JP2007523647A

JP2007523647A - 細胞ディスプレイライブラリー

Info

Publication number: JP2007523647A
Application number: JP2006552328A
Authority: JP
Inventors: ピーリー，ビュー，アール．; ベルチャー，アンジェラ，エム．; ウィットラップ，カール，デーン; クラウランド，エリック
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 2004-02-05
Filing date: 2005-02-07
Publication date: 2007-08-23
Also published as: SG153855A1; US8450247B2; WO2005100590B1; AU2005233502A1; EP1725112A2; CN1942102A; CA2554209A1; US20060003387A1; EP1725112A4; WO2005100590A3; WO2005100590A2; KR20070007793A

Abstract

例えば、金属、磁気、および半導体表面を含む固体材料表面との特異的および選択的結合ならびに濃縮のための発現生体分子を含むパニング工程において使用するための真核細胞ディスプレイライブラリー。ディスプレイは調整されうる。酵母細胞におけるペプチドおよびタンパク質ディスプレイが好ましい。固体材料は、固体材料に対してパニングにかけられている細胞ディスプレイライブラリーの存在下に製造されうる。ナノ粒子は、反応性前駆体からの生体分子の存在下に成長されうる。ナノ粒子は量子閉じ込め効果を示しうる。自己回復フィルムが調製されうる。
【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、２００４年２月５日に出願された仮特許出願第６０／５４１，７５７号、ベルヒャー（Ｂｅｌｃｈｅｒ）、ピール（Ｐｅｅｌｅ）らの「細胞ディスプレイライブラリー（ＣｅｌｌＤｉｓｐｌａｙＬｉｂｒａｒｉｅｓ）」の優先権を請求するが、これは参照することにより本明細書で援用され、その全体において依拠される。

政府支援の声明
本明細書に記載された発明は、国立科学財団のナノスケール学際的研究チーム（ＮＩＲＴ）の認可番号を含む連邦政府からの財政的支援により開発された。連邦政府は本発明に対する一部の権利を保持する。

組合せライブラリーおよび「パニング」法はバイオテクノロジーにおける需要な手段である。しかし、組合せライブラリーおよび「パニング」法における進歩にもかかわらず、さらなる進歩、特に商品化およびより優れた汎用性を提供する進歩が必要とされている。例えば、免疫学およびタンパク質化学を含むバイオテクノロジーにおける研究および応用の目的に生み出された組合せライブラリーは、材料用途に適用可能であるとみなしえない。具体的には、例えば、半導体、磁気、または金属材料などの無機材料の製造および商品化は一般にバイオテクノロジーまたは免疫学とは無関係である。一般的に言って、生物自己集合、特異的認識、および他の生体模倣型方法の使用は材料技術において制限されている。

初期努力において、例えば、米国特許第５，３１６，９２２号明細書（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ））は、特異的プローブを認識し、これに付着するタンパク質を同定し(identify)、発現するための方法を記載することを意図している。ブラウン（Ｂｒｏｗｎ），Ｓ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９、８６５１頁（１９９２年）も参照。しかし、この研究の焦点は、グラム陰性細菌表面ディスプレイであった。ベルヒャー（Ｂｅｌｃｈｅｒ）らによる他の努力は、結晶性無機表面、より一般的には技術的に有用な表面に対する選択的認識のファージディスプレイシステムの使用を説明する。しかし、ファージシステムの利点にもかかわらず、細胞系は、例えば、比較的高いコピー数で比較的大きな複雑な生体分子のディスプレイを含むファージシステムに対する利点を提供しうる。しかも、増殖および発現が全体として良好に調整され、かつ細胞増殖がより汎用的になりうる。

本項では、本発明は、本発明の範囲を限定することなく、多くの異なる実施形態で単に要約される。

１つの実施形態において、本発明は、表面を有する固体材料に選択的に結合する複数の真核細胞を含む真核細胞組成物を提供する。

別の実施形態において、本発明は、表面を有する固体材料に特異的に結合する真核細胞、および表面を有する固体材料に特異的に結合することがない真核細胞から本質的に成る真核細胞組成物を提供する。特異的に結合する細胞の割合は十分に高く、かつ特異的に結合することがない細胞の割合は十分に低く、所定の用途の組成物を商業的に利用することができる。好ましい場合、特異的に結合する真核細胞の割合は、特異的に結合することがない細胞の割合よりも大きい。例えば、結合する割合は、６０％超、もしくは８０％超でありうる。

別の実施形態において、本発明は、表面を有する固体材料と選択的に結合する１つまたはそれ以上の生体分子を含む宿主真核細胞を提供する。

別の実施形態において、本発明は、表面を有する固体材料と選択的に結合する１つまたはそれ以上の生体分子を分泌する真核細胞を提供する。

さらに、本発明は、固体材料表面に選択的に結合する発現生体分子組成物をも提供し、ここで前記生体分子は真核細胞から発現される。

本発明は、さらに他の実施形態において、固体材料表面に選択的に結合する発現ペプチド組成物を含み、ここで前記ペプチドは真核細胞から発現される。

別の実施形態において、本発明は、表面を有する固体材料に選択的に結合されている１つまたはそれ以上の真核細胞を含む細胞被覆材料を提供する。

固体基質および真核細胞表面上のタンパク質またはペプチドによりそれに選択的に結合された１つまたはそれ以上の真核細胞を含む物品も提供される。

別の実施形態は、表面を有する固体材料、および前記表面に選択的に結合されている組合せ真核細胞ディスプレイライブラリーからの発現生体分子を含む物品である。

別の実施形態において、細胞ディスプレイライブラリーからの生体分子の固体材料表面との選択的結合のための方法であって、
真核組合せ細胞ディスプレイライブラリーを提供し、前記ライブラリーが複数の発現生体分子を含むステップと、
表面を有する固体材料を提供するステップと、
前記細胞ディスプレイライブラリーを、結果として真核細胞ディスプレイライブラリーからの複数の発現生体分子の、表面への選択的結合をもたらす条件下に表面を有する固体材料と接触させるステップと
を含む方法が提供される。

別の態様において、本発明は、粒子固体材料を成長させる方法であって、
前記固体粒子材料の１つまたはそれ以上の前駆体試薬を、前記固体粒子材料が１つまたはそれ以上の真核組合せディスプレイライブラリーメンバーの存在下に形成される条件下、固体粒子材料への特異的結合のために選択される１つまたはそれ以上の真核細胞組合せディスプレイライブラリーメンバーと混合するステップを含む方法を提供する。

別の実施形態において、本発明は、粒子固体材料を成長させる方法であって、
真核細胞ディスプレイライブラリーからの固体材料に選択的に結合する生体分子を同定するステップと、
前記固体材料の１つまたはそれ以上の前駆体試薬を、前記固体材料が粒子固体材料として形成される条件下に前記生体分子と混合させるステップと
を含む方法を提供する。

本発明は、表面を有する固体材料に選択的に結合し、かつ酵母ライブラリーを含む真核細胞ディスプレイライブラリーの使用によって同定される生体分子をも提供する。生体分子はペプチドまたはタンパク質でありうる。

本発明の基本的および新規の特徴は、固体表面に選択的に結合し、かつ場合によっては特異的に結合しうる生体分子を精製し、提供することができることである。生体分子は、組成物、結晶化度、または両方が異なるヘテロ構造に曝露されると別の構造上の１つの構造に選択的に結合しうる。生体分子が、特異的に結合することがない他の生体分子に対して所望のレベルの純度を有する組成物を調製することができる。生体分子は、好ましい実施形態において酵母である真核細胞骨格宿主を含まない、またはこれに付着されうる。別の特徴は、ペプチド配列が一般に合成的または人工的であり、かつ知られている限りでは、非天然であるという点である。

以下は、一連の番号付けされた実施形態である。

１．表面を有する固体材料に選択的に結合する複数の真核細胞を含む真核細胞。

２．前記真核細胞が酵母、昆虫、植物、または哺乳類細胞である１に記載の組成物。

３．前記真核細胞が酵母細胞である、１に記載の組成物。

４．前記真核細胞が、表面を有する固体材料に選択的に結合する生体分子を含む、１に記載の組成物。

５．前記真核細胞が、表面を有する固体材料に選択的に結合するペプチド配列を含む、１に記載の組成物。

６．表面を有する前記固体材料が表面を有する結晶性固体材料である、１に記載の組成物。

７．表面を有する前記固体材料が表面を有する無機固体材料である、１に記載の組成物。

８．表面を有する前記固体材料が表面を有する半導体材料である、１に記載の組成物。

９．表面を有する前記固体材料が表面を有する金属材料である、１に記載の組成物。

１０．表面を有する前記固体材料が表面を有する磁気材料である、１に記載の組成物。

１１．表面を有する前記固体材料が表面を有するセラミック材料である、１に記載の組成物。

１２．表面を有する前記固体材料が表面を有する有機材料である、１に記載の組成物。

１３．表面を有する前記固体材料が表面を有するポリマー材料である、１に記載の組成物。

１４．表面を有する前記固体材料が、表面を有する結晶性材料、無機材料、半導体材料、金属材料、磁気材料、セラミック材料、有機材料、またはポリマー材料である、１に記載の組成物。

１５．前記真核細胞が酵母、昆虫、植物、または哺乳類細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する結晶性材料、無機材料、半導体材料、金属材料、磁気材料、セラミック材料、有機材料、またはポリマー材料である、１に記載の組成物。

１６．前記真核細胞が酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する結晶性材料、無機材料、半導体材料、金属材料、磁気材料、セラミック材料、有機材料、またはポリマー材料である、１に記載の組成物。

１７．前記真核細胞が酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する半導体材料、金属材料、または磁気材料を有する、１に記載の組成物。

１８．前記真核細胞が酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する半導体材料である、１に記載の組成物。

１９．前記真核細胞が酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する金属材料である、１に記載の組成物。

２０．前記真核細胞が酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する磁気材料である、１に記載の組成物。

２１．表面を有する固体材料に特異的に結合する真核細胞、および表面を有する固体材料に特異的に結合することがない真核細胞から本質的に成る真核細胞組成物。

２２．特異的に結合する真核細胞が酵母、昆虫、植物、または哺乳類細胞である、２１に記載の組成物。

２３．前記特異的に結合する真核細胞が酵母細胞である、２１に記載の組成物。

２４．前記特異的に結合する真核細胞が、表面を有する固体材料に特異的に結合する生体分子を含む、２１に記載の組成物。

２５．前記特異的に結合する真核細胞が、表面を有する固体材料に特異的に結合するペプチド配列を含む、２１に記載の組成物。

２６．表面を有する前記固体材料が表面を有する結晶性固体材料である、２１に記載の組成物。

２７．表面を有する前記固体材料が表面を有する無機固体材料である、２１に記載の組成物。

２８．表面を有する前記固体材料が表面を有する半導体材料である、２１に記載の組成物。

２９．表面を有する前記固体材料が表面を有する金属材料である、２１に記載の組成物。

３０．表面を有する前記固体材料が表面を有する磁気材料である、２１に記載の組成物。

３１．表面を有する前記固体材料が表面を有するセラミック材料である、２１に記載の組成物。

３２．表面を有する前記固体材料が表面を有する有機材料である、２１に記載の組成物。

３３．表面を有する前記固体材料が表面を有するポリマー材料である、２１に記載の組成物。

３４．表面を有する前記固体材料が、表面を有する結晶性材料、無機材料、半導体材料、金属材料、磁気材料、セラミック材料、有機材料、またはポリマー材料である、２１に記載の組成物。

３５．前記特異的に結合する真核細胞が酵母、昆虫、植物、または哺乳類細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する結晶性材料、無機材料、半導体材料、金属材料、磁気材料、セラミック材料、有機材料、またはポリマー材料である、２１に記載の組成物。

３６．前記特異的に結合する真核細胞が酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する結晶性材料、無機材料、半導体材料、金属材料、磁気材料、セラミック材料、有機材料、またはポリマー材料である、２１に記載の組成物。

３７．前記特異的に結合する真核細胞が酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する半導体材料、金属材料、または磁気材料を有する、２１に記載の組成物。

３８．前記特異的に結合する真核細胞が酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する半導体材料である、２１に記載の組成物。

３９．前記特異的に結合する真核細胞が酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する金属材料である、２１に記載の組成物。

４０．前記特異的に結合する真核細胞が酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する磁気材料である、２１に記載の組成物。

４１．表面を有する固体材料と選択的に結合する１つまたはそれ以上の生体分子を含む宿主真核細胞。

４２．前記１つまたはそれ以上の生体分子がペプチドまたはタンパク質を含む、４１に記載の細胞。

４３．前記１つまたはそれ以上の生体分子が、酵母上のＡｇａ２への融合として示されたヒト一本鎖可変フラグメント抗体を含む、４１に記載の細胞。

４４．前記１つまたはそれ以上の生体分子が、酵母上のＡｇａ２への融合として示されたペプチドを含む、４１に記載の細胞。

４５．表面を有する前記固体材料が無機材料である、４１に記載の細胞。

４６．表面を有する前記固体材料が有機材料である、４１に記載の細胞。

４７．表面を有する前記固体材料が結晶性材料である、４１に記載の細胞。

４８．前記細胞が哺乳類または酵母細胞である、４１に記載の細胞。

４９．前記細胞が酵母細胞である、４１に記載の細胞。

５０．前記細胞が酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が無機材料である、４１に記載の細胞。

５１．前記細胞が酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が有機材料である、４１に記載の細胞。

５２．前記細胞が酵母細胞であり、表面を有する前記固体材料が無機材料であり、かつ前記１つまたはそれ以上の生体分子がペプチドまたはタンパク質を含む、４１に記載の細胞。

５３．前記細胞が酵母細胞であり、表面を有する前記固体材料が無機材料であり、かつ前記１つまたはそれ以上の生体分子が、酵母上のＡｇａ２への融合として示されたヒト一本鎖可変フラグメント抗体を含む、４１に記載の細胞。

５４．４１に記載の複数の宿主細胞を含む宿主細胞の収集物。

５５．前記宿主細胞が、表面を有する前記固体材料と選択的に結合することがない宿主真核細胞の収集物と一緒である、５４に記載の宿主細胞の収集物。

５６．表面を有する固体材料と選択的に結合する１つまたはそれ以上の生体分子を分泌する真核細胞。

５７．前記細胞が酵母、昆虫、植物、または哺乳類細胞である、請求項５６に記載の細胞。

５８．前記１つまたはそれ以上の生体分子がペプチドまたはタンパク質である、５６に記載の細胞。

５９．前記細胞が酵母細胞であり、かつ前記１つまたはそれ以上の生体分子がペプチドまたはタンパク質である、５６に記載の細胞。

６０．前記細胞が酵母細胞または哺乳類細胞であり、かつ前記１つまたはそれ以上の生体分子が表面を有する結晶性固体材料に特異的に結合する、５６に記載の細胞。

６１．表面を有する固体材料に選択的に結合されている１つまたはそれ以上の真核細胞を含む細胞被覆材料。

６２．前記真核細胞が酵母、昆虫、植物、または哺乳類細胞である、６１に記載の材料。

６３．前記真核細胞が酵母細胞である、６１に記載の材料。

６４．前記真核細胞が、表面を有する固体材料に選択的に結合されている生体分子を含む、６１に記載の材料。

６５．前記真核細胞が、表面を有する固体材料に選択的に結合するペプチド配列を含む、６１に記載の材料。

６６．表面を有する前記固体材料が表面を有する結晶性固体材料である、６１に記載の材料。

６７．表面を有する前記固体材料が表面を有する無機固体材料である、６１に記載の材料。

６８．表面を有する前記固体材料が表面を有する半導体材料である、６１に記載の材料。

６９．表面を有する前記固体材料が表面を有する金属材料である、６１に記載の材料。

７０．表面を有する前記固体材料が表面を有する磁気材料である、６１に記載の材料。

７１．表面を有する前記固体材料が表面を有するセラミック材料である、６１に記載の材料。

７２．表面を有する前記固体材料が表面を有する有機材料である、６１に記載の材料。

７３．表面を有する前記固体材料が表面を有するポリマー材料である、６１に記載の材料。

７４．表面を有する前記固体材料が、表面を有する結晶性材料、無機材料、半導体材料、金属材料、磁気材料、セラミック材料、有機材料、またはポリマー材料である、６１に記載の材料。

