CN1879756A - 一种补肾养血软胶囊的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种补肾养血软胶囊的质量控制方法，具体涉及补肾养血软胶囊处方中制何首乌、当归、补骨脂的鉴别和制何首乌中二苯乙烯苷的含量测定方法。该质量控制方法提高了补肾养血软胶囊的质量标准，更好的控制了产品质量，并且能简便快捷的进行产品质量控制。

Description

一种补肾养血软胶囊的质量控制方法

                        技术领域

本发明涉及一种补肾养血软胶囊的质量控制方法。更具体的说本发明涉及补肾养血软胶囊处方中制何首乌、当归、补骨脂的鉴别和制何首乌中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量测定方法。

                        技术背景

《中华人民共和国卫生部药品标准》(中药成方制剂第五册)公布了补肾养血丸，处方由制何首乌80g、当归20g、黑豆40g、牛膝(盐制)20g、茯苓20g、菟丝子20g、补骨脂(盐制)10g、枸杞子20g组成，质量标准号为WS3-B-0948-91。具有补肝肾，益精血的功效。标准WS3-B-0948-91公布了性状、鉴别和丸剂项下的常规检查，其中鉴别项下的鉴别(2)为取本品5g，切碎，加乙醚20ml，密塞，振摇，浸渍过夜，滤过，滤液挥干乙醚，残渣加乙醇4ml溶解，作为供试液。取供试液2ml，置试管中，加0.5％醋酸镁甲醇溶液2～3滴，即显橙色。鉴别(3)为取鉴别(2)项下供试液2ml，置试管中，加氢氧化钠试液1～2滴，即显红色。鉴别(2)和(3)反应是鉴别蒽醌类化合物的显色反应，常见的含蒽醌类化合物的中药有大黄、芦荟、决明、茜草、虎杖、何首乌等，所以这两个鉴别专属性差，不能很好的控制产品质量。该方中制何首乌为君药，具有补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨的功效。《中草药》1997年第28卷第2期苏玮等发表的《何首乌的现代药理研究概况》一文报道了2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷为何首乌的特征成分。《中华人民共和国药典》(2005年版一部)收录了何首乌药材和制何首乌中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量测定方法，其中供试品溶液的制备为取本品粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减少的重量，摇匀，静置，取上清夜，即得。该处理过程需要先称定，再回流，最后再称定，过程繁琐。

                        发明内容

本发明目的是提供一种简便快捷、专属性好、精密度高的质量控制方法。包括：1、利用高效液相色谱法测定补肾养血软胶囊中制何首乌中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(以下简述二苯乙烯苷)的含量。2、利用薄层色谱法鉴别补肾养血软胶囊中药材制何首乌、当归和补骨脂。

补肾养血软胶囊处方由制何首乌480g、当归120g、黑豆240g、牛膝(盐制)120g、茯苓120g、菟丝子120g、补骨脂(盐制)60g、枸杞子120g组成。

提取方法为按上述处方称取以上八味药材，加6-10倍量70％乙醇提取三次，每次1-2小时，合并煎液，滤过，滤液回收乙醇得清膏后备用；药渣加8-12倍量水煎煮两次，每次1-2小时，滤过，滤液回收备用。合并上述两种清膏，继续浓缩至相对密度1.0-1.5(50℃)的清膏，喷雾干燥，收集干燥粉，过120目筛，加入植物油、卵磷脂、蜂蜡等辅料，搅匀，压制软胶囊1000粒，每粒装内容物0.65g，即得。

发明人针对本发明目的1利用高效液相色谱法测定补肾养血软胶囊中制何首乌的二苯乙烯苷含量，为了便于很好的控制处方中君药制何首乌的含量，进而控制产品质量，发明人对制何首乌中二苯乙烯苷的含量测定方法做了如下研究：

