CN1938041A

CN1938041A - 流感病毒感染抑制剂

Info

Publication number: CN1938041A
Application number: CNA2004800427656A
Authority: CN
Inventors: 佐藤智典
Original assignee: Glycomedics Inc
Current assignee: Glycomedics Inc
Priority date: 2004-03-09
Filing date: 2004-03-09
Publication date: 2007-03-28
Also published as: JPWO2005084694A1; US20090098195A1; CA2559067A1; WO2005084694A1; EP1728515A1; EP1728515A4

Abstract

本发明涉及提供一种含有唾液酸半乳糖基结合肽(例如神经节苷脂GM3结合肽)作为活性成分的流感病毒感染抑制剂。更具体地说，本发明提供含有以下(a)或(b)所示唾液酸半乳糖基结合肽作为活性成分的流感病毒感染抑制剂：(a)具有SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列的肽；(b)具有通过从SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列中删除、取代或添加了一个或几个氨基酸从而得到的氨基酸序列并具有唾液酸半乳糖基团结合活性的肽。

Description

流感病毒感染抑制剂

技术领域

本发明涉及含有唾液酸半乳糖结合肽，例如神经节苷脂GM3结合肽作为活性成分的流感病毒感染抑制剂。

背景技术

细胞表面的糖缀合物，例如糖脂、糖蛋白和蛋白聚糖的寡糖是胞外分子识别的靶分子。这种寡糖与细胞特异性结合过程相关(参考文献(1)、(2))。熟知唾液酸半乳糖(NeuAc-Gal)结构是细菌毒素、病毒、内皮细胞等的受体。(参考文献(3)-(5))。称为神经节苷脂的含唾液酸的鞘糖脂与取决于它们的碳水化合物部分的重要生物学功能相关(参考文献(6)-(8))。在过去10年间，对膜组分，例如脂质、糖脂与其它组分的定位和分布的研究致力于它们特性和功能之间的关系(参考文献(9)-(12))。大多数鞘糖脂以洗涤剂不可溶膜与信号转导分子从细胞中提取(参考文献(13)-(15))。已发现细胞刺激和信号转导改变了富含糖脂的亚组分。含有糖脂的膜重建为气-水界面单层(参考文献(16)-(18))。Sato等报道说凝集素结合模式取决于鞘糖脂在脂质单层中的分布(参考文献(19)-(22))。关于膜中富含糖脂的微结构域的结构和功能信息有助于搞清细胞表面糖链的生物学作用。许多结合糖的蛋白质，例如凝集素和抗体用于标记糖缀合物，从而可应用于碳水化合物相关疾病的治疗(参考文献(23)、(24))。

开发了选择特异性结合靶分子的肽的生物选择系统(噬菌体展示文库)(参考文献(25)、(26))。利用该系统有助于选择各种糖缀合物、单糖(参考文献(27)、(28))、肿瘤相关糖抗原(参考文献(29)-(32))、唾液酸Lewis^x(参考文献(33)、(34))、鞘糖脂(参考文献(35)、(36))、蛋白聚糖(参考文献(37)-(39))和多糖(参考文献(40)、(41))。在以前的论文中，本申请的发明人进行了神经节苷脂GM1(Galβ1→3GalNAcβ1→4(NeuAcα2→3)Galβ1→4Glcβ1→1’Cer)结合肽的选择(参考文献(35))。所选择的肽序列显示特异性结合GM1，从而抑制了霍乱毒素与GM1结合。

流感病毒在它们的包膜中具有两种分别在宿主细胞的病毒感染和病毒出芽中起重要作用的糖蛋白：血凝素(HA)和唾液酸酶(神经氨酸酶)。血凝素识别存在于动物宿主细胞膜上作为受体的含唾液酸的糖链，特异性结合这种受体，从而导致流感病毒的胞内胞吞作用。唾液酸酶是一种破坏受体的酶，当病毒颗粒出芽或从宿主细胞释放时，其切断宿主细胞膜或病毒本身膜上的唾液酸残基。

目前，利用预防性/治疗性药物抵御流感病毒感染的疗法选择很少。疫苗用于预防感染，但因需要注射而使其范围有限。近来，唾液酸酶(一种流感病毒膜蛋白)抑制剂作为治疗性药物应用于临床。认为唾液酸酶抑制剂可抑制流感病毒在胞内繁殖后的胞外释放。因此，唾液酸酶抑制剂不是有效的预防性药物。此外，因为它应在感染1或2天后立即给予，其应用受限制。

基于流感病毒感染过程中血凝素与宿主细胞上存在的含唾液酸糖链结合的事实，发明人以前通过上述噬菌体展示文库方法筛选了血凝素结合肽，报道该肽能通过防止流感病毒的胞内侵入来抑制其感染(日本公开专利申请号2002-284798，WO0/59932)，揭示了这些肽可用于预防流感病毒感染。

发明内容

本发明涉及含有唾液酸半乳糖结合肽作为活性成分的流感病毒感染抑制剂，该肽，例如神经节苷脂GM3结合肽可结合唾液酸半乳糖基团(具有唾液酸半乳糖结构的基团)。

如上所述，当流感病毒膜中的血凝素识别并结合细胞上含有唾液酸的糖链时，该病毒感染宿主细胞。本发明涉及通过阻断宿主细胞上存在的血凝素受体来抑制流感病毒感染。具体地说，本发明涉及利用与细胞表面存在的唾液酸半乳糖基团结合的肽来阻断流感病毒与宿主细胞的结合，从而抑制其感染。

本发明人以前发现与流感病毒血凝素结合的血凝素结合肽能抑制流感病毒感染。这些肽通过与流感病毒膜中存在的血凝素结合来抑制流感病毒与宿主细胞结合。

虽然血凝素结合肽能作用于流感病毒从而防止它们感染，但其作用的前提是流感病毒存在。这提示，临床应用时，在已经证实流感病毒感染后给予上述肽时有效，这与采用唾液酸酶抑制剂的情况一样。因此，期望这些肽可有效地作为治疗性药物而非预防性药物。基于可给予作用于活机体的化合物而无论是否存在流感病毒感染从而产生显著的预防作用的信念，本发明人努力研究了抑制流感病毒感染的方法，得到可通过阻断与存在于流感病毒膜中的血凝素结合的宿主细胞上的受体来抑制流感病毒感染的结论。在该方法中，即使流感病毒未感染对象，也可期望通过预先阻断宿主细胞上的受体而获得预防作用。此外，考虑到生物相容性、半衰期、易于生产等，也得出分子量相当低的化合物合适的结论。然而，尽管发现唾液酸半乳糖在流感病毒感染入动物细胞的过程中起受体的作用，能作用于唾液酸半乳糖从而抑制流感病毒感染的化合物以前未见报道；传统观点认为一种化合物难以阻断受体。本发明人将注意力集中于一种流感病毒的宿主细胞表面受体—唾液酸半乳糖的结构，检测了含有10个以下氨基酸的肽与包含在唾液酸半乳糖结构中的神经节苷脂GM3(NeuAcα2→3Galβ→4Glcβ1→1’Cer)结合的效力。发明人利用噬菌体展示法通过靶向在细胞表面高度表达神经节苷脂GM3的小鼠B16黑色素瘤细胞得到了与神经节苷脂GM3结合的肽。发明人认真检测了所获得的神经节苷脂GM3-结合肽，出乎意料地发现这些肽可独自防止流感病毒与细胞表面受体结合并侵入细胞。

因此，本发明包括以下内容：

(1)一种含有唾液酸半乳糖结合肽作为活性成分的流感病毒感染抑制剂；

(2)如(1)所述的流感病毒感染抑制剂，其中所述唾液酸半乳糖结合肽是神经节苷脂GM3结合肽；

(3)如(1)所述的流感病毒感染抑制剂，其含有以下(a)或(b)的唾液酸半乳糖结合肽作为活性成分：

(a)具有SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列的肽；

(b)具有从SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列中删除、取代或添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列并具有神经节苷脂GM3结合活性的肽；

