CN1934242A - 作为药物化合物分布图分析的体外筛选工具的双转染的细胞系：肝胆管清除模型 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表达人NTCP(Na/牛磺胆酸根协同转运蛋白；SLC10A1)以及人BSEP(胆汁盐输出泵；ABCB11)或人MRP2(多药耐性蛋白；ABCC2)的一些双转染的细胞系，其适宜作为药物化合物分布图分析的体外工具，尤其作为肝胆管清除的模型。

Description

作为药物化合物分布图分析的体外筛选工具的 双转染的细胞系：肝胆管清除模型

适宜作为药物化合物分布图分析的体外工具的用人NTCP和人MRP2转染的细胞系：肝胆管清除模型

本发明涉及表达人NTCP(Na/牛磺胆酸根协同转运蛋白(Na/taurocholate Cotransporting Protein)；SLC10A1)以及人BSEP(胆汁盐输出泵(Bile Salt Export Pump)；ABCB11)或人MRP2(多药耐性蛋白(Multidrug Resistance Protein)；ABCC2)的一些双转染的细胞系。

穿过生物屏障的跨细胞转运过程在药物和异生素的吸收、分布和清除中起重要作用。在肠上皮细胞中，转运蛋白参与药物向体循环/从体循环的吸收或者排除。血脑屏障的细胞中表达的转运蛋白参与毒性(和治疗性)化合物从脑的除去。在肾近曲小管上皮细胞和肝细胞中，转运蛋白参与多种内源和外源性物质的清除。在肝细胞中，该清除过程由(i)通过基底外侧膜从血液向细胞的摄取和(ii)通过顶膜向胆汁的清除来介导。预期在所有生物屏障中通过形成将顶膜和基底外侧膜隔室分开的紧密连接(提供相邻细胞之间非常紧密接触的分子结构)实现细胞周(Paracellular)扩散。保持生物屏障的特征(产生通过紧密连接分开的基底外侧膜和顶膜隔室)的细胞系也称作极性细胞系。通常，这些细胞系以称作单层的单细胞层生长。

化合物向人肝细胞的基底外侧(也称作血窦)摄入通过多种不同的转运蛋白介导：大的有机阴离子由OATP8(SLC21A8)、OATP2(SLC21A6，也称作OATP-C或LST1)和OATP-B(SLC21A9)介导，而胆汁酸和可能地类似于胆汁酸的其他化合物由钠牛磺胆酸根协同转运多肽NTCP(SLC10A1)接受。OAT2(SLC22A7)将小的有机阴离子输入肝细胞并且已经报导OCT1(SLC22A1)促进小的有机阳离子的细胞摄入。在顶膜(也称作小管膜)，有机阴离子和胆汁盐向胆汁的清除由多药耐性相关蛋白MRP2(ABCC2)和胆汁盐输出泵BSEP(ABCB11)介导，MRP2和BSEP都是ABC转运蛋白家族(ATP-依赖性输出泵)的成员。也已知在人肝细胞的小管膜表达的其他ABC转运蛋白是乳腺癌抗性蛋白BCRP(ABCG2，也称作MXR)和多药耐性蛋白MDR1(ABCB1，也称作P-糖蛋白)。认为这两种蛋白质参与两亲性和阳离子化合物的小管分泌过程。

多药耐性蛋白(MDR)家族介导亲脂性物质与谷胱甘肽、葡糖醛酸或者硫酸的缀合物的依赖ATP的单向转运(综述：Knig J.et al.，Biochimicaet Biophysica Acta 1461(1999)377-394)。

胆汁盐库经历由不同的胆汁盐转运蛋白介导的肠肝循环，这些转运蛋白包括小管胆汁盐输出泵BSEP、回肠NA+-依赖性胆汁盐输出蛋白SIBT，和肝血窦NA+-牛磺胆酸根协同转运多肽NTCP。其他胆汁盐转运蛋白包括有机阴离子转运多肽OATP和多药耐性相关蛋白2和3MRP2，2(综述：Trauner et al.，Physiol.Rev.83：633-671，2003)。

迄今为止，研究药物的肝胆管清除的唯一方法是在大鼠中进行的胆汁瘘管研究，该方法是复杂且费时的体内测定法。此外，胆汁瘘管研究不能提供关于清除过程的分子基础的任何信息。这里我们描述了一种基于细胞的测定系统，其中肝摄入转运蛋白(在该情况中为人NTCP)与肝输出泵(通常为ABC转运蛋白，在该情况中为人MRP2或者人BSEP)在极化的犬肾细胞系MDCKII中组成性表达(参考文献见Louvard，1980；Fulleret al.，1984)。因此，所得细胞系在一种细胞系中表达两种转基因(i)人NTCP以及人BSEP(MDCKII-hNTCP/hBSEP)和(ii)人NTCP以及人MRP2(MDCKII-hNTCP-hMRP2)。细胞在多孔滤膜上6孔滤器插入物(filterinsert)中培养，从而分离基底外侧隔室和顶端隔室(图1)。将推定的底物(例如，药物化合物)加入顶端或者基底外侧隔室用于在两个方向进行跨细胞(向量的)转运测量。所指示的培养期间之后，从每个隔室取出样品。给定转运蛋白组合(在该情况中为人NTCP和人BSEP或者人NTCP和人MRP2)的底物表明当与未转染的或者单转染的细胞比较时，从基底外侧向顶端隔室的显著的净转运(图4+5)。

借助所述的双转染的细胞系，将能够预测转运蛋白组合人NTCP/人BSEP或者人NTCP/人MRP2是否参与药物化合物的肝胆管清除过程。

在药物开发中，化合物通常由于它们的弱的药代动力学分布图而不能进入临床研发。一个理由是它们通过肝脏快速清除到胆汁中。该现象的实例是绿原酸衍生物，其是葡萄糖-6-磷酸移位酶的有效且特异的抑制剂(II型糖尿病患者中潜在的新的药学靶标)。药物动力学研究表明在Wistar大鼠中，静脉内快速浓注后，一些绿原酸衍生物的血糖降低作用仅持续很短时间。胆汁瘘管研究表明该弱的药物动力学效果是由于快速肝胆管清除过程导致的不适宜的药物动力学。借助双转染的转运蛋白细胞系，将能够鉴定参与清除过程的转运蛋白。在下一步中，可以化学修饰所述化合物使得减轻它们对清除性转运蛋白的亲和力以改善化合物的药理学。

另一个应用领域将是在肝脏中转运蛋白的水平上检查潜在的药物-药物相互作用。例如，肝脏中两种药物对一种转运蛋白的竞争可以显著改变两种化合物的药物动力学分布图。此外，一种药物对转运蛋白的抑制或者活化也可以改变转运蛋白底物的药理学行为。

本发明涉及哺乳动物细胞，其具有第一面和第二面，两面形成该细胞的外表面的部分，并且两面与该细胞的接触区不同，并且所述第一面和第二面通过它们在该细胞的相对末端定位而相互区别，其中第一面携带功能hNTCP蛋白，第二面携带功能hBSEP蛋白。

