CN1903192A - 抗病毒药物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
抗病毒药物，由C－21甾体类化合物以及药物载体组成，对alphavirus－like科的病毒具高度的选择性抑制作用，该类化合物选择性的破坏alphavirus－like科病毒的亚基因组的合成，使病毒不能装配成完整的病毒粒子而抑制病毒的增殖，对寄主细胞没有毒性，用于防治alphavirus－like科病毒。
Description
技术领域：本发明涉及一种抗病毒药物，具体地，涉及一类C-21甾体类化合物，其制备方法，以及其作为抗植物或动物病毒药物的用途。
背景技术：现有技术中没有C-21甾体类化合物作为抗病毒药物的报道。
发明内容：本发明基于发现和研究新类型的天然抗病毒活性物质的目的，通过抗病毒活性的筛选及其抗病毒活性机制的研究，发现植物中存在的天然C-21甾体类化合物具有抗TMV活性，且这类化合物的作用靶点是RNA病毒TMV CP的亚基因组RNA，可能对TMV类似基因组结构的RNA病有广谱的抗病毒活性，可作为新型的抗植物和动物病毒药物。
本发明由植物南板蓝根(Strobilanthes cusia)和徐长卿(Cynanchumpaniculatum kitag)中分离了五个C-21甾体类化合物：(1)白前苷元C(glaucogeninC)，(2)白前苷元C 3-O-β-D-夹竹桃吡喃糖苷(cynatratoside A)，(3)白前苷元C 3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-B-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-O-D-夹竹桃吡喃糖基-(1→4)→β-D-洋地黄毒吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷(paniculatumoside)，(4)白前苷元C 3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-O-L-2-脱氧毛地黄吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁嘛吡喃糖基-(1→4)-β-D-竹桃吡喃糖苷(paniculatumosideD)，(5)白前苷元C 3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-α-L-磁嘛吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黄毒吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷(paniculatumoside E)，发现它们对RNA病毒的增殖和侵染具有高度的抑制作用，证明该类化合物选择性地抑制烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白CP的mRNA的合成，因而使病毒不能装配成完整的病毒粒子而抑制病毒的增殖。该类化合物在可完全抑制病毒增殖的浓度(50nM)时对寄主细胞没有毒性，可用于防治与TMV具有类似基因组结构的植物和动物的RNA病毒。
本发明具体的技术方案为：
抗病毒药物，其中含有式(I)化合物和/或药学上可接受的载体
本发明同时提供了制备式(I)化合物的方法，取板蓝根，用90％的甲醇提取，浸膏分散在水和氯仿溶液，氯仿浸膏用9∶1CHCl3∶CH3OH硅胶柱洗脱，活性部分用硅胶柱、Sephadex LH-20和RP-18层析得到混合物1和2，然后用HPLC纯化得到化合物1和化合物2；另取徐长卿的根，用95％的乙醇提取，浸膏分配到石油醚和水相中脱脂，脱脂后的部分用乙酸乙酯萃取三次，回收溶剂后得乙酯部分萃取物，该部分反复上硅胶柱用9∶1，8∶2氯仿∶甲醇，7∶3，6∶4二氯甲烷∶丙酮洗脱剂洗脱，上反相柱，用8∶2，7∶3，6∶4，5∶5甲醇∶水及7∶3，6∶4丙酮∶水洗脱剂洗脱，最后用HPLC进行纯化分别得到化合物3、4和5。
本发明还进一步提供了式(I)化合物在制备抗病毒药物中的应用。
具体实施方式：
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1：本发明式(I)化合物的制备：
