能选择性结合具有表面的固体材料，能用真核细胞展示文库(包括酵母文库)进行鉴定。所述生物分子可为肽或蛋白质。
本发明的一个基本的和新的特征在于能够纯化和提供能选择性结合、在某些情况下能特异性结合固体表面的生物分子。所述生物分子当暴露于在组成、晶体度或这两者上不同的各异质结构时能选择性结合一种结构胜过另一种结构。可制备组合物，其中所述生物分子相对于不能特异性结合的其他生物分子具有所需水平的纯度。所述生物分子可脱离或附着于真核细胞支架宿主，所述支架宿主在优选的实施方案中为酵母。本发明的另一个特征在于肽序列通常是合成或者说人工的，在已知范围内(to the extent known)不是天然的。
以下是一系列编号的实施方案。
1.一种真核细胞组合物，所述真核细胞组合物包含众多能选择性结合具有表面的固体材料的真核细胞。
2.根据1的组合物，其中所述真核细胞是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞。
3.根据1的组合物，其中所述真核细胞是酵母细胞。
4.根据1的组合物，其中所述真核细胞包含能选择性结合具有表面的固体材料的生物分子。
5.根据1的组合物，其中所述真核细胞包含能选择性结合具有表面的固体材料的肽序列。
6.根据1的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶固体材料。
7.根据1的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的无机固体材料。
8.根据1的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的半导体材料。
9.根据1的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的金属材料。
10.根据1的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的磁性材料。
11.根据1的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的陶瓷材料。
12.根据1的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的有机材料。
13.根据1的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的聚合物材料。
14.根据1的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或聚合物材料。
15.根据1的组合物，其中所述真核细胞是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞，且其中所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或聚合物材料。
16.根据1的组合物，其中所述真核细胞是酵母细胞，且其中所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或聚合物材料。
17.根据1的组合物，其中所述真核细胞是酵母细胞，且其中所述具有表面的固体材料是具有表面的半导体材料、金属材料或磁性材料。
18.根据1的组合物，其中所述真核细胞是酵母细胞，且其中所述具有表面的固体材料是具有表面的半导体材料。
19.根据1的组合物，其中所述真核细胞是酵母细胞，且其中所述具有表面的固体材料是具有表面的金属材料。
20.根据1的组合物，其中所述真核细胞是酵母细胞，且其中所述具有表面的固体材料是具有表面的磁性材料。
21.一种真核细胞组合物，所述真核细胞组合物基本由能特异性结合具有表面的固体材料的真核细胞和不能特异性结合所述具有表面的固体材料的真核细胞组成。
22.根据21的组合物，其中所述能特异性结合的真核细胞是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞。
23.根据21的组合物，其中所述能特异性结合的真核细胞是酵母细胞。
24.根据21的组合物，其中所述能特异性结合的真核细胞包含能特异性结合具有表面的固体材料的生物分子。
25.根据21的组合物，其中所述能特异性结合的真核细胞包含能特异性结合具有表面的固体材料的肽序列。
26.根据21的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶固体材料。
27.根据21的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的无机固体材料。
28.根据21的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的半导体材料。
29.根据21的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的金属材料。
30.根据21的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的磁性材料。
31.根据21的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的陶瓷材料。
32.根据21的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的有机材料。
33.根据21的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的聚合物材料。
34.根据21的组合物，其中所述具有表面的固体材料是结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或具有表面的聚合物材料。
35.根据21的组合物，其中所述能特异性结合的真核细胞是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞，且具有表面的固体材料是结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或具有表面的聚合物材料。
36.根据21的组合物，其中所述能特异性结合的真核细胞是酵母细胞，且其中所述具有表面的固体材料是结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或具有表面的聚合物材料。
37.根据21的组合物，其中所述能特异性结合的真核细胞是酵母细胞，且其中所述具有表面的固体材料是半导体材料、金属材料或具有表面的磁性材料。
38.根据21的组合物，其中所述能特异性结合的真核细胞是酵母细胞，且其中所述具有表面的固体材料是具有表面的半导体材料。
39.根据21的组合物，其中所述能特异性结合的真核细胞是酵母细胞，且其中所述具有表面的固体材料是具有表面的金属材料。
40.根据21的组合物，其中所述能特异性结合的真核细胞是酵母细胞，且其中所述具有表面的固体材料是具有表面的磁性材料。
41.一种宿主真核细胞，所述宿主真核细胞包含一种或多种能选择性结合具有表面的固体材料的生物分子。
42.根据41的细胞，其中所述一种或多种生物分子包括肽或蛋白质。
43.根据41的细胞，其中所述一种或多种生物分子包括在酵母上作为Aga2融合体展示的人单链可变片断抗体。
44.根据41的细胞，其中所述一种或多种生物分子包括在酵母上作为Aga2融合体展示的肽。
45.根据41的细胞，其中所述具有表面的固体材料是无机材料。
46.根据41的细胞，其中所述具有表面的固体材料是有机材料。
47.根据41的细胞，其中所述具有表面的固体材料是结晶材料。
48.根据41的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
49.根据41的细胞，其中所述细胞是酵母细胞。
50.根据41的细胞，其中所述细胞是酵母细胞，且其中所述具有表面的固体材料是无机材料。
51.根据41的细胞，其中所述细胞是酵母细胞，且其中所述具有表面的固体材料是有机材料。
52.根据41的细胞，其中所述细胞是酵母细胞，所述具有表面的固体材料是无机材料，且其中所述一种或多种生物分子包括肽或蛋白质。
53.根据41的细胞，其中所述细胞是酵母细胞，所述具有表面的固体材料是无机材料，且其中所述一种或多种生物分子包括在酵母上作为Aga2融合体展示的人单链可变片断抗体。
54.一批宿主细胞，所述宿主细胞包括众多根据41的宿主细胞。
55.一批根据54的宿主细胞，其中所述宿主细胞与一批不能选择性结合具有表面的固体材料的宿主真核细胞在一起。
56.一种真核细胞，所述真核细胞能分泌一种或多种能选择性结合具有表面的固体材料的生物分子。
57.根据56的细胞，其中所述细胞是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞。
58.根据56的细胞，其中所述一种或多种生物分子是肽或蛋白质。
59.根据56的细胞，其中所述细胞是酵母，且所述一种或多种生物分子是肽或蛋白质。
60.根据56的细胞，其中所述细胞是酵母或哺乳动物细胞，且所述一种或多种生物分子能特异性结合具有表面的结晶固体材料。
61.一种细胞覆盖的材料，所述细胞覆盖的材料包括一种或多种特异性结合至具有表面的固体材料的真核细胞。
62.根据61的材料，其中所述真核细胞是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞。
63.根据61的材料，其中所述真核细胞是酵母细胞。
64.根据61的材料，其中所述真核细胞包含特异性结合至具有表面的固体材料的生物分子。
65.根据61的材料，其中所述真核细胞包含特异性结合至具有表面的固体材料的肽序列。
66.根据61的材料，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶固体材料。
67.根据61的材料，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的无机固体材料。
68.根据61的材料，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的半导体材料。
69.根据61的材料，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的金属材料。
70.根据61的材料，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的磁性材料。
71.根据61的材料，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的陶瓷材料。
72.根据61的材料，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的有机材料。
73.根据61的材料，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的聚合物材料。
74.根据61的材料，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或聚合物材料。
75.根据61的材料，其中所述真核细胞是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞，且其中所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或聚合物材料。
76.根据61的材料，其中所述真核细胞是酵母细胞，且其中所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或聚合物材料。
77.根据61的材料，其中所述真核细胞是酵母细胞，且其中所述具有表面的固体材料是具有表面的半导体材料、金属材料或磁性材料。
78.根据61的材料，其中所述真核细胞是酵母细胞，且其中所述具有表面的固体材料是具有表面的半导体材料。
79.根据61的材料，其中所述真核细胞是酵母细胞，且其中所述具有表面的固体材料是具有表面的金属材料。
80.根据61的材料，其中所述真核细胞是酵母细胞，且其中所述具有表面的固体材料是具有表面的磁性材料。
81.根据61的材料，其中所述具有表面的固体材料是纳米颗粒材料。
82.根据61的材料，其中所述具有表面的固体材料是纳米颗粒材料，也是具有表面的结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或聚合物材料。
83.根据61的材料，其中所述具有表面的固体材料是纳米颗粒材料，也是具有表面的半导体材料、金属材料或磁性材料。
84.根据61的材料，其中所述具有表面的固体材料是纳米颗粒材料，也是具有表面的半导体材料。
85.根据61的材料，其中所述具有表面的固体材料是纳米颗粒材料，也是具有表面的金属材料。
86.根据61的材料，其中所述具有表面的固体材料是纳米颗粒材料，也是具有表面的磁性材料。
87.根据61的材料，其中所述细胞覆盖的材料是自体愈合细胞覆盖的材料。
88.一种制品，所述制品包括固体底物和一种或多种通过其表面上的蛋白质或肽选择性结合至固体底物的真核细胞。
89.根据88的制品，其中所述固体底物是电极，所述真核细胞是人细胞。
90.根据88的制品，其中所述固体底物是无机材料，所述真核细胞是哺乳动物细胞。
91.一种制品，所述制品包括具有表面的固体材料和选择性结合至所述表面的来自组合真核细胞展示文库的表达生物分子。
92.91的制品，其中所述细胞展示文库是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞展示文库。
93.91的制品，其中所述细胞展示文库是酵母细胞展示文库或哺乳动物细胞展示文库。
94.91的制品，其中所述细胞展示文库是酵母细胞展示文库。
95.91的制品，其中所述细胞展示文库是人细胞展示文库。
96.91的制品，其中所述细胞展示文库是哺乳动物细胞展示文库。
97.91的制品，其中所述表达生物分子被分泌。
98.91的制品，其中所述表达生物分子被展示在真核细胞表面上。