这种哺乳动物细胞的第一面是例如基底外侧面并且第二面是顶面或者第一面是例如顶面并且第二面是例如基底外侧面。

哺乳动物细胞可以选自肾、肠系统，肝脏或者血/脑屏障的上皮细胞。

此类细胞可以是永生化细胞或者重组细胞。细胞可以来自普通的哺乳动物组织或者原代细胞培养物。此类细胞还可以是细胞培养物的细胞，例如LLC-PK1细胞或者MDCKII细胞，尤其当还携带重组载体时。

LLC-PK1细胞可以含有例如适于表达hNTCP蛋白质(如SEQ ID NO.4例证)的重组载体和适于表达hBSEP蛋白质(如通过SEQ ID NO.5例证)的重组载体。作为备选，hNTCP和hBSEP蛋白质可以从相同的载体构建体同时表达。MDCKII细胞可以含有例如适于表达hNTCP蛋白质(如SEQ ID NO.4例证)的重组载体和适于表达hBSEP蛋白质(如通过SEQ ID NO.5例证)的重组载体。这种携带能够表达hNTCP蛋白质和hBSEP蛋白质的两种单独载体的MDCKII型的哺乳动物细胞已经保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig)。保藏号是DSM ACC2643。

本发明还涉及携带功能性人NTCP蛋白质和功能性人BSEP蛋白质的哺乳动物细胞的生产方法，其中

a]提供哺乳动物细胞；

b]提供包含hNTCP的编码序列的载体(例如，根据SEQ ID NO.4设计或者等于SEQ ID NO.4的载体)；

c]提供包含hBSEP的编码序列的载体(例如，根据SEQ ID NO.5设计或者等于SEQ ID NO.5的载体)；

d]将来自a]的哺乳动物细胞通过来自b]的载体和来自c]的载体同时或者连续转化；

e]鉴定并增殖来自d]的双转染子细胞。

将为这种生产提供的哺乳动物细胞可以是上皮细胞，尤其是肾、肠系统、肝或者血/脑屏障的上皮细胞。此类细胞还可以是永生化细胞或者重组细胞。细胞可以来自普通哺乳动物组织或者原代细胞培养物。从如上述生产得到的根据e]的此类双转染子细胞可以是例如，LLC-PK1细胞或者MDCKII，尤其当携带重组载体时。此类LLC-PK1细胞可以含有例如适于表达hNTCP蛋白质(如SEQ ID NO.4例证)的重组载体和适于表达hBSEP蛋白质(如通过SEQ ID NO.5例证)的重组载体。hNTCP和hBSEP蛋白质可以从相同的载体构建体同时表达。此类MDCKII细胞可以含有例如适于表达hNTCP蛋白质(如SEQ ID NO.4例证)的重组载体和适于表达hBSEP蛋白质(如通过SEQ ID NO.5例证)的重组载体。这种携带能够表达hNTCP蛋白质和hBSEP蛋白质的两种单独载体的MDCKII型的哺乳动物细胞已经保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig)。保藏号是DSMACC2643。

本发明还涉及包含至少两个哺乳动物细胞的细胞单层，所述哺乳动物细胞具有第一面和第二面，两面形成该细胞的外表面的部分，并且两面与该细胞的接触区不同，并且所述第一面和第二面通过它们在该细胞的相对末端定位而相互区别，其中第一面携带功能hNTCP蛋白，第二面携带功能hBSEP蛋白。

此类单层可以占据整个或者部分固体表面。本发明还涉及携带此类细胞单层的这种固体表面。

可以通过塑料形成固体表面。固体表面还可以是培养皿或者滤器插入物(filter-insert)的部分。

本发明还涉及携带前述细胞单层的培养皿以及携带前述细胞单层的滤器插入物。此类滤器插入物的膜支持体可以由聚碳酸酯和/或聚酯制造。膜支持体的孔径可以为0.4μm+/-0.2μm。滤器插入物的相应的实例已经在图1中描绘。一些生产商生产的滤器插入物可以用于将所述细胞单层置于该插入物上。这些生产商为例如“Corning Inc.，Corning，NY”或者“Millipore”。

具有如下特征的哺乳动物细胞可以用于例如确定关于肝胆管清除和/或肾脏排泄和/或脑吸收和/或肠吸收的药理学分布图：该哺乳动物细胞具有第一面和第二面，两面形成该细胞的外表面的部分，并且两面与该细胞的接触区不同，并且所述第一面和第二面通过它们在该细胞的相对末端定位而相互区别，其中第一面携带功能hNTCP蛋白，第二面携带功能hBSEP蛋白。对于这些应用，所述哺乳动物细胞可以在固体表面和/或培养皿和/或滤器插入物上形成单层的部分。

本发明还涉及哺乳动物细胞，该哺乳动物细胞具有第一面和第二面，两面形成该细胞的外表面的部分，并且两面与该细胞的接触区不同，并且所述第一面和第二面通过它们在该细胞的相对末端的定位而相互区别，其中第一面携带功能hNTCP蛋白，第二面携带功能hMRP2蛋白。

此类哺乳动物细胞的第一面为例如基底外侧面并且第二面为顶面或者第一面为例如顶面并且第二面为例如基底外侧面。

哺乳动物细胞可以选自上皮细胞，尤其肾、肠系统，肝脏或者血/脑屏障的上皮细胞。

此类细胞还可以是永生化细胞或者重组细胞。细胞可以来自普通哺乳动物组织或者原代细胞培养物。此类细胞还可以是细胞培养物的细胞，例如LLC-PK1细胞或者MDCKII细胞，尤其当携带重组载体时。

LLC-PK1细胞可以含有例如适于表达hNTCP蛋白质(如SEQ ID NO.4例证)的重组载体和适于表达hMRP2蛋白质(如通过SEQ ID NO.6例证)的重组载体。作为备选，hNTCP和hMRP2蛋白质可以从相同的载体构建体同时表达。MDCKII细胞可以含有例如适于表达hNTCP蛋白质(如SEQ ID NO.4例证)的重组载体和适于表达hMRP2蛋白质(如通过SEQ ID NO.6例证)的重组载体。这种携带能够表达hNTCP蛋白质和hMRP2蛋白质的两种单独载体的MDCKII型的哺乳动物细胞已经保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig)。保藏号是DSM ACC2644。

本发明还涉及携带功能性人NTCP蛋白质和功能性人MRP2蛋白质的哺乳动物细胞的生产方法，其中

a]提供哺乳动物细胞；

b]提供包含hNTCP的编码序列的载体(例如，根据SEQ ID NO.4设计或者等于SEQ ID NO.4的载体)；

c]提供包含hMRP2的编码序列的载体(例如，根据SEQ ID NO.6设计或者等于SEQ ID NO.6的载体)；

d]将来自a]的哺乳动物细胞通过来自b]的载体和来自c]的载体同时或者连续转化；

e]鉴定并增殖来自d]的双转染子细胞。

将为这种生产方法提供的哺乳动物细胞可以是上皮细胞，尤其是肾、肠系统、肝或者血/脑屏障的上皮细胞。此类细胞还可以是永生化细胞或者重组细胞。细胞可以来自普通哺乳动物组织或者原代细胞培养物。