７５．前記真核細胞が酵母、昆虫、植物、または哺乳類細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する結晶性材料、無機材料、半導体材料、金属材料、磁気材料、セラミック材料、有機材料、またはポリマー材料である、６１に記載の材料。

７６．前記真核細胞が酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する結晶性材料、無機材料、半導体材料、金属材料、磁気材料、セラミック材料、有機材料、またはポリマー材料である、６１に記載の材料。

７７．前記真核細胞が酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する半導体材料、金属材料、または磁気材料を有する、６１に記載の材料。

７８．前記真核細胞が酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する半導体材料である、６１に記載の材料。

７９．前記真核細胞が酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する金属材料である、６１に記載の材料。

８０．前記真核細胞が酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する磁気材料である、６１に記載の材料。

８１．表面を有する前記固体材料がナノ粒子材料である、６１に記載の材料。

８２．表面を有する前記固体材料がナノ粒子材料であり、かつ表面を有する結晶性材料、無機材料、半導体材料、金属材料、磁気材料、セラミック材料、有機材料、またはポリマー材料でもある、６１に記載の材料。

８３．表面を有する前記固体材料がナノ粒子材料であり、かつ表面を有する半導体材料、金属材料、または磁気材料でもある、６１に記載の材料。

８４．表面を有する前記固体材料がナノ粒子材料であり、かつ表面を有する半導体材料でもある、６１に記載の材料。

８５．表面を有する前記固体材料がナノ粒子材料であり、かつ表面を有する金属材料でもある、６１に記載の材料。

８６．表面を有する前記固体材料がナノ粒子材料であり、かつ表面を有する磁気材料でもある、６１に記載の材料。

８７．前記細胞被覆材料が自己回復細胞被覆材料である、６１に記載の材料。

８８．固体基質および真核細胞表面上のタンパク質またはペプチドによりそれと選択的に結合された１つまたはそれ以上の真核細胞を含む物品。

８９．前記固体基質が電極であり、かつ前記真核細胞がヒト細胞である、８８に記載の物品。

９０．前記固体基質が無機材料であり、かつ前記真核細胞が哺乳類細胞である、８８に記載の物品。

９１．表面を有する固体材料、および前記表面に選択的に結合されている組合せ真核細胞ディスプレイライブラリーからの発現生体分子を含む物品。

９２．前記細胞ディスプレイライブラリーが酵母、昆虫、植物、または哺乳類細胞ディスプレイライブラリーである、９１の物品。

９３．前記細胞ディスプレイライブラリーが、酵母細胞ディスプレイライブラリーまたは哺乳類細胞ディスプレイライブラリーである、９１の物品。

９４．前記細胞ディスプレイライブラリーが酵母細胞ディスプレイライブラリーである、９１の物品。

９５．前記細胞ディスプレイライブラリーがヒト細胞ディスプレイライブラリーである、９１の物品。

９６．前記細胞ディスプレイライブラリーが哺乳類細胞ディスプレイライブラリーである、９１の物品。

９７．前記発現生体分子が分泌される、９１の物品。

９８．前記発現生体分子が前記真核細胞上で示される表面である、９１の物品。

９９．前記組合せ細胞ディスプレイライブラリーが、酵母上の融合として示されるヒト一本鎖可変フラグメント抗体ライブラリーである、９１に記載の物品。

１００．前記生体分子がタンパク質またはペプチドである、９１に記載の物品。

１０１．前記細胞ディスプレイライブラリーが、結果として選択的結合をもたらすポリペプチド結合部位の発現生体分子を含む表面を有するメンバーを含む、９１に記載の物品。

１０２．前記発現生体分子が、結果として選択的結合をもたらすポリペプチド結合部位を含む、９１に記載の物品。

１０３．表面を有する前記固体材料基質が表面を有する結晶性固体材料である、９１に記載の物品。

１０４．表面を有する前記固体材料基質が表面を有する無機固体材料である、９１に記載の物品。

１０５．表面を有する前記固体材料が表面を有する半導体材料である、９１に記載の物品。

１０６．表面を有する前記固体材料が表面を有する金属材料である、９１に記載の物品。

１０７．表面を有する前記固体材料が表面を有する磁気材料である、９１に記載の物品。

１０８．表面を有する前記固体材料が表面を有するセラミック材料である、９１に記載の物品。

１０９．表面を有する前記固体材料が表面を有する有機材料である、９１に記載の物品。

１１０．表面を有する前記固体材料が単結晶性、非粒子固体材料である、９１に記載の物品。

１１１．表面を有する前記固体材料が粒子、結晶性固体材料である、９１に記載の物品。

１１２．表面を有する前記固体材料が微粒子材料である、９１に記載の物品。

１１３．表面を有する前記固体材料がナノ粒子材料である、９１に記載の物品。

１１４．表面を有する前記固体材料が表面処理され、前記発現生体分子と前記表面との間の非特異的相互作用を制限する、９１に記載の物品。

１１５．前記生体分子が異なる表面との特異的結合のために遺伝子操作されている、９１に記載の物品。

１１６．前記細胞ディスプレイライブラリーが酵母細胞ディスプレイライブラリーであり、かつ表面を有する前記固体材料が単結晶性、非粒子固体材料である、９１に記載の物品。

１１７．前記細胞ディスプレイライブラリーが酵母細胞ディスプレイライブラリーであり、かつ表面を有する前記固体材料基質が表面を有する無機固体材料である、９１に記載の物品。

１１８．前記細胞ディスプレイライブラリーが酵母細胞ディスプレイライブラリーであり、かつ表面を有する前記固体材料基質が表面を有する無機または有機固体材料である、９１に記載の物品。

１１９．前記細胞ディスプレイライブラリーが酵母細胞ディスプレイライブラリーであり、かつ表面を有する前記固体材料基質が表面を有する無機または有機結晶性固体材料である、９１に記載の物品。

１２０．表面を有する固体材料、および前記表面に選択的に結合された１つまたはそれ以上の生体分子を含み、前記１つまたはそれ以上の生体分子が、組合せ真核細胞ディスプレイライブラリーから得られる配列を有する合成的ペプチドまたはタンパク質である物品。

１２１．細胞ディスプレイライブラリーからの生体分子の固体材料表面との選択的結合のための方法であって、
真核組合せ細胞ディスプレイライブラリーを提供し、前記ライブラリーが複数の発現生体分子を含むステップと、
表面を有する固体材料を提供するステップと、
前記細胞ディスプレイライブラリーを、結果として真核細胞ディスプレイライブラリーからの複数の発現生体分子の、表面への選択的結合をもたらす条件下に表面を有する固体材料と接触させるステップと
を含む方法。

１２２．前記組合せ細胞ディスプレイライブラリーが酵母、昆虫、植物、または哺乳類細胞ディスプレイライブラリーである、１２１の方法。

１２３．前記組合せ細胞ディスプレイライブラリーが酵母ライブラリーである、１２１に記載の方法。

１２４．前記組合せ細胞ディスプレイライブラリーが、酵母上での融合として示されるヒト一本鎖可変フラグメント抗体ライブラリーである、１２１に記載の方法。

１２５．前記組合せ細胞ディスプレイライブラリーが酵母上の融合として示されるペプチドライブラリーである、１２１に記載の方法。

１２６．前記複数の生体分子が複数のタンパク質またはペプチドである、１２１に記載の方法。

１２７．前記細胞ディスプレイライブラリーが、結果として選択的結合をもたらすポリペプチド結合部位の発現生体分子を含む表面を有するメンバーを含む、１２１に記載の方法。

１２８．表面を有する前記固体材料が表面を有する結晶性固体材料である、１２１に記載の方法。

１２９．表面を有する前記固体材料が表面を有する無機固体材料である、１２１に記載の方法。

１３０．表面を有する前記固体材料が表面を有する半導体材料である、１２１に記載の方法。

１３１．表面を有する前記固体材料が表面を有する金属材料である、１２１に記載の方法。

１３２．表面を有する前記固体材料が表面を有する磁気材料である、１２１に記載の方法。

１３３．表面を有する前記固体材料が表面を有するセラミック材料である、１２１に記載の方法。

１３４．表面を有する前記固体材料が表面を有する有機材料である、１２１に記載の方法。

１３５．表面を有する前記固体材料が表面を有するポリマー材料である、１２１に記載の方法。

１３６．表面を有する前記固体材料が、接触ステップ前に表面処理されており、複数の発現生体分子と表面との間の非特異的相互作用を制限する、１２１に記載の方法。

１３７．表面を有する前記固体材料が単結晶性、非粒子固体材料である、１２１に記載の方法。

１３８．表面を有する前記固体材料が粒子固体材料である、１２１に記載の方法。

１３９．前記ライブラリーの発現を調節するステップをさらに含む、１２１に記載の方法。

１４０．表面を有する前記固体材料に選択的に結合する発現生体分子を単離するステップをさらに含む、１２１に記載の方法。

１４１．前記組合せ細胞ディスプレイライブラリーが酵母ライブラリーであり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する無機固体材料である、１２１に記載の方法。

１４２．前記組合せ細胞ディスプレイライブラリーが酵母ライブラリーであり、表面を有する前記固体材料が表面を有する無機固体材料であり、かつ細胞ディスプレイライブラリーが、結果として選択的結合をもたらすポリペプチド結合部位の発現生体分子を含む表面を有する酵母メンバーを含む、１２１に記載の方法。

１４３．前記組合せ細胞ディスプレイライブラリーが酵母ライブラリーであり、表面を有する前記固体材料が表面を有する無機固体材料であり、前記細胞ディスプレイライブラリーが、結果として選択的結合をもたらすポリペプチド結合部位の発現生体分子を含む表面を有する酵母メンバーを含み、かつ表面を有する前記固体材料が表面処理され、前記複数の発現分子と前記表面との間の非特異的相互作用を制限する、１２１に記載の方法。

１４４．前記組合せ細胞ディスプレイライブラリーが酵母ライブラリーであり、表面を有する前記固体材料が表面を有する有機固体材料であり、前記細胞ディスプレイライブラリーが、結果として選択的結合をもたらすポリペプチド結合部位の発現生体分子を含む表面を有するメンバーを含み、かつ表面を有する前記固体材料が表面処理され、前記複数の発現分子と前記表面との間の非特異的相互作用を制限する、１２１に記載の方法。

１４５．粒子固体材料を成長させる方法であって、前記固体粒子材料の１つまたはそれ以上の前駆体試薬を、前記固体粒子材料が１つまたはそれ以上の真核組合せディスプレイライブラリーメンバーの存在下に形成される条件下、固体粒子材料への特異的結合のために選択される１つまたはそれ以上の真核細胞組合せディスプレイライブラリーメンバーと混合するステップを含む方法。

１４６．前記固体粒子材料がナノ粒子材料である、１４５に記載の方法。

１４７．前記固体粒子材料が無機粒子材料である、１４５に記載の方法。

１４８．前記固体粒子材料が有機粒子材料である、１４５に記載の方法。

１４９．前記固体粒子材料が磁気粒子材料である、１４５に記載の方法。

１５０．前記固体粒子材料が金属粒子材料である、１４５に記載の方法。

１５１．前記固体粒子材料がナノ結晶性材料である、１４５に記載の方法。

１５２．前記固体粒子材料が量子ドット材料である、１４５に記載の方法。

１５３．前記固体粒子材料が半導体材料である、１４５に記載の方法。

１５４．前記条件が約３００℃以下の温度を含む、１４５に記載の方法。

１５５．前記条件が約１００℃以下の温度を含む、１４５に記載の方法。

１５６．前記条件が約０℃〜約４０℃の温度を含む、１４５に記載の方法。

１５７．前記条件が約２０℃〜約４０℃の温度を含む、１４５に記載の方法。

１５８．粒子固体材料を成長させる方法であって、
真核細胞ディスプレイライブラリーからの固体材料に選択的に結合する生体分子を同定するステップと、
前記固体材料の１つまたはそれ以上の前駆体試薬を、前記固体材料が粒子固体材料として形成される条件下に前記生体分子と混合させるステップと
を含む方法。

１５９．前記真核細胞ディスプレイライブラリーが酵母または哺乳類細胞ディスプレイライブラリーである、１５８に記載の方法。

１６０．前記真核細胞ディスプレイライブラリーが酵母細胞ディスプレイライブラリーである、１５８に記載の方法。

１６１．前記生体分子がペプチドまたはタンパク質である、１５８に記載の方法。

１６２．前記生体分子が抗体である、１５８に記載の方法。

１６３．前記固体材料が結晶性材料である、１５８に記載の方法。

１６４．前記固体材料が無機材料である、１５８に記載の方法。

１６５．前記固体材料が半導体材料である、１５８に記載の方法。

１６６．前記粒子固体材料がナノ粒子固体材料である、１５８に記載の方法。

１６７．前記真核ディスプレイライブラリーが酵母細胞ディスプレイライブラリーであり、前記生体分子がペプチドまたはタンパク質であり、かつ前記固体材料が結晶性材料である、１５８に記載の方法。

１６８．前記真核細胞ディスプレイライブラリーが酵母細胞ディスプレイライブラリーであり、前記生体分子がペプチドまたはタンパク質であり、前記固体材料が無機材料であり、かつ前記粒子固体材料がナノ粒子固体材料である、１５８に記載の方法。

１６９．前記ナノ粒子固体材料が約１ｎｍ〜約１０ｎｍの平均粒径を有する、１６８の方法。

１７０．固体材料表面に選択的に結合する発現生体分子組成物であって、前記生体分子が真核細胞から発現される生体分子組成物。

１７１．前記真核細胞が酵母、昆虫、植物、または哺乳類細胞であり、かつ前記生体分子がペプチドまたはタンパク質である１７０の生体分子。

１７２．前記真核細胞が酵母、昆虫、植物、または哺乳類細胞であり、かつ前記生体分子が抗体である、１７０の生体分子。

１７３．前記真核細胞が酵母細胞であり、かつ前記生体分子がペプチドまたはタンパク質である、１７０の生体分子。

１７４．前記真核細胞表面が生体分子を示す、１７０に記載の生体分子。

１７５．前記真核細胞が前記生体分子を分泌する、１７０に記載の生体分子。

１７６．固体材料表面に選択的に結合する発現ペプチド組成物であり、真核細胞から発現されるペプチド。

１７７．前記真核細胞が酵母細胞である、１７６のペプチド。

１７８．前記真核細胞表面が前記ペプチドを示す、１７６に記載のペプチド。

１７９．前記真核細胞表面が前記ペプチドを分泌する、１７６に記載のペプチド。

１８０．表面を有する固体材料に選択的に結合し、かつ真核細胞ディスプレイライブラリーの使用によって同定される生体分子。

１８１．前記真核細胞ディスプレイライブラリーが酵母ライブラリーである、１８０に記載の生体分子。

１８２．前記生体分子がペプチドまたはタンパク質である、１８０に記載の生体分子。

１８３．前記生体分子がペプチドまたはタンパク質である、１８１に記載の生体分子。

Ｉ．緒言および技術文献
本発明の説明において、出願人は本発明の実施において使用されうる技術文献に言及するが、引用された技術文献が先行技術であることは承認されていない。本緒言で言及された文献に加えて、文献リストが本明細書の末尾にも示されている。これらの文献は、その全体が参照することにより本明細書で援用される。

２００４年２月５日出願の仮特許出願第６０／５４１，７５７号明細書、ベルヒャー（Ｂｅｌｃｈｅｒ）、ピール（Ｐｅｅｌｅ）らの「細胞ディスプレイライブラリー（ＣｅｌｌＤｉｓｐｌａｙＬｉｂｒａｉｅｓ）」は、図面、表、特許請求の範囲、および実施例を含むその全体が参照することにより本明細書で援用され、かつ依拠される。

本発明において、組合せ酵母細胞ディスプレイライブラリーを含む真核組合せ細胞ディスプレイライブラリーのスクリーニングが、治療薬および創薬のためのタンパク質特異的親和性試薬を生成するために有用でありうる（１）。これらのライブラリーは、複数の発現生体分子を含みうる。多くの進歩が酵母ディスプレイシステムで行われているが（２）、酵母ディスプレイライブラリーは、例えば、本発明において記載されているように無機材料および他の技術上重要な材料を含む、表面を有する固体材料に対してスクリーニングされていない。最近、さまざまなタイプの無機材料に結合し、およびまたはその合成を方向付けるタンパク質を選択または発展させることが可能であるという考えにより無機材料に対するタンパク質特異性の開発における有用な発展がなされている（３）。例としては、ファージ表示ペプチドライブラリー（４−８）、細菌表面表示ポリペプチド（９−１１）、およびモノクローナル抗体ライブラリー（１２）が挙げられる。これらのシステムは有用であるが、さらに本明細書で述べられる真核および酵母表示ライブラリーは特定の利点を示す。