99.根据91的制品，其中所述组合细胞展示文库是在酵母上作为融合体展示的人单链可变片断抗体文库。
100.根据91的制品，其中所述生物分子是蛋白质或肽。
101.根据91的制品，其中所述细胞展示文库包含具有表面的成员，所述成员包含具有能导致选择性结合的多肽结合位点的表达生物分子。
102.91的制品，其中所述表达生物分子包含能导致选择性结合的多肽结合位点。
103.根据91的制品，其中所述具有表面的固体材料底物是具有表面的结晶固体材料。
104.根据91的制品，其中所述具有表面的固体材料底物是具有表面的无机固体材料。
105.根据91的制品，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的半导体材料。
106.根据91的制品，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的金属材料。
107.根据91的制品，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的磁性材料。
108.根据91的制品，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的陶瓷材料。
109.根据91的制品，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的有机材料。
110.根据91的制品，其中所述具有表面的固体材料是单晶非粒状固体材料。
111.根据91的制品，其中所述具有表面的固体材料是粒状结晶固体材料。
112.根据91的制品，其中所述具有表面的固体材料是微颗粒材料。
113.根据91的制品，其中所述具有表面的固体材料是纳米颗粒材料。
114.根据91的制品，其中所述具有表面的固体材料经过表面处理，以限制所述表达生物分子与所述表面之间的非特异性相互作用。
115.根据91的制品，其中所述生物分子经过遗传工程改造，以特异性结合不同的表面。
116.根据91的制品，其中所述细胞展示文库是酵母细胞展示文库，且其中所述具有表面的固体材料是单晶非粒状固体材料。
117.根据91的制品，其中所述细胞展示文库是酵母细胞展示文库，且其中所述具有表面的固体材料底物是具有表面的无机固体材料。
118.根据91的制品，其中所述细胞展示文库是酵母细胞展示文库，且其中所述具有表面的固体材料底物是具有表面的无机或有机固体材料。
119.根据91的制品，其中所述细胞展示文库是酵母细胞展示文库，且其中所述具有表面的固体材料底物是具有表面的无机或有机结晶固体材料。
120.一种制品，所述制品包括具有表面的固体材料和一种或多种选择性结合至所述表面的生物分子，其中所述一种或多种生物分子是具有获自组合真核细胞展示文库的序列的合成肽或蛋白质。
121.一种使来自细胞展示文库的生物分子选择性结合固体材料表面的方法，所述方法包括以下步骤：
提供真核组合细胞展示文库，其中所述文库包含众多表达生物分子；
提供具有表面的固体材料；
使所述细胞展示文库与所述具有表面的固体材料在能导致所述来自真核细胞展示文库的众多表达生物分子选择性结合所述表面的条件下相接触。
122.121的方法，其中所述组合细胞展示文库是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞展示文库。
123.根据121的方法，其中所述组合细胞展示文库是酵母文库。
124.根据121的方法，其中所述组合细胞展示文库是在酵母上作为融合体展示的人单链可变片断抗体文库。
125.根据121的方法，其中所述组合细胞展示文库是在酵母上作为融合体展示的肽文库。
126.根据121的方法，其中所述众多生物分子是众多蛋白质或肽。
127.根据121的方法，其中所述细胞展示文库包含具有表面的成员，所述成员包含具有能导致选择性结合的多肽结合位点的表达生物分子。
128.根据121的方法，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶固体材料。
129.根据121的方法，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的无机固体材料。
130.根据121的方法，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的半导体材料。
131.根据121的方法，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的金属材料。
132.根据121的方法，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的磁性材料。
133.根据121的方法，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的陶瓷材料。
134.根据121的方法，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的有机材料。
135.根据121的方法，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的聚合物材料。
136.根据121的方法，其中所述具有表面的固体材料在所述接触步骤之前先经过表面处理，以限制所述众多表达生物分子与所述表面之间的非特异性相互作用。
137.根据121的方法，其中所述具有表面的固体材料是单晶非粒状固体材料。
138.根据121的方法，其中所述具有表面的固体材料是固体颗粒材料。
139.根据121的方法，所述方法进一步包括调节所述文库的表达的步骤。
140.根据121的方法，所述方法进一步包括分离能选择性结合所述具有表面的固体材料的表达生物分子的步骤。
141.根据121的方法，其中所述组合细胞展示文库是酵母文库，且其中所述具有表面的固体材料是具有表面的无机固体材料。
142.根据121的方法，其中所述组合细胞展示文库是酵母文库，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的无机固体材料，且其中所述细胞展示文库包含具有表面的酵母成员，所述酵母成员包含具有能导致选择性结合的多肽结合位点的表达生物分子。
143.根据121的方法，其中所述组合细胞展示文库是酵母文库，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的无机固体材料，其中所述细胞展示文库包含具有表面的酵母成员，所述酵母成员包含具有能导致选择性结合的多肽结合位点的表达生物分子，且其中所述具有表面的固体材料经过表面处理，以限制所述众多表达生物分子与所述表面之间的非特异性相互作用。
144.根据121的方法，其中所述组合细胞展示文库是酵母文库，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的有机固体材料，其中所述细胞展示文库包含具有表面的成员，所述成员包含具有能导致选择性结合的多肽结合位点的表达生物分子，且其中所述具有表面的固体材料经过表面处理，以限制所述众多表达生物分子与所述表面之间的非特异性相互作用。
145.一种生长固体颗粒材料的方法，所述方法包括以下步骤：
将所述固体颗粒材料的一种或多种前体试剂，与一种或多种与所述固体颗粒材料特异性结合的所选真核组合细胞展示文库成员，在能使所述固体颗粒材料在所述一种或多种真核组合展示文库成员存在下形成的条件下混合。
146.根据145的方法，其中所述固体颗粒材料是纳米颗粒材料。
147.根据145的方法，其中所述固体颗粒材料是无机颗粒材料。
148.根据145的方法，其中所述固体颗粒材料是有机颗粒材料。
149.根据145的方法，其中所述固体颗粒材料是磁性颗粒材料。
150.根据145的方法，其中所述固体颗粒材料是金属颗粒材料。
151.根据145的方法，其中所述固体颗粒材料是纳米结晶材料。
152.根据145的方法，其中所述固体颗粒材料是量子点材料。
153.根据145的方法，其中所述固体颗粒材料是半导体材料。
154.根据145的方法，其中所述条件包括约300℃或更低的温度。
155.根据145的方法，其中所述条件包括约100℃或更低的温度。
156.根据145的方法，其中所述条件包括约0℃至约40℃的温度。
157.根据145的方法，其中所述条件包括约20℃至约40℃的温度。
158.一种生长固体颗粒材料的方法，所述方法包括以下步骤：
从真核细胞展示文库中鉴定出能选择性结合固体材料的生物分子；
将所述固体材料的一种或多种前体试剂与所述生物分子在能使所述固体材料成为固体颗粒材料的条件下混合。
159.根据158的方法，其中所述真核细胞展示文库是酵母或哺乳动物细胞展示文库。
160.根据158的方法，其中所述真核细胞展示文库是酵母细胞展示文库。
161.根据158的方法，其中所述生物分子是肽或蛋白质。
162.根据158的方法，其中所述生物分子是抗体。
163.根据158的方法，其中所述固体材料是结晶材料。
164.根据158的方法，其中所述固体材料是无机材料。
165.根据158的方法，其中所述固体材料是半导体材料。
166.根据158的方法，其中所述固体颗粒材料纳米颗粒固体材料。
167.根据158的方法，其中所述真核细胞展示文库是酵母细胞展示文库，其中所述生物分子是肽或蛋白质，且其中所述固体材料是结晶材料。
168.根据158的方法，其中所述真核细胞展示文库是酵母细胞展示文库，其中所述生物分子是肽或蛋白质，其中所述固体材料是无机材料，且其中所述固体颗粒材料是纳米颗粒固体材料。
169.168的方法，其中所述纳米颗粒固体材料的平均颗粒直径为约1nm至约10nm。
170.一种表达生物分子的组合物，所述表达生物分子的组合物能选择性结合固体材料表面，其中所述生物分子由真核细胞表达。
171.170的生物分子，其中所述真核细胞是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞，所述生物分子是肽或蛋白质。
172.170的生物分子，其中所述真核细胞是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞，所述生物分子是抗体。
173.170的生物分子，其中所述真核细胞是酵母细胞，所述生物分子是肽或蛋白质。
174.根据170的生物分子，其中所述真核细胞表面展示所述生物分子。
175.根据170的生物分子，其中所述真核细胞分泌所述生物分子。
176.一种表达肽的组合物，所述表达肽的组合物能选择性结合固体材料表面，其中所述肽由真核细胞表达。
177.176的肽，其中所述真核细胞是酵母细胞。
178.176的肽，其中所述真核细胞表面展示所述肽。
179.176的肽，其中所述真核细胞表面分泌所述肽。
180.一种生物分子，所述生物分子能选择性结合具有表面的固体材料，且能用真核细胞展示文库进行鉴定。
181.根据180的生物分子，其中所述真核细胞展示文库是酵母文库。
182.根据180的生物分子，其中所述生物分子是肽或蛋白质。
183.根据181的生物分子，其中所述生物分子是肽或蛋白质。
                   附图简述
图1.结合CdS的酵母文库。(A)在d3轮淘选后表达表面展示scFv抗体的酵母文库结合单晶CdS[A-板]。(B)表达CD20胞外域而不是scFv文库的酵母对照克隆不结合单晶CdS。透射光显微图像大小约为260μm2。插图显示结合CdS的单芽殖酵母细胞和对应的CdS晶体在SD中温育24小时后的酵母培养物。
图2.结合CdS的细胞的定量。(A)细胞所覆盖的百分表面积从结合CdS的分离克隆和设计突变体(表I)的图像计算。亲代克隆以深灰色柱形表示，突变体以浅灰色柱形表示。(B)CdS克隆E01结合一批各不相同材料的试验结果：单晶CdS、蒸发到玻璃上的Au、薄膜FePt、单晶Al2O3、外延生长的GaN均归一化到CdS。所列的值为多个实验获取的图像的几何平均数±标准偏差。
图3.对多种材料进行淘选而分离的结合克隆实例。e3轮淘选中鉴定出的各序列在酵母中表达。(A)4H01，为全长scFv抗体，选择性结合Al2O3胜过结合GaN。(B)4H09，为全长scFv抗体，选择性结合GaN胜过结合Al2O3。(C)A02，为scFv片断(表II)，选择性结合Au胜过结合CdS。(D)G02，为scFv片断(表II)，被展示时(开)结合FePt，其表达被葡萄糖阻遏时(关)不结合FePt。光学显微图像约为340μm×260μm。
图4.表达新型材料相互作用性蛋白质的酵母的应用。(A)生物膜涂层的Au表面通过使酵母克隆A02生长2天来创建。(B)在t＝0，从CdS表面清除选定部分的表达CdS克隆D01的结合细胞。24小时生长后，观察到细胞结合被清除的区域。48小时内，生物膜完全自体愈合。(C)用材料特异性酵母标记金属-绝缘体异质结构。克隆G02能选择性结合FePt胜过结合SiN和SiO2。每张图像上显示有比例尺。
图5.对结合的遗传调节。将针对CdS单晶淘选而选出的酵母克隆d7群体在葡萄糖培养基中生长。(A)无抗体文库表达时，细胞不结合CdS单晶。(B)相同的细胞转换到半乳糖培养基(SG)则结合CdS，表明相互作用依赖于文库表达。透射光显微图像大小约为540μm×540μm。
图6.分离克隆与突变体相比对Au或FePt的相对结合能力。用结合Au(A)或FePt(B)的分离克隆和设计突变体(见表II)的图像计算Au表面上结合的细胞数。突变克隆的细胞结合数(浅灰色柱形)对其各自的亲本克隆(深灰色柱形)进行归一化。所列的值为多个实验获取的图像的几何平均数±标准偏差。
图7.以生物分子为模板的CdS纳米颗粒发出的荧光。当暴露于紫外光源时，从合成的D07肽(biot-SGGGDVHHHGRHGAEHADI-c，)与金属盐混合的样品观察到强烈荧光(中间)，但从单独的肽D07或单独的金属盐没有观察到荧光(左边)。与金属盐混合的对照肽FP-I(n-HNKHLPSTQPLA-c)，当以1∶1与金属盐混合时产生少量荧光，当以1∶10混合时没有荧光。肽和金属盐的浓度在图中显示。所有反应均在室温、标准大气压下在水中进行。