从如上述生产方法得到的根据e]的此类双转染子细胞可以是细胞培养物的细胞，例如，LLC-PK1细胞或者MDCKII细胞，尤其当携带重组载体时。此类LLC-PK1细胞可以含有例如适于表达hNTCP蛋白质(如SEQID NO.4例证)的重组载体和适于表达hMRP2蛋白质(如通过SEQ ID NO.6例证)的重组载体。hNTCP和hMRP2蛋白质可以从相同的载体构建体同时表达。此类MDCKII可以含有例如适于表达hNTCP蛋白质(如SEQ IDNO.4例证)的重组载体和适于表达hMRP2(如通过SEQ ID NO.6例证)的重组载体。这种携带能够表达hNTCP蛋白质和hMRP2蛋白质的两种单独载体的MDCKII型的哺乳动物细胞已经保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig)。保藏号是DSMACC2644。

本发明还涉及包含至少两个哺乳动物细胞的细胞单层，所述哺乳动物细胞具有第一面和第二面，两面形成该细胞的外表面的部分，并且两面与该细胞的接触区不同，并且所述第一面和第二面通过它们在该细胞的相对末端定位而相互区别，其中第一面携带功能hNTCP蛋白，第二面携带功能hMRP2蛋白。

此类单层可以占据部分或者整个固体表面。本发明还涉及携带此类细胞单层的这种固体表面。

可以通过塑料形成固体表面。固体表面还可以是培养皿或者滤器插入物的部分。

本发明还涉及携带前述细胞单层的培养皿以及携带前述细胞单层的滤器插入物。此类滤器插入物的膜支持体可以由聚碳酸酯和/或聚酯制造。膜支持体的孔径可以为约0.4μm+/-0.2μm。滤器插入物的相应的实例已经在图1中描绘。一些生产商生产的滤器插入物可以用于将所述细胞单层置于该插入物上。这些生产商为例如“Corning Inc.，Corning，NY”或者“Millipore”。

具有如下特征的哺乳动物细胞可以用于例如确定关于肝胆管清除和/或肾脏排泄和/或脑吸收和/或肠吸收的药理学分布图：该哺乳动物细胞具有第一面和第二面，两面形成该细胞的外表面的部分，并且两面与该细胞的接触区不同，并且所述第一面和第二面通过它们在该细胞的相对末端定位而相互区别，其中第一面携带功能hNTCP蛋白，第二面携带功能hMRP2蛋白。对于这些应用，所述哺乳动物细胞可以在固体表面和/或培养皿和/或滤器插入物上形成单层的部分。

当蛋白质处于在生物学背景，尤其作为活细胞的部分发挥活性的条件下时，认为该蛋白质是有功能的。此类活性可以例如通过测定法检测。例如，当转运蛋白将化合物，尤其该转运蛋白的生物学底物从细胞外移动到该细胞的内部隔室，或者反之亦然时，该转运蛋白是有功能的。离子转运蛋白的生物学底物由例如单价和/或二价离子或者其他离子组成。葡萄糖转运蛋白的底物是例如葡萄糖。多耐药性蛋白质的底物是例如仅药物或者缀合到谷胱甘肽或者葡糖酸的药物。

本发明上下文中蛋白质的处理可以通过本领域技术人员通过应用John Wiley & Sons出版的“Current Protocols in Molecular Biology”(编辑：John E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，Paul T.Wingfield；0-471-11184-8-Looseleaf；0-471-14098-8-CDROM)的方案来实现。

有关分子生物学技术的操作，如克隆、细胞的转化、测序、修饰启动子、表达蛋白质或者其他可以由技术人员应用John Wiley & Sons出版的“Current Protocols in Molecular Biology”(编辑：Fred M.Ausubel，RogerBrent，Robert E.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，John A.Smith，Kevin Struhl；0-471-50338-X-Looseleaf；0-471-306614CDROM)的方案来实现。

生物细胞的操作可以由技术人员应用John Wiley & Sons出版的“Current Protocols in Molecular Biology”(编辑：Fred M.Ausubel，RogerBrent，Robert E.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，John A.Smith，Kevin Struhl；0-471-50338-X-Looseleaf；0-471-306614CDROM)的方案来实现。

实施例

细胞系产生：MDCKII-hBSEP和MDCKII-hNTCP/hBSEP：

在补加10％胎牛血清的Dulbecco改良的基本培养基中37℃，5％CO₂，和95％湿度下培养MDCK II细胞(Madin-Darby犬肾细胞，株系II)。如下产生MDCKII-hNTCP/hBSEP细胞系(DSM ACC2643)：使用如生产商(Roche)描述的FuGene6转染试剂将MDCK II细胞首先用哺乳动物表达质粒pcDNA3.1zeo(+)-hBSEP转染。用1000μg/ml Zeocin选择转染的细胞。在选择期间，组织培养基还补充100单位/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素。所得细胞克隆用免疫印迹筛选重组人BSEP表达，然后用共聚焦激光扫描显微术(Confocal Laser Scanning Microscopy)分析重组人BSEP的适当的亚细胞定位。以最高水平表达人BSEP并且重组BSEP伴随着定位在顶膜的细胞克隆选择用来用哺乳动物表达质粒pcDNA3.1neo(+)-hNTCP进行FuGene6转染。转染的细胞用800μg/ml遗传霉素和1000μg/ml Zeocin选择。在选择期间，组织培养基还补充100单位/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素。双转染的细胞系再次用免疫印迹来筛选重组BSEP和重组人NTCP的表达，然后用共聚焦激光扫描显微术分析两种转基因的适当的亚细胞定位。具有人BSEP(顶膜)和人NTCP(基底外侧膜)的最高表达和适当亚细胞定位的细胞克隆被选择用于进一步的检查。

细胞系产生：MDCKII-hMRP2和MDCKII-hNTCP/hMRP2

在补加10％胎牛血清的Dulbecco改良的基本培养基中37℃，5％CO₂，和95％湿度下培养MDCK II细胞(Madin-Darby犬肾细胞，株系II)。如下产生MDCKII-hNTCP/hMRP2细胞系(DSM ACC2644)：使用如生产商(Roche)描述的FuGene6转染试剂将MDCK II细胞首先用哺乳动物表达质粒pcDNA3.1zeo(+)-hMRP2转染。用1000μg/ml Zeocin选择转染的细胞。在选择期间，组织培养基还补充100单位/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素。所得细胞克隆用免疫印迹筛选重组人MRP2表达，然后用共聚焦激光扫描显微术分析重组人MRP2的适当的亚细胞定位。以最高水平表达人MRP2并且重组MRP2伴随着定位在顶膜的细胞克隆选择用来用哺乳动物表达质粒pcDNA3.1neo(+)-hNTCP进行FuGene6转染。转染的细胞用800μg/ml遗传霉素和1000μg/ml Zeocin选择。在选择期间，组织培养基还补充100单位/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素。双转染的细胞系再次用免疫印迹来筛选重组人MRP2和重组人NTCP的表达，然后用共聚焦激光扫描显微术分析两种转基因的适当的亚细胞定位。具有人MRP2(顶膜)和人NTCP(基底外侧膜)的最高表达和适当亚细胞定位的细胞克隆被选择用于进一步的检查。