本発明において、真核細胞上に示される組合せタンパク質の多様性を利用し、無機材料に対するタンパク質に基づくシステムの認識能力および真核細胞の遺伝的調節、増殖、および感覚能力を有する遺伝的特徴の能力を結合することができる。酵母などの真核細胞は、抗体フラグメント（１３）および受容体（１４）など翻訳後修飾または複合タンパク質を効率的に表示することができるが、細菌またはファージディスプレイシステムを使用して達成されるほど容易ではない。さらに、スクリーニングのために細胞を使用する利点は、高いコピー数のディスプレイ、光学顕微鏡または蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）による検出の容易さ、二次宿主を使用することのない増幅、およびディスプレイを遺伝的に調節する能力の潜在的可能性である（１５、１６）。ファージと比べ比較的大規模な細胞により、粒子状細胞体へ機械的力を加えて生体分子材料の相互作用を定量的に精査することが可能である（１７）。生体分子テンプレート化材料の潜在的産生の他の細胞またはタンパク質に基づくシステムに対して酵母を使用する追加の利点が、何世紀にもわたって探求され、かつ利用されている酵母の拡張性および費用効果である（１８）。

一部の実施形態において、それらの表面上でタンパク質またはペプチドの組合せライブラリーを発現および表示し、次いで材料に対してパニングされ、その後に結合細胞が増幅される、生きた酵母細胞に依拠する無機材料と相互作用するタンパク質生体分子を同定するための新しい方法が本明細書に記載されている。例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に上に表示されるヒト一本鎖抗体ライブラリー（１３）が、半導体、磁気、および金属材料を含む技術的に重要な材料のさまざまな収集物に対してパニングされうる。材料特異的抗体およびポリペプチドが同定されうるとともに、システムの一般的特徴が記載されている。具体的には、フレームシフトおよび切断に由来するペプチド配列が、それらの開始集団における少数発現量にもかかわらず、完全長一本鎖抗体に対して優先的に単離されうる。この新しいシステムは、技術的に重要な材料、マイクロエレクトロニクス、またはハイブリッドデバイスとの相互作用を仲介する医学的または工業的に応用できる細胞またはタンパク質に基づく試薬を見出すための経路を提供する。また、生物はバイオミネラル化における証拠として無機材料を制御する複雑なシステムを進化させたため（１９−２１）、人工的システムによる細胞レベルでの選択が可能であることは、天然のバイオミネラル化システムの分子機構への洞察を提供しうる。

本発明の方法を使用することにより、生体分子は、技術的関心の材料の結合、成長、アセンブル、および組織化が可能である細胞ディスプレイライブラリーから同定されうる。この同定はスクリーニング法によって実行されうるが、ここで例えばライブラリーは表面を有する固体材料と繰り返し接触されうるとともに、その表面に選択的に結合するライブラリーメンバーは連続的に単離され、繰り返しスクリーニングにより表面に結合することがないものに対して濃縮(enrich)される。選択的濃縮のこれらの方法は、パニングまたはバイオパニングと呼ばれうる。

例えば、選択的濃縮によるスクリーニング法は周知である。すなわち、固体表面に対するファージディスプレイ組合せスクリーニング法が、例えば、ベルヒャー（Ｂｅｌｃｈｅｒ）らの米国特許公報、すなわち（１）「ナノ粒子核生成、形状、および結晶相の生物制御（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌｏｆＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅＮｕｃｌｅａｔｉｏｎ，Ｓｈａｐｅ，ａｎｄＣｒｙｓｔａｌＰｈａｓｅ）」、２００３年４月１０日公開、米国特許出願公開第２００３／００６８９００号明細書、（２）「遺伝子操作中規模ウイルスを使用するハイブリッド材料のナノスケール順序付け（ＮａｎｏｓｃａｌｅＯｒｄｅｒｉｎｇｏｆＨｙｂｒｉｄＭａｔｅｒｉａｌｓＵｓｉｎｇＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＭｅｓｏｓｃａｌｅＶｉｒｕｓ）」、２００３年４月１７日公開、米国特許出願公開第２００３／００７３１０４号明細書、（３）「ナノ粒子の生物制御（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌｏｆＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」、２００３年６月１９日公開、米国特許出願公開第２００３／０１１３７１４号明細書、および（４）「材料の分子認識（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆＭａｔｅｒｉａｌｓ）」、２００３年８月７日公開、米国特許出願公開第２００３／０１４８３８０号明細書に記載され、かつこれらを含む本発明の実施において言及されており、そのすべてはその全体が援用される。

ベルヒャー（Ｂｅｌｃｈｅｒ）らの追加の米国特許出願としては、（５）２００３年９月４日出願の米国特許出願第１０／６５４，６２３号明細書（「二官能性生体材料の組成物、方法、および使用（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄＵｓｅｏｆＢｉＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）」）、（６）２００３年９月２２日出願の米国特許出願第１０／６６５，７２１号明細書（「金属および磁気ナノ粒子のペプチド仲介合成（ＰｅｐｔｉｄｅＭｅｄｉａｔｅｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＭｅｔａｌｌｉｃａｎｄＭａｇｎｅｔｉｃＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」）、（７）２００３年９月２４日出願の米国特許出願第１０／６６８，６００号明細書（「加工生物膜貯蔵デバイス（ＦａｂｒｉｃａｔｅｄＢｉｏｆｉｌｍＳｔｏｒａｇｅＤｅｖｉｃｅ）」）、（８）２００３年１０月１５日出願の米国仮特許出願第６０／５１０，８６２号明細書（「ウイルス線維（ＶｉｒａｌＦｉｂｅｒｓ）」）および２００４年１０月１５日出願の米国特許出願第１０／９６５，６６５号明細書、（９）２００３年１０月１５日出願の米国仮特許出願第６０／５１１，１０２号明細書（「多官能性生体材料．．．（ＭｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．．．）」）および２００４年１０月１５日出願の米国特許出願第１０／９６５，２２７号明細書、および（１０）２００４年１月５日出願の米国仮特許出願第６０／５３４，１０２号明細書（「無機ナノワイヤ（ＩｎｏｒｇａｎｉｃＮａｎｏｗｉｒｅｓ）」）および２００４年１０月２９日出願の米国特許出願第（現在無所属(unassigned)）号が挙げられる。

生体分子の同定および各種材料との結合を含む本発明の実施に有用でありうるベルヒャー（Ｂｅｌｃｈｅｒ）らの追加の技術文献としては以下が挙げられる。
・マオＣ（ＭａｏＣ）ら、Ｖｉｒａｌａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｏｒｉｅｎｔｅｄｑｕａｎｔｕｍｄｏｔｎａｎｏｗｉｒｅｓ．、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、２００３年６月１０日号、１００（１２）：６９４６−５１頁。
・リーＳＷ（ＬｅｅＳＷ）ら、Ｏｒｄｅｒｉｎｇｏｆｑｕａｎｔｕｍｄｏｔｓｕｓｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｖｉｒｕｓｅｓ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年５月３日号、２９６（５５６９）：８９２−５頁。
・フリンＣ（ＦｌｙｎｎＣ）ら、ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｎａｎｏｓｃａｌｅＩＩ−ＶＩｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒｍａｔｅｒｉａｌｓｕｓｉｎｇｅｖｏｌｖｅｄｐｅｐｔｉｄｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｖｉｒａｌｃａｐｓｉｄａｓｓｅｍｂｌｙ．、Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、１３（ＡｄｖａｎｃｅＡｒｔｉｃｌｅＯｎｌｉｎｅ）。
・ゼーマンＮＣ（ＳｅｅｍａｎＮＣ）、ベルヒャーＡＭ（ＢｅｌｃｈｅｒＡＭ）、Ｅｍｕｌａｔｉｎｇｂｉｏｌｏｇｙ：ｂｕｉｌｄｉｎｇｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｆｒｏｍｔｈｅｂｏｔｔｏｍｕｐ．、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、２００２年４月３０日号、９９Ｓｕｐｐｌ２：６４５１−５頁。
・ホエーリー（Ｗｈａｌｅｙ）ら、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｐｅｐｔｉｄｅｓｗｉｔｈｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｆｏｒｄｉｒｅｃｔｅｄｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌａｓｓｅｍｂｌｙ．、Ｎａｔｕｒｅ、２０００年６月８日号、４０５（６７８７）：６６５−８頁。

また、酵母ディスプレイライブラリーが、例えば、キーク（Ｋｉｅｋｅ）らの米国特許第６，３００，０６５号明細書（２００１年１０月９日）、ウィットラップ（Ｗｉｔｔｒｕｐ）らの同第６，３３１，３９１号明細書（２００１年１２月１８日、取下げ）、同第６，４２３，５３８号明細書、同第６，３００，０６５号明細書、およびクランツ（Ｋｒａｎｚ）らの特許出願公開第２００２／００５８２５３号明細書（２００２年５月１６日）に記載されている。ウィットラップ（Ｗｉｔｔｒｕｐ）らによる追加の技術文献が本発明の実施において使用されうるが、例えば、以下が挙げられる。
・バチア（Ｂｈａｔｉａ）ら、ＲｏｌｌｉｎｇＡｄｈｅｓｉｏｎＫｉｎｅｍａｔｉｃｓｏｆＹｅａｓｔＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴｏＥｘｐｒｅｓｓＳｅｌｅｃｔｉｎｓ．、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ．、２００３年６月６日号、１９（３）：１０３３−１０３７頁。
・フェルドハウス（Ｆｅｌｄｈａｕｓ）ら、Ｆｌｏｗ−ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｒｏｍａｎｏｎｉｍｍｕｎｅＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｓｕｒｆａｃｅｄｉｓｐｌａｙｌｉｂｒａｒｙ．、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００３年２月号、２１（２）：１６３−７０頁。
・ヤンＹＡ（ＹｅｕｎｇＹＡ）、ウィットラップＫＤ（ＷｉｔｔｒｕｐＫＤ）、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｙｅａｓｔｓｕｒｆａｃｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｌｉｂｒａｒｉｅｓｂｙｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄｃａｐｔｕｒｅ．、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ．、２００２年３月−４月号、１８（２）：２１２−２０頁。
・ウィットラップＫＤ（ＷｉｔｔｒｕｐＫＤ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｂｙｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅｄｉｓｐｌａｙ．、ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００１年８月号、１２（４）：３９５−９頁。
・ボーダーＥＴ（ＢｏｄｅｒＥＴ）、ウィットラップＫＤ（ＷｉｔｔｒｕｐＫＤ）、Ｙｅａｓｔｓｕｒｆａｃｅｄｉｓｐｌａｙｆｏｒｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｆｆｉｎｉｔｙ，ａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙ．、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．、２０００年、３２８：４３０−４４頁。
・ウィットラップＫＤ（ＷｉｔｔｒｕｐＫＤ）、Ｔｈｅｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌａｓａｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｗｅｌｌ．、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０００年１０月号、１８（１０）：１０３９−４０頁。
・ボーダーＥＴ（ＢｏｄｅｒＥＴ）、ミデルフォートＫＳ（ＭｉｄｅｌｆｏｒｔＫＳ）、ウィットラップＫＤ（ＷｉｔｔｒｕｐＫＤ）、Ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｉｔｈｍｏｎｏｖａｌｅｎｔｆｅｍｔｏｍｏｌａｒａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇａｆｆｉｎｉｔｙ．、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、２０００年９月２６日号、９７（２０）：１０７０１−５頁。
・ボーダーＥＴ（ＢｏｄｅｒＥＴ）、ウィットラップＫＤ（ＷｉｔｔｒｕｐＫＤ）、Ｏｐｔｉｍａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｓｕｒｆａｃｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｌｉｂｒａｒｉｅｓ．、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ．、１９９８年１月−２月号、１４（１）：５５−６２頁。
・ホラーＰＤ（ＨｏｌｌｅｒＰＤ）ら、ＩｎｖｉｔｒｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆａＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｗｉｔｈｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙｆｏｒｐｅｐｔｉｄｅ／ＭＨＣ．、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、２０００年５月９日号、９７（１０）：５３８７−９２頁。
・バニスターＳＪ（ＢａｎｎｉｓｔｅｒＳＪ）、ウィットラップＫＤ（ＷｉｔｔｒｕｐＫＤ）、ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｅｘｃｒｅｔｉｏｎｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ．、２０００年５月２０日号、６８（４）：３８９−９５頁。
・バンアントワープＪＪ（ＶａｎＡｎｔｗｅｒｐＪＪ）、ウィットラップＫＤ（ＷｉｔｔｒｕｐＫＤ）、Ｆｉｎｅａｆｆｉｎｉｔｙｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎｂｙｙｅａｓｔｓｕｒｆａｃｅｄｉｓｐｌａｙａｎｄｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ．、２０００年１月−２月号、１６（１）：３１−７頁。
・キークＭＣ（ＫｉｅｋｅＭＣ）ら、ＳｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｍｕｔａｎｔｓｆｒｏｍａｙｅａｓｔｓｕｒｆａｃｅ−ｄｉｓｐｌａｙｌｉｂｒａｒｙ．、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、１９９９年５月１１日号、９６（１０）：５６５１−６頁。
・シュスタＥＶ（ＳｈｕｓｔａＥＶ）ら、ＩｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｈｅｓｅｃｒｅｔｏｒｙｃａｐａｃｉｔｙｏｆＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎａｎｔｉｂｏｄｙｆｒａｇｍｅｎｔｓ．、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈ．、１９９８年８月号、１６（８）：７７３−７頁。
・ボーダーＥＴ（ＢｏｄｅｒＥＴ）、ウィットラップＫＤ（ＷｉｔｔｒｕｐＫＤ）、Ｙｅａｓｔｓｕｒｆａｃｅｄｉｓｐｌａｙｆｏｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｌｉｂｒａｒｉｅｓ．、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９７年６月号、１５（６）：５５３−７頁。
以下も参照：ウィットラップＫＤ（ＷｉｔｔｒｕｐＫＤ）、Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ．、ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９５年４月号、６（２）：２０３−８頁。ウィットラップＫＤ（ＷｉｔｔｒｕｐＫＤ）、Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ．、ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９５年４月号、６（２）：２０３−８頁。

本発明の実施において使用されうる追加の文献は、本明細書の末尾の文献リストにおいて確認されうる。

本発明の実施において、当技術分野の範囲内の分子生物学、遺伝子工学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が使用されうるが、かかる技術は文献において完全に説明されている（例えば、米国特許第６，４２３，５３８号明細書、同第６，３３１，３９１号明細書（取下げ）、および同第６，３００，０６５号明細書、およびウィットラップ（Ｗｉｔｔｒｕｐ）らの米国特許第６，３３１，３９１号明細書、第９欄６０行〜第１０欄６行に引用された文献、および本明細書の末尾に引用された文献を参照）。ジョルジオ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ）の米国特許第５，８６６，３４４号明細書、フォルクス（Ｆｏｗｌｋｅｓ）らの同第５，９３５，８２３号明細書、およびヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）らの同第６，２１４，６１３号明細書も参照。