图8.在D07肽或对照肽FP-1存在下生长的CdS纳米颗粒的吸收光谱和光致发光光谱。用D07肽生长的颗粒显示400-450nm之间的吸收front和对应的荧光峰(约500nm处有最大值)，这是显示量子局限效应的纳米颗粒的特征。而用对照肽FP-1生长的颗粒显示更接近于大块CdS的515nm的弱吸收front，且显示的荧光如有也很弱。浓度以325uM(比例＝10)至32uM(比例＝1)的比例范围表示。
                       详述
I.引言与技术文献
在描述本发明的过程中，本申请人参考了可用于实施本发明的技术文献，但并没有承认所引用的技术文献是现有技术。除在本引言中提到的文献外，在本说明书的结尾还提供了参考文献一览表。这些参考文献通过引用整体结合到本文中。
2004年2月5日提交的Belcher和Peele等的临时专利申请系列号60/541,757(“细胞展示文库”)的整体，包括附图、表、权利要求书和工作实施例，通过引用结合到本文中并支持本文。
在本发明中，真核组合细胞展示文库(包括组合酵母细胞展示文库)的筛选可用于产生蛋白质特异性亲和试剂，用于治疗和药物发现(1)。这些文库可包含众多表达生物分子。虽然对于酵母展示系统来说已取得许多进展(2)，但未曾针对具有表面的固体材料筛选过酵母展示文库，所述固体材料包括例如本发明所述的无机材料和其他技术上重要的材料。最近，在开发针对无机材料的蛋白质特异性方面取得了有用的进展，所述开发的想法在于能够选择或开放出蛋白质，以结合各种类型的无机材料和/或指导所述无机材料的合成(3)。实例包括噬菌体展示的肽文库(4-8)、细菌表面展示的多肽(9-11)和单克隆抗体文库(12)。虽然这些系统已经是有用的，但真核生物和酵母展示的文库显示某些优点，这在本文中将有进一步的描述。
在本发明中，可利用展示在真核细胞上的组合蛋白质多样性，来将基于蛋白质的系统对无机材料的识别能力和遗传学的本领两者与真核细胞的遗传调节、生长和感觉能力结合在一起。真核细胞如酵母能够有效地展示翻译后修饰的或复杂的蛋白质，如抗体片断(13)和受体(14)，这如果使用细菌或噬菌体展示系统将不那么容易实现。此外，使用细胞进行筛选的优点是具有高拷贝数展示的潜力，容易通过光学显微镜术或荧光激活细胞分选术(FACS)检测，不用第二宿主即可进行扩增和遗传调节展示的能力(15，16)。较之噬菌体相对较大的细胞使得可以将机械力施加于颗粒状细胞体，以定量探测生物分子-材料间相互作用(17)。使用酵母来潜在地生产以生物分子为模板的材料胜过使用其他细胞或基于蛋白质的系统的另一个优点是，酵母的可量测性和成本效益性，这一优点已被探究和利用了千百年(18)。
本文描述了用以鉴定能与无机材料相互作用的蛋白质生物分子的新方法，在某些实施方案中，所述方法依赖于活酵母细胞在其表面上表达和展示蛋白质或肽的组合文库，然后针对材料淘选所述活酵母细胞，接着扩增结合的细胞。例如，可针对一批不同的技术上重要材料，包括半导体、磁性材料和金属材料，淘选展示在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)上的人单链抗体文库(13)。可鉴定出材料特异性抗体和多肽，并描述系统的一般特征。具体的说，由移码和截短产生的肽序列可比全长单链抗体优先分离，尽管它们在开始的群体中只占少数。这一新系统为寻找医学上或工业上可应用的基于细胞或蛋白质的试剂提供了途径，该试剂能介导与技术上重要材料、微电子元件或混成装置的相互作用。另外，由于如生物矿化所显示(19-21)，生物已进化出复杂的系统来控制无机材料，如果能够用人工改造的系统在细胞水平上实行选择，则可洞察天然生物矿化系统的分子机制。
使用本发明的方法，可从细胞展示文库中鉴定出能够结合、生长、装配和组织具有技术意义的材料的生物分子。所述鉴定可通过筛选方法来进行，其中可例如使所述文库反复地与具有表面的材料相接触，并经反复筛选使能选择性结合所述表面的文库成员相对于不能结合所述表面的文库成员逐步得到分离和富集。这些用以进行选择性富集的方法可称之为淘选或生物淘选。
例如，用以进行选择性富集的筛选方法是公知的：针对固体表面的噬菌体展示组合筛选方法已在以下得到描述并可在本发明的实施中加以参考，包括例如Belcher等的美国专利申请：(1)“Biological Controlof Nanoparticle Nucleation，Shape，and Crystal Phase(纳米颗粒成核作用、形状和结晶相的生物控制)”；2003/0068900；2003年4月10日公开；(2)“Nanoscale Ordering of Hybrid Materials Using GeneticallyEngineered Mesoscale Virus(用遗传工程改造的中尺度病毒对杂化材料进行纳米尺度有序化)”；2003/0073104；2003年4月17日公开；(3)“Biological Control of Nanoparticles(纳米颗粒的生物控制)”；2003/0113714；2003年6月19日公开；和(4)“Molecular Recognition ofMaterials(材料的分子识别)”；2003/0148380；2003年8月7日公开，这些专利申请通过引用整体结合到本文中。
Belcher等的另外的美国专利申请包括(5)2003年9月4日提交的系列号10/654,623(“Composition，Method，and Use of BiFunctionalBiomaterials(双功能生物材料的组成、方法和应用)”)；(6)2003年9月22日提交的系列号10/665,721(“Peptide Mediated Synthesis of Metallicand Magnetic Nanoparticles(金属纳米颗粒和磁性纳米颗粒的肽介导合成)”)；(7)2003年9月24日提交的系列号10/668,600(“FabricatedBiofilm Storage Device(装配式生物膜储存装置)”)；(8)2003年10月15日提交的美国临时系列号60/510,862(“Viral Fibers(病毒纤维)”)和2004年10月15日提交的美国正式申请系列号10/965,665；(9)2003年10月15日提交的美国临时系列号60/511,102(“MultifunctionalBiomaterials...(多功能生物材料...)”)和2004年10月15日提交的美国正式申请系列号10/965,227；和(10)2004年1月5日提交的美国临时系列号60/534,102(“Inorganic Nanowires(无机纳米丝)”)和2004年10月29日提交的美国正式申请系列号(现在未给出)。
Belcher等以外的可用于实施本发明(包括鉴定生物分子和与不同类型的材料结合)的技术文献包括：
·Mao C等.Viral assembly of oriented quantum dot nanowires(定向量子点纳米丝的病毒装配).Proc Natl Acad Sci USA.2003年6月10日；100(12)：6946-51.
·Lee SW等.Ordering of quantum dots using genetically engineeredviruses(用遗传工程改造的病毒进行量子点的有序化).Science.2002年5月3日；296(5569)：892-5.
·Flynn C等.Synthesis and organization of nanoscale II-VIsemiconductor materials using evolved peptide specificity and viral capsidassembly(应用设计的肽特异性和病毒衣壳装配合成和组织纳米尺度II-VI半导体材料).J.Mater.Chem.2003，13(网上预发表文章).
·Seeman NC，Belcher AM.Emulating biology：buildingnanostructures from the bottom up(仿效生物学：颠倒建造纳米结构).Proc Natl Acad Sci USA.2002年4月30日；99 Suppl 2：6451-5.
·Whaley等.Selection of peptides with semiconductor bindingspecificity for directed nanocrystal assembly(具有针对定向纳米晶体装配的半导体结合特异性的肽的选择).Nature.2000年6月8日；405(6787)：665-8。
另外，酵母展示文库描述于例如Kieke等的美国专利申请第6,300,065号(2001年10月9日)；Wittrup等的第6,331,391号(2001年12月18日；已撤回)；第6,423,538号；第6,300,065号；和Kranz等的专利申请出版物2002/0058253(2002年5月16日)。Wittrup等的另外的技术文献可用于本发明的实施，包括例如：
·Bhatia等.Rolling Adhesion Kinematics of Yeast Engineered ToExpress Selectins(经工程改造表达选择蛋白的酵母的前滚黏着运动学).Biotechnol Prog.2003年6月；19(3)：1033-1037.
·Feldhaus等.Flow-cytometric isolation of human antibodies from anonimmune Saccharomyces cerevisiae surface display library(通过流式细胞术从非免疫酿酒酵母表面展示文库分离人抗体).Nat Biotechnol.2003年2月；21(2)：163-70.
·Yeung YA，Wittrup KD.Quantitative screening of Yeast surface-displayed polypeptide libraries by magnetic bead capture(通过磁珠捕捉定量筛选酵母表面展示的多肽文库).Biotechnol Prog.2002年3-4月；18(2)：212-20.
·Wittrup KD.Protein engineering by cell-surface display(通过细胞表面展示进行的蛋白质工程).Curr Opin Biotechnol.2001年8月；12(4)：395-9.
·Boder ET，Wittrup KD.Yeast surface display for directed evolutionof protein expression，affinity，and stability(进行蛋白质表达、亲和性和稳定性的定向进化的酵母表面展示).Methods Enzymol.2000；328：430-44.
·Wittrup KD.The single cell as a microplate well(作为微量培养板孔的单细胞).Nat Biotechnol.2000年8月；18(10)：1039-40.
·Boder ET，Midelfort KS，Wittrup KD.Directed evolution of antibodyfragment with monovalent femtomolar antigen-binding affinity(具有单价飞摩尔抗原结合亲和性的抗体片断的定向进化).Proc Natl Acad SciUSA.2000年9月26日；97(20)：10701-5.
·Boder ET，Wittrup KD.Optimal screening of surface-displayedpolypeptide libraries(表面展示的多肽文库的优化筛选).Biotechnol Prog.1998年1-2月；14(1)：55-62.
·Holler PD等.In vitro evolution of a T cell receptor with high affinityfor peptide/MHC(对肽/MHC具有高亲和性的T细胞受体的体外进化).Proc Natl Acad Sci USA.2000年5月9日；97(10)：5387-92.
·Bannister SJ，Wittrup KD.Glutathione excretion in response toheterologous protein secretion in Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母响应异源蛋白质分泌进行的谷胱甘肽排泄).Biotechnol Bioeng.2000年5月20日；68(4)：389-95.
·VanAntwerp JJ，Wittrup KD.Fine affinity discrimination by yeastsurface display and flow cytometry(通过酵母表面展示和流式细胞术进行细微亲和性辨别).Biotechnol Prog.2000年1-2月；16(1)：31-7.
·Kieke MC等.Selection of functional T cell receptor mutants fromyeast surface-display library(从酵母表面展示文库选择功能性T细胞受体突变体).Proc Natl Acad Sci USA.1999年5月11日；96(10)：5651-6.
·Shusta EV等.Increasing the secretory capacity of Saccharomycescerevisiae for production of single-chain antibody fragment(提高酿酒酵母生产单链抗体片断的分泌能力).Nat Biotech.1998年8月；16(8)：773-7.
·Boder ET，Wittrup KD.Yeast surface display for screeningcombinatorial polypeptide libraries(用于筛选组合多肽文库的酵母表面展示).Nat Biotechnol.1997年6月；15(6)：553-7.