细胞系产生：MDCKII-hNTCP

在补加10％胎牛血清的Dulbecco改良的基本培养基中37℃，5％CO₂，和95％湿度下培养MDCK II细胞(Madin-Darby犬肾细胞，株系II)。为了产生MDCKII-hNTCP细胞系，使用如生产商(Roche)描述的FuGene6转染试剂将MDCK II细胞用哺乳动物表达质粒pcDNA3.1neo(+)-hNTCP转染。转染的细胞用800μg/ml遗传霉素选择。在选择期间，组织培养基还补充100单位/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素。所得细胞克隆用免疫印迹来筛选重组人NTCP的表达，然后对具有最高人NTCP表达的细胞克隆进行功能分析(测量与亲代MDCKII细胞比较在MDCKII-hNTCP细胞中牛磺胆酸的摄入)。

化学药品：[³H(G)]-磺溴酞钠(BSP)(0.2TBq/mmol)购自HartmannAnalytic(Braunschweig，Germany)。[2，4-³H(N)]-胆酸(0.7TBq/mmol)，[羧基-14C]-鹅脱氧胆酸(1.9GBq/mmol)和[甘氨酸-2-³H]-甘氨胆酸(0.15TBq/mmol)购自Biotrend Chemikalien(Kln，Germany)。[³H(G)]-牛磺胆酸(0.1TBq/mmol)购自PerkinElmer Life Sciences。Zeocin、遗传霉素、青霉素G和硫酸链霉素从Invitrogen得到。额外分析纯的化学药品从Sigma和Merck(Darmstadt，Germany)得到。

转运测定法：

细胞在6孔板中在聚酯膜插入物(insert)(孔径0.4μM，插入物直径24mm，Costar)上以汇合(1×10⁶个细胞/插入物)生长6天。通过向生长培养基加入10mM丁酸钠24小时诱导转基因的过表达。第二天，将细胞用转运测定缓冲液(142mM NaCl，5mM KCl，5mM葡萄糖，1.5mM CaCl₂，1.2mM MgSO₄，1mM KH₂PO₄，12.5mM HEPES，pH 7.3)洗涤一次，然后向顶部(1.5ml)或者基底外侧(2.5ml)隔室加入[³H]-或[¹⁴C]-标记的化合物。相对的隔室填充转运测定缓冲液。所指示的温育期(37℃)后，从每个隔室取出样品并通过闪烁计数(Wallac，Winspectral 1414 LiquidScintillation Counter)测量。如下计算输入的跨细胞转运百分数：

从顶部隔室向基底外侧隔室的转运：

转运A-B[％]＝100×(放射性(t1)基底外侧[dpm]×2.5[ml])/

                  (放射性(t0)顶部的[dpm]×1.5[ml])

从基底外侧隔室向顶部隔室的转运：

转运B-A[％]＝100×(放射性(t1)顶部的[dpm]×1.5[ml])/

                  (放射性(t0)基底外侧的[dpm]×2.5[ml])

在本发明上下文中将下面的生物材料保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroder Weg 1b；D-38124 Braunschweig)：

DSM ACC2643：双转染的MDCKII细胞，含有用于表达人NTCP(SeqID No.4)的载体和用于表达人BSEP(Seq ID No.5)的载体。

DSM ACC2644：双转染的MDCKII细胞，含有用于表达人NTCP(Seq ID No.4)的载体和用于表达人MRP2(Seq ID No.6)的载体。

附图描述：

图1：

一般测定法设计

细胞在多孔膜(聚酯膜，孔径0.4μM，6-孔)上滤器插入物中作为极化和紧密的单层生长，从而分开基底外侧隔室和顶部隔室。图1描绘了携带细胞单层的滤器插入物的实例。

图2：

测定法设计MDCK II-hNTCP/hBSEP

用人BSEP(B)或人NTCP(C)，或人NTCP和人BSEP(D)转染的MDCK II细胞(A)和MDCK II细胞的图示。人NTCP定位在基底外侧膜而人BSEP定位在顶膜。单转化的细胞系MDCKII-hBSEP和MDCKII-hNTCP用作对照。

图3：

测定法设计MDCK II-hNTCP/hMRP2

用人MRP2(B)或人NTCP(C)，或人NTCP和人MRP2(D)转染的MDCK II细胞(A)和MDCK II细胞的图示。人NTCP定位在基底外侧膜而人MRP2定位在顶膜。单转化的细胞系MDCKII-hMRP2和MDCKII-hNTCP用作对照。

图4：

在MDCKII-hNTCP/hBSEP单层中[³H]甘氨胆酸、[³H]牛磺胆酸、[³H]胆酸、[¹⁴C]鹅脱氧胆酸和[³H]BSP(磺溴酞钠)的向量转运

MDCKII、MDCKII-hNTCP、MDCKII-hMRP2和MDCKII-hNTCP/hMRP2在滤器插入物上生长6天(1×10⁶个细胞/孔)。通过加入10mM丁酸钠24小时诱导转基因表达。每种化合物的所指示的量分别加入基底外侧或者顶部隔室。45分钟和90分钟后，从相对隔室取出等分试样并通过液体闪烁计数分析。A-B表示向顶部隔室加入化合物和从基底外侧隔室取样(从顶部向基底外侧隔室的向量转运)。B-A表示向基底外侧隔室加入化合物和从顶部隔室取样(从基底外侧向顶部隔室的向量转运)。数据代表平均值±SD(n＝3)。

图5：

在MDCKII-hNTCP/hMRP2单层中[³H]BSP(磺溴酞钠)、[³H]胆酸和[³H]牛磺胆酸的向量转运

MDCKII、MDCKII-hMRP2和MDCKII-hNTCP/hMRP2细胞在滤器插入物上生长6天(1×10⁶个细胞/孔)。通过加入10mM丁酸钠24小时诱导转基因表达。100nM每种化合物分别加入基底外侧或者顶部隔室。1小时和2小时后，从相对的隔室取出等分试样并通过液体闪烁计数分析。A-B表示向顶部隔室加入化合物和从基底外侧隔室取样(从顶部向基底外侧隔室的向量转运)。B-A表示向基底外侧隔室加入化合物和从顶部隔室取样(从基底外侧向顶部隔室的向量转运)。数据代表平均值±SD(n＝3)。

图6：

人NTCP(Slc10A1)，cDNA序列；长度：1061个碱基；描绘的序列对应于Seq ID No.1。

图7：

人BSEP(ABCB11)，cDNA序列；长度：3966个碱基；描绘的序列对应于Seq ID No.2。

图8：

人MRP2(ABCC2)，cDNA序列；长度：4650个碱基；描绘的序列对应于Seq ID No.3。

图9：

pcDNA3.1neo(+)-hNTCP，全序列；长度：6433个碱基；描绘的序列对应于Seq ID No.4：

人依赖钠的牛磺胆酸根协同转运蛋白(hNTCP，SLC10A1)cDNA经由BamH I和Xba I克隆到pcDNA3.1neo(+)(Invitrogen)的MCS中。用来自人肝脏cDNA文库(Clontech)的基因特异引物对人NTCP cDNA进行PCR扩增。所克隆的cDNA对应于GenBank检索号L21893从76-1136位(编码序列：83-1132位)。例外：616位c→t(无氨基酸改变)和774位t→c(氨基酸改变F→S)。

图10：

pcDNA3.1zeo(+)-hBSEP，全序列；长度：9043个碱基；所描绘的序列对应于Seq ID No.5：

用Gateway Technology(Invitrogen)克隆人胆汁盐输出泵(hBSEP，ABCB11)cDNA。用attB-修饰的基因特异引物从人胎儿肝脏cDNA文库(Clontech)对人BSEP cDNA进行PCR扩增并通过pDONR221克隆到pcDNA3.1zeo(+)载体(Invitrogen，修饰成Gateway目的载体)。克隆的cDNA对应于GenBank检索号AF136523从128-4093位(编码序列：128-4093位)。例外：3211位G→A(无氨基酸改变)。