最後に、本発明の１つの実施形態は酵母システムであり、以下の文献が使用されうるが、固体材料表面と相互作用する本発明による酵母システムを提供している。
・ジョホＭ（ＪｏｈｏＭ）、ヤマナカＣ（ＹａｍａｎａｋａＣ）、ムラヤマＴ（ＭｕｒａｙａｍａＴ）、Ｃｄ２＋ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎｂｙＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ．１９８６年、４５（１８４−１８５）：１６９−７９頁。
・ダメロンＣＴ（ＤａｍｅｒｏｎＣＴ）、ウィングＤＲ（ＷｉｎｇｅＤＲ）、Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｑｕａｎｔｕｍｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒｓ．、ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９０年１月号、８（１）：３−６頁。
・ダメロンＣＴ（ＤａｍｅｒｏｎＣＴ）、スミスＢＲ（ＳｍｉｔｈＢＲ）、ウィングＤＲ（ＷｉｎｇｅＤＲ）、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｃｏａｔｅｄｃａｄｍｉｕｍ−ｓｕｌｆｉｄｅｃｒｙｓｔａｌｌｉｔｅｓｉｎＣａｎｄｉｄａｇｌａｂｒａｔａ．、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．、１９８９年１０月１５日号、２６４（２９）：１７３５５−６０頁。
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・ホルムズＪＤ（ＨｏｌｍｅｓＪＤ）、スミスＰＲ（ＳｍｉｔｈＰＲ）、エバンス・ゴーウィングＲ（Ｅｖａｎｓ−ＧｏｗｉｎｇＲ）、リチャードソンＤＪ（ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎＤＪ）、ラッセルＤＡ（ＲｕｓｓｅｌｌＤＡ）、ソドーＪＲ（ＳｏｄｅａｕＪＲ）、Ｅｎｅｒｇｙ−ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅＸ−ｒａｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｄｍｉｕｍｓｕｌｆｉｄｅｃｒｙｓｔａｌｌｉｔｅｓｏｆＫｌｅｂｓｉｅｌｌａａｅｒｏｇｅｎｅｓ．、ＡｒｃｈＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９５年２月号、１６３（２）：１４３−７頁。
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・ホルムズＪＤ（ＨｏｌｍｅｓＪＤ）、リチャードソンＤＪ（ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎＤＪ）、サイドＳ（ＳａｅｄＳ）、エバンス・ゴーウィングＲ（Ｅｖａｎｓ−ＧｏｗｉｎｇＲ）、ラッセルＤＡ（ＲｕｓｓｅｌｌＤＡ）、ソドーＪＲ（ＳｏｄｅａｕＪＲ）、Ｃａｄｍｉｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｌｓｕｌｆｉｄｅ ’Ｑ−ｐａｒｔｉｃｌｅｓ’ｂｙＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．、１９９７年８月号、１４３（Ｐｔ８）：２５２１−３０頁。
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・コブレンツＡ（ＣｏｂｌｅｎｚＡ）、ウォルフＫ（ＷｏｌｆＫ）、ＴｈｅｒｏｌｅｏｆｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｈｅａｖｙｍｅｔａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｔｈｅｆｉｓｓｉｏｎｙｅａｓｔＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ．、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｖ．、１９９４年８月号、１４（４）：３０３頁。
・メヘラＲＫ（ＭｅｈｒａＲＫ）、ムルチャンダニＰ（ＭｕｌｃｈａｎｄａｎｉＰ）、ハンターＴＣ（ＨｕｎｔｅｒＴＣ）、ＲｏｌｅｏｆＣｄＳｑｕａｎｔｕｍｃｒｙｓｔａｌｌｉｔｅｓｉｎｃａｄｍｉｕｍｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＣａｎｄｉｄａｇｌａｂｒａｔａ．、ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．、１９９４年５月１６日号、２００（３）：１１９３−２００頁。
・メヘラＲＫ（ＭｅｈｒａＲＫ）、ムルチャンダニＰ（ＭｕｌｃｈａｎｄａｎｉＰ）、ハンターＴＣ（ＨｕｎｔｅｒＴＣ）、ＲｏｌｅｏｆＣｄＳｑｕａｎｔｕｍｃｒｙｓｔａｌｌｉｔｅｓｉｎｃａｄｍｉｕｍｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＣａｎｄｉｄａｇｌａｂｒａｔａ．、ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．、１９９４年５月１６日号、２００（３）：１１９３−２００頁。
・ミニーＳＦ（ＭｉｎｎｅｙＳＦ）、クワークＡＶ（ＱｕｉｒｋＡＶ）、ＧｒｏｗｔｈａｎｄａｄａｐｔａｔｉｏｎｏｆＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｄｍｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ．、１９８５年、４２（１６７）：３７−４４頁。

ＩＩ．細胞ディスプレイライブラリー
細胞ディスプレイ組合せライブラリーが当技術分野で周知である（例えば、上記第Ｉ項を参照、以下の文献２およびそれの中に引用された文献を参照、例えば、Ｋ．ヒグチ（Ｋ．Ｈｉｇｕｃｈｉ）らの米国特許第６，２１４，６１３号明細書、「発現スクリーニングベクター（ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｃｒｅｅｎｉｎｇＶｅｔｏｒ）」も参照）。例えば、細胞表面上のタンパク質のディスプレイは、例えば、セファロース上のタンパク質の固定化と同様の支持を提供しうる。可溶性タンパク質を不活性支持基質に共有結合せずに、発現タンパク質が細胞表面上に表示されうる。次いで、細胞は、それらが支持培地のミクロンサイズのビーズであるかのように処理されうる。したがって、細胞表面ディスプレイを使用し、結合タンパク質および酵素の別々の発現、精製、および固定化を回避することができる。また、生体分子は、表面上に表示されるよりも細胞から分泌されうる。

真核組合せ細胞ディスプレイライブラリーを、酵母ライブラリーを含めて、本発明の実施において使用することができるが、このライブラリーは複数の発現生体分子を含む。真核細胞ディスプレイライブラリーとしては、例えば、酵母、昆虫、植物、および哺乳類ライブラリーが挙げられる。細胞は細胞系であり、または初代培養細胞型でありうる。

哺乳類細胞は、その遺伝工学的手法および細胞表面ディスプレイ法を含めて周知である。例えば、ビーチ（Ｂｅａｃｈ）らの米国特許第６，２５５，０７１号明細書（２００１年７月３日）、ザンブロビッツ（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ）らの同第６，２０７，３７１号明細書（２００１年３月２７日）、およびサンズ（Ｓａｎｄｓ）らの同第６，１３６，５６６号明細書（２０００年１０月２４日）を参照。また、例えば、ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９９年、２３０：１４１−１４７頁、チェスナット（Ｃｈｅｓｎｕｔ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９６年、１９３：１７−２７頁、シュー（Ｃｈｏｕ）ら、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ、１９９９年、６５：１６０−１６９頁も参照。

具体的には、酵母ライブラリーが本発明において好ましい。酵母の選択は特に限定されているわけではない。例えば、酵母、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を使用することができる。

酵母の一般的な細胞特性は周知であり、本発明の実施において使用されうる。例えば、ウォーカー、Ｇ．Ｍ．（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｍ．）、ＹｅａｓｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ジョン・ワイリー（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ）、１９９８年を参照。例えば、異なる細胞サイズ、形状、および色の酵母を使用することができ、酵母環境の物理的および化学的条件を変更し、要望どおりに酵母を変更することができる。酵母細胞の例が以下の実施例に示されている。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、一般に形状が楕円体であり、例えば、大きな直径で約５ミクロン〜約１０ミクロン、小さな直径で約１ミクロン〜約７ミクロンである。平均細胞体積は、例えば、１倍体細胞で約２５立方ミクロン〜約３５立方ミクロンでありうる。平均細胞体積は、例えば、２倍体細胞で約５０立方ミクロン〜約６０立方ミクロンでありうる。細胞サイズは加齢に伴って増大しうる。酵母は、例えば、タンパク質、糖タンパク質、多糖類、ポリリン酸塩、脂質、および核酸を含む高分子成分を含みうる。顕微鏡検査、位相差顕微鏡検査、染色法、フルオロクロム染料、蛍光顕微鏡検査法、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびフローサイトメトリーを含む周知の細胞学の方法を使用することができる。

発現生体分子は、特異的および選択的結合が固体材料との表面相互作用において達成されうると同時に相互作用を提供する遺伝的にコード化された生体分子でありうる。例えば、これらの生体分子はプラスミドにおいてコード化され、ライブラリーは、酵母細胞の表面において、または表面上で産生され、または酵母細胞から分泌されうる。別の例において、生体分子はレトロウイルス構成物において遺伝的にコード化され、ライブラリーは、例えば、哺乳類またはヒト細胞などの細胞の表面において、または表面上で産生されうる。

生体分子は特に限定されているわけではないが、一般に細胞発現過程の対象でありうる。生体分子は、ペプチド、オリゴペプチド、およびポリペプチドを含みうる。それらはタンパク質でありうる。それらは抗体または抗体のフラグメントでありうる。生体分子の修飾は、ビオチン化、グリコシル化、ジスルフィド形成、グリコシル化、タンパク質分解、ミリスチル化、プレネル化（ｐｒｅｎｅｌａｔｉｏｎ）、パルミチル化、ファルネシル化、ライゲーション、非天然アミノ酸の取込み、環化、およびイオンの取込みを含みうる。

生体分子はペプチドおよびタンパク質ならびにそれらの誘導体を含みうる。生体分子は、抗体、またはｓｃＦｖフラグメントを含む抗体フラグメントを含みうる。生体分子と表面との間の相互作用の種類は、結合が達成されうる限り特に限定されているわけではないが、当技術分野で周知の相互作用としては、静電、イオン、疎水、ファンデルワールス、共有、接着などが挙げられる。

生体分子は、細胞内、または細胞の表面上で産生されうる。１つの実施形態において、細胞ディスプレイライブラリーは、酵母の表面上に示されるヒト一本鎖可変フラグメント抗体ライブラリーである。

１つの実施形態において、複数の生体分子は複数のタンパク質またはペプチドである。具体的には、細胞ディスプレイライブラリーは、結果として選択的結合をもたらすポリペプチド結合部位など結合部位を有する発現生体分子を含む表面を有するメンバーを含みうる。

１つの実施形態においては、生体分子は、表面を有する固体材料に加えて異なる表面との特異的結合のために遺伝子操作されうる。生体分子は、例えば、選択的または特異的結合を提供する２つまたはそれ以上の部位を有し、リンカー部分として機能しうる。例えば、生体分子は、表面を有する固体材料に結合され、次いで第２の結合部位で追加の表面に結合されうる。

ライブラリーの多様性は特に限定されているわけではないが、例えば、１０⁴クローンより多く、１０⁵クローンより多く、１０⁶クローンより多く、１０⁷クローンより多く、または１０⁸クローンよりも多い。単一ライブラリーによりスクリーニングが実行されうる。あるいは、一連の小さなライブラリーによるスクリーニングも実行されうる。

本発明の重要な態様は、時間的または空間的制御を含む調節可能なシステムによる方法のさらなる制御である。例えば、生体分子のディスプレイは生体分子の転写または翻訳の制御によって調整されうる。細胞増殖に対する時間的制御、シグナル伝達(signal transduction)、転写、翻訳、およびタンパク質機能を含む追加の制御の多くのオプションを提供する外部の合図を使用することができる。１つの実施形態において、例えば、ペプチドなどの生体分子が、ガラクトース調節可能プロモータなど栄養的に調節可能な遺伝要素の下流でコード化されうる。この実施形態において、グルコースまたはガラクトースのいずれかを含有する増殖培地へ宿主細胞をスイッチすることにより、ペプチドの転写が制御される。したがって、栄養素を使用してライブラリーの発現を調節することができる。ディスプレイの調節またはペプチドの分泌は、コード化ペプチドがナノ結晶または他の材料に結合し、またはアセンブルする場合には、材料沈殿に対する時間的または空間的制御を可能にしうる。時間的制御は、シグナル伝達経路、転写、翻訳、または分子内相互作用に影響を及ぼす外部の合図または刺激によって達成されうる。調節はさまざまな異なる種類のスイッチ機構によって制御されうる。これらの機構は、生体分子の転写、翻訳、折畳み、安定性、または加工に直接影響を及ぼし、またはシグナル伝達経路を通じてスイッチ機構を誘発しうる。スイッチ機構は当技術分野で周知である。生体分子のディスプレイは、小さな分子、例えば、増殖因子などの拡散性リガンド、サイトカイン、フェロモン、ホルモン、神経伝達物質、糖、アミノ酸、ヌクレオチド、栄養化合物、光、高周波、機械的変換（ｍｅｃｈａｎｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、磁場、電場、電流、温度などを含むがこれらに限定されない外部の合図によって時間的に制御されうる。

調節可能なシステムの例としては以下が挙げられる。
１．ゴッセン、Ｍ．（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．）およびブヤード、Ｈ．（Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．）（１９９２年）。Ｔｉｇｈｔｃｏｎｔｒｏｌｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓｂｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８９、５５４７−５１頁。
２．ガリＥ（ＧａｒｉＥ）、ピエドラフィータＬ（ＰｉｅｄｒａｆｉｔａＬ）、アルデアＭ（ＡｌｄｅａＭ）、ヘレロＥ（ＨｅｒｒｅｒｏＥ）、ＡｓｅｔｏｆｖｅｃｔｏｒｓｗｉｔｈａｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｙｓｔｅｍｆｏｒｍｏｄｕｌａｔｅｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．、Ｙｅａｓｔ、１９９７年７月号、１３（９）：８３７−４８頁。
３．ノー、Ｄ．（Ｎｏ，Ｄ．）、ヤオ、Ｔ．Ｐ．（Ｙａｏ，Ｔ．Ｐ．）、およびエバンス、Ｒ．Ｍ．（Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．）（１９９６年）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９３（８）：３３４６−５１頁。（昆虫ホルモンエクジソンまたはその類似体ポナステロンＡ（ｐｏｎＡ）は、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）エクジソン受容体の遺伝子およびエクジソン受容体の結合部位を含有するプロモータを収容する哺乳類細胞における転写を活性化しうる。）

また、異なるプロモータを酵母発現において使用することができる。例えば、Ｇａｌ１，１０プロモータはガラクトースによって誘導可能である。ＵＡＳ配列を含有する調節領域は、ガラクトース誘導性発現およびグルコース抑制を与える他の遺伝子の上流に配置されうる。ＡＤＨ２プロモータはグルコース抑制性であり、かつこれは非発酵性炭素源で強く転写される（ガラクトースによって誘導可能でないことを除きＧＡＬ１，１０と同様）。メタロチオネイン遺伝子プロモータであるＣＵＰ１プロモータを使用することができる。これは培地に添加される銅または銀イオンによって活性化されうる。ＰＨＯ５プロモータは培地における低リン酸または無リン酸の条件下に誘導されうる。ステロイド誘導性発現も使用してコード化生体分子の発現を調節することができる。

１つの実施形態において、ラットグルココルチコイド受容体遺伝子を構成的ＧＰＤプロモータの背後に配置し、ラットグルココルチコイド受容体を酵母において発現させることができる。第２のベクターをＣＹＣ１（シトクロムｃ）遺伝子最小プロモータおよび制御される目的とする遺伝子の上流の３つのグルココルチコイド反応要素で作ることができる。このシステムは、ステロイドホルモンが培地に添加されうると用量依存発現で功を奏しうる。反応時間はホルモンの添加後７−９分のｔ１／２で迅速である。熱ショック誘発発現は、最小プロモータの前で熱ショック遺伝子からのＵＡＳを配置することによって達成されうる。また、（１）シェーナＭ．（ＳｃｈｅｎａＭ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８年８月１９日号、２４（４８６８）：９６５−７頁、（２）ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ：Ｃｈｅｍ．、１９９０年９月５日号、２６５（２５）：１４７６３−９頁を参照。

細胞ディスプレイは、生体分子が産生され、かつ表示され、細胞膜、細胞壁、または、例えば、鞭毛、繊毛、線毛、またはピリ（ｐｉｌｌｉ）など細胞付属物に付着するようにありうる。

ディスプレイは、細胞質ゾル、細胞内成分、または細胞小器官においても生じうる。また、生体分子は宿主細胞から分泌され、または放出されうる。

ＩＩＩ．固体表面
表面を有する固体材料は、発現生体分子が表面に選択的に結合されうる限り特に限定されるわけではない。例えば、これは表面を有する結晶性固体材料、または表面を有する非晶質固体材料でありうる。これは単結晶性、ミクロ結晶性、ナノ結晶性、または多結晶性でありうる。これは無機または有機クラスタでありうる。または、これは表面を有する無機固体材料であり、もしくはこれは表面を有する有機固体材料でありうる。また、これは表面を有する半導体材料、金属材料、またはセラミックもしくはガラス材料でありうる。これは表面を有するポリマー材料でありうる。量子ドット固体材料を使用することができる。ガラス繊維、木、およびコンクリートなど複合材料を使用することができる。一般的に言って、硬い表面を有する固体材料が、軟らかい表面を有する固体材料よりも好ましい。混合物を使用することができる。