1、测定波长的选择

二苯乙烯苷对照品以流动相为溶剂测定其紫外吸收图谱，见附图1；由图所测结果λ_max＝320.8nm，因此确定本品的检测波长为320±2nm。

2、对照品溶液的制备

精密称取二苯乙烯苷对照品，用50％乙醇配置成浓度为10-60μg/ml的溶液。

3、色谱条件与系统适用性试验

发明人参照《中国药典》(2005年一部)中制何首乌的含量测定方法中的色谱条件，针对本产品补肾养血软胶囊，为了使二苯乙烯苷色谱峰与杂质峰分离度符合要求，以便二苯乙烯苷的含量测定结果更准确，对色谱条件做了深入的考察和筛选。筛选的色谱条件如下：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈—水的体积比为15-25∶85-75；检测波长为320±2nm。理论板数按二苯乙烯苷峰计算应不低于3000。

4、供试品溶液的制备

针对《中国药典》(2005年一部)中制何首乌的含量测定方法中供试品溶液制备过程繁琐，为了找到一种能够对补肾养血软胶囊中二苯乙烯苷提取完全、消耗成本最低、操作简便快捷的制备方法，发明人在溶剂的选择、用量、提取方法、提取时间进行了更深的考察，找出一个简便快捷的制备方法，现将供试品溶液制备方法研究表述如下：

4.1 提取溶剂的选择

取补肾养血软胶囊内容物(以下简述为本品内容物)约0.15g5份，精密称定，分别置50ml量瓶中，各加水、30％乙醇、50％乙醇、75％乙醇、无水乙醇约35ml，超声处理20min，放冷至室温，分别加入水、30％乙醇、50％乙醇、75％乙醇、无水乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表1。

                       表1 不同提取溶剂考察结果

提取溶剂	水	30％乙醇	50％乙醇	75％乙醇	无水乙醇
						二苯乙烯苷含量(mg/g)	6.9524	7.5909	7.8097	7.8058	7.2452

结果表明：本品内容物溶于水、30％乙醇和无水乙醇后结果偏低，溶于50％乙醇、75％乙醇结果基本没有区别，故将提取溶剂定为50％乙醇。

4.2 提取溶剂用量的选择

取本品内容物约0.15g4份，精密称定，分别置25、50、100、150ml容量瓶中，各加50％乙醇至容量瓶体积的2/3-3/4，超声处理20min，放冷至室温，分别加入50％乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表2。

                   表2 提取溶剂用量考察结果

溶剂用量(ml)	25	50	75	100
					二苯乙烯苷含量(mg/g)	7.2534	7.8097	7.8109	7.8021

结果表明：溶剂用量在25ml时，含量偏低，提取不完全；溶剂用量在50、75、100ml时，含量相差无几，说明提取已完全，考虑降低成本、减少污染环境，故将溶剂用量定为50ml。

4.3 提取方法的选择

取本品内容物约0.15g3份，精密称定，分别置50ml量瓶中，加50％乙醇约35ml，分别超声、回流、浸泡20min，放置至室温，分别加入50％乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表3。

                   表3 提取方法的考察结果

提取方法	回流	超声	浸泡
				二苯乙烯苷含量(mg/g)	7.8105	7.8097	6.2746

结果表明：本品采用回流和超声，含量相当，采用浸泡含量低，故提取方法选用操作简便的超声处理。

4.4 超声提取时间的确定

取本品内容物约0.15g4份，精密称定，分别置50ml量瓶中，加入50％乙醇约30ml，分别超声处理10、15、20、30min，放冷至室温，加入50％乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表15-5。

                     表4 超声提取时间考察结果

超声时间(min)	10	15	20	30
					二苯乙烯苷含量(mg/g)	7.6997	7.8109	7.8097	7.8021

结果表明：10-30分钟时本品中二苯乙烯苷几乎都能提取完全，15-30min时本品中二苯乙烯苷提取更为完全，故将超声提取时间最优选为15min。

因此供试品溶液的制备方法为：取本品内容物，混匀，取约0.15g，精密称定，置50ml量瓶中，加50％乙醇适量，超声处理15min，放冷至室温，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

本发明确定的技术方案为：

(1)、色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈—水体积比为13-23∶87-77；检测波长为320±2nm。