图11：

pcDNA3.1zeo(+)-hMRP2，全序列；长度：9658个碱基；所描绘的序列对应于Seq ID No.6：

通过Nhe I和Afl II将人多抗药性相关蛋白2(MRP2，ABCC2)cDNA克隆到pcDNA3.1zeo(+)(Invitrogen)的MCS。用基因特异引物从HepG2cDNA文库PCR扩增人MRP2 cDNA。克隆的cDNA对应于GenBank检索号X96395的26-4675位(编码序列：38-4675位)。例外：4009位C→T(无氨基酸改变)。

Seq ID描述：

Seq ID No.1：

人NTCP(Slc10A1)，cDNA序列；长度：1061个碱基；Seq ID No.1在图6中公开。

Seq ID No.2：

人BSEP(ABCB11)，cDNA序列；长度：3966个碱基；Seq ID No.2在图7中公开。

Seq ID No.3：

人MRP2(ABCC2)，cDNA序列；长度：4650个碱基；Seq ID No.3在图8中公开。

Seq ID No.4：

pcDNA3.1neo(+)-hNTCP，全序列；长度：6433个碱基；Seq ID No.4在图9中公开。

Seq ID No.5：

pcDNA3.1zeo(+)-hBSEP，全序列；长度：9043个碱基；Seq ID No.5在图10中公开。

Seq ID No.6：

pcDNA3.1zeo(+)-hMRP2，全序列；长度：9658个碱基；Seq ID No.6在图11中公开。

参考文献：

1.Louvard D.(1980)Apical membrane aminopeptidase appears atsite of cell-cell contact in cultured kidney epithelial cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(7)：4132-4136

2.Fuller S，von Bonsdorff C-H，and Simons K(1984)VesicularStomatitis Virus infects and matures only through the basolateral surfaceof the polarized epithelial cell line，MDCK.Cell 38：65-77

                                      序列表

<110>塞诺菲-安万特德国有限公司

<120>作为药物化合物分布图分析的体外筛选工具的双转染的细胞系：肝胆管清除模型

<130>DEAV 2004/0025

<160>6

<170>PatentIn版本3.2

<210>1

<211>1061

<212>DNA

<213>人

<400>1

caggaggatg gaggcccaca acgcgtctgc cccattcaac ttcaccctgc cacccaactt    60

tggcaagcgc cccacagacc tggcactgag cgtcatcctg gtgttcatgt tgttcttcat    120

catgctctcg ctgggctgca ccatggagtt cagcaagatc aaggctcact tatggaagcc    180

taaagggctg gccatcgccc tggtggcaca gtatggcatc atgcccctca cggcctttgt    240

gctgggcaag gtcttccggc tgaagaacat tgaggcactg gccatcttgg tctgtggctg    300

ctcacctgga gggaacctgt ccaatgtctt cagtctggcc atgaaggggg acatgaacct    360

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gtacatctac tccaggggga tctatgatgg ggacctgaag gacaaggtgc cctataaagg    480

catcgtgata tcactggtcc tggttctcat tccttgcacc atagggatcg tcctcaaatc    540

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cagtgtggcc gtcacagttc tctctgccat caatgtgggg aagagcatca tgtttgccat    660

gacaccactc ttgattgcca cctcctccct gatgccttct attggctttc tgctgggtta    720

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<210>2

<211>3966

<212>DNA

<213>人

<400>2

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gagtcagata aatcatataa taatgataag aaatcaaggt tacaagatga gaagaaaggt    120

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cagattccag gaaaagcatg tgtgaataac accattgtat ggactaacag ttccctcaac    360

cagaacatga caaatggaac acgttgtggg ttgctgaaca tcgagagcga aatgatcaaa    420

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gctgatgaag tcatttcatc aatgagaaca gtggctgctt ttggtggtga gaaaagagag    900

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gtgatgggat tctttactgg attcgtgtgg tgtctcatct ttttgtgtta tgcactggcc    1020

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cagattttcc tcagtgtcat agtaggagct ttaaatcttg gcaatgcctc tccttgtttg    1140

gaagcctttg caactggacg tgcagcagcc accagcattt ttgagacaat agacaggaaa    1200

cccatcattg actgcatgtc agaagatggt tacaagttgg atcgaatcaa gggtgaaatt    1260

gaattccata atgtgacctt ccattatcct tccagaccag aggtgaagat tctaaatgac    1320

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gtggatggcc atgacattcg ctctcttaac attcagtggc ttagagatca gattgggata    1500

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cttttggaca tggccacctc agctctggac aatgagagtg aagccatggt gcaagaagtg    1800

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acctttagca gagggagcta ccaggatagt ttaagggctt ccatccggca acgctccaag    2100

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tatgaagaag atagaaagga caaggacatt cctgtgcagg aagaagttga acctgcccca    2220

gttaggagga ttctgaaatt cagtgctcca gaatggccct acatgctggt agggtctgtg    2280

ggtgcagctg tgaacgggac agtcacaccc ttgtatgcct ttttattcag ccagattctt    2340

gggacttttt caattcctga taaagaggaa caaaggtcac agatcaatgg tgtgtgccta    2400

ctttttgtag caatgggctg tgtatctctt ttcacccaat ttctacaggg atatgccttt    2460

gctaaatctg gggagctcct aacaaaaagg ctacgtaaat ttggtttcag ggcaatgctg    2520

gggcaagata ttgcctggtt tgatgacctc agaaatagcc ctggagcatt gacaacaaga    2580

cttgctacag atgcttccca agttcaaggg gctgccggct ctcagatcgg gatgatagtc    2640

aattccttca ctaacgtcac tgtggccatg atcattgcct tctcctttag ctggaagctg    2700

agcctggtca tcttgtgctt cttccccttc ttggctttat caggagccac acagaccagg    2760

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agatatggag gttacttaat ctccaatgag gggctccatt tcagctatgt gttcagggtg    3060

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gtgtcgatta gtccagggca gacactggcg tttgttggga gcagtggatg tggcaaaagc    3360

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ggtcatgaca gcaaaaaagt aaatgtccag ttcctccgct caaacattgg aattgtttcc    3480

caggaaccag tgttgtttgc ctgtagcata atggacaata tcaagtatgg agacaacacc    3540

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gtcatgtcac tcccagagaa atatgaaact aacgttgggt cccaggggtc tcaactctct    3660

agaggggaga aacaacgcat tgctattgct cgggccattg tacgagatcc taaaatcttg    3720

ctactagatg aagccacttc tgccttagac acagaaagtg aaaagacggt gcaggttgct    3780

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cagaacgcgg atatcattgc tgtcatggca cagggggtgg tgattgaaaa ggggacccat    3900

gaagaactga tggcccaaaa aggagcctac tacaaactag tcaccactgg atcccccatc    3960

agttga                                                               3966

<210>3

<211>4650

<212>DNA

<213>人

<400>3

agtccaggaa tcatgctgga gaagttctgc aactctactt tttggaattc ctcattcctg    60

gacagtccgg aggcagacct gccactttgt tttgagcaaa ctgttctggt gtggattccc    120

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aagagatcct ctaccaccaa actctatctt gctaagcagg tattcgttgg ttttcttctt    240