取南板蓝根全株(20kg)，以及徐长卿(70kg)的根。化合物(1)和(2)从南板蓝根中全株获得，提取方法如下：植物材料20kg用90％的甲醇提取，浸膏分散在水和氯仿溶液里，氯仿浸膏(70g)过硅胶柱用CHCl3/CH3OH(9∶1)进行洗脱，活性部分用硅胶柱、Sephadex LH-20和RP-18层析得到混合物(1)和(2)，用HPLC纯化得到11毫克化合物(1)和17毫克化合物(2)；另取徐长卿的根，用95％的乙醇提取，浸膏分配到石油醚和水相中脱脂，脱脂后的部分用乙酸乙酯萃取三次，回收溶剂后得乙酯部分萃取物，该部分反复上硅胶柱用9∶1，8∶2氯仿∶甲醇，7∶3，6∶4二氯甲烷∶丙酮洗脱剂洗脱，上反相柱，用8∶2，7∶3，6∶4，5∶5甲醇∶水及7∶3，6∶4丙酮∶水洗脱剂洗脱，最后用HPLC进行纯化分别得到535毫克化合物3、1120毫克化合物4和310毫克化合物5。
实施例2.本发明式(I)化合物对TMV的抑制作用试验
1、细胞实验(C-21甾体化合物对TMV在原生质体中复制的抑制作用)：
(1)病毒材料：TMV(2mg/ml)；细胞材料：烟草细胞BY-2的原生质体。
(2)方法：
a.烟草细胞BY-2的液体悬浮培养：悬浮细胞培养在含有20-25ml培养基50ml三角瓶中，28℃，140/min转避光培养。每隔7天继代一次。
b.烟草BY-2细胞的固体培养：为了长期维持BY-2细胞细胞株，在固体培养皿中，28℃，避光培养细胞团，每个月继代一次于新鲜培养基中。
c.烟草BY-2细胞的原生质体的制备：160×g，15分钟离心收集继代培养3-5天的BY-2细胞并用0.4M的甘露醇溶液洗一遍，将细胞重悬于含1％的纤维素酶RS和0.1％果胶酶Y-23的0.4M的甘露醇溶液中，30℃水浴酶解三小时，每隔15分钟轻轻摇晃一次并用显微镜检查酶解情况。待细胞被充分酶解后，将酶解细胞溶液分别过100μm和60μm的筛网并离心15分钟收集原生质体。再用W5溶液(NaCl 154mM/CaCl2.2H2O 125mM/kCl 5mM/Surcrose 5mM PH 5.9)
洗三次后将原生质体重悬于2-5ml W5溶液中并置于4℃待用。
d.C-21甾体化合物抑制病毒在原生质体中的复制：原生质体接种病毒采用聚鸟氨酸接种法：将含3×106/ml原生质体的悬浮液低速离心备用，将纯化的10ul TMV(2mg/ml)与不同浓度的药物混合后在37℃放置30分钟，然后悬浮在10ml含0.7M的甘露醇的0.02M柠檬酸钾缓冲液中(PH 5.2)，内含2μg/ml的聚鸟氨酸(分子量130000)。把原生质体重悬浮于10ml 0.7M的甘露醇中使其浓度为3×106/ml。立即把病毒悬浮液与原生质悬浮液混合，此时各成分的最终浓度是：TMV 1μg/ml，聚鸟氨酸1μg/ml，原生质体1.5×106/ml，在25℃下保温10分钟后，离心3分钟(35×g)收集原生质体，用0.7M/L的甘露醇内含0.1mMCaCl2洗三次，以除去未被吸附的病毒颗粒，然后放入原生质体培养基中培养。
不同时间取样，用TMV的枯斑寄主法检测不同浓度下病毒的增殖。
(3)实验结果：
式(I)所示的化合物当浓度达到10nM时对TMV的增殖都有显著的抑制作用，且随着浓度的增加，抑制率逐渐升高，当浓度达到50nM时，TMV的增殖完全受到抑制(表1)。
表1抗病毒化合物对TMV增殖的抑制(病毒感染12个小时取样测定效果)
| 化合物 | 浓度(nM) | 枯斑数a | 枯斑直径(mm)b | 抑制率(％) |
| glaucogenin C(1) | 01020304050 | 52±2.6443±4.5821±1.0011±2.648±3.000 | 2.6±0.102.1±0.201.9±0.371.5±0.101.3±0.100 | 017607985100 |
| cynatratoside A(2) | 01020304050 | 54±2.0043±1.5234±2.647±1.524±1.00 | 2.5±0.202.33±0.251.76±0.2081.46±0.3051.2±0.20 | 020378793100 |
| paniculatumosideC(3) | 01020304050 | 55.6±1.5245.0±2.0033.6±2.0815.6±2.084.0±2.000 | 2.53±0.1522.43±0.1521.63±0.2081.1±0.11.0±0.60 | 019407293100 |
| paniculatumosideD(4) | 01020304050 | 52±2.6449±1.036±2.0811±4.356.33±1.520 | 2.6±0.11.7±0.11.6±0.31.4±0.2081.2±0.2040 | 06317988100 |
| paniculatumosideE(5) | 01020304050 | 51.3±2.5143.0±2.032±2.014±3.056.6±1.520 | 2.6±0.5281.56±0.1531.33±0.1521.2±0.11.1±0.1520 | 016387387100 |