另参见：Wittrup KD.Disulfide bond formation and eukaryoticsecretory productivity(二硫键形成与真核生物分泌的生产率).CurrOpin Biotechnol.1995年4月；6(2)：203-8。Wittrup KD.Disulfide bondformation and eukaryotic secretory productivity(二硫键形成与真核生物分泌的生产率).Curr Opin Biotechnol.1995年4月；6(2)：203-8。
可用于本发明的实施的另外参考文献可在本说明书结尾的参考文献列表中找到。
在实施本发明过程中，可使用本领域技术内的分子生物学、遗传工程、微生物学和重组DNA技术，这种技术在文献中得到充分的阐述(例如参见美国专利第6,423,538号；第6,331,391号(已撤回)；和第6,300,065号及Wittrup等的美国专利第6,331,391号中9列，60行到10列，6行引用的参考文献；以及本说明书结尾引用的参考文献)。另参见Georgiou的美国专利第5,866,344号；Fowlkes等的第5,935,823号；和Higuchi等的第6,214,613号。
最后，本发明的一个实施方案是酵母系统，以下参考文献可用于提供能与固体材料表面相互作用的本发明酵母系统。
·Joho M，Yamanaka C，Murayama T. Cd2+ accommodation bySaccharomyces cerevisiae(酿酒酵母对Cd2+的顺应).Microbios.1986；45(184-185)：169-79.
·Dameron CT，Winge DR.Peptide-mediated formation of quantum半导体(量子半导体的肽介导形成).Trends Biotechnol.1990年9月；8(1)：3-6.
·Dameron CT，Smith BR，Winge DR.Glutathione-coated cadmium-sulfide crystallites in Candida glabrata(光滑假丝酵母中谷胱甘肽包被的硫化镉微晶).J Biol Chem.1989年10月15日；264(29)：17355-60.
·Mutoh N，Hayashi Y.Isolation of mutants of Schizosaccharomycespombe unable to synthesize cadystin，small cadmium-binding peptides(不能合成cadystin——镉结合小肽的粟酒裂殖酵母突变体的分离).Biochem Biophys Res Commun.1988年2月29日；151(1)：32-9.
·Hayashi Y，Nakagawa CW，Murasugi A.Unique properties of Cd-binding peptides induced in fission yeast，Schizosaccharomyces pombe(裂殖酵母——粟酒裂殖酵母诱导的Cd结合肽的独特性质).EnvironHealth Perspect.1986年3月；65：13-9.
·Barbas J，Santhanagopalan V，Blaszczynski M，Ellis WR Jr，WingeDR.Conversion in the peptides coating cadmium：sulfide crystallites inCandida glabrata(肽包被镉的转化：光滑假丝酵母中的硫化物微晶).JInorg Biochem.1992年11月1日；48(2)：95-105.
·Mehra RK，Mulchandani P，Hunter TC.Role of CdS quantumcrystallites in cadmium resistance in Candida glabrata(CdS量子微晶在光滑假丝酵母的镉抗性中的作用).Biochem Biophys Res Commun.1994年5月16日；200(3)：1193-200.
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II.细胞展示文库
细胞组合展示文库是本领域公知的(参见例如以上I节；参见以下参考文献2及其中引用的参考文献；另参见例如K.Higuchi等的美国专利第6,214,613号“Expression Screening Vector(表达筛选载体)”)。例如，类似于蛋白质在例如琼脂糖凝胶上的固定化，蛋白质在细胞表面上的展示可提供支持体(support)。可将表达蛋白质展示在细胞表面上，而不是将可溶性蛋白质共价连接到惰性支持体基体(support matrix)。这样，就可操作细胞，如同它们是支持介质(support media)中微米大小的珠。因此，细胞表面展示可用来绕开结合蛋白质和酶的单独表达、纯化和固定化。另外，所述生物分子可从细胞中分泌出来而不是展示在细胞表面上。
真核组合细胞展示文库(包括酵母文库)可用于本发明的实施，其中所述文库包含众多表达生物分子。真核细胞展示文库包括例如酵母、昆虫、植物和哺乳动物文库。细胞可为细胞系，或者可为原代培养细胞类型。
哺乳动物细胞，包括其遗传工程和细胞表面展示程序是公知的。参见例如Beach等的美国专利第6,255,071号(2001年7月3日)；Zambrowicz等的第6,207,371号(2001年3月27日)；和Sands等的第6,136,566号(2000年10月24日)。另参见例如Holmes等，J.Immunol.Methods，1999，230：141-147；Chesnut等，J.Immunol.Methods，1996，193：17-27；Chou等，Biotechnol Bioeng，1999，65：160-169。
具体地说，本发明中优选酵母文库。对酵母的选择并没有特别的限制。例如，可使用酿酒酵母(S.cerevisiae)。
酵母的一般细胞特性是公知的，可用于本发明的实施。参见例如Walker，G.M.Yeast Physiology and Biotechnology(酵母生理学和生物技术)，John Wiley，1998。例如，可使用不同细胞大小、性状和颜色的酵母，且可改变酵母环境的物理和化学条件以按需改变酵母。酵母细胞的一个实例在以下工作实施例中提供。酿酒酵母通常为椭圆形，其大小例如大直径为约5微米至约10微米，小直径为约1微米至约7微米。单倍体细胞的平均细胞体积可为例如约25立方微米至约35立方微米。二倍体细胞的平均细胞体积可为例如约50立方微米至约60立方微米。细胞大小可随菌龄增大。酵母可包含大分子成分，包括例如蛋白质、糖蛋白、多糖、聚磷酸盐、脂质和核酸。可使用已知的细胞学方法，包括显微术、相差显微术、染色法、荧光染料、荧光显微术、绿色荧光蛋白(GFP)和流式细胞术。
表达生物分子可为能提供相互作用的遗传编码生物分子，发生相互作用时，可通过与固体材料的表面相互作用实现特异性和选择性结合。例如，生物分子可在质粒中编码，其文库可在酵母细胞中或表面上产生，或者从酵母细胞中分泌出来。在另一个实施例中，生物分子可在反转录病毒构建物中遗传编码，其文库可在细胞如哺乳动物或人类细胞中或表面上产生。
对生物分子没有特别的限制，但通常可为细胞表达过程的对象。生物分子可包括肽、寡肽和多肽。它们可为蛋白质。它们可为抗体或抗体片断。生物分子的修饰包括生物素化、糖基化、二硫化物形成、糖基化、蛋白酶解、十四烷基化、prenelation、棕榈酰化、法尼基化、连接、掺入非天然氨基酸、环化和掺入离子。
生物分子可包括肽和蛋白质及它们的衍生物。生物分子可包括抗体或抗体片断，包括scFv片断。对生物分子与表面之间的相互作用类型没有特别限制，只要能实现结合即可，不过本领域公知的相互作用包括静电相互作用、离子相互作用、疏水相互作用、范德华相互作用、共价相互作用、黏着等。
生物分子可在细胞内部或细胞表面上产生。在一个实施方案中，细胞展示文库是展示在酵母表面上的人单链可变片断抗体文库。
在一个实施方案中，所述众多生物分子是众多蛋白质或肽。具体的说，细胞展示文库可包含具有表面的成员，所述成员包含具有能导致选择性结合的结合位点如多肽结合位点的表达生物分子。
在一个实施方案中，生物分子可被遗传工程改造，以使除特异性结合具有表面的固体材料外还可特异性结合另一种不同的表面。所述生物分子可例如具有两个或多个能提供选择性或特异性结合的位点，起到连接序列部分的作用。例如，所述生物分子可结合具有表面的固体材料，然后在第二个结合位点结合另一种表面。
对文库多样性没有特别的限制，但可为例如大于104、大于105、大于106、大于107或大于108个克隆。可用单一文库进行筛选。或者也可用一系列较小的文库进行筛选。
本发明的一个重要方面在于通过可调节系统进一步控制过程，包括时序控制或空间控制。例如，生物分子的展示可通过控制生物分子的转录或翻译来调节。可使用外界信号(cue)，这些外界信号能为额外控制提供许多选择可能，所述额外控制包括对细胞生长、信号转导、转录、翻译和蛋白质功能的时序控制。例如在一个实施方案中，生物分子如肽可在营养可调节遗传元件如半乳糖可调节启动子的下游编码。在这个实施方案中，将宿主细胞转换到含葡萄糖或半乳糖的生长培养基，可控制肽的转录。因此，可用营养物来调节文库的表达。如果编码肽可结合或装配纳米结晶材料或其他材料，则对肽的展示或分泌的调节可使能够对材料沉积进行时序或空间控制。可通过能影响信号转导途径、转录、翻译或分子内相互作用的外界信号或刺激，来实现时序控制。可通过多种不同类型的转换机制来控制调节。这些机制可直接影响生物分子的转录、翻译、折叠、稳定性或加工，或者通过信号转导途径诱导转换机制。转换机制是本领域公知的。可通过外界信号来时序控制生物分子的展示，所述外界信号包括但不限于小分子、可扩散配体例如生长因子、细胞因子、信息素、激素、神经递质、糖、氨基酸、核苷酸、营养化合物、光线、射频、机械转导、磁场、电场、电流、温度等。
可调节系统的实例包括：
1.Gossen，M.和Bujard，H.(1992).Tight control of gene expression inmammalian cells by tetracycline-responsive promoters(四环素应答启动子对哺乳动物细胞基因表达的紧密控制).Proc Natl Acad Sci USA 89，5547-51.
2.Gari E，Piedrafita L，Aldea M，Herrero E.A set of vectors with atetracycline-regulatable promoter system for modulated gene expression inSaccharomyces cerevisiae(一套用于酿酒酵母中调制基因表达的带四环素可调节启动子系统的载体).Yeast.1997年7月；13(9)：837-48.