表面を有する固体材料の形状は特に限定されているわけではない。例えば、これは、例えば、膜またはウエハーなどの非粒子固体材料であり、またはこれは粒子固体材料でありうる。表面は実質的に平滑、平面、または曲面でありうる。粒子固体材料は、例えば、およそ数ミリメートルの側面寸法を有する肉眼で見える粒子でありうる。または、それらは微粒子もしくはナノ粒子でありうる。

一般に、表面を有する固体材料は周期表のいかなる元素も含みうる。Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ、Ｆｅ、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、Ｐｔ、ＦｅＰｔ、Ｃｏ、ＣｏＰｔ、Ｓｍ、ＳｍＣｏ５、Ａｌ、ＡｌＡｓ、ＡｌＧａＡｓ、Ｔｉ、ＴｉＯ２、Ｓｎ、ＳｎＯ２、Ｚｎ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、Ｃｄ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、Ｐｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＰｂＴｅ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｇａ、ＧａＮ、ＡｌＧａＮ、ＩｎＧａＮ、Ｉｎ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、Ｃａ、ＣａＣＯ３、ＣａＰＯ４などを含むが、これらに限定されない元素もしくは元素の組合せから成る単結晶、多結晶性材料、またはナノ結晶。上記の材料、およびそれらの酸化物誘導体に限定されないが、これらから成る非晶質材料を使用することができる。材料は、Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ、Ｆｅ、Ｐｔ、Ｃｏ、Ｓｍ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｓｎ、Ｚｎ、Ｃｄ、ＰｂおよびＣａを含むがこれらに限定されない元素もしくは元素の組合せから成る金属、金属の合金、または金属イオン、もしくは可溶性金属塩でありうる。

基質は単結晶、鉱物、またはウエハーでありうる。これはコーティングされていないナノ粒子または粉末でありうる。

金属および磁気材料は、例えば、２００３年９月２２日出願、ベルヒャー（Ｂｅｌｃｈｅｒ）らの特許出願第１０／６６５，７２１号明細書（「金属および磁気ナノ粒子のペプチド媒介合成（ＰｅｐｔｉｄｅＭｅｄｉａｔｅｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＭｅｔａｌｌｉｃａｎｄＭａｇｎｅｔｉｃＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」）に記載されているものを含めて使用されうる。

ポリマー表面は、例えば、炭化水素鎖ポリマー、有機ポリマー、無機ポリマー、電子ポリマー、半導体ポリマー、金属ポリマー、ポリピロール、または、例えば、ポリプロピレンもしくはポリエステルなどの衣料品用ポリマーでありうる。

表面を有する固体材料は、また、生体高分子、例えば、クモの糸、カイコの糸、コラーゲン、リグニン、キチン、セルロース、およびそれの誘導体でありうる。

選択的結合前に、表面は処理されうる。好ましくは、例えば、表面を有する固体材料は処理され、複数の発現生体分子と表面との間の非特異的相互作用を制限することができる。表面を有する固体材料は、材料のモノリシックブロックであり、または、例えば、混合物、合金、合成物を含む材料の混合物でありうる。固体材料は、表面構造と異なるバルク構造を有しうる。固体材料は表面酸化されうる。

固体材料は修飾され、生体分子との選択的結合において使用するための既知の相補的認識単位を有する部分を含むことができる。例えば、ナノ粒子は表面処理され、ナノ粒子から周囲の培地へ伸びる部分を含むことができ、相補的構造を認識し、かつこれに結合しうる。

固体表面の使用は好ましい実施形態であるが、選択的相互作用も、例えば、反応して生体分子の存在下に固体材料を形成する金属塩および反応性前駆体など溶液中の基質に対して実行されうる。

ＩＶ．選択的結合のための接触ステップおよび条件
接触ステップは、選択的結合を可能にする条件が提供されている限り特に限定されているわけではない。当技術分野で周知の方法を使用し、ｐＨ調整および塩濃度変化を含む結合の厳密性を調整することができる。結合の時間は必要に応じて調整されうる。一般に、水性バッファー条件を含む水性条件が使用されうる。温度は特に限定されているわけではないが、約１００℃未満、より詳しくは、約５０℃未満の温度が使用されうる。概して適した温度範囲は、例えば、約０℃〜約４０℃、より詳しくは、約１５℃〜約４０℃である。約１００℃までの温度が可能である好熱性生物を使用することができる。

Ｖ．他のステップおよび要素
いったん選択的結合が実行されると、表面を有する固体材料に選択的に結合する発現生体分子を単離するステップを含む別のステップを実行することができる。この単離のために、例えば、光学、磁気、電気、または物理的特性の使用を含む当技術分野で周知の方法が使用されうる。具体的には、蛍光および磁気特性を使用することができる。例えば、磁気細胞分離装置を有するフロ（Ｆｌｏ）血球計算器で単離を行うことができる。あるいは、密度勾配により、もしくは流体チャンバにおいて、または遠心分離デバイスを使用して単離を行うことができる。

結合集団からのクローンは、ＰＣＲによる直接配列決定を含む当技術分野で周知の方法によって、またはクローンからのＤＮＡの単離の後、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）における増幅によって配列決定されうる。同一の配列のグループ化の後、複数の独自の配列が決定されうる。

好ましくは、集団から配列決定された高い割合のクローンがナイーブ宿主細胞における結合を与えることができ、かつ好ましくは、この割合は少なくとも５０％、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、かつより好ましくは、少なくとも８０％、かつより好ましくは、少なくとも９０％である。

必要に応じて、いったん選択的に結合生体分子が決定されると、これらの生体分子は材料、特に、選択的結合にかけられた表面を有する固体材料の製造にも使用されうる。例えば、粒子固体材料は生体分子の存在下に成長されうるが、ここで選択的結合は、結晶構造、粒径、および反応の温度などの因子を制御する。固体粒子材料は微粒子材料またはナノ粒子材料でありうる。平均粒径は、例えば、約２ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約２５ｎｍでありうる。追加の平均粒径は、例えば、約１００ｎｍ〜約１ミクロン、または約１ミクロンから約５００ミクロンでありうる。粒子材料は特に限定されているわけではないが、例えば、無機、有機、磁気、金属、電子、セラミック、酸化物、ナノ結晶、量子ドット、半導体、および表面を有する固体材料の説明における上記の他の材料でありうる。

一般に、粒子材料は、例えば、約３００℃以下、約１００℃以下、または約０℃〜約４０℃、またはより詳しくは、約２０℃〜約４０℃を含む比較的低い温度で調製されうる。大気である温度、具体的にはほぼ室温であることが好ましい。

ＶＩ．物品
表面を有する固体材料、およびその表面に選択的に結合され、かつその表面に選択的に結合するように遺伝子操作されている発現生体分子を含む物品が製造されうる。結合分子は、遺伝子操作、ライブラリーの形成、およびバイオパニングによって直接調製され、またはバイオパニング方法の結果に基づき合成的に調製されうる。発現生体分子は、真核細胞ディスプレイライブラリーにおいて発現されうる。

単層膜、多層膜、および単層を含む表面上で膜が形成されうる。膜の厚さは特に限定されているわけではないが、例えば、約１ｎｍ〜約１００ミクロン、または約１０ｎｍ〜約５０ミクロン、または約１００ｎｍ〜約１０ミクロンでありうる。

必要に応じて、高温を使用して表面上の有機材料を除去し、残留材料を残すことができる。

ＶＩＩ．製造方法、物品、および使用方法
無機材料と有機材料の橋渡しをし、または無機材料と生きた材料の橋渡しをする本明細書に記載された方法および組成物の使用を含む特に関心のある用途。

用途としては、明確な特性を有する醸造材料および低欠陥材料、高密度貯蔵のための磁気材料、自己回復コーティング、バイオスポンジ環境用途、特異的材料または材料（例えば、細胞−電極、細胞−半導体）上の領域への局在または付着、生体材料および移植接触面の材料への細胞結合、画像造影剤、薬物送達、バイオセンサ、細胞に基づいたセンサ、材料表面への細胞の局在、神経細胞の電極への接続、細胞上への直接の量子ドットまたは他の材料マーカーの成長、医療インプラントが挙げられる。

真核細胞ディスプレイの追加の用途は、ファージウイルスディスプレイの用途でありうる。具体的には、例えば、以下の酵母および他の真核細胞の追加の特性を考慮に入れる用途が実行されうる。すなわち、
１）酵母は安価であり、きわめて高い収量でタンパク質生体分子を産生し、かつ、例えば、醸造工業において明白なようにきわめて拡張性であり、
２）細胞は、高いコピー数で、大きな、より複雑な、または翻訳後修飾生体分子を産生することができ、
３）細胞は生きており、かつ成長しており、したがって、コーティングに関係した用途において、それらは生きたコーティング、または自己回復する物品を形成することができ、
４）細胞は感覚能力を有し、環境刺激／条件に反応しうる。したがって、バイオセンサ態様を任意の物品と結合することができる。例えば、細胞は材料との結合に対する反応をもたらすことができ、または細胞は刺激に対して反応し、次いで、例えば、ディスプレイの調節において材料に結合することができる。

組合せライブラリーキットを含むキットを調製することができる。例えば、（１）前駆体からの材料をアセンブルする生体分子、（２）反応して材料へ形成し、またはアセンブルする前駆体、（３）例えば、管、カラム、および方法における補助となる同様のものなど付属品を含む１つまたはそれ以上の要素を含む溶液中で材料を成長させるためのキットが提供されうる。

例えば、細胞標識における細胞上または細胞内で材料を成長させるためのキットが提供されうる。要素としては、例えば、（１）生体分子をコード化して前駆体からの材料をアセンブルするＤＮＡ、このＤＮＡは、次いで生体分子をタグとして発現させる細胞に送達され、（２）材料へアセンブルする前駆体、および（３）例えば、方法における補助となる管およびカラムなどの付属品を挙げることができる。

細胞を、例えば、電極など特定の材料に結合するためのキットが提供されうる。これらとして、目的とする材料との結合を仲介しうる生体分子をコード化するＤＮＡを挙げることができる。

結合による欠陥の同定を含む特定の材料表面の検出のためのキットが提供されうる。これらとしては、（１）特定の材料に結合する、生体材料を発現する細胞、または生体分子そのもの、必要に応じて、材料特異的クローンの各種取合せが提供されうる、（２）細胞を材料に結合する方法に関する説明書、および材料間の区別の方法を挙げることができる。

ＶＩＩＩ．発明および実施例の追加的な説明
本発明は、実施例および次項におけるそれの議論によってさらに説明されるが、次項では抗体およびペプチドが、酵母上で表示されると、ＩＩ−ＶＩ（ＣｄＳ）およびＩＩＩ−Ｖ（ＧａＮ）半導体、金属（Ａｕ）、磁気合金（ＦｅＰｔ）、および絶縁体（Ａ１₂Ｏ₃）を含むさまざまな材料との相互作用を仲介する組合せライブラリーから単離されうることが明らかにされる。上記のように、これらのクラスの材料は、新しいタイプのトランジスタ、増幅器、光電池、磁気ストレージ、および発光ダイオードの開発においてますます重要になっている。これらおよび他の技術的に重要な材料を生物学と統合する方法は、潜在的なバイオテクノロジーおよび医療的価値を有する多様な用途の開発を助長する。これらの材料がすでに生物学に影響を及ぼしている例が、細胞および細胞内撮像の光学プローブとしてのＩＩ−ＶＩ半導体量子ドットの使用である（２９）。本明細書に記載された組合せ方法は、生物学的製剤と電子、光学、および磁気材料との制御可能な、特定の接着相互作用を操作することを可能にする。

この細胞パニング法により、ｓｃＦｖフラグメントポリペプチドおよび完全長ｓｃＦｖが同定され、ＣｄＳクローンＥ０１の場合のように材料特異的であった。ペプチドは、さまざまな材料のファージディスプレイによって選択されるペプチドを使用して示されているように、平面の材料表面と相互作用を仲介するのに十分であった（３、４）。本発明は理論によって制限されるわけではないが、ペプチドはより構造化されたｓｃＦｖ抗体よりも大きな配座自由を有するため、ペプチドが結果として、ｓｃＦｖの可能性よりも平面の結晶表面とのエネルギー的に好ましい相互作用をもたらす配位を担い、ライブラリーに存在する結晶表面に適合する完全またはほぼ完全な構造を有すると仮定されている可能性が高い。さらに、より小さなペプチドは、完全タンパク質よりも高いレベルで発現し、したがって、結合活性により細胞結合の強化に寄与しうる。ライブラリーの一部分としてのみ示されているが（３分の１未満）（１３）、フレームシフトＣ末端ポリペプチドを有するフラグメントが主に単離された。したがって、細胞表面上に示される多数の任意のペプチドライブラリーのパニングは、材料特異的ペプチドの産生にも役立ち、ファージパニングを補完し、さらに結合を直接視覚化する能力を有する。

非金属結晶性材料ＣｄＳ、Ａｌ₂Ｏ₃、およびＧａＮに対する３ラウンドのパニングの後に抗体も同定された。フレームシフトされたｓｃＦｖフラグメントがこれらのスクリーンでも優勢であったが、これは完全長ｓｃＦｖが材料表面と相互作用が可能であることを示す。明らかに折畳まれた構造は、結合のエントロピーコストを削減することによって適切に折畳まれている場合には、より特異的または高親和性の相互作用を仲介しうる。このパニング法の改良は、例えば、ＦＡＣＳを使用して蛍光免疫標識化完全長クローン（１５）を濃縮し、または磁気ビード濃縮（２６）によって、さまざまな用途のために高親和性、材料特異的抗体の良好な検出を可能にすることが期待される。さらに、この方法は、量子ドット（３０）、または粒子へ成長した溶質（５−７、３１、３２）などの材料の懸濁、およびＦＡＣＳによるかかる粒子材料と相互作用し、またはこれを成長させるクローンのスクリーニング、磁気（９、２６）、または密度細胞分離法の使用によって修飾されうる。ＦＡＣＳ選別または磁気分離など、かかるスクリーニング法は、小さなサイズおよび比較的少数の潜在的な結合蛍光または磁気ユニットによりファージで行うことが不可能でない場合には困難であるが、細胞では日常的に実行されている。

細胞パニング法は、比較的単純な実験法により材料特異的タンパク質を同定することが可能であった。さらに選択されたｓｃＦｖおよびフラグメント酵母クローンの自己回復生物膜および材料同定試薬としての直接の用途が明らかにされた。しかし、これら選択された生体分子の利用は、酵母細胞を表示することに限定されていない。他の真核細胞型でかかる材料結合タンパク質を表示し、細胞−材料相互作用を仲介することが目的とされている。例えば、ニューロンまたは加工細胞を電極に付着させるために使用される現在の方法は、外因性接着分子を必要とし、結果として不正確な細胞局在をもたらす（３３、３４）。ヒトニューロンによって表示される、本発明によって提供される選択タンパク質は、Ａｕ電極、または他のデバイスへの直接の付着を可能にし、結果として細胞とデバイスとの直接の接触面をもたらしうる。これらおよび同様の生体分子ブリッジは、インプラント、組織工学骨格、および医用診断および治療において使用されうる。

さらに、細胞に基づくシステムは動的であり、ビルトイン感覚、ロジック、および、ここで環境的合図に反応し、ディスプレイを調節し、かつ複製する細胞の能力によって示される反応機械を有する。したがって、敏感なバイオセンサおよび生体力学的デバイスの開発は、デバイスアーキテクチャー内の特定の位置への細胞の有効な結合によって利益を得ることができる。

最後に、加工細胞、特に酵母は、タンパク質およびペプチドの生体分子工場として機能しうる（１８、３５）。この細胞の合成の可能性を材料特異的生体分子を使用する高値の材料の産生に適合させ、材料のアセンブリを方向付けることができる。

ＩＸ．実施例
本発明はさらに以下の非限定的実施例によって説明される。

Ｉ．材料と方法
酵母菌株およびライブラリー
ヒトレパートリー一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）ライブラリー（１３）を既述されているように（２２）維持した。Ａｇａ２のＣ末端に融合したｓｃＦｖはＧａｌベースのプロモータの下流の２ミクロンプラスミドでコード化され、そのゲノムに一体化されたＧａｌベースのプロモータの制御下にＡｇａ１を有する酵母菌株ＥＢＹ１００において維持される（２２）。