(4)如(1)到(3)中任一项所述的流感病毒感染抑制剂，其中所述唾液酸半乳糖结合肽被烷基化或脂质化(lipidized)；

(5)如(1)到(3)中任一项所述的流感病毒感染抑制剂，其中所述唾液酸半乳糖结合肽包含于脂质体中；

(6)如(1)到(5)中任一项所述的流感病毒感染抑制剂，其中所述流感病毒选自甲型、乙型和丙型流感病毒；

(7)如(1)到(5)中任一项所述的流感病毒感染抑制剂，其中所述流感病毒是禽流感病毒或猪流感病毒；

(8)如(1)到(7)中任一项所述的流感病毒感染抑制剂，还含有药学上可接受的运载体；

(9)一种预防或治疗流感的方法，包括给予非人动物(1)到(8)中任一项所述流感病毒抑制剂的步骤；

(10)如(9)所述预防或治疗流感的方法，其中所述非人动物是鸟或猪；

(11)一种预防或治疗流感的方法，包括制备(1)到(8)中任一项所述流感病毒抑制剂和给予对象该抑制剂的步骤；

(12)如(11)所述预防或治疗流感的方法，其中所述对象选自人、鸟和猪；

(13)(1)到(8)中任一项所述流感病毒抑制剂用于预防或治疗流感；和

(14)以下(a)或(b)所示神经节苷脂GM3结合肽在制备流感病毒抑制剂中的应用：

(a)具有SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列的肽；

附图简述

图1显示了与固定于石英-水晶微量天平上的神经节苷脂GM3单层结合的噬菌体的时间曲线。

图2显示了噬菌体克隆与NeuAc-Gal结构的结合选择性的检测结果。

图3显示了通过流式细胞术检测噬菌体克隆与小鼠黑色素瘤B16细胞结合的结果。

图4显示了通过c01-噬菌体检测唾液酸寡糖识别的结果。

图5显示合成肽与GM3的结合量是肽浓度的函数。

图6显示了通过含有肽的脂质体抑制流感病毒感染MDCK细胞。

图7显示了通过含有神经节苷脂GM3-结合肽的脂质体和含有血凝素结合肽的脂质体抑制流感病毒感染MDCK细胞。

优选实施方案描述

本发明涉及用于预防和治疗流感病毒感染并含有唾液酸半乳糖结合肽，例如神经节苷脂GM3-结合肽作为活性成分的感染抑制剂。

当流感病毒透过细胞时，具有唾液酸和半乳糖相结合结构的唾液酸半乳糖基团作为血凝素的受体。因此，唾液酸半乳糖结合肽能通过防止流感病毒经唾液酸半乳糖基团与细胞结合来抑制流感病毒感染入细胞。具有唾液酸半乳糖基团的化合物的例子包括神经节苷脂GM3。本发明的唾液酸半乳糖结合肽包括神经节苷脂GM3结合肽。

应注意到本发明的肽不受具体限制，只要它能结合唾液酸半乳糖基团；只要细胞在其表面表达唾液酸半乳糖基团，即使其表面不表达神经节苷脂GM3，该肽也能抑制流感病毒感染入细胞。

本发明的感染抑制剂要抑制其感染的流感病毒是直径约100nm的球形RNA病毒，其属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，它们的类型不受限制。本发明的流感病毒抑制剂能抑制流感病毒感染而无论该流感病毒的类型，因为它阻断了流感病毒所识别的细胞上的受体。流感病毒的类型包括甲型(H2N2、H3N2、H1N1等)、乙型、丙型、人分离物、禽类分离物(禽流感病毒(H5N1、H7N2、H7N7等))、猪分离物(猪流感病毒)和其它哺乳动物分离物(例如，马分离物)。该流感病毒抑制剂能广泛抑制所有这些类型的流感病毒。一些流感病毒依照血凝素和唾液酸酶(神经氨酸)的血清型而具有许多亚型。本发明的流感病毒抑制剂能抑制流感病毒感染而无论其类型或亚型。

此外，本发明的流感病毒感染抑制剂可用于任何动物，只要它是流感病毒能感染的动物，因此该抑制剂可抑制流感病毒感染人、鸟、猪等。

如下所述，可利用已知的噬菌体展示文库通过噬菌体展示文库法来选择本发明的唾液酸半乳糖结合肽。例如，可通过Scott和Smith(Scott，J.M.和Smith，G.P.，Science， 249，386-390，(1990)；Smith，G.P.和Scott，J.K.，Methods inEnzymology， 217，228-257，(1993))的方法进行噬菌体展示文库法。或者，可按照日本公开专利申请号2000-253900和2002-284798进行。

采用的噬菌体展示文库可购得。

首先，将随机DNA序列插入已知的噬菌体展示文库，它们应构建为使具有随机氨基酸序列的肽能表达在噬菌体外包膜表面上。如实施例中所示，在此情况中，所用的展示噬菌体是，例如，通过将随机DNA插入噬菌体包衣蛋白pIII基因而构建的能在噬菌体外包膜表面表达随机十五肽的噬菌体。。通过利用展示噬菌体，可获得其中每种表达约10⁸类肽的噬菌体。

然后，用神经节苷脂GM3淘选随机表达肽的噬菌体。就这种淘选而言，可在合适的基板(神经节苷脂GM3单层组合基板)上制备神经节苷脂GM3单层，然后可选择与该单层结合的噬菌体。使选出的噬菌体感染入大量培养的、分离并纯化的大肠杆菌以获得与神经节苷脂GM3结合的表达肽的噬菌体。通过重复该淘选操作数次，可选择并集中能特异性结合神经节苷脂GM3的能表达肽的噬菌体。

然后，通过从所选择的噬菌体中提取DNA并测序，可获得与唾液酸半乳糖基团特异性结合的肽。可通过已知的方法，例如Maxam-Gilbert方法利用商业购得的测序仪进行DNA测序。

当以此方式利用单层时，由于表面上只有糖链伸出，可有效地选择唾液酸半乳糖结合肽。应注意当制备了单层并选择了表达与神经节苷脂GM3结合的肽的噬菌体，可利用称为微量天平的石英晶体振荡器。利用石英晶体振荡器，可以频率变化来检测与噬菌体结合所致的石英晶体振荡器上金电极表面的重量变化。可根据，例如Biochim.Biophys.Acta.，1138，82-92，(1998)或Biochim.Biophys.Acta，1285，14-20，(1996)所述的方法进行基于石英晶体振荡器的方法。具体地说，振荡器上电极的表面与在凹槽中用作水面下相(water subphase)的Tris缓冲盐水(TBS)上制备的单层表面水平连接并振荡。当振荡稳定后，加入噬菌体文库溶液并测量对应于噬菌体结合的振荡频率。从而可检测结合存在与否。

唾液酸半乳糖结合肽的例子包括具有SEQ ID NO.1和2所示15聚体氨基酸序列的神经节苷脂GM3结合肽。这些肽中的每一种可用作本发明流感病毒感染抑制剂的活性成分。或者，含有从SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列中删除、取代或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列并能结合神经节苷脂GM3的肽可用作本发明流感病毒感染抑制剂的活性成分。上述“一个或几个”优选1到10，更优选1到5、1到4、1到3、1到2或1。或者，由以下DNA编码的氨基酸序列构成并能结合神经节苷脂GM3的肽可用作本发明流感病毒感染抑制剂的活性成分：所述DNA可在严谨条件下与编码具有SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列的肽的DNA的互补DNA杂交。本文所述“严谨条件”包括可通过杂交来鉴定DNA的条件：在68℃，有0.7到1.0M NaCl存在时可利用其上固定有DNA的过滤器，然后在68℃利用0.1到2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC包含150mMNaCl和15mM柠檬酸钠)洗涤该过滤器。或者，具有编码含有SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列的肽的DNA的简并突变体所编码的氨基酸序列并能结合神经节苷脂GM3的肽也可用作本发明流感病毒抑制剂的活性成分。例如，可通过上述连接有神经节苷脂单层的石英晶体振荡器来检测肽是否可结合神经节苷脂GM3。