3.No，D.，Yao，T.P.和Evans，R.M.(1996)Proc Natl Acad Sci USA93(8)：3346-51.(昆虫激素蜕皮素或其类似物百日青蜕皮酮A(ponA)可激活携有黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)蜕皮素受体的基因及含蜕皮素受体结合位点的启动子两者的哺乳动物细胞中的转录作用。)
另外，可将不同的启动子用于酵母表达。例如，Gal 1，10启动子可被半乳糖诱导。可将含UAS序列的调节区置于任何其他基因的上游，以赋予半乳糖可诱导表达和葡萄糖阻遏。ADH2启动子可被葡萄糖阻遏，在不可发酵碳源上被强烈转录(类似于Gal 1，10，只是不可被半乳糖诱导)。可使用CUP1启动子，其为金属硫蛋白基因启动子。它可被添加到培养基中的铜或银离子激活。PHO5启动子可在培养基中磷酸盐含量低或没有磷酸盐的条件下被诱导。还可采用类固醇可诱导表达来调节编码生物分子的表达。
在一个实施方案中，可将大鼠糖皮质类固醇受体基因置于组成型GPD启动子之后，以在酵母中表达大鼠糖皮质类固醇受体。可用3个位于CYC1(细胞色素c)基因最小启动子上游的糖皮质类固醇应答元件和待控制目的基因构建第二载体。当培养基中添加类固醇激素时，这个系统对剂量依赖性表达起到很好的作用。应答时间快速，添加激素后t1/2为7-9分钟。热激诱导的表达可通过将热激基因的UAS置于最小启动子之前来实现。另外参见(1)Schena M.等，Science，1988年8月19日：24(4868)：965-7，(2)Wright等，J.Biol.Chem.，1990年9月5日：265(25)：14763-9。
细胞展示可以是这样：生物分子被产生出来，并与细胞膜、细胞壁或细胞附器(例如鞭毛、纤毛、伞毛或菌毛)连接而被展示。
展示也可出现在细胞溶胶、胞内成分或细胞器中。另外，生物分子可从宿主细胞中分泌或释放出来。
III.固体表面
对具有表面的固体材料没有特别的限制，只要表达生物分子选择性结合至其表面即可。例如，它可为具有表面的结晶固体材料或者具有表面的无定形固体材料。它可为单晶、微晶、纳米晶或多晶材料。它可为无机或有机簇(cluster)。或者它可为具有表面的无机固体材料，或者为具有表面的有机固体材料。另外，它可为具有表面的半导体材料，金属材料或者陶瓷或玻璃材料。它可为具有表面的聚合物材料。可使用量子点固体材料。可使用复合材料，如玻璃纤维、木材和混凝土。一般来说，具有硬表面的固体材料比具有软表面的固体材料要优选。可使用混合物。
对具有表面的固体材料的形式没有特别的限制。例如，它可为非固体颗粒材料如薄膜或薄片，或者可为固体颗粒材料。其表面可基本光滑、平坦或弯曲。固体颗粒材料可为宏观颗粒，其侧向尺寸例如达几毫米。或者它们可为微观颗粒或纳米颗粒。
一般来说，具有表面的固体材料可包含元素周期表中的任何元素。单晶、多晶材料或纳米晶体由元素或元素组合构成，包括但不限于Cu、Ag、Au、Fe、Fe3O4、Fe2O3、Pt、FePt、Co、CoPt、Sm、SmCo5、Al、AlAs、AlGaAs、Ti、TiO2、Sn、SnO2、Zn、ZnS、ZnSe、ZnTe、Cd、CdS、CdSe、CdTe、Pb、PbS、PbSe、PbTe、Si、Ge、Ga、GaN、AlGaN、InGaN、In、InP、InAs、Ca、CaCO3、CaPO4等。可使用由上述材料及其氧化物衍生物构成(但不限于这些材料和衍生物)的非晶材料。材料可为金属、金属合金或者金属离子或可溶性金属盐，其由包括但不限于Cu、Ag、Au、Fe、Pt、Co、Sm、Al、Ti、Sn、Zn、Cd、Pb和Ca的元素或元素组合构成。
底物可为单晶、矿物或薄片。它可为不镀膜纳米颗粒或粉末。
可使用金属和磁性材料，包括在例如Belcher等2003年9月22日提交的专利申请系列号10/665,721(“金属纳米颗粒和磁性纳米颗粒的肽介导合成”)中描述的金属和磁性材料。
聚合物表面可为例如烃链聚合物、有机聚合物、无机聚合物、电子聚合物、半导体聚合物、金属聚合物、聚吡咯或者服装聚合物如聚丙烯或聚酯。
另外，具有表面的固体材料还可为生物聚合物，例如蜘蛛丝、蚕丝、胶原、木质素、几丁质、纤维素和它们的衍生物。
在进行选择性结合前，可先对表面进行处理。优选例如可对具有表面的固体材料进行处理，以限制众多表达生物分子与表面之间的非特异性相互作用。具有表面的固体材料可为整块(monolithic block)材料，或者可为各材料的混合物，包括例如共混物、合金、复合材料。固体材料可具有与表面结构截然不同的主体结构。固体材料可进行表面氧化处理。
固体材料可进行改性，以包括具有已知互补识别单元的部分，所述互补识别单元供用于选择性结合生物分子。例如，纳米颗粒可进行表面处理，以包括能从纳米颗粒延伸出而进入周围介质中，从而能识别和结合互补结构的部分。
尽管使用固体表面是优选的实施方案，但也可对溶液中的底物，例如金属盐和活性前体进行选择性相互作用，所述底物在生物分子存在下可反应形成固体材料。
IV.接触步骤和选择性结合的条件
对接触步骤没有特别的限制，只要提供允许选择性结合的条件即可。可用本领域公知的方法来调整结合的严谨性，包括调整pH和改变盐浓度。可按需调整结合时间。通常可使用含水条件，包括含水缓冲条件。对温度没有特别的限制，但可使用低于约100℃，更具体的说低于约50℃的温度。典型的良好温度范围可为例如约0℃至约40℃，更具体的说约15℃至约40℃。可使用允许温度达约100℃的嗜热生物。
V.其他步骤和因素
一旦进行选择性结合，可进行更多的步骤，包括分离能选择性结合具有表面的固体材料的表达生物分子的步骤。可为此分离目的使用本领域公知的方法，包括例如利用光学、磁学、电学或物理学特征。特别是可利用荧光特性和磁性特性。例如，可在带磁性细胞分离装置的流式细胞仪上进行分离。或者，可通过密度梯度，或者在流体箱(fluidic chamber)中进行分离，或者用离心装置进行分离。
结合群体中的各克隆可通过本领域公知的方法测序，包括通过PCR直接测序，或者先从克隆中分离DNA，然后在大肠杆菌中扩增来测序。在将完全相同的序列分组后，可确定出众多独特的序列。
优选高百分比的从群体中测序出的克隆能够在幼稚宿主细胞中赋予结合能力，优选此百分比为至少50％、至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，还更优选至少90％。
如果需要，一旦确定了选择性结合的生物分子，还可将这些生物分子用于制造材料，特别是进行选择性结合的具有表面的固体材料。例如，可在生物分子存在下生长固体颗粒材料，其中所述选择性结合控制诸如晶体结构、颗粒大小和反应温度等因素。固体颗粒材料可为微粒材料或纳米颗粒材料。平均颗粒大小可为例如约2nm至约100nm，约5nm至约50nm或约10nm至约25nm。另外的平均颗粒大小可为例如约100nm至约1微米或约1微米至约500微米。对颗粒状材料没有特别的限制，但可为例如在以上对具有表面的固体材料的描述中提到的无机材料、有机材料、磁性材料、金属材料、电子材料、陶瓷材料、氧化物材料、纳米晶材料、量子点材料、半导体材料和其他材料。
通常，颗粒状材料可在相对较低的温度下制备，包括例如约300℃或更低，约100℃或更低，或者约0℃至约40℃，或更具体的说约20℃至约40℃。优选环境温度，特别是大约室温。
VI.制品
可制造包含具有表面的固体材料和表达生物分子的制品，所述表达生物分子选择性结合所述表面，且经遗传工程改造能选择性结合所述表面。结合分子可通过遗传工程、文库形成和生物淘选直接制备，或者可根据生物淘选方法的结果用合成法制备。表达生物分子可在真核细胞展示文库中表达。
可在表面上形成薄膜，包括单层薄膜，多层薄膜和单分子层。对薄膜厚度没有特别的限制，但可为例如约1nm至约100微米，或约10nm至约50微米，或约100nm至约10微米。
如果需要，可使用高温，以除去表面上的有机材料而留下残余材料。
VII.制品的制造方法和使用方法
具有特殊意义的应用包括用本文描述的方法和组合物来桥接无机材料和有机材料，或桥接无机材料和活材料。
应用包括具有明确特性的酿造材料和低缺陷材料；高密度存储用磁性材料；自体愈合涂层；生物海绵环境应用；定位或附着于特定材料或所述材料各区域(例如细胞-电极、细胞-半导体)；细胞结合于生物材料和用于移植界面的材料；图像造影剂；药物递送；生物传感器；基于细胞的传感器；细胞定位于材料表面；使神经细胞于电极连接；直接在细胞上生长量子点或其他材料标记；医学植入物。
真核细胞展示的另外应用可为噬菌体病毒展示的应用。具体的说，可进行考虑了酵母和其他真核细胞的另外特性的应用，所述另外特性例如：
1)酵母廉价，能以非常高的产率生产蛋白质生物分子，而且如酿造工业所显示，其工艺过程非常容易放大；
2)细胞可以以更高的拷贝数产生更大更复杂的或者经翻译后修饰的生物分子；
3)细胞是活的，且不断生长，因此在与涂层有关的应用中，它们可形成自体愈合活涂层或制品；
4)细胞具有感觉能力，能对环境刺激/条件作出响应。因此，可将生物传感器方面(aspect)与任何制品组合。例如，细胞在结合材料时能产生响应，或者细胞可对刺激作出响应，然后结合材料，例如在展示的调节中。
可制备试剂盒，包括组合文库试剂盒。例如，可提供用以在溶液中生长材料的试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种成分，包括(1)用以从前体装配材料的生物分子，(2)能反应形成或装配成材料的前体，(3)用以协助该过程的附件，例如管、柱等。
可提供用以例如在细胞标记中，在细胞上或细胞中生长材料的试剂盒。成分包括例如(1)用以从前体装配材料的生物分子的编码DNA；可将所述DNA给予细胞，细胞然后将生物分子表达成标记物(tag)，(2)装配成材料的前体，和(3)用以协助该过程的附件，例如管和柱。
可提供用以使细胞结合特定材料例如电极的试剂盒。这些试剂盒可包含能介导与目的材料结合的生物分子的编码DNA。
可提供用以检测特定材料表面，包括通过结合来鉴定表面缺陷的试剂盒。这些试剂盒可包含(1)表达能结合特定材料的生物分子的细胞或者所述生物分子本身；如果需要，可提供一批材料特异性克隆，(2)有关如何使细胞结合材料及区分各种材料的方法的说明书。
VIII.本发明的进一步描述和工作实施例
本发明通过下一节中的工作实施例和对它们的讨论作进一步的阐述，下一节说明了可从组合文库分离抗体和肽，所述抗体和肽当展示在酵母上时，能介导与各种材料的相互作用，包括II-VI(CdS)和III-V(GaN)半导体、金属(Au)、磁性合金(FePt)和绝缘体(Al2O3)。以上提到，这些类别的材料在新型晶体管、放大器、光电池、磁存储器和发光二极管的开发上变得日益重要。将这些和其他技术上重要的材料与生物学整合在一起的方法，将有助于发展一大批具有潜在生物技术和医学价值的应用。这些材料已在影响生物学的一个实例是II-VI半导体量子点作为细胞和亚细胞成像的光学探针的使用(29)。本文描述的组合方法允许人们工程改造生物制品与电子材料、光学材料和磁性材料之间的可控制特异性黏着相互作用。
通过这种细胞淘选方法，可鉴定出scFv片断多肽以及全长scFv，它们都具有材料特异性，如在CdS克隆E01的情况下。如将通过噬菌体展示选择的肽用于多种材料所示(3，4)，肽足以介导与平坦材料表面的相互作用。尽管本发明不受理论的局限，但据假设由于肽比结构更为复杂的scFv抗体具有更大的构象自由度，具有完美或近乎完美的结构来与晶体表面相匹配的肽，将采取能导致与平坦晶体平面发生能量上有利的相互作用的构型，其可能性大于文库中存在的scFv的可能性。此外，更小的肽可比完全蛋白质以更高的水平表达，从而有助于通过亲和力(avidity)增强细胞结合。带移码C端多肽的片断虽然只占文库的一小部分(不到三分之一)(13)，但主要分离出来的是它们。因此，淘选展示在细胞表面上的庞大随机肽文库，也有助于产生材料特异性肽，同时作为噬菌体淘选的补充，还能够直接结合显现。
经过三轮针对非金属结晶材料CdS、Al2O3和GaN的淘选也鉴定出抗体。尽管在这些筛选中仍主要分离出移码scFv片断，但这表明全长scFvs也能够与材料表面发生相互作用。确定的折叠结构如果通过减少结合所耗费的熵得以适当折叠，则可介导与材料发生特异性更强和亲和性更高的相互作用。预期这种淘选方法的改进，例如通过使用FACS来富集荧光免疫标记的全长克隆(15)，或者是磁珠富集(26)，将使得可以更好地为各种应用而检测高亲和性材料特异性抗体。此外，可通过使用材料如量子点(30)或生长成颗粒的溶质(5-7，31，32)的悬浮液，和用FACS分选、磁性分离(9，26)或密度细胞分离方法筛选能相互作用于或生长这种颗粒状材料的克隆，来对这种方法加以修改。这种筛选程序，如FACS分选或磁性分离，如果不是不可能在噬菌体上进行的话也是难以进行的，因为噬菌体尺寸小，潜在的结合荧光或磁性单元数相对较少，但这种筛选程序却可在细胞上常规进行。
细胞淘选方法通过相对简单的实验程序就能够鉴定材料特异性蛋白质。此外，还证实选定的scFv和片断酵母克隆可直接作为自体愈合生物膜和材料辨别试剂应用。但是，这些选定的生物分子的效用并不限于在酵母细胞上展示。有意义的是将这种材料结合蛋白质展示在其他真核细胞类型上，以介导细胞-材料相互作用。例如，用以将神经元或工程改造的细胞附着于电极的现行方法，可能需要外源黏着分子，会导致不精确的细胞定位(33，34)。本发明提供的选定蛋白质由人神经元展示，可使能够直接附着于Au电极或其他装置，导致细胞和装置之间产生直接的界面。这些和类似的生物分子桥可用于植入物、组织工程支架和医学诊断和治疗。
此外，基于细胞的系统是动态的，具有内置的感觉、逻辑和响应机构，这由细胞响应环境信号、调节展示和复制的能力证明。因此，灵敏的生物传感器和生物机械装置的开发可得益于细胞与装置构造当中的特定位置的有效偶联。
最后，工程改造的细胞尤其是酵母可起到蛋白质和肽的生物分子工厂的作用(18，35)。通过使用材料特异性生物分子来指导材料的装配，人们可将细胞的这种合成潜力适用于高价值材料的生产。
IX.
