CN1903858A

CN1903858A - 抗肿瘤化合物去乙酰真菌环氧乙酯及其制备方法

Info

Publication number: CN1903858A
Application number: CN 200610036892
Authority: CN
Inventors: 沈月毛; 杨丽姗; 黄耀坚; 郑忠辉; 宋思扬; 苏文金
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2006-08-03
Filing date: 2006-08-03
Publication date: 2007-01-31
Anticipated expiration: 2026-08-03
Also published as: CN100422190C

Abstract

抗肿瘤化合物去乙酰真菌环氧乙酯及其制备方法，涉及一种真菌代谢产生的化合物，提供一种结构新颖，用拟茎点霉A－1－2－3代谢产生的去乙酰真菌环氧乙酯与制法及在抗肿瘤药物或其他生物活性先导物中的应用。分子式为C₁₄H₁₆O₄，制备时取菌种接种于培养基培养至发酵，加入乙酸乙酯、甲醇和乙酸混合溶剂，收集提取液减压浓缩至膏状，用水分散，萃取至无色，分别得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇相浸膏。再分离，装柱，浓缩，洗脱，收集合并各个组分进行反相硅胶柱分离。取反相硅胶，装柱，洗涤，洗脱，收集每个柱体积的洗脱液，浓缩至干，收集第2个组分进行凝胶柱层析分离，取凝胶，装柱，洗脱，收集各组分。反复洗涤直至晶体表面无色素附着。

Description

抗肿瘤化合物去乙酰真菌环氧乙酯及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种真菌代谢产生的化合物，尤其是一种利用新分离获得的拟茎点霉(Phomosis sp.)A-1-2-3代谢产生的化合物去乙酰真菌环氧乙酯(Deacetyl-mycoepoxydiene化学名：2-(8-甲基-9-氧杂-双环[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧-3，6-二氢-2H-吡喃酮)。

背景技术

拟茎点霉(Phomosis sp.)A-1-2-3分离于福建省漳州市九龙江口浮宫镇草埔头村红树林生态区红树植物秋茄叶子，该属真菌为植物寄生菌(见裘纬蕃主编，菌物学大全[M]，北京：科学出版社，1998)，该菌株在20％海水配方马铃薯琼脂培养基(PDA)培养基上，生长良好，菌丝纯白，无明显色素产生，不产孢子，培养10d以后，产生黑色子座。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结构新颖，利用新分离获得的拟茎点霉A-1-2-3代谢产生的化合物去乙酰真菌环氧乙酯及其制备方法。

本发明的另一目的在于将化合物去乙酰真菌环氧乙酯作为抗肿瘤药物或其他生物活性的先导物。

本发明所采用的真菌为本申请发明人从福建省漳州市九龙江口浮宫镇草埔头(地名)红树林生态区的红树植物秋茄叶子中分离得到的菌株A-1-2-3，经鉴定为拟茎点霉(Phomosissp.)。该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，登记入册的保藏编号为CCTCC NO：M206060，保藏的培养物名称及注明的鉴别特征为拟茎点霉(Phomosis sp.)，保藏日为2006年6月26日。

本发明所述的真菌代谢产生的化合物去乙酰真菌环氧乙酯，其分子式为C₁₄H₁₆O₄，结构式为：

本发明所述的化合物去乙酰真菌环氧乙酯的制备方法，其步骤为：

1)固体培养及发酵产物处理：取斜面上菌种接种于20％海水配方马铃薯固体培养基(PDA)中培养至发酵，发酵产物分装后加入1～2倍体积的乙酸乙酯、甲醇和乙酸混合溶剂，按体积比乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝80∶15∶5，提取至少3遍，收集提取液，在45～55℃减压浓缩至膏状；膏状物用水分散，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取至无色，分别收集萃取液的有机相，在45～55℃减压浓缩至膏状，分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇相浸膏。