2、整体植物实验(C-21甾体化合物对TMV病毒对温室中生长的烟草的侵染的抑制作用)：
(1)病毒材料：TMV(2mg/ml)；植物材料：温室生长的5周的烟草K326植株，
(2)方法：将C-21甾体化合物制成不同浓度的水溶液，与5ul的TMV(2mg/ml)混合，37℃温浴15分钟后摩擦接种到烟草K326上。接种后，每隔5～10天观察记录其病级数，计算发病株率(RDP/％)、病情指数(ID/％)和防治效果。病株率(RDP/％)＝病株数/调查总株数×100
病情指数(ID)＝∑[(各级病叶数×相对级数值)]/调查总叶数×最高级数防治效果(Ce/％)＝对照区病情指数-试验区病情指数/对照区病情指数×100
(3)实验结果
整体烟草的药效试验结果表明，C-21甾体在50nM时对TMV的防治效果为84.9％～92.4％，而且这五个化合物都不影响烟苗的正常生长(表2)。
表2抗病毒化合物对TMV的防治效果
| 防治效果(％) | 化合物 | ||||
| 浓度(nM) | glaucogeninC | cynatratosideA | paniculatumosideC | paniculatumosideD | paniculatumosideE |
| 10203050 | 8.232.161.392.4 | 7.424.652.790.2 | 8.632.745.986.9 | 6.442.156.788.1 | 6.821.351.584.9 |
2、C-21甾体化合物抗病毒作用机制的探索
(1)C-21甾体化合物对TMV在烟草中系统侵染的影响：
为便于观察药物对TMV移动的影响，本发明构建了TMV的植物表达载体p35S-30B，并将绿色荧光的蛋白基因gfp插入TMV中构建成p35S-30B：GFP质粒并转入农杆菌中，然后用简单的农杆菌注射接种法(agroinoculation)接种烟草(N.benthamiana)。p35S-30B：GFP进入植物细胞后在细胞中表达产生带有绿色荧光标记的病毒，并可在寄主植物上发生系统侵染，使非接种叶在紫外光照下发出绿色荧光，用C-21甾体化合物处理含p35S-30B：GFP质粒的农杆菌后，再注射接种N.benthamiana的叶片，同不用药物处理的含p35S-30B：GFP质粒的农杆菌作对照。注射5天后观察病毒的移动情况，结果表明用抗病毒化合物处理的p35S-30B：GFP只在注射部位发绿色荧光，而对照病毒却可以沿着叶脉发生系统侵染，说明该类化合物可以抑制病毒的长距离的运输而不影响病毒基因组的复制。该类化合物只抑制病毒的长距离的运输而不影响病毒的复制。
(2)不同浓度的C-21甾体化合物对TMV外壳蛋白及TMV基因组和亚基因组RNA合成的影响：
a.方法：
(1)Western印迹法和ELISA实验检测C-21甾体化合物对TMV外壳蛋白合成的影响
BY-2原生质体病毒接种和不同药物浓度处理按上述方法，从用化合物处理的病毒感染3小时和12小时的原生质体提取总蛋白，外壳蛋白积累量的测定用Western和ELISA检测。用兔抗TMV血清作为一抗，用碱性磷酸酶偶联的羊抗兔Iga作为二抗。染色剂分别用o-phenylenediamine(ELISA)and NBT/BCIP(Northern)。
(2)Northern杂交实验检测C-21甾体化合物对病毒RNAs的影响
用TRIZOL试剂提取病毒感染3小时的原生质体的总RNA，取5μg RNA在1.2％的甲醛变性的琼脂胶上电泳，然后转膜。用外壳蛋白的cDNA作探针观察病毒的RNAs的合成。
b.实验结果：
TMV的基因组编码病毒RNA复制所必需的130KD和180KD的非结构蛋白，而决定病毒短距离移动和长距离移动的移动蛋白和外壳蛋白则是由其亚基因组RNA所编码的。这两个蛋白都不是病毒RNA复制所必需的。由上述实验可知这类化合物只影响了病毒的长距离移动而不影响病毒的复制，因此我们观察病毒外壳蛋白的积累是否受影响。Western印迹实验表明，随着化合物浓度的增加外壳蛋白的积累逐渐减少，当浓度达到50nM时，外壳蛋白的积累完全受到了抑制。
病毒外壳蛋白的积累取决于外壳蛋白的mRNA的合成和翻译，因此本发明利用外壳蛋白的cDNA做探针，观察病毒RNAs的合成，实验结果表明，病毒外壳蛋白mRNA的合成随着C-21甾体化合物浓度的增加而逐渐减少，当浓度达到50nM时，病毒的外壳蛋白mRNA的合成被完全抑制，但是病毒基因组的合成不受影响。而且病毒外壳蛋白的积累与其mRNA的积累同步。这个结论表明，这类化合物选择性的抑制了病毒外壳蛋白mRNA的合成而不影响其翻译。外壳蛋白mRNA的合成取决于RNA聚合酶和亚基因组RNA的启动子，由于化合物不影响基因组RNA的复制，因此RNA聚合酶应不受该类化合物的影响，只有亚基因组RNA的启动子可能受影响，因此这类化合物的作用靶点是RNA病毒的亚基因组RNA的启动子。由于TMV与其基因组结构相似的病毒在亚基因组RNA启动子的序列和二级结构方面的保守性很强，因此这类化合物可能也会抑制与TMV结构相似的RNA病毒，包括植物病毒和动物病毒，具有广谱的抗病毒活性。