可通过已知的液相和固相肽合成方法来合成上述肽。或者，也可用所选择的噬菌体和大肠杆菌来制备这些肽。可通过已知的肽纯化方法来纯化以此方式得到的肽。

也可使用神经节苷脂GM3-结合肽的修饰肽。由于修饰的肽可提高其亲水性、延长其血液半衰期，也能提高细胞亲和力和/或组织亲和力，期望修饰的肽作为流感病毒感染抑制剂可产生更强作用。此外，由于通过修饰来聚合肽在空间上影响了流感病毒与神经节苷脂GM3的结合，作为抑制剂可期望具有更强的作用。

肽修饰的例子包括烷基化、脂质化和结合水溶性聚合物如PEG。

可通过已知的方法与烷基结合。例如，烷基胺可与神经节苷脂GM结合肽的C-末端羧基结合，或者脂肪酸可与N-末端氨基结合。可通过酰胺键形成反应实现烷基胺与末端羧基或者脂肪酸与末端氨基的结合。待结合的烷基的例子包括但不限于具有2到20个(例如，18个)碳原子的烷基。用于结合的脂肪酸也不限，但是适合采用有活的机体中存在的脂肪酸。具体例子包括具有约12到20个碳原子的脂肪酸：饱和的脂肪酸，例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和花生酸等；不饱和的脂肪酸，例如油酸、反油酸、亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸等。

也可通过已知的方法，例如根据New Current，11(3)，15-20，(2000)；Biochemica et Biophysica Acta.，1128，44-49，(1992)；FEBS Letters，413，177-180，(1997)和J.Biol.Chem.，257，286-288，(1982)等所述对神经节苷脂GM3-结合肽进行脂质化。具体地说，神经节苷脂GM-3结合肽可通过磷脂的2-羟基或3-磷酸基与各种磷脂结合。这种结合可采用合适的间隔基团。该反应可采用各种类型的缩合方法。一个例子是利用反应性SH基团的方法，其中具有包括半胱氨酸的少许氨基酸的长度合适的氨基酸序列与神经节苷脂GM3-结合肽的N-末端或C-末端结合。可用的磷脂的例子包括但不限于：磷脂酸、磷脂酰胆碱(卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和磷脂酰甘油等。如此得到的脂质化的肽称为脂肽。

当通过与水溶性聚合物结合来修饰肽时，可用的水溶性聚合物的例子包括：聚乙二醇、单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物和聚乙烯醇等。这些聚合物可通过反应活性基团，例如醛与蛋白质N末端的α氨基或赖氨酸的ε-氨基共价结合。这些聚合物中优选PEG，PEG的分子量优选6kDa到50kDa。

聚合神经节苷脂GM3-结合肽的方法的另一例子是接枝化(dendrimerization)。

此外，含有神经节苷脂GM3结合肽的脂质体制备物也可用作本发明的流感病毒感染抑制剂。术语“脂质体”指由膜形式的聚集脂质层和内部含水层构成的膜状闭合囊泡。可通过制备含有神经节苷脂GM3结合肽的脂质体来制备本发明的脂质体制备物。所述脂质体包括由脂质磷脂构成膜的脂质体和由中性和酸性磷脂构成膜的脂质体。

作为膜成分的酸性磷脂的例子包括天然或合成的磷脂酰甘油(PG)，例如二月桂酰基磷脂酰甘油(DLPG)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、卵磷脂酰甘油(卵PG)、氢化卵磷脂酰甘油；和天然或合成的磷脂酰肌醇(PI)，例如磷脂酰肌醇(DLPI)、二肉豆蔻酰基磷脂酰肌醇(DMPI)、二棕榈酰基磷脂酰肌醇(DPPI)、二硬脂酰基磷脂酰肌醇(DSPI)、二油酰基磷脂酰肌醇(DOPI)、大豆磷脂酰肌醇(大豆PI)和氢化大豆磷脂酰肌醇。可单独使用每种这些组分或联用两种或多种。

中性磷脂的例子包括天然或合成的磷脂酰胆碱(PC)，例如大豆磷脂酰胆碱、卵磷脂酰胆碱、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化卵磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、肉豆蔻酰基棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、棕榈酰基硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)和二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)；和天然或合成的磷脂酰乙醇胺(PE)，例如大豆磷脂酰乙醇胺、卵磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化卵磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、肉豆蔻酰基棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(MPPE)、棕榈酰基硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PSPE)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。可单独使用每种这些组分或联用两种或多种。

可根据已知的方法用上述磷脂制备含有神经节苷脂GM3结合肽的脂质体。在该制备物中，酸性磷脂在脂质体膜组分中按比例计占约0.1到约100摩尔％，优选约1到约90摩尔％，更优选约10到约50摩尔％。

当制备上述脂质体时，可加入胆固醇等。通过加入胆固醇可以调节磷脂的流动性从而可简单且方便地制备脂质体。胆固醇一般以和磷脂相等的体积加入并混合，优选0.5到1倍的体积。

脂质分散体中酸性磷脂和神经节苷脂GM3-结合肽的混合比一般约为0.5到约100当量的酸性磷脂/当量肽，优选约1到约60当量的酸性磷脂/当量肽，更优选约1.5到约20当量的酸性磷脂/当量肽。

脂质体中神经节苷脂GM3结合肽含量的比例通常是所有脂质的几到几十摩尔％，优选5到30摩尔％，最优选5到10摩尔％。

可通过已知方法制备含有本发明神经节苷脂GM3-结合肽的脂质体制备物。

例如，按照以下步骤制备多层脂泡(MLV)。首先，将脂质溶解于有机溶剂(氯仿、乙醚等)，然后装入圆底烧瓶。在氮气流下或减压除去有机溶剂，从而在烧瓶底部形成薄的脂质膜。可任选将烧瓶在减压下置于干燥器中以完全除去残留溶剂。然后，通过将药物溶液加在薄的脂质膜上使脂质水化以得到混浊的，乳白色的脂质体混悬液。

通过向小单层磷脂酰丝氨酸小泡中加入Ca²⁺，这些小泡融合形成圆柱形片状物，然后加入螯合剂EDTA以除去Ca²⁺来制备大单层脂泡(LUV)(Biochim.Biophys.Acta， 394，483-491，1975)。也可通过将乙醚配制的脂质注射入水溶液，然后在60℃蒸发掉乙醚来制备LUV(Biochim.Biophys.Acta， 443，629-634，1976)。

或者可采用Szoka等(Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A， 75，4194-4198，1978)设计的利用反相技术的脂质体制备方法。按照该方法，通过将药物溶液加入磷脂的乙醚溶液并超声处理得到的混合物可形成W/O型乳液。用蒸发器减压除去该W/O型乳液这的乙醚。然后加入缓冲液，得到的乳液在漩涡混合器上搅拌，从而导致W/O型乳液向O/W型乳液的相转换。除去残留溶剂得到脂质体。

除了这些方法，可通过弗氏压碎法(FEBS lett.， 99，210-214，1979)制备小粒径脂质体。或者，也可采用Ohsawa等报道的用于高容量脂质体的冻干法(Chem.Pharm.Bull， 32，2442-2445，1984)和冻融法(Chem.Pharm.Bull.， 33，2916-2923，1985)。