其中流动相乙腈—水较好的体积比为15-21∶85-79，更好的体积比为18∶82。

(2)、对照品溶液的制备：精密称取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品，用50％乙醇配置成浓度为10-50μg/ml的溶液。

其中对照品溶液浓度较好为20-40μg/ml，更好为30μg/ml。

(3)、供试品溶液的制备：取本品内容物，混匀，取约0.05-0.50g，精密称定，置50ml量瓶中，加50％乙醇适量，超声处理10-30min，放冷至室温，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

其中取本品内容物较好为0.10-0.30g，更好为0.15g。

(4)、测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-20μl，注入液相色谱仪，测定，按外标法以峰面积计算，即得。

其中分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl更好。

发明人为了验证所确定的技术方案是否可行、准确度是否高、阴性是否干扰，选用如下的技术方案进行方法学验证。

(1)、色谱条件与系统适用性试验  流动相乙腈—水体积比18∶82；检测波长为320nm。

(2)、对照品溶液的制备  精密称取二苯乙烯苷对照品，用50％乙醇配置成浓度为30μg/ml的溶液。

(3)、供试品溶液的制备  取本品内容物，混匀，取约0.15g，精密称定，置50ml量瓶中，加50％乙醇适量，超声处理15min，放冷至室温，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

(4)、测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，分别记录色谱图。对照品色谱图见附图2，供试品色谱图见附图3。

方法学验证内容：

1、专属性试验

按补肾养血软胶囊制备方法制备不含制何首乌的阴性制剂，取阴性制剂按供试品的制备及测定方法进行处理及测定，结果表明，色谱图中的与二苯乙烯苷色谱峰保留时间一致的位置上，无色谱峰干扰，并且与其他杂峰分离度符合要求，认为处方中除制何首乌的其他药材均不干扰制何首乌的含量测定。色谱图见附图4。

2、线性范围考察

取对照品适量，溶解并稀释成浓度分别为0.0031、0.0154、0.0309、0.0617、0.1543、mg/ml溶液，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表5。

      表5 线性关系考察结果

进样量(μg)	峰面积积分值
		0.0310.1540.3090.6171.543	120.14582.341174.262346.915868.42

线性方程为y＝3803.5x-0.4909.

3、精密度试验

精密吸取对照品溶液10μl，重复进样5次，结果见表6。

     表6 对照品精密度试验结果

次数	峰面积	RSD(％)
			12345	1174.261175.391171.581173.471171.72	0.14

精密吸取供试品溶液10μl，重复进样5次，结果见表7。

    表7 供试品精密度试验结果

次数	峰面积	RSD(％)
			12345	919.71918.77918.56915.65917.54	0.17

4、回收率试验

采用加样回收实验的方法，精密称定已知含量的样品(7.8092mg/g)约0.04g 3份、0.08g 6份，精密加入二苯乙烯苷对照品溶液(0.1543mg/ml)1.0、4.0、5.0ml各三份，依法测定，计算回收率，结果见表8。

                             表8 回收率测定结果

样品中二苯乙烯苷的量(mg)	添加二苯乙烯苷的量(mg)	测出量(mg)	回收率(％)	平均(％)	RSD(％)
						0.31260.32250.30790.63120.61850.62240.62570.60790.6183	0.15430.15430.15430.61720.61720.61720.77150.77150.7715	0.46330.48300.45591.25191.22961.23961.39811.37021.3821	99.22101.3098.64100.5799.01100.00100.1298.8199.00	99.63	0.91

由以上方法学验证证明本技术方案操作简便、专属性好，准确度高，重现性好。

本发明的另一目的利用薄层色谱法鉴别补肾养血软胶囊中药材制何首乌、当归和补骨脂，其中更为重要的是本发明用一种方法同时鉴别当归和补骨脂。发明人对所确定的技术方案进行了多批次的方法学研究，证明本技术方案方法可行，专属性好，方便快捷。具体研究如下所述。