2)化合物分离：选取步骤1)中制得的乙酸乙酯相浸膏为上样样品，进行硅胶柱分离，取质量为上样量8～10倍的硅胶，用湿法装柱至硅胶的沉降不再变动，浓缩后的上样样品用硅胶拌样，干法上样，洗脱，洗脱溶剂系统按极性从小到大的顺序的洗脱梯度进行洗脱，收集每个梯度的洗脱液，浓缩至干，收集各个组分。

3)合并步骤2)中收集的第25、26、27个组分，进行反相硅胶柱分离，取质量为上样量40～800倍的反相硅胶，用湿法装柱至硅胶的沉降不再变动，用甲醇、丙酮等极性溶剂，洗涤柱子至液体没有颜色，再用水平衡柱子，使柱内充满水，湿法上样，洗脱，采用70％(v/v)甲醇—水固定梯度洗脱10～15个柱体积，收集每个柱体积的洗脱液，浓缩至干，共收集10～15个组分。

4)取步骤3)中收集的第2个组分，进行凝胶柱层析分离，取质量为上样量70～700倍的LH-20凝胶，用湿法装柱至硅胶的沉降不再变动，湿法上样，甲醇洗脱，自动收集器按1～1.2小时1管的速率，收集各组分，共收集90～120管。

5)将步骤4)中有羽状晶体析出的收集管用石油醚反复洗涤，直至晶体表面无色素附着，结晶制得的真菌代谢产物即为去乙酰真菌环氧乙酯；母液静置至有棒状晶体析出，反复洗涤，直至晶体表面无色素附着，得到透明棒状晶体的去乙酰真菌环氧乙酯。

在步骤1)中，取斜面上菌种接种于20％海水配方马铃薯固体培养基(PDA)中培养至发酵的温度为25～28℃，优选28℃。

在步骤2)中，取质量为上样量8～10倍的硅胶选用200～300目的硅胶，浓缩后的上样样品所用硅胶选用60～100目的硅胶。所述的洗脱溶剂系统按极性从小到大的顺序，由石油醚与乙酸乙酯不同体积比混合溶剂至纯乙酸乙酯为洗脱溶剂，总共7级洗脱梯度进行洗脱，每个洗脱梯度溶剂为1个柱床体积(300mL)的整数倍。所述的洗脱梯度分别为：石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1(3个柱床体积)、石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1(3个柱床体积)、石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1(6个柱床体积)、石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1(5个柱床体积)、石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1(6个柱床体积)、石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1(4个柱床体积)、乙酸乙酯(2个柱床体积)。所述的湿法装柱所采用的柱的柱高可为10cm，直径Φ为6cm。

在步骤3)中，所述的反相硅胶为Silicagel 60RP-18。每个收集组分为1个柱床体积(100mL)。所述的湿法装柱所采用的柱的柱高可为23cm，直径Φ为2.6cm。

在步骤4)中，所述的凝胶为SephadexLH-20。所述的湿法装柱所采用的柱的柱高可为150cm，直径Φ为2cm。

对化合物的分析进行晶体X-Ray(X衍射)，NMR(核磁共振)，生物活性等测试。

根据X-Ray衍射数据和NMR数据，对化合物去乙酰真菌环氧乙酯进行结构鉴定，可确定化合物结构。根据对化合物去乙酰真菌环氧乙酯的生物活性测定，利用细胞毒MTT(噻唑蓝)法(参见文献Mosmann F.Rapid colorinetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assay[J].J.Immunol Methods，1983，65：55-63)测定化合物的抗肿瘤活性，发现其对人B淋巴瘤Raji细胞IC₅₀＝3μg/mL。由此证明，化合物去乙酰真菌环氧乙酯具有抗肿瘤活性，可应用于制备抗肿瘤药物或其他生物活性先导物。

本发明所述的去乙酰真菌环氧乙酯结构新颖，具有很强的抗肿瘤活性。可以利用本发明所述菌株Phomosis sp.A-1-2-3发酵制得，马铃薯、葡萄糖、海水和琼脂等原料来源广泛，价格便宜，制备方法简单，易实现工业化生产。