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ttgggagggg atgacttgga cacatctgcc attcgacatg actgcaattt tgacaaagcc    1920

atgcagtttt ctgaggcctc ctttacctgg gaacatgatt cggaagccac agtccgagat    1980

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tttgtgttca tagcacattt ctggagtgcc tttggtttcg tccatgcatc aaatatcttg    3180

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<210>4

<211>6433

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒

<400>4

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cacagtatgg catcatgccc ctcacggcct ttgtgctggg caaggtcttc cggctgaaga    1200

acattgaggc actggccatc ttggtctgtg gctgctcacc tggagggaac ctgtccaatg    1260

tcttcagtct ggccatgaag ggggacatga acctcagcat tgtgatgacc acctgctcca    1320

ccttctgtgc ccttggcatg atgcctctcc tcctgtacat ctactccagg gggatctatg    1380

atggggacct gaaggacaag gtgccctata aaggcatcgt gatatcactg gtcctggttc    1440

tcattccttg caccataggg atcgtcctca aatctaaacg gccacaatac atgcgctatg    1500

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ccatcaatgt ggggaagagc atcatgtttg ccatgacacc actcttgatt gccacctcct    1620

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tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac    2220

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taggcttttg caaaaagctc ccgggagctt gtatatccat tttcggatct gatcaagaga    3120

caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg    3180

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ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg    3360

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ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg    3540

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cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg    5640

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tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat    5760

cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag    5820

gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat    5880

cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa    5940

ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa    6000

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<210>5

<211>9043

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒

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tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg  660

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acaatgacag atgtttttat tgactacgac gttgagttac aagaactcca gattccagga    1260

aaagcatgtg tgaataacac cattgtatgg actaacagtt ccctcaacca gaacatgaca    1320

aatggaacac gttgtgggtt gctgaacatc gagagcgaaa tgatcaaatt tgccagttac    1380

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attgccgcag ctcgtcagat acagaaaatg agaaaatttt actttaggag aataatgaga    1500

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gatattaata aaatcaatga tgccatagct gaccaaatgg cccttttcat tcagcgcatg    1620

acctcgacca tctgtggttt cctgttggga tttttcaggg gttggaaact gaccttggtt    1680

attatttctg tcagccctct cattgggatt ggagcagcca ccattggtct gagtgtgtcc    1740

aagtttacgg actatgagct gaaggcctat gccaaagcag gggtggtggc tgatgaagtc    1800

atttcatcaa tgagaacagt ggctgctttt ggtggtgaga aaagagaggt tgaaaggtat    1860

gagaaaaatc ttgtgttcgc ccagcgttgg ggaattagaa aaggaatagt gatgggattc    1920

tttactggat tcgtgtggtg tctcatcttt ttgtgttatg cactggcctt ctggtacggc    1980

tccacacttg tcctggatga aggagaatat acaccaggaa cccttgtcca gattttcctc    2040

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ctgcaactca ttcagcgatt ctatgacccc tgtgaaggaa tggtgaccgt ggatggccat    2400

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tttgcctttg cccagtgcat catgtttatt gcgaattctg cttcctacag atatggaggt    3960

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ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac    7200

agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa    7260

ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca    7320

caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc    7380

gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata    7440

cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta    7500

tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca    7560

gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga    7620

cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg    7680

tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg    7740

tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg    7800

caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag    7860

aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa    7920

cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat    7980

ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc    8040

tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc    8100

atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc    8160

tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc    8220

aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc    8280

catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt    8340

gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc    8400

ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa    8460

aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt    8520

atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg    8580

cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc  8640

gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa  8700

agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt  8760

gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt  8820

caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag  8880

ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta  8940

tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat  9000

aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtc                    9043

<210>6

<211>9658

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒

<400>6

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg  60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg  120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc  180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt  240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata  300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc  360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc  420

attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt  480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt  540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca    600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg    660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc    720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg    780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca    840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc    900