可利用聚碳酸酯膜通过透析(J.Pharm.Sci.， 71，806-812，1982)或过滤方法使如此制备的脂质体制成粒径均匀(Biochim.Biophys.Acta， 557，9-23，1979；Biochim.Biophys.Acta， 601，559-571，1980)。可采用透析、凝胶过滤方法和离心方法从所制备的脂质体乳液中除去未留在脂质体中的药物(参见Liposome(脂质体)，“Shishitsu no Kagaku”(脂质的化学)；Biochemical Experiment Lecture 3(生物化学实验讲义3)，Japanese Biochemical Society编，Tokyo Kagaku Dojin出版，1974)。此外，也可利用透析膜浓缩脂质体。

如此制备的脂质分散体可适当地含有各种种类的已知物质，例如防腐剂、等渗剂、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和吸收促进剂等作为配制制备物所需的添加剂。如果需要，也可用水或含有这些添加剂的溶液稀释脂质分散体。上述添加剂的具体例子比例：有效用于真菌和细菌的防腐剂，例如苯扎氯铵、苯索氯铵、氯己定、对羟基苯甲酸酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯等)和乙基汞硫代水杨酸钠；等渗剂，例如D-甘露醇、D-山梨醇、D-木糖醇、甘油、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和电解质(例如，多元醇和氯化钠)；和稳定剂，例如育儿酚、丁基羟基茴香醚(burylhydroxyanisole)、丁基羟基甲苯、乙二胺四乙酸盐(EDTA)和半胱氨酸。

此外，还可将另一种药物，例如抗病毒药物包裹入上述含有本发明HA-结合肽的脂质体中，可类似地制备脂质体制备物。

可按照，例如Woodle等(Long Circulating Liposomes：old drug，Newtherapeutic(长循环脂质体：老药新疗法)，M.C.Woodle，G.Storm编：Springer-Verlag，Berlin，(1998))或Namba等(Liposomal applications to cancertherapy(癌症治疗中的脂质体应用)，Y.Namba，N.Oku，J.Bioact.Compat.Polymers， 8，158-177，(1993))具体描述的方法制备脂质体制备物。

为制备脂质体制备物，上述烷基化肽和/或脂质化肽可用作脂质组分。

含有上述本发明脂质体制备物的药学组合物中神经节苷脂GM3-结合肽的量不限，但可取决于组合物所给予的对象而适当选择：一般约为组合物的0.0002到0.2(w/v％)，优选约为0.001到0.1(w/v％)。

可通过将本发明的流感病毒感染抑制剂给予未感染流感病毒的对象来预防流感病毒感染，也可通过将其给予已感染流感病毒的对象来用作抵御流感病毒的治疗性药物，因为它能乙酯流感病毒感染入身体的其它细胞。本发明的流感病毒抑制剂可含有药学上可接受的运载体、稀释剂和赋形剂，以及作为茴香成分的神经节苷脂GM3-结合肽。就水性制备物而言，纯水(无菌水)、生理缓冲溶液、等渗溶液等可用作运载体。也可用乙二醇、甘油、可注射有机酯类，例如橄榄油等。就片剂而言，胶凝剂、乳糖、硬脂酸镁等也可用作运载体或赋形剂。

作为药物组合物，本发明的流感病毒感染抑制剂可以各种剂型给予。这种剂型包括口服制备物，例如片剂、胶囊、颗粒、粉末、糖浆等；或胃肠外制备物，例如注射液、输液、栓剂等。喷剂是另一种选择。就喷剂而言，含有本发明流感病毒抑制剂的溶液可经口或鼻喷给对象。这种喷剂可有效地给予家养动物，例如鸟和猪等。这些组合物可通过已知方法制备并通常用于药学领域。

本发明流感病毒感染抑制剂的给药途径包括但不限于：口服给药、静脉内注射、肌肉内注射、真皮内注射、皮下注射、腹膜内注射、喷雾等。或者，就家养动物，例如鸟、猪等而言，也可将本发明的流感病毒感染抑制剂混合入饮用水、食物等来给予。可根据患者的严重性来适当确定剂量，给予患者药物有效剂量的本发明组合物。本文所述的“给予药物有效剂量”指以适当治疗各种疾病的水平给予药物。可根据患者的症状适当选择本发明组合物的给药次数。例如，就成人患者而言，剂量的可选择范围等于约0.001到100mg/天的神经节苷脂GM3-结合肽用量。本发明的制备物可以，但不限于每日一次的剂量给予，也可以多剂量给予。当给予家养动物，例如鸟或猪时，可考虑体重等(因素)适当确定剂量。

本发明的流感病毒感染抑制剂可含有抑制流感病毒感染的另一种化合物作为活性成分。这种化合物的例子包括日本公开专利申请号2002-284798所述的流感病毒血凝素-结合肽。具体的例子是日本公开专利申请号2002-284798和WO00/59932所述的肽。通过使流感病毒抑制剂含有神经节苷脂GM3-结合肽和流感病毒血凝素-结合肽，可同时阻断流感病毒上存在的用于和细胞结合的位点与细胞上存在的用于和流感病毒结合的位点，故而可期待更强的流感病毒抑制作用。与上述神经节苷脂GM3-结合肽相似，流感病毒血凝素-结合肽也可含有部分突变的氨基酸以及修饰的氨基酸。脂质体中可含有流感病毒血凝素-结合肽。当本发明的流感病毒感染抑制剂是脂质体制备物时，肽可含有神经节苷脂GM3-结合肽与流感病毒血凝素-结合肽。

接下来将参考实施例来详细解释本发明。

实施例

材料的取得

神经节苷脂GM3(NeuAcα2→3Galβ1→4Glcβ1→1’Cer)得自Snow BrandMilk Products Co.，Ltd.(日本)。通过参考文献(42)所述的方法制备合成的GM3类似物-6’GM3(NeuAcα2→6Galβ1→4Glcβ1→1’Cer)。乳糖基神经酰胺(LacCer)、半乳糖基神经酰胺(GalCer)和葡糖脑苷脂(GlcCer)购自SigmaChemical Co.(St Louis，MO，USA)。卵磷脂酰胆碱(卵PC)和胆固醇分别得自NOF Corporation Inc.(日本)和Nacalai Tesque Inc.(日本)。

按照参考文献(43)所述得到噬菌体展示15聚体随机肽文库(多样性为10⁸)。通过标准Fmoc法利用Advanced Chemtech的自动肽合成仪ACT357合成15聚体肽酰胺(肽-NH₂)和N-硬脂酰基(十八烷酰基)肽酰胺(C₁₇H₃₅CO-肽-NH₂)。通过反相高效液相色谱纯化肽酰胺和N-硬脂酰基肽酰胺。然后通过MALDI-TOF/MS确认它们的纯度和所期望的结构。

小鼠B16黑色素瘤细胞得自RIKEN Cell Bank(日本)。Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞和流感病毒A/Puerto Rico/8/34毒株(H1N1)由K.Nagata(Universityof Tsukuba，Japan)提供。

实施例1

选择神经节苷脂GM3结合肽

(1)唾液酸半乳糖-结合肽的亲和力选择

将含有神经节苷脂GM3(约0.5mg/mL)的脂质溶液(氯仿/甲醇＝2∶1，v/v)铺在涂有Teflon的Langmuir凹槽(USI Co.，Ltd，(日本))内的Tris-缓冲盐水(TBS)(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5)上。水层底部的温度维持在20℃。通过Wilhelmy平板法(Wilhelmy plate method)检测表面压力-面积(p-A)等温线。以恒定速率(10cm²/分钟)压缩GM3单层并以30mN/m的表面压力将其水平转移至石英-晶体微量天平的金表面(QCM；9MHz，AT-切口(AT-cut)，直径4.5mm，面积15.9mm²)(参考文献(21))。将QCM转移至装有1ml TBS的手工制塑料试管，缓冲液的温度维持在20℃并搅拌。将噬菌体(每轮选择6.1到87×10¹⁰个转导单位)注射入比色皿。为确定培育时间，监测噬菌体与单层的结合(ΔF，Hz)(参考文献(35))。噬菌体的结合在15分钟内变得几乎平衡(数据未显示)。从缓冲液中取出QCM并用TBS洗涤3次。与单层结合的噬菌体用0.1N Gly-HCl缓冲液(pH2.2)洗涤15分钟。用1M Tris-HCl缓冲液(pH9.1)中和洗出液，然后通过感染大肠杆菌K91Kan宿主细菌细胞来扩增噬菌体。该过程重复4次以扩增GM3-特异性噬菌体。分离单个噬菌体克隆，扩增并用聚乙二醇/NaCl(PEG#6000)沉淀(参考文献(26))。用QIAprep Spin M13试剂盒(QIAGEN)纯化每个噬菌体克隆的DNA，将其用作测序模板以推测氨基酸排列。