                     工作实施例
本发明通过以下非限制性工作实施例作进一步的阐述。
I.材料和方法.
酵母株和文库.人源全单链抗体(scFv)文库(13)如前所述保持(22)。融合到Aga2的C端的scFv在基于Ga1的启动子下游的2微米质粒上编码，并保持在具有Aga1的酵母株EBY100中(22)，所述Aga1在整合到该酵母株基因组中的基于Ga1的启动子控制下。
材料.各材料从以下来源获得：抛光的单晶CdS[A-板](ClevelandCrystal)、蒸发Au涂层的载玻片(Evaporated Metal Films Corporation)、SiN薄片上的FePt薄膜(T.Thomson，IBM，Almaden，CA)、外延生长的GaN和Al2O3模板(A.Stonas and E.Hu，UCSB，CA)。各材料实验后在bath sonicator(Fisher Scientific)中作短暂水超声清洗，然后在乙醇在漂洗，干燥保藏。GaN和Al2O3还用4mM HCl进行弱酸洗涤。各材料使用前在适当的淘选介质中封闭1小时。
淘选程序.一般如下进行选择：将材料暴露于补充有半乳糖(SG)的合成撤除成分培养基(22)中的诱导酵母细胞培养物，在新鲜培养基中洗涤材料，然后通过胰蛋白酶消化/研磨(d1轮)或者在补充有葡萄糖(SD)的合成撤除成分培养基(22)中生长出(grow off)以收回(rescue)结合的细胞。d1-d7轮淘选在22℃下按以下条件进行：d1轮：150OD细胞，75mL SG+5mg/mL牛血清白蛋白(SG-BSA)中，24小时温育；d2轮：8OD细胞，8mL SG-BSA中，24小时温育；d3轮：2OD细胞，4mLSG-BSA中，6小时温育；d4轮：2OD细胞，4mL SG-BSA中，2.25小时温育；d5轮：0.2OD细胞，1.5mL磷酸缓冲盐水+5mg/mL BSA+0.1％吐温20(PBS-BSAT)中，2小时温育；d6轮：0.1OD细胞，1mLPBS-BSAT中，1小时温育；d7轮：0.1OD细胞，1mL PBS-BSAT中，45分钟温育。e1-e3轮淘选按以下条件进行，每轮之后通过生长出以收回：e1轮：250OD细胞，125mL SG-BSA中，21.5小时温育；e2轮：1.5OD细胞，3mL SG-BSA+0.1％吐温20(SG-BSAT)中，2小时温育；e3轮：1OD细胞，1mL SG-BSAT中，2小时温育。
scFV突变体的克隆.用Quickchange诱变(Stratagene)在所需的位置添加终止密码子，构建截短突变体。使用以下寡核苷酸引物：D01I(5′-GGAACTGAGCAGCCTGACTAACGAAGACACGGCCGTC-3′和5′-GACGGCCGTGTCTTCGTTAGTCAGGCTGCTCAGTTCC-3′)，D01H(5′-CCTTGAGTGGCAGGGTTAAGATTACCGCGGACACA-3′和5′-TGTGTCCGCGGTAATCTTAACCCTGCCACTCAAGG-3′)，D07V(5′-CACCATGACCAGGGACTAACATCACCACGGCCGAC-3′和5′-GTCGGCCGTGGTGATGTTAGTCCCTGGTCATGGTG-3′)，D07R(5′-GGCTTGAGTGGATGGGATAGATCAACCCTAGCAGTGG-3′和5′-CCACTGCTAGGGTTGATCTATCCCATCCACTCAAGCC-3′)，E01V(5′-CACCATGACCAGGGACTAACATCACCACGGCCGAC-S′和5′-GTCGGCCGTGGTGATGTTAGTCCCTGGTCATGGTG-3′)，E01R(5′-GGCTTGAGTGGATGGGATAGATCAACCCTAACAGTGGTG-3′和5′-CACCACTGTTAGGGTTGATCTATCCCATCCACTCAAGCC-S′)，并用从克隆D01、D07和E01分离出的质粒DNA作为模板。对应于缺乏VH区的远侧肽片断的突变体如下克隆：从以下寡核苷酸产生dsDNA掺入片断：
D01pep(5′-CCCGGGGCTAGCGGTGGCGGCCATGATTACAGAGGTCATATTCATGGTCATTCTCAACATGGTACTGAACAACCAGATTAGGATCCGATCAG-3′)，
D07pep(5′-CCCGGGGCTAGCGGTGGCGGCGATGTTCATCATCATGGTAGACATGGTGCTGAACATGCTGATATTTAGGATCCGATCAG-3′)，和
E01pep(5′-CCCGGGGCTAGCGGTGGCGGCGATGTTCATCATCATGGTAGACATGGTGCTGAACAAGCTGAAATTTAGGATCCGATCAG-3′)，与引物(5′-ATCCCGGGGCTAGCGGTGGCGGC-3′)退火，并用Expand Enzyme(Roche Diagnostics)延伸。插入片断用NheI/BamHI消化并克隆到NheI/BamHI消化的pCTCON中，导致肽在(G4S)3柔性连接序列的末端发生融合，如与scFv相同的情形。用Geitz转化试剂盒(Tetralink)将携有这些克隆突变体和肽的已测序质粒DNA转化到EBY100中。
克隆证实和材料特异性结合试验.使质粒DNA转化的细胞在SD中30℃下生长至对数中期，然后在SG中室温下诱导18-24小时。在2ml微量离心管中将2OD600单位细胞重悬于1.5mL SG-BSAT中。将预封闭的0.5cm2CdS加入到每个克隆培养物中，荡动1小时，在新管中用SG-BSAT洗涤30分钟，然后转移到6孔培养板进行光学显微镜成像。对于E01克隆特异性试验，所有材料均放在含20OD600单位细胞(于20mL SG-BSAT中)的培养瓶中1小时，洗涤1小时，如上进行成像。
光学显微镜检和细胞定量.在Axioplan光学显微镜(Carl Zeiss Inc.)上用AxioCam MR采集数字图像，用Wayne Rasband，NIH开发的ImageJv1.3定量百分面积覆盖度。简单的说，通过调整阈值以区分细胞面积和背景面积，将图像转化成二进制数。用颗粒分析功能(颗粒大小范围10-105像素)计算细胞所覆盖总面积的分数。对于每个克隆，数值均得自675μm×535μm总面积，为从各2-4个独立实验获得的3张图像的平均值。
生物膜.Au上：在6孔板中将4cm2Au涂层的载玻片与0.1OD600/mL未诱导克隆A02(表II)一起在SG-BSAT中温育，室温下荡动12小时。然后将Au载玻片转移到新鲜的SG-BSAT中，置于荡动器上。在生物膜生长过程的不同时间点获取32X图像：结合前(t＝0)及12(转移时间)、24、36和48小时。CdS上：在荡动器上将0.5cm2抛光CdS单晶与1OD600/mL预诱导克隆D07一起室温下温育1小时。然后将CdS放入带新鲜SG-BSAT的6孔板中。用移液管头从CdS表面清除某一图案的细胞，在此时间点(t＝0h)及24和48小时生长后获取32X图像。
以生物分子为模板的量子点.试验了作为可溶性肽的CdS克隆指导荧光、光致发光纳米颗粒装配的能力。受试的合成肽是CdS结合D07peρ克隆(biot-SGGGDVHHHGRHGAEHADI-c，NewEngland Peptide，Inc.)，FP-I肽(n-HNKHLPSTQPLA-c，MIT biopolymers laboratory)作为阴性对照。
CdS量子点通过在室温下简单地将衍生自D07pep克隆的所选肽与金属盐在含水条件下混合来形成。简单的说，将合成的CdS D07肽和阴性对照FePt结合序列FP-I室温下溶于水中，与CdCl2水溶液混合。然后将Na2S水溶液慢慢加入到这些剧烈搅拌下的溶液中，直到获得等摩尔浓度的Cd和S(各为325μM)。将在不同摩尔组成的肽中生长的颗粒暴露于长波紫外光进行快速荧光显色(图7)。通过微调生长条件，可控制这种以生物分子为模板的纳米颗粒的大小和荧光特性。用Beckman Coulter的DU800分光光度计获取所制备颗粒的吸收光谱(图8)。在PTI荧光计上以360nm激发获取光致发光发射光谱(图8)。
II.结果
淘选.首先针对单晶硫化镉(CdS，II-VI半导体)淘选在酿酒酵母上展示的109个人scFv抗体的非免疫文库(13)。在1.0cm2抛光的CdS单晶[A-板]上依次进行的各轮筛选(d1-d7)，以鉴定材料特异性克隆。首先将CdS的表面在含5mg/mL BSA的SG(23)中封闭，以限制每轮之前的非特异性相互作用。然后将CdS在水相缓冲环境下暴露于酵母文库1-24小时，在培养基中洗涤，然后进行光学显微观察(图1A)。然后通过将CdS放在基于葡萄糖的SD(23)中，让结合的酵母“生长出”其表面，然后培养24小时(图1A插图)，所述基于葡萄糖的SD关闭融合到Aga2的scFv的表达。这种“生长出”方法能保证收回所有结合材料的克隆。d1-d4轮在SG-BSA中筛选，而d5-d7轮在PBS-BSAT(含吐温20)中筛选更短的时间，以提高选择的严谨性。
作为比较，将表达CD20胞外域片断CTCON(13)的对照酵母克隆在与图1A中文库完全相同的条件下与CdS相接触，但仍不能发生结合(图1B)。即使试图在SD中24小时内生长出任何结合的细胞，但结果培养物仍保持透明(图1B插图)。在第3轮亚文库上进行其他对照试验。相对于含BSA的筛选缓冲液，不含BSA的筛选缓冲液导致细胞对材料的覆盖度提高(数据未显示)，表明各克隆对CdS表面的BSA非依赖性结合和非特异性封闭剂的有用性。而且，在使用诱导的培养物时，在SD和SG中均观察到与材料的结合，表明糖分子本身并不影响结合。此外，在缺乏酵母营养成分的基于PBS的缓冲液中也观察到结合现象(数据未显示)。这些实验一起证明，结合不依赖于培养基，而依赖于所展示的文库。
然后探究了通过控制基因表达调节细胞与材料的结合的能力。重要的是，含葡萄糖的培养基(SD)阻遏scFv的表达，而转换到半乳糖(SG)则诱导表达，比如前所示(23)的阻遏状态约提高1000倍。在SD中生长的克隆与在SG中生长的完全相同培养物相比没有显示出结合能力(图5)。因此，与CdS表面的相互作用是通过所展示的抗体片断来介导的，且可通过营养进行调节。
在d7轮之后，选定的结合群体中共有36各酵母克隆进行了测序。从每个酵母克隆分离出DNA，在大肠杆菌中扩增，通过普通方法进行分离和测序。在将完全相同的DNA序列分组后，鉴定出三种独特的CdS克隆D01、D07和E01，它们分别出现26、6和4次。将各序列翻译，用IgG BLAST( http://www.ncbi.nlm.nih.goy/igblast/)与共有IgG Fv结构域序列比对，并鉴定出与共有序列不同的残基(表I)。然后将对应于这些组的DNA转化回到幼稚EBY100酵母中，再次测试各克隆与CdS的结合情况，以消除由于宿主染色体突变造成的假阳性。所有三个CdS结合序列再次证实它们在克隆证实结合试验(材料和方法)中的原始表型。结果在图2A中定量显示为CdS表面的百分面积覆盖度。