实施例3：本发明化合物C-21甾体化合物作为有效成分的药物制剂：
本发明的化合物用作药物上时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用，该药物组合物含有0.1-99％，优选0.5-90％的，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、超填料以及药物制品辅剂。将所述的有效部位以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服给药。
口服可用其固体或液体制剂，如片剂、散剂、糖衣剂、胶囊、溶液、乳剂、糖浆、滴丸剂等。
下面仅提供几个制剂的例子，本发明的制剂并不局限于此。
(1)按实施例1制得式(I)5个化合物：(1)白前苷元C(glaucogeninC)，(2)白前苷元C 3-O-β-D-夹竹桃吡喃糖苷(cynatratoside A)，(3)白前苷元C 3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-B-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-O-D-夹竹桃吡喃糖基-(1→4)→β-D-洋地黄毒吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷(paniculatumoside)，(4)白前苷元C 3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-O-L-2-脱氧毛地黄吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁嘛吡喃糖基-(1→4)-β-D-竹桃吡喃糖苷(paniculatumoside D)，(5)白前苷元C 3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-α-L-磁嘛吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黄毒吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷(paniculatumoside E)，按化合物1或2或3或4或5与赋形剂重量比1∶2的比例加入赋形剂，制粒压片。
(2)按化合物1或2或3或4或5与赋形剂重量比1∶1的比例加入赋形剂，制粒压片。
(3)片剂：
化合物1或2或3或4或5 100mg
淀粉 100mg
玉米浆 适量
硬脂酸镁 适量
(4)按常规胶囊制剂方法制成胶囊。
胶囊剂：
化合物1或2或3或4或5 100mg
淀粉 100mg
葡萄糖 200mg
硬脂酸镁 适量
制备方法：将化合物与助剂研匀混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊。
(5)散剂：
化合物1或2或3或4或5 100mg
淀粉 100mg
蔗糖 200mg
制备方法：将化合物1或2或3或4或5、淀粉、蔗糖研细，混合均匀，过筛，分包即得。
Claims (3)
1、抗病毒药物，其中含有式(I)化合物和/或药学上可接受的载体
(1)R＝H
2、制备权利要求(1)所述的式(I)化合物的方法，其特征是取板蓝根，用90％的甲醇提取，浸膏分散在水和氯仿溶液，氯仿浸膏用9∶1CHCl3∶CH3OH硅胶柱洗脱，活性部分用硅胶柱、Sephadex LH-20和RP-18层析得到混合物1和2，然后用HPLC纯化得到化合物1和化合物2；另取徐长即的根，用95％的乙醇提取，浸膏分配到石油醚和水相中脱脂，脱脂后的部分用乙酸乙酯萃取三次，回收溶剂后得乙酯部分萃取物，该部分反复上硅胶柱用9∶1，8∶2氯仿∶甲醇，7∶3，6∶4二氯甲烷∶丙酮洗脱剂洗脱，上反相柱，用8∶2，7∶3，6∶4，5∶5甲醇∶水及7∶3，6∶4丙酮∶水洗脱剂洗脱，最后用HPLC进行纯化分别得到化合物3、4和5。
3、权利要求1化合物在制备抗病毒药物中的应用。
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