附图说明

图1为本发明所述的化合物去乙酰真菌环氧乙酯的立体构型图。

具体实施方式

以下实施例将对本发明作进一步的说明。

实施例1

取斜面上菌种接种于20％海水PDA中培养至发酵，温度为28℃，将发酵产物分装于3L三角瓶中(1L/瓶)，加入2倍体积的乙酸乙酯、甲醇和乙酸混合溶剂，按体积比乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝80∶15∶5，提取3遍，收集提取液，用旋转蒸发仪50℃减压浓缩至膏状；膏状物用水分散，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取至无色，分别收集萃取液的有机相，用旋转蒸发仪50℃减压浓缩至干，分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇相浸膏。取质量为上样量10倍的硅胶(200～300目)，用湿法装柱，柱内径选为6cm，柱长为10cm，用泵加压至硅胶的沉降不再变动；浓缩后的乙酸乙酯相浸膏样品经60～100目硅胶拌样后压实平铺于柱面。采用正相柱层析法进行洗脱。洗脱溶剂系统按极性从小到大的顺序，由石油醚与乙酸乙酯不同体积比混合溶剂至纯乙酸乙酯为洗脱溶剂，总共7级洗脱梯度进行洗脱，每个洗脱梯度溶剂为1个柱床体积(300mL)的整数倍，洗脱液每300mL收集1管。减压浓缩洗脱液至干，总共得到29个回收组分。乙酸乙酯溶解后(若不溶，可加入适量甲醇至完全溶解)置于小管中常温自然挥发。

合并上一个步骤中的第25、26、27个组分，进行反相硅胶柱分离。取质量为上样量60倍的反相硅胶，用湿法装柱，柱内径选为2.6cm，柱长为23cm，用泵加压至硅胶的沉降不再变动，分别用甲醇、丙酮洗涤柱子至液体没有颜色，再用水平衡柱子，使柱内充满水。湿法上样，洗脱，采用70％(v/v)甲醇—水固定梯度洗脱，浓缩至干，共收集10个组分。甲醇溶解后置于小管中常温自然挥发。

取上一个步骤中的第2个组分，进行凝胶柱层析分离。取质量为上样量300倍的LH-20凝胶，用湿法装柱，柱内径选为2cm，柱长为150cm，至硅胶的沉降不再变动，湿法上样，甲醇洗脱，自动收集器按1～1.2小时1管的速率，收集各组分，共收集90管。该步骤中回收组分的第74～78管中出现羽状晶体，反复洗涤直至晶体表面无色素附着，结晶制得的真菌代谢产物即为去乙酰真菌环氧乙酯。母液静置至有棒状晶体析出，反复洗涤直至晶体表面无色素附着，得到去乙酰真菌环氧乙酯的透明棒状晶体。

对该化合物进行TLC(薄层层析)分析，在展层系统为石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1体系中，Rf值为0.35。挑取合适晶体进行晶体X-Ray衍射，其余取部分进行NMR、MS、生物活性等测试、保存。

化合物的结构鉴定可采用以下办法：化合物的结构鉴定采用晶体X-Ray^3，4分析测定，根据晶体数据，可确定上述化合物的结构。立体构型图如图1所示。

利用细胞毒MTT法测定化合物的抗肿瘤活性，发现其对人B淋巴瘤Raji细胞IC₅₀＝3μg/mL。可见，本发明所述的去乙酰真菌环氧乙酯可作为抗肿瘤药物或其他生物活性的先导物。