使用图像分析软件发现，D01覆盖CdS表面的48％，D07覆盖50％，E01覆盖40％。六方堆积理想球体的足迹(footprint)产生的表面积覆盖度的理论最大值约为90.7％。但是，酵母大小并不均匀，它们可能有芽体，移动细胞的侧向力不足以使随机黏着的酵母细胞的堆积程度最大化。因此，以六方堆积理想球体之间的平均相隔距离为其直径的一半计，理论最大足迹覆盖度减至约41％。因此，D07所观察到的覆盖度很可能代表单层随机黏着细胞的最大表面覆盖度。
由表I可见，所有三种CdS克隆均为全长scFv的片断，经DNA序列分析发现，它们似乎来源于天然抗体谱中存在的或文库的PCR构建过程中引入的移码突变。Feldhaus等报告说文库的68％表达远侧c-myc表位(13)，因此文库最多有约三分之一可表达scFv截短。所得的D01、D07和E01多肽分别由47、70和70个氨基酸(这些氨基酸分别与VH6-1、VH1-2和VH1-2类可变重链结构域有100、91和90％的同源性)及紧接的33、13和13个氨基酸组成，与天然邻接VH序列没有相似性。“移码”氨基酸的组成主要是极性和带电的残基，明显富含组氨酸。
构建了衍生自每种CdS克隆的截短突变体(表I)，并测试其与CdS的结合能力(图2A)，以确定结合所必需的区域。D01I只除去D01一半的C端“移码”氨基酸，能结合CdS。除去整个移码区域(克隆D01H)则使结合完全被破坏，这提示移码区域对于介导酵母-材料相互作用是必需的。类似地，D07V和E01V分别除去D07和E01的全部C端移码氨基酸，不显示任何介导CdS结合的能力。如所预期，除去CDR2和C端肽区域的进一步截短(D07R和E01R)不显示任何结合能力。因此我们猜测，在抗体框架片断C端连接的短肽贡献了大量结合能量，使酵母细胞附着于CdS的表面。
为验证所述肽是否足以独自使酵母细胞结合CdS的表面，我们构建了所述肽的Aga2融合体。在这里，所述肽不用抗体框架来展示(表I)，而是直接连接到Aga2C端的长柔性-(G4S)3AS-连接序列，如同scFv带有另外的-GGG-间隔序列。将这些肽与截短肽和原始选定的克隆进行平行淘选，以确定相对结合效率(图2A)。表达D07pep的克隆能够结合CdS，明确证明移码区域在原始分离的D07克隆中的重要性。E01pep和D01pep也显示可检测的结合能力，尽管黏着强度似乎较低。与亲本序列相比，表达所述肽的酵母表面覆盖度降低，提示抗体框架为所述肽提供了较好的展示水平或肽更易达到的朝向。这些结果还证明E01pep的结合能力比D07pep要弱，这令人惊讶，因为所述肽在15个氨基酸残基中只相差2个残基(HHHGRHGAE[Q/H]A[D/E]I)。
设定半径2μm的刚性平滑球形细胞立在平坦材料表面上，我们估计单细胞表面积中约有2.25％离该材料5nm以内。假设每个细胞约有104-105个平均分布的肽(15，24)，且展示的肽和材料之间发生相互作用需要＜5nm的距离，则存在大约200-2000个潜在的表面相互作用多肽。因此，相对结合强度的差别可被多重肽-材料相互作用产生的亲和力效应所放大或掩盖。
CdS克隆的材料特异性.还选择其他技术上重要的材料来验证选定的克隆对CdS单晶的特异性。将单晶蓝宝石(Al2O3)、外延生长的氮化镉(GaN)、溅射涂层到玻璃上的多晶金(Au)、Si/SiN上的铁铂(FePt)薄膜和CdS在完全相同的条件下(材料和方法)暴露于CdS克隆。克隆E01显示出对CdS胜过对Al2O3、GaN和Au的特殊特异性，这由Al2O3、GaN和Au这些材料上缺乏细胞可以看出(图2B)。克隆E01还显示出对CdS胜过对FePt的明显偏好，尽管对FePt确实发生一定的结合。但是，观察到此FePt薄膜以特异性明显较低的方式结合其他克隆，因此，用这个系统鉴定材料特异性蛋白质生物分子是靠得住的。
广泛适用的方法.在淘选实验中还使用了其他材料，以证明这个方法的通用性。在单个克隆测序前(材料和方法)，对Al2O3、GaN、Au、FePt和CdS进行三轮淘选(e1-e3)。另外，如对CdS所述用CTCON和其他含水培养基进行了相同的对照试验，以证明结合依赖于展示，最终产生类似的结果。图3显示选定的克隆结合Al2O3、GaN、Au和FePt。这些酵母克隆从用DNA转化的幼稚细胞创建，所述DNA从针对Al2O3、GaN、Au和FePt进行淘选、对各材料鉴定出的克隆中分离，因此这些酵母克隆是特异性结合克隆。还证明了克隆4H01对Al2O3胜过对GaN的材料特异性(图3A)，克隆4H09对GaN胜过对Al2O3的材料特异性(图3B)和克隆A02对Au胜过对CdS的材料特异性(图3C)，以及营养对克隆G02结合FePt的调节(图3D)。
有趣的是，从e3轮的350种以上DNA序列中只鉴定出14种全长scFv序列，这些序列分组如下：Al2O3两种全长克隆，GaN 3种克隆，CdS 1种克隆，Au和FePt 0种克隆。剩余的组呈现2-26种序列，主要是原始CdS筛选所见的scFv片断。截短的scFv在3轮选择中从最初在非选定文库中约占30％富集到96％以上，表明在我们对材料表面的淘选中对全长克隆的偏离。通过将淘选程序与交替几轮FACS(用以筛选这个和其他基于细胞的文库的强大工具(13，25))或磁珠富集(26)相结合，以确定C端c-myc表位标记的存在，可增进将来从这个文库鉴定全长scFv的工作。
另外，还以与CdS d1-d7轮完全相同的方式淘选Au和FePt，以证明再现性。分别在36和23个测序的克隆中，未能鉴定出针对Au或FePt的全长抗体。共有3种Au克隆(序列呈现13、5和2次)和4种FePt克隆(序列呈现16、1、1和1次)在分离和再转化表达质粒后赋予结合能力。因此，CdS、Au和FePt d7群体的100、56和87％的序列能够在幼稚宿主细胞中赋予结合能力。假阳性克隆幸免于7轮筛选的能力很可能是由于Au和FePt沉积在其他材料上。Au涂层在玻璃上，因此呈现SiO2边缘表面。FePt涂层在SiN薄片上，因此呈现SiN，很可能还有SiO2。相反，CdS作为未被黏着的单晶而用于淘选中，这消除了结合目的材料之外的表面的克隆对真正结合克隆的潜在污染。我们还比较了Au克隆对单晶Au和多晶Au的结合，发现两者每单位面积结合相等的细胞数。
对经表型转移确认分别为Au和FePt的真正结合克隆的三个Au克隆A01、A02和A12及两个FePt克隆G02和G04作进一步的分析。所有这些序列均在其VH结构域中含有突变，导致出现由终止密码子结束的移码肽序列(表II)。对这些Au和FePt克隆进行表1和图2A中对CdS特异性多肽所示的类似突变分析程序。只除去移码区域的Au和FePt克隆截短并不完全使结合破坏(图6)。此外，对比于CdS克隆，衍生自移码序列的C端肽不足以使酵母结合材料。因此，scFv抗体框架对于直接贡献于结合或者对于以有利的构象来呈现C端肽来说显得很重要。
材料特异性展示的应用.用展示scFv和各片断的酵母证明细胞-材料特异性结合的潜在应用(图4)。将克隆A02(金结合片断)生长于SD中并与Au涂层的载玻片相接触(材料和方法)。如所预期，在t＝0时没有细胞发生结合。但是，在室温下48小时过程中，细胞结合Au，并继续生长、结合和扩散，最后将载玻片完全覆盖(图4A)。这张活涂层或者说生物膜能够黏附和生长至由于干扰而被清除的区域，因此可自体愈合。用CdS克隆D07证明这种生物膜涂层生长和自体愈合的能力(图4B)。即使在SD中过了三周以上，生物膜仍保持黏着于CdS并能够再生。这种自体愈合生物膜可用于腐蚀防护、生物整治、医学(27)或其他应用(28)。
选定的克隆辅助对表面上特定组成区域的检测和鉴定的应用得到了证明。例如，用克隆G02(FePt结合克隆)检测SiN/SiO2上的FePt，发现细胞覆盖含Fe和Pt的异质结构区域，而不结合含Si的区域(图4C)。类似地，如图2B所示，当将CdS、Au、GaN和Al2O3放在相同的培养瓶中时，CdS克隆只结合CdS。因此，这些选定的蛋白质生物分子可起到材料特异性探针的作用，可将细胞黏着于异质表面上的特定位置。
作为模板.还将选定的生物分子用作半导体纳米颗粒生长的模板。CdS量子点通过简单地在室温下将衍生自D07pep克隆的合成肽与金属盐在含水条件下混合来形成。将在不同摩尔组成的肽中生长的颗粒暴露于长波紫外光进行快速荧光显色(图7)。D07肽生长的颗粒显示400-450nm之间的吸收front和对应的荧光峰(约500nm处有最大值)，这是显示量子局限效应的纳米颗粒的特征(图8)。而用对照肽FP-1生长的颗粒显示较接近大块CdS的515nm的弱吸收front，且显示的荧光如有也很弱(图8)。通过微调生长条件，可控制这种以生物分子为模板的纳米颗粒的大小和荧光特性。
竞争性结合.图2显示融合到Aga2的CdS肽序列对于介导CdS特异性酵母结合是必需的和足够的。另外，用这些酵母克隆在游离D07肽存在下进行类似的CdS结合研究。简单的说，将作为Aga2融合体展示D07或D07pep的酵母克隆(表I)在培养基(1.5OD/ml)中与单晶CdS±37μM游离D07肽一起温育，在培养基中洗涤，然后进行光学显微成像。在两种情况下，游离肽均封闭酵母与CdS的结合，这提供了更多有关结合机制的信息。
                     参考文献：
最后，本发明可参考以下技术文献来实施：
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美国专利第6,331,391号在39-41列还引用了另外的参考文献，本领域技术人员可用这些参考文献来实施本发明。
虽然上文已通过举例说明和实施例的方式较为详细地描述了本发明，目的是为了清楚理解本发明，但本领域技术人员容易明白，根据本发明的教导，可对本发明作出某些变化和改动，而不背离本发明所附权利要求书的精神或范围。
Figure A20058001195300541
a在Aga2的C端融合到-(G4S)3AS-连接序列。
b用IbBLAST发现粗体残基与邻接VH共有序列不同。
c在Aga2的C端直接融合到-(G4S)3ASGGG-连接序列。
Figure A20058001195300551
a在Aga2的C端融合到-(G4S)3AS-柔性连接序列。
b用IgBLAST发现粗体残基与邻接VH共有序列不同。