材料
材料を以下の供給源から得た。すなわち、研磨単結晶ＣｄＳ［Ａ−プレート］（クリーブランド・クリスタル（ＣｌｅｖｅｌａｎｄＣｒｙｓｔａｌ））、蒸着Ａｕコートガラススライド（エバポレーテッド・メタル・フィルムズ・コーポレーション（ＥｖａｐｏｒａｔｅｄＭｅｔａｌＦｉｌｍｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＳｉＮウエハー上のＦｅＰｔ薄膜（Ｔ．トムソン（Ｔ．Ｔｈｏｍｓｏｎ）、ＩＢＭ、Ａｌｍａｄｅｎ、カルフォルニア州（ＣＡ））、エピタキシャル成長ＧａＮおよびＡｌ₂Ｏ₃テンプレート（Ａ．ストナス（Ａ．Ｓｔｏｎａｓ）およびＥ．フー（Ｅ．Ｈｕ）、ＵＣＳＢ、カリフォルニア州（ＣＡ））。バスソニケーター（フィッシャー・サイエンティフィック（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）における短時間の水性超音波処理によって実験後に材料を清浄にし、エタノール中でリンスし、乾燥保存した。ＧａＮおよびＡｌ₂Ｏ₃も４ｍＭＨＣｌ中で弱酸性洗浄にかけた。使用前に適切なパニング培地中に１時間、材料を遮断した。

パニング法
一般的に言って、選択は材料をガラクトース（ＳＧ）を補充した合成的ドロップアウト培地中に誘導酵母細胞の培養に曝露し（２２）、材料を新鮮倍中で洗浄し、次いで結合細胞をラウンドｄ１でのトリプシン処理／トリテレーション（ｔｒｉｔｅｒａｔｉｏｎ）によって回収し(rescuing)、またはグルコース（ＳＤ）を補充した合成的ドロップアウト培地中でグローオフ(growing off)することによって実行された（２２）。パニングラウンドｄ１−ｄ７を２２℃で以下の条件下に行った。ラウンドｄ１：７５ｍＬＳＧ＋５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＳＧ−ＢＳＡ）中１５０ＯＤ細胞、２４時間インキュベーション、ｄ２：８ｍＬＳＧ−ＢＳＡ中８ＯＤ細胞、２４時間インキュベーション、ｄ３：４ｍＬＳＧ−ＢＳＡ中２ＯＤ細胞、６時間インキュベーション、ｄ４：４ｍＬＳＧ−ＢＳＡ中２ＯＤ細胞、２．２５時間インキュベーション、ｄ５：１．５ｍＬリン酸緩衝生理食塩水＋５ｍｇ／ｍＬＢＳＡ＋０．１％トゥイーン２０（ＰＢＳ−ＢＳＡＴ）中０．２ＯＤ細胞、２時間インキュベーション、ｄ６：１ｍＬＰＢＳ−ＢＳＡＴ中０．１ＯＤ細胞、１時間インキュベーション、ｄ７：１ｍＬＰＢＳ−ＢＳＡＴ中０．１ＯＤ細胞、４５分インキュベーション。パニングラウンドｅ１−ｅ３を以下の条件下に行い、各ラウンド後にグローオフして回収した。すなわち、ラウンドｅ１：１２５ｍＬＳＧ−ＢＳＡ中２５０ＯＤ細胞、２１．５時間インキュベーション、ｅ２：３ｍＬＳＧ−ＢＳＡ＋０．１％トゥイーン２０（ＳＧ−ＢＳＡＴ）中１．５ＯＤ細胞、２時間インキュベーション、ｅ３：１ｍＬＳＧ−ＢＳＡＴ中１ＯＤ細胞、２時間インキュベーション。

ＳｃＦｖ変異体のクローニング
クイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ）突然変異誘発（ストラータジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して切断変異株を構成し、所望の位置で停止コドンを添加した。Ｄ０１Ｉ（５’−ＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＴＡＡＣＧＡＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＣ−３’および５’−ＧＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＣＴＴＣＧＴＴＡＧＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣ−３’）、Ｄ０１Ｈ（５’−ＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＣＡＧＧＧＴＴＡＡＧＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＡＣＡ−３’および５’−ＴＧＴＧＴＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＣＴＴＡＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣＡＡＧＧ−３’）、Ｄ０７Ｖ（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＧＡＣ−３’および５’−ＧＴＣＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＧＴＣＣＣＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＧ−３’）、Ｄ０７Ｒ（５’−ＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡＧＣＡＧＴＧＧ−３’および５’−ＣＣＡＣＴＧＣＴＡＧＧＧＴＴＧＡＴＣＴＡＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＣＣ−３’）、Ｅ０１Ｖ（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＧＡＣ−３’および５’−ＧＴＣＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＧＴＣＣＣＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＧ−３’）、およびＥ０１Ｒ（５’−ＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＴＧ−３’および５’−ＣＡＣＣＡＣＴＧＴＴＡＧＧＧＴＴＧＡＴＣＴＡＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＣＣ−３’）に対するオリゴヌクレオチドプライマーをテンプレートとしてクローンＤ０１、Ｄ０７、およびＥ０１から単離されたプラスミドＤＮＡとともに使用した。Ｖ_H領域を欠く遠位ペプチドフラグメントに対応する変異体を、プライマー（５’−ＡＴＣＣＣＧＧＧＧＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣ−３’）にアニールしたＤ０１ｐｅｐ（５’−ＣＣＣＧＧＧＧＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＴＡＴＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＣＡＴＧＧＴＡＣＴＧＡＡＣＡＡＣＣＡＧＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＣＡＧ−３’）、Ｄ０７ｐｅｐ（５’−ＣＣＣＧＧＧＧＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＡＴＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＡＧＡＣＡＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＡＴＧＣＴＧＡＴＡＴＴＴＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＣＡＧ−３’）、およびＥ０１ｐｅｐ（５’−ＣＣＣＧＧＧＧＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＡＴＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＡＧＡＣＡＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＡＴＴＴＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＣＡＧ−３’）に対するオリゴヌクレオチドからｄｓＤＮＡ挿入を生成することによってクローン化し、エキスパンド・エンザイム（ＥｘｐａｎｄＥｎｚｙｍｅ）（ロシュ・ディアグノスティック社（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して伸延した。挿入をＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＣＴＣＯＭへクローン化し、結果として、ＳｃＦｖと同じコンテキストで（Ｇ₄Ｓ）₃フレキシブルリンカーの末端でペプチドの融合が生じた。これらのクローン化変異体およびペプチドを収容する配列決定プラスミドＤＮＡをゲイツ（Ｇｅｉｔｚ）トランスフォーメーションキット（テトラリンク（Ｔｅｔｒａｌｉｎｋ））を使用してＥＢＹ１００へトランスフォームした。

クローン検証および材料特異的結合アッセイ
プラスミドＤＮＡでトランスフォームした細胞を３０℃下にＳＤ中で中間対数期(mid-log phase)に成長させ、次いでＳＧ中で１８〜２４時間、室温（ＲＴ）下に誘導した。２ＯＤ₆₀₀単位の細胞を２ｍＬ微小遠心管中１．５ｍＬＳＧ−ＢＳＡＴ中に再懸濁した。事前遮断０．５ｃｍ²ＣｄＳを各クローン培養に添加し、１時間揺動させ、新しい管中ＳＧ−ＢＳＡＴ中で３０分間洗浄し、光学顕微鏡撮像のために６ウェル培養プレートに移した。クローンＥ０１特異的アッセイのために、全材料を２０ｍＬＳＧ−ＢＳＡＴ中２０ＯＤ₆₀₀単位の細胞を含有する培養フラスコに１時間配置し、１時間洗浄し、上記のように撮像した。

光学顕微鏡検査および細胞定量化
デジタル画像をアキシオプラン（Ａｘｉｏｐｌａｎ）光学顕微鏡（カールザイス社（ＣａｒｌＺｅｉｓｓＩｎｃ．））上のアキシオカム（ＡｘｉｏＣａｍ）ＭＲで収集し、ウェイン・ラスバンド（ＷａｙｎｅＲａｓｂａｎｄ）、ＮＩＨによって開発されたイメージＪ（ＩｍａｇｅＪ）ｖ１．３を使用してエリア被覆率を定量化した。手短に言えば、閾値を調整することによって画像を２値(binary)に変換し、細胞と背景エリアとの間を区別した。粒子分析機能（粒径範囲１０−１０⁵ピクセル）を使用し、細胞によってカバーされた全エリアの一部分を計算した。各クローンの値を６７５μｍ×５３５μｍ全エリアから導き出し、２−４回の独立実験の各々から取られた３つの画像から平均化した。

生物膜
Ａｕ上：４ｃｍ²Ａｕコートスライドを６ウェルプレート中０．１ＯＤ₆₀₀／ｍＬ非誘導性クローンＡ０２（表ＩＩ）でＳＧ−ＢＳＡＴ中でインキュベートし、１２時間室温（ＲＴ）下に揺動させた。次いでＡｕスライドを新鮮ＳＧ−ＢＳＡＴに移し、揺動機上に配置した。３２枚の画像を生物膜生長中のさまざまな時点、すなわち、結合前（ｔ＝０）および１２（移行時）、２４、３６、および４８時間に撮影した。ＣｄＳ上：０．５ｃｍ²研磨ＣｄＳ単結晶を揺動機上で室温（ＲＴ）下に１時間、１ＯＤ₆₀₀／ｍＬ事前誘導クローンＤ０７でインキュベートした。次いで、ＣｄＳを新鮮ＳＧ−ＢＳＡＴを有する６ウェルプレートへ配置した。細胞パターンをピペットの先端を使用してＣｄＳの表面から除去し、この時点（ｔ＝０時間）および２４および４８時間成長時点で５枚の画像を撮影した。

生体分子テンプレート化量子ドット
可溶性ペプチドとしてのＣｄＳクローンを蛍光、光ルミネセンス(photoluminescent)ナノ粒子アセンブリを方向付ける能力について検査した。検査した合成的ペプチドは、ＣｄＳ結合Ｄ０７ｐｅｐクローン（ｂｉｏｔ−ＳＧＧＧＤＶＨＨＨＧＲＨＧＡＥＨＡＤＩ−ｃ、ニューイングランド・ペプチド社（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＰｅｐｔｉｄｅ，Ｉｎｃ．））および陰性対照としてＦＰ−１ペプチド（ｎ−ＨＮＫＨＬＰＳＴＱＰＬＡ−ｃ、ＭＩＴバイオポリマーズ・ラボラトリー（ＭＩＴｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））であった。

ＣｄＳ量子ドットをクローンＤ０７ｐｅｐ由来の選択ペプチドを金属塩と単純に混合することによって水性条件下に室温で形成した。手短に言えば、合成ＣｄＳＤ０７ペプチドおよび陰性対照ＦｅＰｔ結合配列ＦＰ−１を室温下に水中で溶解し、水性ＣｄＣｌ₂と混合した。次いで、水性Ｎａ₂ＳをＣｄおよびＳの等モル濃度が達成されるまで（各々３２５μＭ）、ゆっくりこれら強く攪拌した溶液に添加した。ペプチドのさまざまなモル組成物中で成長した粒子を迅速蛍光視覚化のために長い波長のＵＶ光に露出させた（図７）。増殖条件の調整により、かかる生体分子テンプレート化ナノ粒子のサイズおよび蛍光特性の制御が管理されうる。ベックマン・コールター（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）のＤＵ８００分光光度計を使用して調製された粒子として吸光度スペクトルを得た（図８）。発光スペクトルを３６０ｎｍでの励起によりＰＴＩ蛍光光度計で得た（図８）。

ＩＩ．結果
パニング
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで表示された１０⁹ヒトｓｃＦｖ抗体の非免疫ライブラリー（１３）を最初に単結晶硫化カドミウム（ＣｄＳ）、ＩＩ−ＶＩ半導体に対してパニングした。連続ラウンドのスクリーニング（ｄ１−ｄ７）を１．０ｃｍ²研磨ＣｄＳ単結晶［Ａプレート］で実行し、材料特異的クローンを同定した。ＣｄＳの表面を最初に５ｍｇ／ｍＬＢＳＡを含有するＳＧ（２３）で遮断し、各ラウンド前に非特異的相互作用を制限した。次いで、ＣｄＳを水性緩衝環境下の酵母ライブラリーに１−２４時間露出し、倍地中で洗浄し、光学顕微鏡によって視覚化した（図１Ａ）。次いで、結合酵母をグルコースベースのＳＤ（２３）中にＣｄＳを配置することによって表面を「グローオフ（ｇｒｏｗｏｆｆ）」させるが、これはＡｇａ２に融合したｓｃＦｖの発現を止め、かつ２４時間培養した（図１Ａ、差込み図）。「グローオフ」法は、材料に結合された全クローンの回収を確実にする。ラウンドｄ１−ｄ４はＳＧ−ＢＳＡでスクリーニングされたが、ラウンドｄ５−ｄ７は、トゥイーン２０を含有するＰＢＳ−ＢＳＡＴ中で短時間スクリーニングされ、選択の厳密性を増大した。

比較において、ＣＤ２０細胞外ドメイン、ＣＴＣＯＮ（１３）のフラグメントを発現する対照酵母クローンを図１Ａにおけるライブラリーと同一の条件下にＣｄＳと接触させたが、結合することはできなかった（図１Ｂ）。ＳＤ中で２４時間まで結合細胞をグローオフする試みの後でも、培養はきれいなままであった（図１Ｂ差込み図）。他の対照をラウンド３のサブライブラリーで実行した。ＢＳＡを含まないバッファーのスクリーニングは結果として、ＢＳＡを含むバッファー（データを示さず）に対する材料表面の細胞被覆率の増大をもたらし、クローンのＣｄＳ表面へのＢＳＡ非依存結合および非特異的遮断剤の有用性を示した。また、材料との結合が、誘導培養を使用した場合にＳＤおよびＳＧにおいても確認され、糖分子そのものは結合に影響を及ぼさないことを示した。さらに、酵母栄養成分を欠いたＰＢＳベースのバッファーにおいても結合が確認された（データを示さず）。全体的にこれらの実験は、結合が培地非依存性であるが、表示ライブラリー依存性であることを明らかにした。

次いで、遺伝子発現の制御により細胞の材料との結合を調節する能力を検討した。重要なことには、グルコース（ＳＤ）を含む培地はｓｃＦｖの発現を抑制したが、ガラクトース（ＳＧ）へのスイッチは、以前に示されている抑制状態（２３）に対して約１０００倍の発現を誘導した。ＳＤ中で成長したクローンは、ＳＧ中で成長した同一の培養と比べ結合を示さなかった（図５）。したがって、ＣｄＳの表面との相互作用は、表示抗体フラグメントにより仲介され、栄養的に調節された。

ラウンドｄ７の後、選択結合集団から合計３６の酵母クローンが配列決定された。ＤＮＡが各酵母クローンから単離され、大腸菌で増幅され、通常の方法によって単離され、配列決定された。３つの独自のＣｄＳクローン、Ｄ０１、Ｄ０７、およびＥ０１が同一のＤＮＡ配列のグループ化後に同定され、それぞれ、２６、６、および４倍示された。配列は翻訳され、ＩｇＧＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を使用してコンセンサスＩｇＧＦｖドメイン配列と整列し、そのコンセンサスと異なる残基が同定された（表Ｉ）。次いで、これらのグループに対応するＤＮＡを元のナイーブＥＢＹ１００酵母へトランスフォームし、ＣｄＳとの結合についてクローンを再び検査し、宿主染色体変異による偽陽性を除去した。３つのＣｄＳ結合配列すべてにより、クローン検証結合アッセイにおけるその最初の表現型が再確認された（材料と方法）。結果は、ＣｄＳ表面のエリア被覆率として図２Ａにおいて定量的に示されている。