(2)通过ELISA测定噬菌体克隆结合能力

预先用1％BSA/TBS封闭聚苯乙烯多孔板并洗涤3次。塑料板(直径13.5mm；Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.，日本)与上述制备的神经节苷脂GM3或6’GM3单层水平相连。噬菌体克隆(200μl TBS配制，0.01到10nM)与单层在4℃培育30分钟。通过加入0.5％BSA/TBS封闭塑料板的另一侧，然后用0.5％BSA/TBS洗涤两次。结合的噬菌体与1∶2000(v/v)稀释的抗-fd噬菌体(Sigma)在4℃培育1小时，然后在4℃用1∶2000(v/v)稀释的抗-家兔免疫球蛋白G过氧化物酶偶联物标记1小时。用邻苯二胺显色，492nm检测。每个实验进行3次。吸光度增加(492nm处的ΔA)显示了噬菌体浓度的简单饱和曲线，反映了[噬菌体]/ΔA和[噬菌体]之间的线性关系，如以下方程所示：

[噬菌体]/ΔA＝[噬菌体]/ΔA_max+K_d/ΔA_max (I)

分别从方程的斜率和截距计算最大吸光度(ΔA_max)和解离常数(K_d)。K_d的范围是0.018到0.091nM。每次也测试对照噬菌体的ΔA_max并计算相对结合亲和力(ΔA_max/ΔA_max对照)(表1)。野生型噬菌体用作对照噬菌体。

(3)细胞

小鼠B16黑色素瘤细胞在37℃、5％CO₂、95％空气的条件下生长在添加了10％胎牛血清(Life Technologies，Inc.)、100单位/ml青霉素G和100单位/ml链霉素的Dulbecco改进的Eagle培养基(ICN Biomedicals)中。Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞在37℃、5％CO₂、95％空气的条件下生长在添加了10％胎牛血清、0.1％NaHCO₃、10μg/ml谷氨酰胺、100单位/ml青霉素G和100单位/ml链霉素的极限必需eagle培养基(MEM；GIBCO BRL)中。

(4)流式细胞术

胰蛋白酶处理的B16细胞(2×10⁵)与用1％BSA/磷酸缓冲盐水(PBS)连续稀释的200μl噬菌体克隆([噬菌体]＝0.1到500nM)在冰上培育0.5小时。用1％BSA/PBS洗涤3次后，细胞与200μl稀释400倍的(v/v)家兔抗-fd噬菌体抗体(Sigma)在冰上培育0.5小时。洗涤两次后，细胞与200μl稀释400倍的(v/v)抗-家兔IgG异硫氰酸荧光素(FITC)偶联物(Sigma)在冰上培育0.5小时。用1％BSA/PBS洗涤FITC标记的细胞两次并用流式细胞仪(EPICS XL；Coulter)分析。

(5)加入单糖的抑制作用

胰蛋白酶处理的B16细胞(2×10⁵)在存在或不存在单糖(1或5mM N-乙酰神经氨酸(NeuAc)、葡萄糖(Glc)或葡糖醛酸(GlcU))时与200μl噬菌体克隆([噬菌体]＝10nM)在冰上培育1小时。洗涤细胞、用FITC标记并通过流式细胞仪分析。

(6)从细胞的糖蛋白上除去唾液酸

胰蛋白酶处理的B16细胞(2×10⁵)在37℃与得自Arthrobacter ureafaciens(Sigma)的0.05单位神经氨酸酶培育1.5小时。用1％BSA/PBS洗涤细胞3次后，细胞与噬菌体克隆([噬菌体]＝10nM)一起培育，FITC标记并通过流式细胞仪分析。

(7)通过利用石英-晶体微量天平(QCM)分析合成的肽和糖脂单层之间的相互作用

在Langmuir型凹槽上制备糖脂(GM3、6’GM3、LacCer、GalCer或GlcCer)单层并水平转移至QCM(27MHz，AT-切口，直径2.5mm，面积4.9mm²)。27-MHz QCM的灵敏度显示比9-MHz QCM高(约10倍)(参考文献(44)-(46))。向QCM设备的细胞比色皿中加入0.1mM、1mM和10mM肽的TBS溶液，监测响应加入肽所致的频率降低(ΔF，Hz)。每个实验进行2到6次。通过Sauerbrey方程获得结合量(Δm，ng cm^-2)和ΔF之间的关系(参考文献(27))。在这些实验中，1Hz的ΔF对应于肽的质量增加1.1ng cm^-2。Δm对肽浓度作图(终浓度：1到70μM)。然后按照参考文献(44-45，48)所述的以下方程计算最大结合量(Δm_max)和解离常数(K_d)。

[肽]/Δm＝[肽]/Δm_max+K_d/Δm_max (II)

(8)制备含有肽的脂质体

将溶解于氯仿/甲醇(2∶1，v/v)的卵磷脂酰胆碱(PC)和胆固醇的混合脂质(2∶1，摩尔比)加入圆底烧瓶并蒸发得到薄的脂质膜。真空干燥脂质膜过夜。用PBS(pH7.4)在漩涡(混合器)上溶胀该膜并超声处理30分钟。PC/胆固醇脂质体与N-硬脂酰基肽酰胺的水溶液混合。PC∶胆固醇∶肽的最终摩尔比是20∶10∶3。

以下结果得自实施例1。

(a)GM3单层的噬菌体展示选择

通过参考文献35所述与脂质单层结合的噬菌体文库的方法来选择与GM3的糖链结合的肽序列。在气-水界面处制备GM3单层并用于亲和力选择。通过重复4次亲和力选择方法富集GM3特异性噬菌体。通过4轮生物淘选回收的噬菌体的相对产量增加到0.2-15×10⁶(数据未显示)。通过利用9MHz石英-晶体微量天平(QCM)确认所选择噬菌体对GM3单层的亲和力(参考文献(21)-(22))。监测响应加入用Tris-缓冲盐水(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5)配制的噬菌体(10¹⁰TU/mL)的QCM频率降低(图1)。图1显示了在利用GM3单层进行的第4轮亲和力选择中的噬菌体文库(白色圆圈)和噬菌体克隆(黑色圆圈)的结果。GM3单层与9MHz QCM的金表面相连，QCM浸在pH7.5的1ml Tris-缓冲盐水中。将含有6×10¹⁰转导单位的噬菌体溶液注射入缓冲液，以响应噬菌体结合的频率降低对时间作图。结果显示最终噬菌体的浓度是2nM。