agtccaggaa tcatgctgga gaagttctgc aactctactt tttggaattc ctcattcctg    960

gacagtccgg aggcagacct gccactttgt tttgagcaaa ctgttctggt gtggattccc    1020

ttgggcttcc tatggctcct ggccccctgg cagcttctcc acgtgtataa atccaggacc    1080

aagagatcct ctaccaccaa actctatctt gctaagcagg tattcgttgg ttttcttctt    1140

attctagcag ccatagagct ggcccttgta ctcacagaag actctggaca agccacagtc    1200

cctgctgttc gatataccaa tccaagcctc tacctaggca catggctcct ggttttgctg    1260

atccaataca gcagacaatg gtgtgtacag aaaaactcct ggttcctgtc cctattctgg    1320

attctctcga tactctgtgg cactttccaa tttcagactc tgatccggac actcttacag    1380

ggtgacaatt ctaatctagc ctactcctgc ctgttcttca tctcctacgg attccagatc    1440

ctgatcctga tcttttcagc attttcagaa aataatgagt catcaaataa tccatcatcc    1500

atagcttcat tcctgagtag cattacctac agctggtatg acagcatcat tctgaaaggc    1560

tacaagcgtc ctctgacact cgaggatgtc tgggaagttg atgaagagat gaaaaccaag    1620

acattagtga gcaagtttga aacgcacatg aagagagagc tgcagaaagc caggcgggca    1680

ctccagagac ggcaggagaa gagctcccag cagaactctg gagccaggct gcctggcttg    1740

aacaagaatc agagtcaaag ccaagatgcc cttgtcctgg aagatgttga aaagaaaaaa    1800

aagaagtctg ggaccaaaaa agatgttcca aaatcctggt tgatgaaggc tctgttcaaa    1860

actttctaca tggtgctcct gaaatcattc ctactgaagc tagtgaatga catcttcacg    1920

tttgtgagtc ctcagctgct gaaattgctg atctcctttg caagtgaccg tgacacatat    1980

ttgtggattg gatatctctg tgcaatcctc ttattcactg cggctctcat tcagtctttc    2040

tgccttcagt gttatttcca actgtgcttc aagctgggtg taaaagtacg gacagctatc    2100

atggcttctg tatataagaa ggcattgacc ctatccaact tggccaggaa ggagtacacc    2160

gttggagaaa cagtgaacct gatgtctgtg gatgcccaga agctcatgga tgtgaccaac    2220

ttcatgcaca tgctgtggtc aagtgttcta cagattgtct tatctatctt cttcctatgg    2280

agagagttgg gaccctcagt cttagcaggt gttggggtga tggtgcttgt aatcccaatt    2340

aatgcgatac tgtccaccaa gagtaagacc attcaggtca aaaatatgaa gaataaagac    2400

aaacgtttaa agatcatgaa tgagattctt agtggaatca agatcctgaa atattttgcc    2460

tgggaacctt cattcagaga ccaagtacaa aacctccgga agaaagagct caagaacctg    2520

ctggccttta gtcaactaca gtgtgtagta atattcgtct tccagttaac tccagtcctg    2580

gtatctgtgg tcacattttc tgtttatgtc ctggtggata gcaacaatat tttggatgca    2640

caaaaggcct tcacctccat taccctcttc aatatcctgc gctttcccct gagcatgctt    2700

cccatgatga tctcctccat gctccaggcc agtgtttcca cagagcggct agagaagtac    2760

ttgggagggg atgacttgga cacatctgcc attcgacatg actgcaattt tgacaaagcc    2820

atgcagtttt ctgaggcctc ctttacctgg gaacatgatt cggaagccac agtccgagat    2880

gtgaacctgg acattatggc aggccaactt gtggctgtga taggccctgt cggctctggg    2940

aaatcctcct tgatatcagc catgctggga gaaatggaaa atgtccacgg gcacatcacc    3000

atcaagggca ccactgccta tgtcccacag cagtcctgga ttcagaatgg caccataaag    3060

gacaacatcc tttttggaac agagtttaat gaaaagaggt accagcaagt actggaggcc    3120

tgtgctctcc tcccagactt ggaaatgctg cctggaggag atttggctga gattggagag    3180

aagggtataa atcttagtgg gggtcagaag cagcggatca gcctggccag agctacctac    3240

caaaatttag acatctatct tctagatgac cccctgtctg cagtggatgc tcatgtagga    3300

aaacatattt ttaataaggt cttgggcccc aatggcctgt tgaaaggcaa gactcgactc    3360

ttggttacac atagcatgca ctttcttcct caagtggatg agattgtagt tctggggaat    3420

ggaacaattg tagagaaagg atcctacagt gctctcctgg ccaaaaaagg agagtttgct    3480

aagaatctga agacatttct aagacataca ggccctgaag aggaagccac agtccatgat    3540

ggcagtgaag aagaagacga tgactatggg ctgatatcca gtgtggaaga gatccccgaa    3600

gatgcagcct ccataaccat gagaagagag aacagctttc gtcgaacact tagccgcagt    3660

tctaggtcca atggcaggca tctgaagtcc ctgagaaact ccttgaaaac tcggaatgtg    3720

aatagcctga aggaagacga agaactagtg aaaggacaaa aactaattaa gaaggaattc    3780

atagaaactg gaaaggtgaa gttctccatc tacctggagt acctacaagc aataggattg    3840

ttttcgatat tcttcatcat ccttgcgttt gtgatgaatt ctgtggcttt tattggatcc    3900

aacctctggc tcagtgcttg gaccagtgac tctaaaatct tcaatagcac cgactatcca    3960

gcatctcaga gggacatgag agttggagtc tacggagctc tgggattagc ccaaggtata    4020

tttgtgttca tagcacattt ctggagtgcc tttggtttcg tccatgcatc aaatatcttg    4080

cacaagcaac tgctgaacaa tatccttcga gcacctatga gattttttga cacaacaccc    4140

acaggccgga ttgtgaacag gtttgccggc gatatttcca cagtggatga caccctgcct    4200

cagtccttgc gcagctggat tacatgcttc ctggggataa tcagcaccct tgtcatgatc    4260

tgcatggcca ctcctgtctt caccatcatc gtcattcctc ttggcattat ttatgtatct    4320

gttcagatgt tttatgtgtc tacctcccgc cagctgaggc gtctggactc tgtcaccagg    4380

tccccaatct actctcactt cagcgagacc gtatcaggtt tgccagttat ccgtgccttt    4440

gagcaccagc agcgatttct gaaacacaat gaggtgagga ttgacaccaa ccagaaatgt    4500

gtcttttcct ggatcacctc caacaggtgg cttgcaattc gcctggagct ggttgggaac    4560

ctgactgtct tcttttcagc cttgatgatg gttatttata gagataccct aagtggggac    4620

actgttggct ttgttctgtc caatgcactc aatatcacac aaaccctgaa ctggctggtg    4680

aggatgacat cagaaataga gaccaacatt gtggctgttg agcgaataac tgagtacaca    4740

aaagtggaaa atgaggcacc ctgggtgact gataagaggc ctccgccaga ttggcccagc    4800

aaaggcaaga tccagtttaa caactaccaa gtgcggtacc gacctgagct ggatctggtc    4860

ctcagaggga tcacttgtga cattggtagc atggagaaga ttggtgtggt gggcaggaca    4920

ggagctggaa agtcatccct cacaaactgc ctcttcagaa tcttagaggc tgccggtggt    4980

cagattatca ttgatggagt agatattgct tccattgggc tccacgacct ccgagagaag    5040

ctgaccatca tcccccagga ccccatcctg ttctctggaa gcctgaggat gaatctcgac    5100

cctttcaaca actactcaga tgaggagatt tggaaggcct tggagctggc tcacctcaag    5160

tcttttgtgg ccagcctgca acttgggtta tcccacgaag tgacagaggc tggtggcaac    5220

ctgagcatag gccagaggca gctgctgtgc ctgggcaggg ctctgcttcg gaaatccaag    5280

atcctggtcc tggatgaggc cactgctgcg gtggatctag agacagacaa cctcattcag    5340

acgaccatcc aaaacgagtt cgcccactgc acagtgatca ccatcgccca caggctgcac    5400

accatcatgg acagtgacaa ggtaatggtc ctagacaacg ggaagattat agagtgcggc    5460

agccctgaag aactgctaca aatccctgga cccttttact ttatggctaa ggaagctggc    5520

attgagaatg tgaacagcac aaaattctag cttaagcttg gtaccgagct cggatccact    5580

agtccagtgt ggtggaattc tgcagatatc cagcacagtg gcggccgctc gagtctagag    5640

ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg    5700

tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct    5760

aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg    5820

gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg    5880

cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg gggctctagg gggtatcccc    5940

acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg    6000

ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca    6060

cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcggggcat ccctttaggg ttccgattta    6120

gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc    6180

catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg    6240

gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat    6300

aagggatttt ggggatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta    6360

acgcgaatta attctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc    6420

aggcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt    6480

ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca    6540

tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc    6600

cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg    6660

agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc    6720

cgggagcttg tatatccatt ttcggatctg atcagcacgt gttgacaatt aatcatcggc    6780

atagtatatc ggcatagtat aatacgacaa ggtgaggaac taaaccatgg ccaagttgac    6840

cagtgccgtt ccggtgctca ccgcgcgcga cgtcgccgga gcggtcgagt tctggaccga    6900

ccggctcggg ttctcccggg acttcgtgga ggacgacttc gccggtgtgg tccgggacga    6960

cgtgaccctg ttcatcagcg cggtccagga ccaggtggtg ccggacaaca ccctggcctg    7020

ggtgtgggtg cgcggcctgg acgagctgta cgccgagtgg tcggaggtcg tgtccacgaa    7080

cttccgggac gcctccgggc cggccatgac cgagatcggc gagcagccgt gggggcggga    7140

gttcgccctg cgcgacccgg ccggcaactg cgtgcacttc gtggccgagg agcaggactg    7200

acacgtgcta cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat    7260

cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt    7320

cgcccacccc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac    7380

aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat    7440

caatgtatct tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg    7500

gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc    7560

cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc    7620

gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat    7680

cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac    7740

tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt    7800

aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca    7860

gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc    7920

ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact    7980

ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct    8040

gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg    8100

ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca    8160

cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa    8220

cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc    8280

gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag    8340

aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg    8400

tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca    8460

gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc    8520

tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag    8580

gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata    8640

tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat    8700

ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg    8760

ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc    8820

tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc    8880

aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc    8940

gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc    9000

gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc    9060

ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa    9120

gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat    9180

gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata    9240

gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca    9300

tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag    9360

gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc    9420

agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc    9480

aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata    9540

ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta    9600

gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtc      9658

Claims (52)