画像分析ソフトウェアを使用することによって、Ｄ０１はＣｄＳの表面の４８％カバーし、Ｄ０７は５０％カバーし、Ｅ０１は４０％カバーした。六角形にパックされた完全球のフットプリントからの表面エリア被覆率の理論最大値は約９０．７％であった。しかし、酵母はサイズが均一ではなく、それらは芽を有しうるとともに、細胞を移動させる横力はランダムに付着した酵母細胞のパッキングを最大にするには不十分であった。したがって、その２分の１の直径の六角形にパックされた完全球間の平均分離距離に基づき、理論的最大フットプリント被覆率は約４１％に減少した。したがって、Ｄ０７で確認された被覆率は、おそらくランダムに付着した細胞の単層による最大表面被覆率を示す。

表Ｉに示されているように、３つのＣｄＳクローンはすべて完全長ｓｃＦｖのフラグメントであったが、これはＤＮＡ配列の分析時に天然抗体レパートリーに存在するフレームシフト変異由来であったか、またはライブラリーのＰＣＲ構成中に誘導されたと思われた。フェルドハウス（Ｆｅｌｄｈａｕｓ）らは、ライブラリーの６８％が遠位ｃ−ｍｙｃエピトープを発現することを報告し（１３）、したがって、ライブラリーの最大約３分の１がｓｃＦｖ切断を発現しうる。結果として生じるＤ０１、Ｄ０７、およびＥ０１ポリペプチドは、クラスＶ_H６−１、Ｖ_H１−２、およびＶ_H１−２可変重鎖ドメインと１００、９１、および９０％相同を有する４７、７０、および７０アミノ酸の後、それぞれ、天然隣接Ｖ_H配列との類似性を有さない３３、１３、および１３アミノ酸で構成されている。「フレームシフト」アミノ酸の組成物は、主に極性および荷電残基であり、ヒスチジンにおいて顕著に濃縮された。

各ＣｄＳクローン由来の切断変異体を作り（表Ｉ）、結合に必要な部位を決定するためにＣｄＳとの結合について検査した（図２Ａ）。Ｃ末端「フレームシフト」アミノ酸の半分のみをＤ０１から除去したＤ０１Ｉは、ＣｄＳに結合された。全フレームシフト部位の除去（クローンＤ０１Ｈ）は結合を無効にしたが、これはフレームシフト部位が酵母−材料相互作用を仲介するために必要であることを示した。同様に、全Ｃ末端フレームシフトアミノ酸をクローンＤ０７およびＥ０１から除去したＤ０７ＶおよびＥ０１Ｖは、それぞれ、ＣｄＳ結合を仲介する能力を示すことがなかった。すなわち、予想通り、ＣＤＲ２およびＣ末端ペプチド部位（Ｄ０７ＲおよびＥ０１Ｒ）を除去した追加的な切断は、結合を示すことはなかった。したがって、われわれは、抗体フレームワークフラグメントのＣ末端で付着した短いペプチドが、酵母細胞をＣｄＳの表面に保持した結合エネルギーの大部分に寄与すると仮定した。

ペプチドのみが酵母細胞をＣｄＳの表面と結合するのに十分であったかどうかを検査するために、われわれはペプチドのＡｇａ２融合を構成した。ここでペプチドは抗体フレームワークなしに表示され（表Ｉ）、追加の−ＧＧＧ−スペーサーを有するｓｃＦｖがそうであったように（１３）、Ａｇａ２のＣ末端で長いフレキシブル−（Ｇ₄Ｓ）₃ＡＳ−リンカーに直接付着された。これらのペプチドは切断および最初の選択クローンと同時にパニングされ、相対結合効率を決定した（図２Ａ）。Ｄ０７ｐｅｐを発現するクローンはＣｄＳに結合することが可能であり、最初の単離Ｄ０７クローンにおけるフレームシフト部位の重要性を明らかに示した。Ｅ０１ｐｅｐおよびＤ０１ｐｅｐも、一見したところ低い接着強度にもかかわらず、検出可能な結合を示した。親配列と比べペプチドを発現する酵母の表面被覆率の減少は、抗体フレームワークが改善されたディスプレイレベル、またはペプチドに対してより利用しやすい方向を提供することを示した。これらの結果は、Ｅ０１ｐｅｐがＤ０７ｐｅｐよりも弱い結合剤であることも明らかにしたが、これはペプチドが１５個のアミノ酸残基のうち２個のみで違っているため意外であった（ＨＨＨＧＲＨＧＡＥ［Ｑ／Ｈ］Ａ［Ｄ／Ｅ］Ｉ）。

平坦な材料表面上に位置する半径２μｍの硬い平滑な球形の細胞に基づき、われわれは単細胞の表面積の約２．２５％がその材料の５ｎｍ内にあると推定している。細胞あたり約１０⁴−１０⁵の均一に分布されたペプチド（１５、２４）、および表示ペプチドと材料との間の相互作用に５ｎｍ未満の距離が必要であると仮定すると、ほぼ２００−２０００の潜在的に表面相互作用性のポリペプチドがある。したがって、相対結合強度の差は、多重ペプチド−材料相互作用に由来する結合活性効果によって増幅され、または隠されうる。

ＣｄＳクローンの材料特異性
他の技術的に重要な材料を選択し、ＣｄＳ単結晶に対する選択クローンの特異性を検査した。単結晶サファイア（Ａｌ₂Ｏ₃）、エピタキシャル成長ガリウムナイトライド（ＧａＮ）、ガラス上にスパッタコーティングした多結晶性金（Ａｕ）、Ｓｉ／ＳｉＮ上の鉄白金（ＦｅＰｔ）薄膜、およびＣｄＳを同一の条件下にＣｄＳクローンに露出した（材料と方法）。クローンＥ０１は、Ａｌ₂Ｏ₃、ＧａＮ、およびＡｕに対して、これらの材料上での細胞の欠如によって確認されるように、ＣｄＳに対する例外的な特異性を示した（図２Ｂ）。クローンＥ０１は、一部の結合が生じるにもかかわらず、ＦｅＰｔに対するＣｄＳの顕著な選好をも示した。しかし、ＦｅＰｔ薄膜は、明らかに特異的でない仕方で他のクローンに結合することが確認されている。したがって、このシステムは材料特異的タンパク質生体分子を同定するのに適している。

広範囲に適用可能な方法
パニング実験において、この方法の普遍的な有用性を明らかにするために他の材料も使用した。３ラウンドのパニングを、個々のクローンが配列決定される前にＡｌ₂Ｏ₃、ＧａＮ、Ａｕ、ＦｅＰｔ、およびＣｄＳ上で実行した（ｅ１−ｅ３）（材料と方法）。また、ＣＴＣＯＮおよび他の水性培地を使用し、ＣｄＳで述べたのと同じ対照を実行し、結合が、同様の結果が生じた、ディスプレイに依存することを示した。図３は、Ａｌ₂Ｏ₃、ＧａＮ、Ａｕ、およびＦｅＰｔとの選択クローン結合を示す。これらの酵母クローンは、そのそれぞれの材料とのＡｌ₂Ｏ₃、ＧａＮ、Ａｕ、ＦｅＰｔに対するパニングによって同定されたクローンから単離されたＤＮＡでトランスフォームされたナイーブ細胞から作られ、したがって特異的な結合剤である。クローン４Ｈ０１のＡｌ₂Ｏ₃でのＧａＮ（図３Ａ）に対する、クローン４Ｈ０９のＧａＮでのＡｌ₂Ｏ₃（図３Ｂ）に対する、かつクローンＡ０２のＡｕでのＣｄＳ（図３Ｃ）に対する材料特異性、およびクローンＧ０２のＦｅＰｔとの結合の栄養調節（図３Ｄ）も示されている。

意外なことに、１４の完全長ｓｃＦｖ配列のみがラウンドｅ３からの３５０超のＤＮＡ配列から同定されたが、これらはＡｌ₂Ｏ₃では２個の完全長クローン、ＧａＮでは３個のクローン、ＣｄＳでは１個のクローン、ＡｕおよびＦｅＰｔでは０個のクローンへ分類された。２〜２６の配列を代表する残りのグループは、最初のＣｄＳスクリーンで確認されるように主にｓｃＦｖフラグメントであった。約３０％の非選択ライブラリーにおける最初の代表から９６％超までの選択の３ラウンドにおける切断ｓｃＦｖの濃縮は、材料表面のわれわれのパニングにおける完全長クローンに対するバイアスを示す。今後のこのライブラリーからの完全長ｓｃＦｖの同定は、Ｃ末端ｃ−ｍｙｃエピトープタグの存在のために、パニング法を、これや他の細胞ベースのライブラリー（１３、２５）、または磁気ビード濃縮（２６）をスクリーニングするために広範囲に使用される強力な手段であるＦＡＣＳの交互のラウンドと組み合わせることによって強化されうる。

さらに、ＡｕおよびＦｅＰｔをＣｄＳラウンドｄ１−ｄ７と同一の方法でパニングされ、再現性を示した。３６および２３の配列決定されたクローンから、ＡｕまたはＦｅＰｔについて、それぞれ、同定された完全長抗体はなかった。合計３個のＡｕクローン（配列表示１３、５、および２）および４個のＦｅＰｔクローン（配列表示１６、１、１、および１）が、発現プラスミドの単離および再トランスフォーメーション後の結合を与えた。したがって、ＣｄＳ、Ａｕ、およびＦｅＰｔｄ７集団からの配列の１００、５６、および８７％が、ナイーブ宿主細胞における結合を与えることができた。７ラウンドのスクリーニングを通じて生存する偽陽性クローンの能力はおそらく、ＡｕおよびＦｅＰｔが他の材料上に沈殿したことによるものであった。Ａｕはガラス上にコーティングされ、したがってＳｉＯ₂エッジ面が示され、ＦｅＰｔはＳｉＮウエハー上にコーティングされ、したがってＳｉＮおよびおそらくＳｉＯ₂も示された。ＣｄＳは、他方では、非付着単結晶としてパニングにおいて使用されたが、これは目的とする材料以外の表面とのクローン結合による真の結合剤の潜在的な汚染を除去した。われわれは、Ａｕクローンの単結晶Ａｕおよび多結晶Ａｕとの結合の比較し、両方は単位エリアあたり同数の細胞と結合された。

３個のＡｕクローン、Ａ０１、Ａ０２、およびＡ１２、および２個のＦｅＰｔクローン、Ｇ０２およびＧ０４は、ＡｕおよびＦｅＰｔとの真の結合剤として表現型の移動によって確認されたが、それぞれ、追加的に分析された。これらの配列のすべては、停止コドンによって終了されるフレームシフトされたペプチド配列に至るそのＶ_Hドメインにおける変異を包含した（表ＩＩ）。表１および図２ＡにおけるＣｄＳ特異的ポリペプチドについて示されている同様の変異分析法をこれらのＡｕおよびＦｅＰｔクローンで行った。フレームシフト部位のみを除去するＡｕおよびＦｅＰｔクローンの切断は、完全に結合を無効にすることはなかった（図６）。さらに、ＣｄＳクローンと対照的に、フレームシフト配列由来のＣ末端ペプチドは、酵母を材料と結合するには不十分であった。したがって、ｓｃＦｖ抗体フレームワークは、結合への直接の寄与のために、または好ましい立体構造におけるＣ末端ペプチドの提示のために重要であると思われた。

材料特異的ディスプレイの用途
ｓｃＦｖおよびフラグメントの酵母ディスプレイを使用し、細胞−材料特異的相互作用の潜在的な用途を明らかにした（図４）。クローンＡ０２、金結合フラグメントをＳＤ中で成長させ、Ａｕコートスライドと接触させた（材料と方法）。ｔ＝０では、予想通り、細胞は結合されなかった。しかし、室温（ＲＴ）下の４８時間にわたって、細胞はＡｕに結合され、継続して成長し、結合し、かつ広がり、スライドを均一に完全に覆った（図４Ａ）。この生きたコーティング、もしくは生物膜は、障害によって除去された部位に接着し、かつ成長でき、したがって自己回復性であった。ＣｄＳクローンＤ０７を使用し、かかる生物膜コーティングの成長および自己回復の能力を示した（図４Ｂ）。ＳＧにおける３週間を超えた後でも、生物膜はＣｄＳに付着されたままであり、再生することができた。かかる自己回復生物膜は、防食、バイオレメディエーション、医療（２７）、または他の用途（２８）に有用でありうる。

特定の組成物による表面の部位の検出および同定に役立つ選択クローンの使用を明らかにした。例えば、クローンＧ０２、ＦｅＰｔ結合剤を使用し、ＦｅおよびＰｔを含有するヘテロ構造の部位を覆う細胞によって確認されるが、Ｓｉ含有部位では確認されない、ＳｉＮ／ＳｉＯ₂上のＦｅＰｔを検出した（図４Ｃ）。同様に、図２Ｂに示されているように、ＣｄＳクローンは、ＣｄＳ、Ａｕ、ＧａＮ、およびＡｌ₂Ｏ₃が同じ培養フラスコに配置されていた場合にはＣｄＳのみに結合した。したがって、これらの選択タンパク質生体分子は、材料特異的プローブとして機能しうるとともに、細胞をヘテロ表面上の特定の位置へ接着させる。

テンプレーティング
選択生体分子を使用し、半導体ナノ粒子の増殖をテンプレート化もした。クローンＤ０７ｐｅｐ由来の合成的ペプチドを金属塩の溶液と単純に混合することによって水性条件下の室温でＣｄＳ量子ドットを形成した。ペプチドのさまざまなモル組成物中で成長した粒子を迅速蛍光視覚化のために長い波長のＵＶ光に露出させた（図７）。Ｄ０７ペプチド成長粒子は、４００−４５０ｎｍと対応する蛍光ピーク（最大約５００ｎｍ）との間の吸光前面(absorption fronts)を示し、これは量子閉じ込め効果を示すナノ粒子に特有である（図８）。あるいは、対照ペプチドＦＰ−１で成長された粒子は、バルクＣｄＳの５１５ｎｍに近い弱い吸光前面を示し、あるとすれば、弱い蛍光のみを示す（図８）。増殖条件の同調により、かかる生体分子のテンプレート化ナノ粒子のサイズおよび蛍光特性に対する良好な対照が達成されうる。

競合結合
図２は、ＣｄＳ特異的酵母結合を仲介するために必要かつ十分であるＡｇａ２と融合されたＣｄＳペプチド配列を示す。また、同様のＣｄＳ結合研究が、遊離Ｄ０７ペプチドの存在下にこれらの酵母クローンで実行された。手短に言えば、Ａｇａ２融合としてＤ０７またはＤ０７ｐｅｐを表示する酵母クローン（表１）を単結晶ＣｄＳ±３７μＭ遊離Ｄ０７ペプチドとともに培地（１．５ＯＤ／ｍｌ）中でインキュベートし、倍地中で洗浄し、光学顕微鏡によって撮像した。両方の場合、遊離ペプチドは、ＣｄＳとの酵母の結合を遮断し、結合の機序に関する追加的な情報が得られた。