频率变化显示所选择的噬菌体的结合量(26Hz)比原始文库的(4Hz)高6.5倍。这些结果表明亲和力选择从随机噬菌体文库中得到了GM3结合噬菌体。

分离了27个GM3特异性噬菌体克隆并鉴定了它们的DNA序列。代表随机区域的推测的氨基酸序列表明发现了如表1所示的7种15聚体序列(序列1到7)。这些序列分为两组，每组具有推测的共有基序，W-xxxA-R或WRx-VxFxS。每种共有基序含有Arg(R)、Trp(W)和Phe(F)。非常令人感兴趣的是，GM1结合肽共有基序也含有这3种氨基酸(精氨酸和芳族氨基酸)(参考文献35)。此外，此项研究中所选择的c01序列与GM1结合肽之一(GM1/肽2)具有相同的序列。这是因为使用的是同一噬菌体文库，而文库的多样性有限。这些结果提示c01-序列对含有唾液酸的糖脂具有广泛的亲和力。

表1

4轮亲和力选择后分离的噬菌体克隆的推测的肽序列和结合亲和力

克隆号	肽序列^a	频率^b	相对结合亲和力^c
克隆号	肽序列^a	频率^b	相对结合亲和力^c	c01c07c21c11c13c15c30	GWWYKGRARPVSAVALSWPLHAGRGFRWVSGWYSSRHYVRSLNGLQQLVYNWWAVSSARRRAVWRHSVATPSHSVLWRPVLFHSAVRALGWRGVYFGDRWLGSQP	15/271/271/271/277/271/271/27	2.11.21.11.11.81.71.4

a.推测的氨基酸序列；黑体字母表示推测的共有基序。

b.所分离的噬菌体克隆数。

c.ΔA_max/ΔA_max，对照之比。通过ELISA评估噬菌体克隆与GM3的结合。对照噬菌体克隆(野生型)的N-末端序列是AETVESCLAKPHTEN。

(b)通过ELISA进行的亲和力筛选

通过ELISA评估所分离的噬菌体克隆对GM3的结合亲和力。在气-水界面制备GM3单层并将其转移至塑料板。将板转移至24-孔多层板(multiplate)，然后与噬菌体克隆一起培育30分钟。酶染色的吸光度对噬菌体浓度作图得到饱和曲线。通过上述方程I计算最大吸光度(ΔA_max)。ELISA得到的结果显示7种噬菌体克隆以以下顺序强烈结合GM3：c01＞c03＞c15＞c30＞c07＞c21＝c11。相对结合亲和力，即(所选择噬菌体的ΔA_max)/(展示AETVESCLAKPHTEN的对照噬菌体的ΔA_max)在1.1和2.1之间(表1)。表现出最高频率(15/27)的噬菌体克隆c01显示对GM3的亲和力最高。

(c)噬菌体克隆的结合亲和力

通过ELISA进一步检测了两种噬菌体克隆，c01和c03的结合亲和力。通过利用含有NeuAcα2→3Gal键的GM3和含有NeuAcα2→6Gal键的合成的6’GM3测试了这些克隆的结合亲和力。c01克隆与GM3和6’GM3的结合亲和力分比对照克隆高2.1倍和1.6倍(图2)。

连续稀释分离的c01和c03噬菌体克隆(0.05到10nM)，通过ELISA方法评估与GM3(NeuAcα2→3Galβ1→4Glcβ1→1’Cer)或6’GM3(NeuAcα2→6Galβ1→4Glcβ1→1’Cer)单层相互作用的结合的噬菌体克隆的量。用噬菌体克隆的最大吸光度(ΔA_max)除以对照克隆的最大吸光度(ΔA_max，对照)得到相对结合亲和力(ΔA_max/ΔA_max，对照)。

c01噬菌体克隆显示与两种NeuAc-Gal键结合，而c03-克隆以高于对照克隆1.8-倍的特异性结合GM3。c03噬菌体克隆对唾液酸到半乳糖的α2→3和α2→6键显示不同的结合亲和力。

(d)特异性结合B16细胞上糖蛋白中的唾液酸寡糖

检测了为动物细胞所选择的噬菌体克隆的结合亲和力。小鼠B16黑色素瘤细胞在其表面具有两种唾液酸-半乳糖键(α2→3和α2→6)。B16细胞系主要表达GM3但几乎不表达其它神经节苷脂(参考文献(13)、(15)、(49)-(51))。细胞与噬菌体克隆以及所结合的克隆一起培育，并用荧光素-偶联物抗体标记。利用流式细胞仪检测细胞中的荧光素，并将所观察到的荧光强度作为噬菌体浓度的函数作图(图3)。

B16细胞于0℃在1％BSA/PBS中与c01-噬菌体克隆(黑色圆圈)、c03-噬菌体克隆(白色圆圈)或对照噬菌体克隆(野生型；黑色三角形)一起培育。用第一抗噬菌体抗体和第二FITC-偶联物抗体标记所结合的噬菌体克隆。通过流式细胞仪测得与细胞结合的噬菌体克隆的量。

c01噬菌体克隆在噬菌体浓度为1到10nM范围时与B16细胞结合。相反，c03或对照噬菌体克隆为观察到明显的结合。

为确定噬菌体的结合是否为细胞表面的唾液酸所介导，对细胞进行抑制试验和神经氨酸酶处理。通过转化1mM NeuAc抑制01-噬菌体克隆(10nM)与B16细胞的结合(图4A)。

图4A显示了单糖对c01-噬菌体克隆和B16细胞之间结合的抑制。B16细胞(2×10⁵个细胞)在没有(-)或有NeuAc、Glc或GlcU(1mM)存在时与噬菌体克隆(10nM)一起培育。

在有葡糖醛酸(GlcU)存在时观察到微弱的抑制。由于GlcU与NeuAc一样是酸性糖，提示羧酸部分负责噬菌体和糖链之间的相互作用。相反，加入葡萄糖未观察到抑制。Arthrobacter ureafaciens的神经氨酸酶(唾液酸酶)优先水解糖缀合物的末端α2→3和α2→6结合的唾液酸(相对活性：α2→6＞α2→3＞α2→8)，参考文献(52))。于37℃在缓冲液(pH6.5)中用神经氨酸酶处理B16细胞1.5小时。在此条件下，推测从细胞上除去的唾液酸的量为13μg/10⁶个细胞，这几乎与现有糖蛋白中NeuAc的总量相同(参考文献(49)-(50))。另一方面，薄层层析分析未观察到有NeuAc从GM3上分解下来(数据未显示)。用神经氨酸酶消化GM3中纯化的唾液酸。然而，处理完整的细胞未显示唾液酸从GM3上解离。因此认为当用神经氨酸酶处理细胞时，细胞上的唾液酸糖缀合物只是GM3。虽然ELISA显示c01-噬菌体克隆与GM3结合，c01-噬菌体与神经氨酸酶处理的B16细胞结合降低至与对照噬菌体相同的水平(图4B)。

图4B显示神经氨酸酶处理对噬菌体与B16细胞结合的作用。B16细胞(2×10⁵个细胞)于37℃在1％BSA/PBS中与0.05单位的神经氨酸酶(pH6.5)一起培育90分钟，然后再与噬菌体克隆一起培育。在图4B中，星号表示p＜0.05。

当用神经氨酸酶在酶无活性的pH7.4条件下处理细胞时，c01-噬菌体与细胞结合(数据未显示)。这些结果表明c01-噬菌体克隆与糖蛋白上的唾液酸寡糖而非GM3结合。由于噬菌体是柔韧的丝状(约1μm长，6-10nm厚)(参考文献(26))，此亲和力可能是因噬菌体的空间位阻所致。基于ELISA的结果(图2)，推断c01-噬菌体克隆与糖蛋白中α2→6结合的唾液酸半乳糖相互作用。

(e)合成的15聚体肽的糖识别(能力)

为检测所选择肽的糖识别(能力)，合成了15聚体肽H-GWWYKGRARPVSAVA-NH₂(c01-肽；SEQ ID NO.1)和H-RAVWRHSVATPSHSV-NH₂(c03-肽；SEQ ID NO.2)。利用27MHz QCM方法分析了这些肽与糖脂的结合试验(27-MHz QCM的灵敏度约是9MHz QCM的10倍)(参考文献(44)-(46))。在气-水界面制备糖脂单层(GM3、6’GM3、LacCer、GalCer或GlcCer)并转移至QCM金表面。然后将肽溶液注射入QCM比色皿，检测作为时间函数的肽的结合量(数据未显示)。如图5所示，肽与单层的结合(Δm)作为肽浓度的函数作图。