1、制何首乌的薄层鉴别

本品的质量标准含量测定制定了有效成分二苯乙烯苷的含量测定方法，因此在薄层鉴别时采用何首乌对照药材为对照进行本产品的鉴别。由于制何首乌中含有蒽醌类化合物，溶于甲醇，而所含的油类成分在甲醇中不易提出，因此采用甲醇提取蒽醌类成分。

(1)供试品溶液的制备  取本品内容物约0.5-2.0g，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至约1ml作为供试品溶液。

(2)对照品溶液的制备  取何首乌对照药材0.5-2.0g，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至约1ml作为对照品溶液。

(3)阴性对照溶液的制备  取不含制何首乌的阴性制剂，同供试品溶液的制备方法处理，得阴性对照品溶液。

(4)测定方法  吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以展开剂氯仿-甲醇体积比6-9∶1-4，展开，取出，晾干，置波长为365nm紫外光灯下检视。

结果显示供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主荧光斑点，斑点显色清晰，阴性样品在相应位置无斑点，即阴性样品不干扰。结果见附图5。

采用多批样品验证，方法可行，专属性好，重现性好。

2、当归、补骨脂的薄层鉴别

采用一种方法将两种药材同时进行薄层鉴别。研究过程如下：

当归的薄层鉴别

由于当归中含有阿魏酸，本品提取工艺为先醇提后水提，可以最大限度的提取阿魏酸等有效成分，故进行本品中阿魏酸的薄层鉴别。

方法一：

供试品溶液1：取内容物4.0g，加乙酸乙酯20ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸至无乙酸乙酯，倾去油，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液1。

供试品溶液2：另取内容物4.0g，加甲醇20ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干(有少量油，弃去)，加入乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液2。

对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品，加甲醇制成1ml含1mg的溶液。

测定方法：吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄板上，以正己烷-氯仿-冰醋酸体积比8∶8∶1为展开剂，展开，展距8cm左右，取出晾干，在波长为254nm紫外光灯下检视。

结果显示供试品1、2在与阿魏酸对照品相应位置均无斑点。即未检到阿魏酸。

方法二：

供试品溶液：取本品内容物4.0g加甲醇10ml超声10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，调PH值至2左右，用乙醚萃取3次，每次20ml，醚液浓缩至约20ml，用2％的碳酸钠洗涤3次，每次20ml，合并碳酸钠液，弃去乙醚层用乙酸乙酯萃取一次弃去，水层用稀盐酸调PH值至2左右，用乙醚萃取3次，每次20ml，合并乙醚蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品，加甲醇制成1ml含1mg的溶液。

测定方法：吸取供试品液及阿魏酸对照品液(1mg/ml甲醇液)，展开条件同方法一，结果在波长为254nm紫外光灯下检视，

结果显示供试品在与阿魏酸对照品相应位置上无相同颜色的荧光斑点。

以上各供试品溶液加大点样量，结果仍未检出，改用硅胶G板，结果仍未检出，均未检出阿魏酸。

方法三：

供试品溶液的制备：取本品内容物4.0g加石油醚20ml，搅拌，静置，倾去石油醚层，药渣挥去石油醚，加1％的碳酸钠溶液20ml，超声10分钟，离心，倾取上清液，加稀盐酸调节PH至2-3，用乙醚萃取3次，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品，加甲醇制成1ml含1mg的溶液。

测定方法：测定方法同方法一和方法二，分别点于硅胶G及GF₂₅₄薄层板上，结果均未检出阿魏酸。

由于当归中含有的阿魏酸很少，并且补肾养血软胶囊处方中当归药材所占比例也很小，只占8.6％，，故放弃对阿魏酸的检测。

发明人又采用当归对照药材进行本品的检测。

方法四：

供试品溶液的制备：取内容物4.0g，加甲醇20ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干(有少量油，弃去)，加入乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：另取当归对照药材1.0g，加乙醚10ml，超声提取10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。

测定方法：吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G板上，以正己烷-乙酸乙酯体积比5∶1为展开剂，展开，展距8cm左右取出，晾干，在波长为365nm紫外光灯下检视。