最後に、本発明は以下の技術文献を参照して実行されうる。

文献
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５．リー、Ｓ．Ｗ．（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｗ．）、マオ、Ｃ．（Ｍａｏ，Ｃ．）、フリン、Ｃ．Ｅ．（Ｆｌｙｎｎ，Ｃ．Ｅ．）およびベルヒャー、Ａ．Ｍ．（Ｂｅｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｍ．）、（２００２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９６、８９２−５頁。
６．ナイク、Ｒ．Ｒ．（Ｎａｉｋ，Ｒ．Ｒ．）、ストリンガー、Ｓ．Ｊ．（Ｓｔｒｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｊ．）、アガルワル、Ｇ．（Ａｇａｒｗａｌ，Ｇ．）、ジョーンズ、Ｓ．Ｅ．（Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｅ．）およびストーン、Ｍ．Ｏ．（Ｓｔｏｎｅ，Ｍ．Ｏ．）、（２００２年）ＮａｔＭａｔｅｒ１、１６９−７２頁）。
７．マオ、Ｃ．（Ｍａｏ，Ｃ．）、フリン、Ｃ．Ｅ．（Ｆｌｙｎｎ，Ｃ．Ｅ．）、ハイフースト、Ａ．（Ｈａｙｈｕｒｓｔ，Ａ．）、スウィーニー、Ｒ．（Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｒ）、チ、Ｊ．（Ｑｉ，Ｊ．）、ジョルジオ、Ｇ．（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ｇ．）、アイバーソン、Ｂ．（Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｂ．）およびベルヒャー、Ａ．Ｍ．（Ｂｅｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｍ．）、（２００３年）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１００、６９４６−５１頁。
８．ワング、Ｓ．（Ｗａｎｇ，Ｓ．）、ハンプレイ、Ｅ．Ｓ．（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ，Ｅ．Ｓ．）、チャン、Ｓ．Ｙ．（Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．Ｙ．）、デルドコ、Ｄ．Ｆ．（Ｄｅｌｄｕｃｏ，Ｄ．Ｆ．）、ルスティク、Ｓ．Ｒ．（Ｌｕｓｔｉｇ，Ｓ．Ｒ．）、ワング、Ｈ．（Ｗａｎｇ，Ｈ．）、パーカー、Ｋ．Ｎ．（Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．Ｎ．）、リゾ、Ｎ．Ｗ．（Ｒｉｚｚｏ，Ｎ．Ｗ．）、サブラモニー、Ｓ．（Ｓｕｂｒａｍｏｎｅｙ，Ｓ．）、チャン、Ｙ．Ｍ．（Ｃｈｉａｎｇ，Ｙ．Ｍ．）およびヤゴタ、Ａ．（Ｊａｇｏｔａ，Ａ．）（２００３年）ＮａｔＭａｔｅｒ２、１９６−２００頁。
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１２．ブラーデン、Ｂ．Ｃ．（Ｂｒａｄｅｎ，Ｂ．Ｃ．）、ゴールドバウム、Ｆ．Ａ．（Ｇｏｌｄｂａｕｍ，Ｆ．Ａ．）、チェン、Ｂ．Ｘ．（Ｃｈｅｎ，Ｂ．Ｘ．）、キルヒナー、Ａ．Ｎ．（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ，Ａ．Ｎ．）、ウィルソン、Ｓ．Ｒ．（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓ．Ｒ．）およびエアランガー、Ｂ．Ｆ．（Ｅｒｌａｎｇｅｒ，Ｂ．Ｆ．）（２０００年）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９７、１２１９３−７頁。
１３．フェルドハウス、Ｍ．Ｊ．（Ｆｅｌｄｈａｕｓ，Ｍ．Ｊ．）、ジーゲル、Ｒ．Ｗ．（Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．Ｗ．）、オプレスコ、Ｌ．Ｋ．（Ｏｐｒｅｓｋｏ，Ｌ．Ｋ．）、コールマン、Ｊ．Ｒ．（Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｊ．Ｒ．）、フェルドハウス、Ｊ．Ｍ．（Ｆｅｌｄｈａｕｓ，Ｊ．Ｍ．）、ヤン、Ｙ．Ａ．（Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．Ａ．）、コクラン、Ｊ．Ｒ．（Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｊ．Ｒ．）、ハインツェルマン、Ｐ．（Ｈｅｉｎｚｅｌｍａｎ，Ｐ．）、コルビー、Ｄ．（Ｃｏｌｂｙ，Ｄ．）、スゥェアズ、Ｊ．（Ｓｗｅｒｓ，Ｊ．）、グラフ、Ｃ．（Ｇｒａｆｆ，Ｃ．）、ワイリー、Ｈ．Ｓ．（Ｗｉｌｅｙ，Ｈ．Ｓ．）およびウィットラップ、Ｋ．Ｄ．（Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．）（２００３年）ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２１、１６３−７０頁。
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３２．フリン、Ｃ．Ｅ．（Ｆｌｙｎｎ，Ｃ．Ｅ．）、マオ、Ｃ．（Ｍａｏ，Ｃ．）、ハイフルスト、Ａ．（Ｈａｙｈｕｒｓｔ，Ａ．）、ウイリアムズ、Ｊ．Ｌ．（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｌ．）、ジョルジオ、Ｇ．（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ｇ．）、アイバーソン、Ｂ．（Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｂ．）およびベルヒャー、Ａ．Ｍ．（Ｂｅｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｍ．）、（２００３年）Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．１３、２４１４−２４２１頁。
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３４．チアパロン、Ｍ．（Ｃｈｉａｐｐａｌｏｎｅ，Ｍ．）、バト、Ａ．（Ｖａｔｏ，Ａ．）、テデスコ、Ｍ．Ｂ．（Ｔｅｄｅｓｃｏ，Ｍ．Ｂ．）、マルコリ、Ｍ．（Ｍａｒｃｏｌｉ，Ｍ．）、ダビデ、Ｆ．（Ｄａｖｉｄｅ，Ｆ．）およびマルチノイア、Ｓ．（Ｍａｒｔｉｎｏｉａ，Ｓ．）（２００３年）ＢｉｏｓｅｎｓＢｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ１８、６２７−３４年。
３５．ロマノス、Ｍ．Ａ．（Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．）、スコラー、Ｃ．Ａ．（Ｓｃｏｒｅｒ，Ｃ．Ａ．）およびクレア、Ｊ．Ｊ．（Ｃｌａｒｅ，Ｊ．Ｊ．）（１９９２年）Ｙｅａｓｔ８、４２３−８８頁。

追加の文献が米国特許第６，３３１，３９１号明細書の３９−４１欄にも引用されており、これは本発明を実施する当業者によって使用されうる。

上述の発明は理解の明確さのための説明図および実施例によって詳細に述べられているが、発明の開示に照らし、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく一定の変更および修正が行われうることが当業者には容易に理解されるであろう。

表Ｉ．単離ＣｄＳ結合配列および設計変異体

^aＡｇａ２のＣ末端で−（Ｇ₄Ｓ）₃ＡＳ−リンカーと融合。
^b太字の残基は、ＩｇＢＬＡＳＴを使用することにより隣接Ｖ_Hコンセンサス配列と異なる。
^cＡｇａ２のＣ末端で−（Ｇ₄Ｓ）₃ＡＳＧＧＧ−リンカーと直接融合。

表ＩＩ．選択ＡｕおよびＦｅＰｔ結合配列および設計変異体

^aＡｇａ２のＣ末端で−（Ｇ₄Ｓ）₃ＡＳ−フレキシブルリンカーと融合。
^b太字の残基は、ＩｇＢＬＡＳＴを使用することにより隣接Ｖ_Hコンセンサス配列と異なる。
^cＡｇａ２のＣ末端で−（Ｇ₄Ｓ）₃ＡＳＧＧＧ−リンカーと直接融合。

ＣｄＳに結合された酵母ライブラリー。（Ａ）パニングラウンドｄ３後の単結晶ＣｄＳ［Ａプレート］に結合された表面表示ｓｃＦｖ抗体を発現する酵母ライブラリー。（Ｂ）ｓｃＦｖライブラリーの代わりにＣＤ２０細胞外ドメインを発現する酵母対照クローンは単結晶ＣｄＳに結合することはない。透過光学顕微鏡像はサイズが約２６０μｍ²であった。差込み図は、ＣｄＳに結合された単一出芽酵母細胞、および対応するＣｄＳ結晶がＳＤにおいてインキュベートされた２４時間後の酵母培養を示す。ＣｄＳとの細胞結合の定量化。（Ａ）細胞によって覆われた表面積パーセントがＣｄＳに結合された単離クローンおよび設計変異株（表Ｉ）の画像から計算された。親クローンは濃灰色の棒として、変異株は薄灰色の棒として示す。（Ｂ）材料のさまざまな収集物、単結晶ＣｄＳ、ガラス上に蒸着したＡｕ、薄膜ＦｅＰｔ、単結晶Ａｌ₂Ｏ₃、およびエピタキシャル成長ＧａＮとの結合が試験されたＣｄＳクローンＥ０１の結果をＣｄＳに正規化した。記載値は多重実験から取られた画像の幾何平均±標準偏差である。さまざまな材料に対するパニングによって単離された結合クローンの例。パニングラウンドｅ３から同定された配列は酵母において発現された。（Ａ）４Ｈ０１、完全長ｓｃＦｖ抗体、ＧａＮ上のＡｌ₂Ｏ₃に選択的に結合。（Ｂ）４Ｈ０９、完全長ｓｃＦｖ抗体、Ａｌ₂Ｏ₃上のＧａＮに選択的に結合。（Ｃ）Ａ０２、ｓｃＦｖフラグメント（表ＩＩ）、ＣｄＳ上のＡｕに選択的に結合。（Ｄ）Ｇ０２、ｓｃＦｖフラグメント（表ＩＩ）、表示された場合の結合ＦｅＰｔ（ＯＮ）、ただし発現がグルコースによって示された場合は非結合（ＯＦＦ）。光学顕微鏡像は約３４０μｍ×２６０μｍであった。新規の材料相互作用タンパク質を発現する酵母の応用。（Ａ）生物膜被覆Ａｕ表面は２日間にわたる酵母クローンＡ０２を成長させることによって作られた。（Ｂ）ＣｄＳクローンＤ０１を発現する結合細胞の選択部はｔ＝０でのＣｄＳの表面源から除去された。２４時間の成長後、細胞は除去された領域に結合することが確認された。４８時間までに生物膜は完全に自己回復した。（Ｃ）材料特異的酵母による金属絶縁ヘテロ構造の標識化。クローンＧ０２は、ＳｉＮおよびＳｉＯ₂上のＦｅＰｔに選択的に結合する。各画像にスケール棒が示されている。結合の遺伝的調節。ＣｄＳ単結晶に対するパニングによって選択された酵母クローンのｄ７集団をグルコース培地において成長させた。（Ａ）抗体ライブラリー発現なしに、細胞はＣｄＳ単結晶に結合することはない。（Ｂ）相互作用を示すＣｄＳ結合ガラクトース培地（ＳＧ）へスイッチされた同じ細胞は、ライブラリー発現に依存した。透過光学顕微鏡像はサイズが約５４０μｍ×５４０μｍであった。ＡｕまたはＦｅＰｔとの単離クローン対変異体の相対結合。Ａｕ（Ａ）またはＦｅＰｔ（Ｂ）に結合された単離クローンおよび設計変異体（表ＩＩを参照）の画像を使用し、Ａｕ表面上に結合した細胞の数を計算した。変異体クローン（薄灰色棒）の細胞結合数をそのそれぞれの親クローン（濃灰色棒）に対して正規化した。記載値は多重実験から取られた画像の幾何平均±標準偏差である。生体分子テンプレート化ＣｄＳナノ粒子の蛍光。ＵＶ光源への曝露と同時に、金属塩と混合された合成Ｄ０７ペプチド（ｂｉｏｔ−ＳＧＧＧＤＶＨＨＨＧＲＨＧＡＥＨＡＤＩ−ｃ，）による試料（中央）からは強い蛍光が確認されたが、ペプチドＤ０７単独または金属塩単独（左）からは確認されなかった。金属塩と混合された対照ペプチドＦＰ−１（ｎ−ＨＮＫＨＬＰＳＴＱＰＬＡ−ｃ）（右）は、１：１で混合されるとわずかな蛍光を生じさせ、金属と１：１０で混合されると蛍光を生じさせなかった。ペプチドおよび金属塩の濃度は図に示されている。すべての反応は室温、水中の標準気圧下に行われた。Ｄ０７ペプチドまたは対照ペプチドＦＰ−１の存在下に成長したＣｄＳナノ粒子の吸光度および発光スペクトル。Ｄ０７ペプチド成長粒子は、４００−４５０ｎｍと対応する蛍光ピーク（最大約５００ｎｍ）との間の吸光前面を示し、これは量子閉じ込め効果を示すナノ粒子に特有である。あるいは、対照ペプチドＦＰ−１で成長された粒子は、バルクＣｄＳの５１５ｎｍに近い弱い吸光前面を示し、あるとすれば、弱い蛍光のみを示す。濃度は３２５ｕＭ（比＝１０）〜３２ｕＭ（比＝１）の比範囲で示されている。

Claims

表面を有する固体材料に選択的に結合する複数の真核細胞を含む真核細胞組成物。
前記真核細胞が、酵母、昆虫、植物、または哺乳類細胞である、請求項１に記載の組成物。
前記真核細胞が、表面を有する固体材料に選択的に結合する生体分子を含む酵母細胞である、請求項１に記載の組成物。
前記真核細胞が、表面を有する固体材料に選択的に結合するぺプチド配列を含む酵母細胞である、請求項１に記載の組成物。
表面を有する前記固体材料が、表面を有する結晶性材料、無機材料、半導体材料、金属材料、磁気材料、セラミック材料、有機材料、またはポリマー材料である、請求項１に記載の組成物。
表面を有する固体材料に特異的に結合する真核細胞、および表面を有する前記固体材料に特異的に結合することがない真核細胞から本質的に成る真核細胞組成物。
前記特異的に結合する真核細胞が、酵母、昆虫、植物、または哺乳類細胞である、請求項６に記載の組成物。
前記特異的に結合する真核細胞が、表面を有する固体材料に特異的に結合する生体分子から本質的に成る、請求項６に記載の組成物。
前記真核細胞が酵母細胞であり、表面を有する前記固体材料が表面を有する結晶性材料、無機材料、半導体材料、金属材料、磁気材料、セラミック材料、有機材料、またはポリマー材料である、請求項６に記載の組成物。
表面を有する固体材料と選択的に結合する１つまたはそれ以上の生体分子を含む宿主真核細胞。
前記１つまたはそれ以上の生体分子がペプチドまたはタンパク質を含む、請求項１０に記載の細胞。
表面を有する前記固体材料が無機または有機材料である、請求項１０に記載の細胞。
前記細胞が哺乳類または酵母細胞であり、かつ表面を有する前記固体材料が表面を有する結晶性材料、無機材料、半導体材料、金属材料、磁気材料、セラミック材料、有機材料、またはポリマー材料である、請求項１０に記載の細胞。
表面を有する固体材料に選択的に結合されている１つまたはそれ以上の真核細胞を含む細胞被覆材料。
前記真核細胞が酵母、昆虫、植物、または哺乳類細胞である、請求項１４に記載の材料。
前記真核細胞が、表面を有する固体材料に選択的に結合されている生体分子を含む酵母細胞である、請求項１４に記載の材料。
表面を有する前記固体材料が、表面を有する結晶性材料、無機材料、半導体材料、金属材料、磁気材料、セラミック材料、有機材料、またはポリマー材料である、請求項１４に記載の材料。
前記細胞被覆材料が自己回復細胞被覆材料である、請求項１４に記載の材料。
細胞ディスプレイライブラリーからの生体分子を固体材料表面に選択的に結合する方法であって、
真核組合せ細胞ディスプレイライブラリーを提供し、前記ライブラリーが複数の発現生体分子を含むステップと、
表面を有する固体材料を提供するステップと、
前記細胞ディスプレイライブラリーを、結果として前記真核細胞ディスプレイライブラリーからの複数の発現生体分子の、前記表面への選択的結合をもたらす条件下に表面を有する前記固体材料と接触させるステップと、
を含む方法。
前記組合せ細胞ディスプレイライブラリーが、酵母、昆虫、植物、または哺乳類細胞ディスプレイライブラリーである、請求項１９に記載の方法。
前記複数の生体分子が複数のタンパク質またはペプチドである、請求項１９に記載の方法。
表面を有する前記固体材料が、表面を有する結晶性固体材料、無機固体材料、半導体材料、金属材料、磁気材料、セラミック材料、有機材料、またはポリマー材料である、請求項１９に記載の方法。
前記ライブラリーの発現を調節するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
表面を有する前記固体材料に選択的に結合する発現生体分子を単離するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
粒子固体材料を成長させる方法であって、前記固体粒子材料の１つまたはそれ以上の前駆体試薬を、前記固体粒子材料が１つまたはそれ以上の真核組合せディスプレイライブラリーメンバーの存在下に形成される条件下、固体粒子材料への特異的結合のために選択される１つまたはそれ以上の真核細胞組合せディスプレイライブラリーメンバーと混合するステップを含む方法。
前記固体粒子材料がナノ粒子材料である、請求項２５に記載の方法。
前記固体粒子材料が無機、有機、磁気、半導体、または金属粒子材料である、請求項２５に記載の方法。
粒子固体材料を成長させる方法であって、
真核細胞ディスプレイライブラリーからの固体材料に選択的に結合する生体分子を同定するステップと、
前記固体材料の１つまたはそれ以上の前駆体試薬を、前記固体材料が粒子固体材料として形成される条件下に前記生体分子と混合させるステップと、
を含む方法。
前記真核細胞ディスプレイライブラリーが酵母または哺乳類細胞ディスプレイライブラリーであり、かつ前記生体分子がペプチドまたはタンパク質である、請求項２８に記載の方法。
前記固体材料が無機材料である、請求項２８に記載の方法。