通过QCM分析可知，平衡时，响应c01-肽(黑色圆圈)和c03-肽(白色圆圈)结合的质量增加值(Δm，ng cm^-2)在最终肽浓度为1.0-10μM的范围内。利用方程II从相互关系图(mutual plot)计算最大结合量(Δm_max)和解离常数(K_d)(表2)(参考文献(44)-(45)，(47))。K_d值等于50％最大结合所需的肽浓度。c01-肽和c03-肽分别在K_d值为1.8和0.34μM时对GM3具有最高的亲和力。c01-肽的最大结合量(46ng cm^-2)大于c03-肽(11ng cm^-2)。然而，虽然这些肽也对6’GM3和LacCer具有亲和力，它们的K_d值高于对GM3的K_d值。这两类肽对GalCer和GlcCer的结合(能力)低或者不结合二者。因此，这些肽看起来与末端NeuAc-Gal结构相互作用。同时，调控肽(H-AETVESCLAKPHTEN-NH₂)不与该项研究所用的任一鞘糖脂结合(数据未显示)。

表2

与神经节苷脂和鞘糖脂结合的合成的肽

糖脂	结构^a	c01-肽		c03-肽
		c01-肽		c03-肽		Δm_max ^b(ng cm^-2)	K_d ^b(μM)	Δm_max(ng cm^-2)	K_d(μM)
		GM36'GM3LacCerGalCerGlcCer	NeuAc(α2-3)GalGlcCerNeuAc(α2-6)GalGlcCerGalGlcCerGalCerGlcCer	46±2.493±4.674±5.264±4.5n.d.c	1.8±0.44.0±1.14.8±1.613±3.3-	Δm_max ^b(ng cm^-2)	K_d ^b(μM)	Δm_max(ng cm^-2)	K_d(μM)	11±0.156±3.137±1.8＜3n.d.	0.34±0.0057.0±2.25.9±1.2--

a.下划线处是肽所识别的区域。

b.通过QCM分析(1Hz＝0.91ng cm^-2)得到Δm_max和K_d值。

c.未检测。

如实施例1所示，利用噬菌体文库方法来测定在气-水界面与脂单层结合的糖脂-结合肽序列(参考文献(35))。在该方法中，由于在表面压力为30mN m^-1(0.4nm²/分子)时糖脂分子高度定向，所以只有糖链接触水相。结果只有噬菌体分子与糖链相互作用。在该项研究中，由于GM3具有唾液酸半乳糖残基(细胞表面主要的寡糖)，其用作亲和力选择的靶分子。经过4轮亲和力选择，富集了GM3-结合噬菌体。每轮用石英-晶体微量天平检测富集情况(数据未显示)。最后检测到质量增加约6.5倍(图1)。第4轮时观察到的QCM频率降低(26Hz)对应于QCM电极上噬菌体结合量的饱和。

从27个分离的噬菌体克隆中推测了7种肽序列。该7种肽序列分为两种共有基序：W-xxxA-R和WRx-VxFxS(表1)。在GM1-结合肽中也观察到了共有基序中的精氨酸和芳香族氨基酸(参考文献(35))。此外，c01-肽的序列与GM1-结合肽一样(GWWYKGRARPVSAVA)。化学合成含有所选择序列的15聚体c01-和c03-肽。检测了它们对几种糖脂的结合亲和力，测定了参与和这些肽相互作用的糖部分(图5和表2)。该两种肽对GM3的K_d值最低的事实说明末端NeuAc-Gal结构是肽识别碳水化合物所需。因此，推断肽基序中的(R)、Trp(W)、Ala(A)、Val(V)、Phe(F)和Ser(S)参与和GM3的NeuAc-Gal相互作用。糖的羟基同时用作氢键的供体和受体(参考文献(53)、(54))。在许多情况中，肽的酰胺基团还用作氢键供体，肽的羰基或羧酸基团和NeuAc用作氢键受体。此外，吡喃型半乳糖的B位点和NeuAc的甲基可与Trp和Phe的芳香环相互作用。GM3-结合肽的共有基序含有结合糖的氨基酸。因此，这些肽可通过氢键和范德华力相互作用识别NeuAc-Gal部分。

唾液酸半乳糖(NeuAc-Gal)结构是糖蛋白和糖脂的末端糖序列。由于小鼠B16黑色素瘤细胞主要表达GM3，而几乎不表达其它神经节苷脂，B16细胞用于测定所选择噬菌体对细胞表面GM3的亲和力(参考文献(13)、(15)、(49)-(50))。当B16细胞与所选择的噬菌体克隆一起培育时，只有c01-噬菌体与细胞结合(图3)。从细胞上除去唾液酸和加入游离的N-乙酰基神经氨酸可抑制噬菌体与细胞结合。这些结果显示c01-噬菌体克隆的结合受糖蛋白的唾液酸残基介导。c01噬菌体克隆对Neuα2→3Gal和Neuα2→6Gal键具有亲和力，c03-噬菌体克隆对Neuα2→3Gal键具有亲和力(图2)。这表明只有噬菌体克隆c01与B16细胞表面的Neuα2→6Gal相互作用。虽然GM3表达于B16细胞表面，但是未观察到与这些细胞结合的噬菌体。神经氨酸酶不能消化GM3-NeuAc。这些结果显示大分子(例如噬菌体克隆和酶)不能接近B16细胞上的GM3。

实施例2

抑制流感病毒感染的实验

噬菌斑试验

通过MDCK细胞的噬菌斑试验测定流感病毒感染的抑制情况。6孔板中的MDCK细胞与含有脂质体或含肽脂质体的0.2ml流感病毒A/PR/8/34溶液(100-200 pfu；pfu表示噬菌斑形成单位)一起培育。在37℃、5％CO₂条件下培育30分钟后，除去上清液，用PBS洗涤细胞。加入2mL(每孔)含有0.6％琼脂糖(0.01％0-二乙氨基乙基纤维素葡聚糖)、0.1％NaHCO₃，和0.01μ/m乙酰胰蛋白酶的2×MEM+BSA，细胞培育两天。用结晶紫溶液(20％乙醇配制为1mg/mL)染色活细胞，噬菌斑计数。将不存在脂质体情况下的噬菌斑数量定义为最大感染活性(100％)。从log[f/(1-f)]和log[含肽脂质体]的图中得到含肽脂质体的IC₅₀值(50％抑制浓度)，其中f是感染活性百分比。

含肽脂质体抑制流感病毒感染入MDCK细胞的检测结果如下。

通过噬菌斑试验测定含肽脂质体对流感病毒感染入MDCK细胞的抑制。利用硬脂酰基团对肽的N-末端乙酰化并将其掺入PC/胆固醇脂质体(含肽脂质体)。由于合成的c01和c03-肽对NeuAcα2→3Gal和NeuAcα2→6Gal结构具有亲和力，含肽脂质体能与MDCK细胞上的唾液酸半乳糖结合。在有含肽脂质体存在时，流感病毒A/PR/8/34(H1N1)感染入MDCK细胞得到抑制(图6)。

MDCK细胞在有含c01肽的脂质体(黑色圆圈)、含c03肽的脂质体(白色圆圈)或单独脂质体(黑色三角形)存在时与流感病毒A/PR/8/34培育30分钟。洗涤细胞并培育两天。然后染色活细胞并对噬菌斑计数。