实施例2

与实施例1类似，其区别在于化合物的结构鉴定采用NMR(核磁共振)解析方法，根据NMR及MS数据，可确定上述化合物的结构。

从化合物的¹H NMR数据可以看出，该化合物低场位置有6个质子，(δ7.10dd，δ6.29d，δ6.09br dd，δ6.08br dd，δ5.91m，δ5.87m)，根据化学位移推测可能是3对烯烃质子，中间位置有4个质子，(δ4.46dd，δ4.44dd，δ4.27d，δ4.08dd)，根据化学位移推测可能是4个与氧原子直接相连的次甲基，较高场位置有2个质子，(δ2.91m，δ2.32m)由化学位移推测，可能是2个次甲基，高场位置有1个甲基(δ1.13，d，6.6，3H)。共合15个氢原子。结合¹H NMR，分析¹³C NMR和DEPT(不失真地极化转移增强)谱图可进一步确证化合物分子中含有1个酯羰基(δ165.8)，12个次甲基，其中6个不饱和次甲基(δ147.5～δ122.4)，6个饱和次甲基，其中4个次甲氧基(δ87.9，δ81.3，δ78.2，δ62.4)，2个次甲基(δ54.0，δ51.9)，1个甲基(δ14.8)。

ESI-MS数据显示该化合物分子量为248，结合NMR数据，可确定化合物的分子式为C₁₄H₁₆O₄，根据不饱和度的推算公式：UN＝Cm+1-Hn/2，其中UN为不饱和度，Cm为化合物中C原子的数目，Hn为化合物中H原子的数目，得出此化合物的不饱和度为7。扣除3对烯烃(3×1)和1个羰基(1×1)的不饱和度余3，说明化合物中还有3个环存在。

综合上述分析，结合晶体X-Ray分析测定得到的立体构型图，最后确定化合物为去乙酰真菌环氧乙酯，化合物¹H和¹³C NMR数据见表1。

表1化合物去乙酰真菌环氧乙酯的NMR数据(CD₃OD，TMS，ppm)

No.	δH(multiplicity，JH/HHZ)	δC
No.	δH(multiplicity，JH/HHZ)	δC	1234567891011121314	6.29(dd，5.8，10.3)7.10(dd，5.9，9.7)4.46(dd，2.4，10.9)4.44(dd，2.7，5.0)2.91(m)4.08(dd，2.2，5.8)6.08(br dd，5.1，11.5)5.87(m)5.91(m)6.09(br dd，4.6，9.7)4.27(d，4.5)2.32(m)1.13(d，7.0，3H)	165.8(s)125.8(d)147.5(d)62.4(d)81.3(d)51.9(d)78.2(d)137.6(d)126.1(d)122.4(d)139.6(d)87.9(d)54.0(d)14.8(q)

1.化合物溶于氘代甲醇(CD₃OD)试剂中，氢谱由TMS(四甲基硅烷)做内标，ppm为化学位移单位，百万分之一；

2.字母q，t，d，s分别代表伯，仲，叔，季碳，由DEPT图确定；

3.δC.C化学位移；δH：H化学位移J：耦合常数；

4.multiplicity：多重裂峰。

实施例3

与实施例1类似，其区别在于加入为发酵产物1.5倍体积的乙酸乙酯、甲醇和乙酸混合溶剂，按体积比乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝80∶15∶5，提取4遍，收集的提取液用旋转蒸发仪55℃减压浓缩至膏状；膏状物用水分散，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取至无色，分别收集萃取液的有机相，用旋转蒸发仪55℃减压浓缩至干，分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇相浸膏。

实施例4

与实施例1类似，其区别在于加入为发酵产物等体积的乙酸乙酯、甲醇和乙酸混合溶剂，按体积比乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝80∶15∶5，提取4遍，收集的提取液用旋转蒸发仪45℃减压浓缩至膏状；膏状物用水分散，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取至无色，分别收集萃取液的有机相，用旋转蒸发仪45℃减压浓缩至干，分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇相浸膏。