1.哺乳动物细胞，其具有第一面和第二面，两个面形成该细胞的外表面的部分，并且两个面与该细胞的接触区不同，并且所述第一面和第二面通过它们在该细胞的相对末端的定位而相互区别，其中第一面携带功能hNTCP蛋白，第二面携带功能hBSEP蛋白。

2.权利要求1所述的哺乳动物细胞，其中第一面是基底外侧面并且第二面是顶面。

3.权利要求1和2所述的哺乳动物细胞，其中第一面是顶面并且第二面是基底外侧面。

4.权利要求1到3所述的哺乳动物细胞，其中所述细胞是肾脏、肠系统、肝脏或者血/脑屏障的上皮细胞。

5.权利要求1到4所述的哺乳动物细胞，其是永生化的细胞。

6.权利要求1到5所述的哺乳动物细胞，其是重组细胞。

7.权利要求1到6所述的哺乳动物细胞，其是含有用于表达hNTCP蛋白的载体和用于表达hBSEP蛋白的载体的LLC-PK1细胞。

8.权利要求1到6所述的哺乳动物细胞，其是含有用于表达hNTCP蛋白的载体和用于表达hBSEP蛋白的载体的MDCKII细胞。

9.权利要求8的哺乳动物细胞，其是根据保藏物DSM ACC2643的细胞。

10.权利要求1到9的哺乳动物细胞的生产方法，其中

a]提供哺乳动物细胞；

b]提供包含hNTCP的编码序列的载体；

c]提供包含hBSEP的编码序列的载体；

d]将来自a]的哺乳动物细胞通过来自b]的载体和来自c]的载体同时或者连续转化；

e]鉴定并增殖来自d]的双转染子细胞。

11.权利要求10的哺乳动物细胞的生产方法，其中来自a]的哺乳动物细胞是肾脏、肠系统、肝脏或者血/脑屏障的上皮细胞。

12.权利要求10和11的哺乳动物细胞的生产方法，其中来自a]的哺乳动物细胞是永生化的细胞。

13.权利要求10到12的哺乳动物细胞的生产方法，其中来自b]的载体是根据图9的多核苷酸(Seq ID No.4)。

14.权利要求10到12的哺乳动物细胞的生产方法，其中来自c]的载体是根据图10的多核苷酸(Seq ID No.5)。

15.权利要求10到14的哺乳动物细胞的生产方法，其中将所述哺乳动物细胞建立为所保藏的细胞DSM ACC2643。

16.细胞单层，其包含至少两个权利要求1到9的细胞。

17.携带权利要求16的单层的固体表面，其中该细胞单层可以占据部分或者整个固体表面。

18.权利要求17的固体表面，其由塑料形成。

19.权利要求17的固体表面，其是培养皿的部分。

20.权利要求17的固体表面，其是滤器插入物(filter-insert)的部分。

21.培养皿，其携带根据权利要求17的细胞单层。

22.滤器插入物，其携带根据权利要求17的细胞单层。

23.权利要求22的滤器插入物，其中膜支持体由聚碳酸酯和/或聚酯制造。

24.权利要求22和23的滤器插入物，其中膜支持体的孔径为0.4μm。

25.权利要求1到9的哺乳动物细胞的用途，用于确定关于肝胆管清除和/或肾脏排泄和/或脑吸收和/或肠吸收的药理学分布图。

26.权利要求25的哺乳动物细胞的用途，其中哺乳动物细胞在固体表面和/或培养皿和/或滤器插入物上形成单层。

27.哺乳动物细胞，其具有第一面和第二面，两个面形成该细胞的外表面的部分，并且两个面与该细胞的接触区不同，并且所述第一面和第二面通过它们在该细胞的相对末端的定位而相互区别，其中第一面携带功能hNTCP蛋白，第二面携带功能hMRP2蛋白。

28.权利要求27所述的哺乳动物细胞，其中第一面是基底外侧面并且第二面是顶面。

29.权利要求27和28所述的哺乳动物细胞，其中第一面是顶面并且第二面是基底外侧面。

30.权利要求27到29所述的哺乳动物细胞，其中所述细胞是肾脏、肠系统、肝脏或者血/脑屏障的上皮细胞。

31.权利要求27到30所述的哺乳动物细胞，其是永生化的细胞。

32.权利要求27到31所述的哺乳动物细胞，其是重组细胞。

33.权利要求27到32所述的哺乳动物细胞，其是含有用于表达hNTCP蛋白的载体和用于表达hMRP2蛋白的载体的LLC-PK1细胞。

34.权利要求27到33所述的哺乳动物细胞，其是含有用于表达hNTCP蛋白的载体和用于表达hMRP2蛋白的载体的MDCKII细胞。

35.权利要求27到34的哺乳动物细胞，其是根据保藏物DSMACC2644的细胞。

36.权利要求27到35的哺乳动物细胞的生产方法，其中

a]提供哺乳动物细胞；

b]提供包含hNTCP的编码序列的载体；

c]提供包含hMRP2的编码序列的载体；

d]将来自a]的哺乳动物细胞通过来自b]的载体和来自c]的载体同时或者连续转化；

e]鉴定并增殖来自d]的双转染子细胞。

37.权利要求36的哺乳动物细胞的生产方法，其中来自a]的哺乳动物细胞是肾脏、肠系统、肝脏或者血/脑屏障的上皮细胞。

38.权利要求36和37的哺乳动物细胞的生产方法，其中来自a]的哺乳动物细胞是永生化的细胞。

39.权利要求36到38的哺乳动物细胞的生产方法，其中来自b]的载体是根据图9的多核苷酸(Seq ID No.4)。

40.权利要求36到38的哺乳动物细胞的生产方法，其中来自c]的载体是根据图11的多核苷酸(Seq ID No.6)。

41.权利要求36到38的哺乳动物细胞的生产方法，其中将所述哺乳动物细胞建立为所保藏的细胞DSM ACC2644。

42.细胞单层，其包含至少两个权利要求27到35的细胞。

43.携带权利要求42的单层的固体表面，其中该细胞单层可以占据部分或者整个固体表面。

44.权利要求43的固体表面，其由塑料形成。

45.权利要求43的固体表面，其是培养皿的部分。

46.权利要求43的固体表面，其是滤器插入物的部分。

47.培养皿，其携带根据权利要求27到35的细胞单层。

48.滤器插入物，其携带根据权利要求27到35的细胞单层。

49.权利要求48的滤器插入物，其中膜支持体由聚碳酸酯和/或聚酯制造。

50.权利要求48的滤器插入物，其中膜支持体的孔径为0.4μm。

51.权利要求27到35的哺乳动物细胞的用途，用于确定关于肝胆管清除和/或肾脏排泄和/或脑吸收和/或肠吸收的药理学分布图。

52.权利要求51的哺乳动物细胞的用途，其中哺乳动物细胞在固体表面和/或培养皿和/或滤器插入物上形成单层的部分。

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