含c01肽的脂质体和含c03肽的脂质体的IC₅₀值分别是0.36和0.37nM(表3)。对照肽序列未显示抑制作用。c01和c03-噬菌体克隆对流感病毒不具有亲和力(数据未显示)。因此，这些脂质体与细胞表面的结合显示抑制了流感病毒感染。

表3

脂质体中的N-硬脂酰基肽抑制甲型流感病毒感染

脂质体	PC/胆固醇/肽(Mol∶mol∶mol)	N-硬脂酰肽	IC₅₀(mM)
脂质体	PC/胆固醇/肽(Mol∶mol∶mol)	N-硬脂酰肽	IC₅₀(mM)	C01-肽/脂质体C03-肽/脂质体pIII肽/脂质体脂质体	20∶10∶320∶10∶320∶10∶320∶10∶0	C₁₇H₃₅CO_{-GWWYKGRARPVSAVA-NH2}C₁₇H₃₅CO_{-RAVWRHSVATPSHSV-NH2}C₁₇H₃₅CO_{-AETVESCLAKPHTEN-NH2}-	0.360.37＞10＞10

此外，利用含有c01-肽和c03-肽的脂质体进行了类似的实验，二者均是神经节苷脂GM3-结合肽和流感病毒血凝素结合肽A-1(ARLSPTMVHPRGAQP(SEQ ID NO.8))。这些结果示于图7，其中横轴表示脂质体中卵PC的浓度(mM)，纵轴表示感染抑制的百分比(％)。感染抑制百分比计算为与加入不含肽脂质体时的噬菌斑数量相比，加入含肽脂质体时的噬菌斑数量降低的比例。如图7所示，所有3种肽抑制了流感病毒感染，其中神经节苷脂GM3-结合肽显示抑制作用较高：卵PC浓度为1mM时(肽浓度：0.15mM)，c01-肽、c03-肽和A1肽的感染抑制百分比分别是83％、94％和76％。

多种毒素和病毒识别感染早期步骤中细胞表面的糖链(参考文献(6))。人们认为淀粉样β蛋白也与神经节苷脂GM1相互作用，因此淀粉样(蛋白)-GM1复合物导致原纤维形成(参考文献(55)、(56))。抑制病原分子与糖链相互作用的几种化合物正处于医学应用开发中(参考文献(57)、(58))。本发明将合成的肽引入脂质体以评价它们作为流感病毒抑制剂的功能。肽的N-末端用硬脂酰基团乙酰化得到疏水性部分。如期望的那样，含肽脂质体抑制流感病毒(H1N1型)感染入MDCK细胞(图6)。甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的血清型H1血凝素对NeuAcα→3Gal键特异。MDCK细胞在它们的表面具有α2→3和α2→6键合的唾液酸(参考文献(59))。肽脂质体与MDCK细胞上的唾液酸半乳糖部分键合从而抑制了流感病毒与MDCK细胞上的唾液酸半乳糖受体结合。Takikawa等近来报道说含有糖基-复制肽的脂质体可与癌细胞结合从而抑制了癌细胞转移(参考文献(58))。将功能性肽引入脂质体可以是抑制细胞-细胞和细胞-病毒相互作用的有效方法。

通过噬菌体文库选择得到能识别唾液酸半乳糖部分的15聚体肽序列。得到的肽不只对糖脂单层的糖链具有亲和力，也对细胞表面的糖蛋白具有亲和力。肽与细胞表面的结合明显抑制了流感病毒感染。本发明所选择的肽可用作流感病毒抑制剂。

以下是本发明所提及的参考文献清单。当本说明书提及以下清单中的参考文献时，显示了其参考文献号。

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工业适用性

本发明提供通过阻断宿主细胞上的受体来抑制流感病毒与宿主细胞结合的流感病毒感染抑制剂。

本发明的流感病毒感染抑制剂阻断了宿主细胞上的受体。因此，即使给予未感染的对象，该抑制剂也能抑制随后的流感病毒感染，从而可用作有效的预防感染的药物。由于本发明的流感病毒感染抑制剂阻断了流感病毒所识别的细胞受体，该抑制剂可抑制感染而无论流感病毒的类型，它不仅能抑制分离自人的流感病毒，例如甲型或乙型流感病毒的感染，也能抑制分离自鸟类的流感病毒等的感染。此外，即使在流感病毒感染后，本发明的流感病毒感染抑制剂也能抑制通过出芽复制的流感病毒的再感染，因此也可有效地用作流感的治疗性药物。由于本发明的流感病毒感染抑制剂含有具有10个以下氨基酸的肽作为活性成分，它易于合成与制备，因此可以广泛的各种形式用作药物组合物。

本说明书引用的所有出版物均全文纳入部位作为参考。本领域的技术人员不难了解，在本文中可作出各种改变和改进而不脱离以下权利要求所公开的技术思想和范围。本发明要包括这种改变和改进。

序列表

<110>庆应大学(Keio University)

<120>抑制流感病毒感染，含有对神经节苷脂GM3具有结合活性的肽的药物

<130>PH-2026-PCT

<140>

<160>8

<170>PatentIn version 2.1

<210>1

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的肽

<400>1

Gly Trp Trp Tyr Lys Gly Arg Ala Arg Pro Val Ser Ala Val Ala

1 5 10 15

<210>2

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的肽

<400>2

Arg Ala Val Trp Arg His Ser Val Ala Thr Pro Ser His Ser Val

1 5 10 15

<210>3

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的肽

<400>3

Leu Ser Trp Pro Leu His Ala Gly Arg Gly Phe Arg Trp Val Ser

1 5 10 15

<210>4

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的肽

<400>4

Gly Trp Tyr Ser Ser Arg His Tyr Val Arg Ser Leu Asn Gly Leu

1 5 10 15

<210>5

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的肽

<400>5

Gln Gln Leu Val Tyr Asn Trp Trp Ala Val Ser Ser Ala Arg Arg

1 5 10 15

<210>6

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的肽

<400>6

Leu Trp Arg Pro Val Leu Phe His Ser Ala Val Arg Ala Leu Gly

1 5 10 15

<210>7

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的肽

<400>7

Trp Arg Gly Val Tyr Phe Gly Asp Arg Trp Leu Gly Ser Gln Pro

1 5 10 15

<210>8

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的肽

<400>8

Ala Arg Leu Ser Pro Thr Met Val His Pro Asn Gly Ala Gln Pro

1 5 10 15

Claims

1.一种含有唾液酸半乳糖结合肽作为活性成分的流感病毒感染抑制剂。

2.如权利要求1所述的流感病毒感染抑制剂，其特征在于，所述唾液酸半乳糖结合肽是神经节苷脂GM3结合肽。

3.如权利要求1所述的流感病毒感染抑制剂，其特征在于，含有以下(a)或(b)的唾液酸半乳糖结合肽作为活性成分：

(a)具有SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列的肽；

(b)具有从SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列中删除、取代或添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列并具有神经节苷脂GM3结合活性的肽。

4.如权利要求1到3中任一项所述的流感病毒感染抑制剂，其特征在于，所述唾液酸半乳糖结合肽被烷基化或脂质化。

5.如权利要求1到3中任一项所述的流感病毒感染抑制剂，其特征在于，所述唾液酸半乳糖结合肽含在脂质体中。

6.如权利要求1到5中任一项所述的流感病毒感染抑制剂，其特征在于，所述流感病毒选自甲型、乙型和丙型流感病毒。

7.如权利要求1到5中任一项所述的流感病毒感染抑制剂，其特征在于，所述流感病毒是禽流感病毒或猪流感病毒。

8.如权利要求1到7中任一项所述的流感病毒感染抑制剂，其特征在于，还含有药学上可接受的运载体。

9.一种预防或治疗流感的方法，包括给予非人动物权利要求1到8中任一项所述流感病毒抑制剂的步骤。

10.如权利要求9所述的预防或治疗流感的方法，其特征在于，所述非人动物是鸟或猪。