Claims

1.去乙酰真菌环氧乙酯，所述的真菌为拟茎点霉(Phomosis sp.)A-1-2-3，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，登记入册的保藏编号为CCTCC NO：M 206060，保藏的培养物名称及注明的鉴别特征为拟茎点霉(Phomosis sp.)A-1-2-3，保藏日为2006年6月26日，其特征在于其分子式为C₁₄H₁₆O₄。

2.如权利要求1所述的去乙酰真菌环氧乙酯，其特征在于其结构式为：

3.如权利要求1所述的去乙酰真菌环氧乙酯制备方法，其特征在于其步骤为：

1)固体培养及发酵产物处理：取斜面上菌种接种于20％海水配方马铃薯固体培养基中培养至发酵，发酵产物分装后加入1～2倍体积的乙酸乙酯、甲醇和乙酸混合溶剂，按体积比乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝80∶15∶5，提取至少3遍，收集提取液，在45～55℃减压浓缩至膏状；膏状物用水分散，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取至无色，分别收集萃取液的有机相，在45～55℃减压浓缩至膏状，分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇相浸膏；

2)化合物分离：选取步骤1)中制得的乙酸乙酯相浸膏为上样样品，进行硅胶柱分离，取质量为上样量8～10倍的硅胶，用湿法装柱至硅胶的沉降不再变动，浓缩后的上样样品用硅胶拌样，干法上样，洗脱，洗脱溶剂系统按极性从小到大的顺序的洗脱梯度进行洗脱，收集每个梯度的洗脱液，浓缩至干，收集各个组分；

3)合并步骤2)中收集的第25、26、27个组分，进行反相硅胶柱分离，取质量为上样量40～800倍的反相硅胶，用湿法装柱至硅胶的沉降不再变动，用甲醇、丙酮等极性溶剂，洗涤柱子至液体没有颜色，再用水平衡柱子，使柱内充满水，湿法上样，洗脱，采用体积比70％甲醇-水固定梯度洗脱10～15个柱体积，收集每个柱体积的洗脱液，浓缩至干，共收集10～15个组分；

4)取步骤3)中收集的第2个组分，进行凝胶柱层析分离，取质量为上样量70～700倍的LH-20凝胶，用湿法装柱至硅胶的沉降不再变动，湿法上样，甲醇洗脱，自动收集器按1～1.2小时1管的速率，收集各组分，共收集90～120管；

4.如权利要求3所述的去乙酰真菌环氧乙酯制备方法，其特征在于在步骤1)中，取斜面上菌种接种于20％海水配方马铃薯固体培养基中培养至发酵的温度为25～28℃。

5.如权利要求3所述的去乙酰真菌环氧乙酯制备方法，其特征在于在步骤2)中，取质量为上样量8～10倍的硅胶选用200～300目的硅胶；浓缩后的上样样品所用硅胶选用60～100目的硅胶。

6.如权利要求3所述的去乙酰真菌环氧乙酯制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述的洗脱溶剂系统按极性从小到大的顺序，由石油醚与乙酸乙酯不同体积比混合溶剂至纯乙酸乙酯为洗脱溶剂，总共7级洗脱梯度进行洗脱，每个洗脱梯度溶剂为1个柱床体积的整数倍；所述的洗脱梯度分别为：石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1、石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1、石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1、石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1、石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1、石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1、乙酸乙酯。

7.如权利要求3所述的去乙酰真菌环氧乙酯制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述的湿法装柱所采用的柱的柱高为10cm，直径Φ为6cm。

8.如权利要求3所述的去乙酰真菌环氧乙酯制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述的反相硅胶为Silicagel 60 RP-18，每个收集组分为1个柱床体积，所述的湿法装柱所采用的柱的柱高为23cm，直径Φ为2.6cm。

9.如权利要求3所述的去乙酰真菌环氧乙酯制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述的凝胶为SephadexLH-20，所述的湿法装柱所采用的柱的柱高为150cm，直径Φ为2cm。

10.如权利要求1所述的去乙酰真菌环氧乙酯应用于制备抗肿瘤药物或其他生物活性先导物。