c在Aga2的C端直接融合到-(G4S)3ASGGG-连接序列。
权利要求书
(按照条约第19条的修改)
1.一种真核细胞组合物，所述组合物包含能选择性结合具有表面的固体材料的众多真核细胞。
2.权利要求1的组合物，其中所述真核细胞是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞。
3.权利要求1的组合物，其中所述真核细胞是包含生物分子的酵母细胞，所述生物分子能选择性结合具有表面的固体材料。
4.权利要求1的组合物，其中所述真核细胞是包含肽序列的酵母细胞，所述肽序列能选择性结合具有表面的固体材料。
5.权利要求1的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或聚合物材料。
6.一种真核细胞组合物，所述组合物主要由能特异性结合具有表面的固体材料的真核细胞和不能特异性结合所述具有表面的固体材料的真核细胞组成。
7.权利要求6的组合物，其中所述能特异性结合的真核细胞是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞。
8.权利要求6的组合物，其中所述能特异性结合的真核细胞主要包含能特异性结合具有表面的固体材料的生物分子。
9.权利要求6的组合物，其中所述真核细胞是酵母细胞，所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或聚合物材料。
10.一种宿主真核细胞，所述真核细胞包含一种或多种能选择性结合具有表面的固体材料的生物分子。
11.权利要求10的细胞，其中所述一种或多种生物分子包括肽或蛋白质。
12.权利要求10的细胞，其中所述具有表面的固体材料是无机或有机材料。
13.权利要求10的细胞，其中所述细胞是哺乳动物或酵母细胞，所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或聚合物材料。
14.一种细胞覆盖的材料，所述材料包含一种或多种选择性结合至具有表面的固体材料的真核细胞。
15.权利要求14的材料，其中所述真核细胞是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞。
16.权利要求14的材料，其中所述真核细胞是包含生物分子的酵母细胞，所述生物分子选择性结合至具有表面的固体材料。
17.权利要求14的材料，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或聚合物材料。
18.权利要求14的材料，其中所述细胞覆盖的材料是自体愈合细胞覆盖的材料。
19.一种使来自细胞展示文库的生物分子选择性结合固体材料表面的方法，所述方法包括以下步骤：
提供真核组合细胞展示文库，其中所述文库包含众多表达生物分子；
提供具有表面的固体材料；
使所述细胞展示文库与所述具有表面的固体材料在能导致所述来自真核细胞展示文库的众多表达生物分子选择性结合所述表面的条件下相接触。
20.权利要求19的方法，其中所述组合细胞展示文库是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞展示文库。
21.权利要求19的方法，其中所述众多生物分子是众多蛋白质或肽。
22.权利要求19的方法，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶固体材料、无机固体材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或聚合物材料。
23.权利要求19的方法，所述方法进一步包括调节文库的表达的步骤。
24.权利要求19的方法，所述方法进一步包括分离表达生物分子的步骤，所述表达生物分子能选择性结合具有表面的固体材料。
25.一种生长固体颗粒材料的方法，所述方法包括以下步骤：将固体颗粒材料的一种或多种前体试剂，与一种或多种选择来与所述固体颗粒材料特异性结合的真核组合细胞展示文库成员，在能使所述固体颗粒材料在所述一种或多种真核组合展示文库成员存在下得以形成的条件下混合。
26.权利要求25的方法，其中所述固体颗粒材料是纳米颗粒材料。
27.权利要求25的方法，其中所述固体颗粒材料是无机、有机、磁性、半导体或金属颗粒材料。
28.一种生长固体颗粒材料的方法，所述方法包括以下步骤：
从真核细胞展示文库中鉴定出能选择性结合固体材料的生物分子；
将所述固体材料的一种或多种前体试剂与所述生物分子在能使所述固体材料成为固体颗粒材料的条件下混合。
29.权利要求28的方法，其中所述真核细胞展示文库是酵母或哺乳动物细胞展示文库，所述生物分子是肽或蛋白质。
30.权利要求28的方法，其中所述固体材料是无机材料。
31.一种使生物分子选择性结合固体材料表面的方法，所述方法包括：
提供真核组合细胞展示文库，其中所述文库包含众多表达生物分子；
提供具有表面的固体材料；
使所述细胞展示文库与所述具有表面的固体材料在能导致至少一部分所述众多表达生物分子选择性结合所述表面的条件下相接触。
32.权利要求31的方法，所述方法进一步包括分离能选择性结合具有表面的固体材料的表达生物分子。
33.权利要求31的方法，所述方法进一步包括鉴定一种或多种能选择性结合具有表面的固体材料的表达生物分子。
34.一种选择性结合固体材料的方法，所述方法包括：
从真核细胞展示文库中鉴定出能选择性结合固体材料的生物分子；
分离或合成所述生物分子；
使所述固体材料与所述生物分子在使所述生物分子结合到所述固体材料的条件下相接触。
35.一种组合物，所述组合物按照权利要求34的方法制备。
36.一种组合物，所述组合物包含以下生物分子：(a)从真核细胞展示文库中鉴定出，和(b)能选择性结合固体材料。
37.权利要求36的组合物，其中所述固体材料是成核的。

Claims (30)

1.一种真核细胞组合物，所述组合物包含能选择性结合具有表面的固体材料的众多真核细胞。
2.权利要求1的组合物，其中所述真核细胞是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞。
3.权利要求1的组合物，其中所述真核细胞是包含生物分子的酵母细胞，所述生物分子能选择性结合具有表面的固体材料。
4.权利要求1的组合物，其中所述真核细胞是包含肽序列的酵母细胞，所述肽序列能选择性结合具有表面的固体材料。
5.权利要求1的组合物，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或聚合物材料。
6.一种真核细胞组合物，所述组合物主要由能特异性结合具有表面的固体材料的真核细胞和不能特异性结合所述具有表面的固体材料的真核细胞组成。
7.权利要求6的组合物，其中所述能特异性结合的真核细胞是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞。
8.权利要求6的组合物，其中所述能特异性结合的真核细胞主要包含能特异性结合具有表面的固体材料的生物分子。
9.权利要求6的组合物，其中所述真核细胞是酵母细胞，所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或聚合物材料。
10.一种宿主真核细胞，所述真核细胞包含一种或多种能选择性结合具有表面的固体材料的生物分子。
11.权利要求10的细胞，其中所述一种或多种生物分子包括肽或蛋白质。
12.权利要求10的细胞，其中所述具有表面的固体材料是无机或有机材料。
13.权利要求10的细胞，其中所述细胞是哺乳动物或酵母细胞，所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或聚合物材料。
14.一种细胞覆盖的材料，所述材料包含一种或多种选择性结合至具有表面的固体材料的真核细胞。
15.权利要求14的材料，其中所述真核细胞是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞。
16.权利要求14的材料，其中所述真核细胞是包含生物分子的酵母细胞，所述生物分子选择性结合至具有表面的固体材料。
17.权利要求14的材料，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶材料、无机材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或聚合物材料。
18.权利要求14的材料，其中所述细胞覆盖的材料是自体愈合细胞覆盖的材料。
19.一种使来自细胞展示文库的生物分子选择性结合固体材料表面的方法，所述方法包括以下步骤：
提供真核组合细胞展示文库，其中所述文库包含众多表达生物分子；
提供具有表面的固体材料；
使所述细胞展示文库与所述具有表面的固体材料在能导致所述来自真核细胞展示文库的众多表达生物分子选择性结合所述表面的条件下相接触。
20.权利要求19的方法，其中所述组合细胞展示文库是酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞展示文库。
21.权利要求19的方法，其中所述众多生物分子是众多蛋白质或肽。
22.权利要求19的方法，其中所述具有表面的固体材料是具有表面的结晶固体材料、无机固体材料、半导体材料、金属材料、磁性材料、陶瓷材料、有机材料或聚合物材料。
23.权利要求19的方法，所述方法进一步包括调节文库的表达的步骤。
24.权利要求19的方法，所述方法进一步包括分离表达生物分子的步骤，所述表达生物分子能选择性结合具有表面的固体材料。
25.一种生长固体颗粒材料的方法，所述方法包括以下步骤：将固体颗粒材料的一种或多种前体试剂，与一种或多种选择来与所述固体颗粒材料特异性结合的真核组合细胞展示文库成员，在能使所述固体颗粒材料在所述一种或多种真核组合展示文库成员存在下得以形成的条件下混合。
26.权利要求25的方法，其中所述固体颗粒材料是纳米颗粒材料。
27.权利要求25的方法，其中所述固体颗粒材料是无机、有机、磁性、半导体或金属颗粒材料。
28.一种生长固体颗粒材料的方法，所述方法包括以下步骤：
从真核细胞展示文库中鉴定出能选择性结合固体材料的生物分子；
将所述固体材料的一种或多种前体试剂与所述生物分子在能使所述固体材料成为固体颗粒材料的条件下混合。
29.权利要求28的方法，其中所述真核细胞展示文库是酵母或哺乳动物细胞展示文库，所述生物分子是肽或蛋白质。
30.权利要求28的方法，其中所述固体材料是无机材料。
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