结果显示供试品色谱中与对照药材色谱相应位置上有相同颜色的主斑点。斑点显色清晰。

补骨脂的薄层鉴别

方法一：

供试品溶液的制备：取本品内容物2.0g，加乙酸乙酯30ml，超声提取20分钟，，过滤，滤液蒸至无乙酸乙酯，加甲醇20ml，振摇，取上清液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：另取补骨脂对照药材1.0g，加乙酸乙酯30ml，超声提取20分钟，，过滤，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解作为补骨脂对照药材溶液。

测定方法：吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G板上，以正己烷-乙酸乙酯体积比8∶2为展开剂，展开，展距8cm左右取出，晾干，喷10％的氢氧化钾甲醇液，在波长为365nm紫外光灯下检视。

结果显示供试品色谱中与对照品色谱相应位置上有相同颜色的斑点。斑点显色清晰。

发明人在鉴别研究过程中发现，这二种药材处理方法相似，展开剂相近，故发明人采用相同的方法进行前处理和展开，用一种方法同时鉴别这两味药材。

鉴别方法如下：

供试品样品的制备：取本品内容物2.0g，加乙酸乙酯30ml，超声提取20分钟，，过滤，滤液蒸至无乙酸乙酯，加甲醇20ml，振摇，取上清液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：

取补骨脂对照药材1.0g，加乙酸乙酯30ml，超声提取20分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解作为补骨脂对照药材溶液。

另取当归对照药材1.0g，加乙醚10ml，超声提取10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为当归对照药材溶液。

阴性对照溶液的制备：取不含当归及补骨脂药材的阴性制剂，同供试品溶液的制备处理。

测定方法：吸取上述四种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G板上，以正己烷-乙酸乙酯体积比8∶2为展开剂，展开，展距8cm左右取出，晾干，喷10％的氢氧化钾甲醇液，晾干，在波长为365nm紫外光灯下检视。

结果显示供试品色谱中与当归对照药材及补骨脂对照药材色谱相应位置上有相同颜色的斑点，斑点显色清晰。阴性对照溶液在相应的位置无斑点，表明阴性样品不干扰。结果见附图6。

采用多批样品验证，方法可行，重现性好。

本发明目的2的技术方案如下：

制何首乌薄层鉴别：

(1)供试品溶液的制备  取本品内容物约0.5-2.0g，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至约1ml作为供试品溶液。

其中取本品内容物更好为1.0g。

(2)对照品溶液的制备  取何首乌对照药材0.5-2.0g，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至约1ml作为供对照药材溶液。

其中取何首乌对照药材更好为1.0g。

(3)测定方法  吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇体积比9-6∶1-4为展开剂，展开，取出，晾干，置波长为365nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

其中展开剂氯仿-甲醇更好体积比为8∶2。

当归、补骨脂的薄层鉴别：

(1)供试品溶液的制备  取本品内容物约1.0-4.0g，加乙酸乙酯30ml，搅拌，超声处理25分钟，滤过，滤液蒸至无乙酸乙酯，用甲醇20ml，溶解残留物，取上清液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。

其中取本品内容物更好为2.0g。

(2)对照品溶液的制备

取当归对照药材0.5-2.0g，加乙醚10ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为当归对照药材溶液；

取补骨脂对照药材0.5-2.0g，加乙酸乙酯30ml，超声处理25分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为对照药材溶液。

其中取当归对照药材更好为1.0g；取补骨脂对照药材更好为1.0g。

(3)测定方法  吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯体积比9-6∶1-4为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％的氢氧化钾溶液，晾干，置波长为365nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

其中展开剂正己烷-乙酸乙酯更好体积比为8∶2。

本发明克服了已有的质量标准WS3-B-0948-91中鉴别反应专属性差，《中国药典》(2005年一部)中制何首乌的含量测定方法供试品溶液制备过程繁琐，针对本产品补肾养血软胶囊发明了一种简便快捷、专属性好、重现性好、精密度高的质量控制方法，该方法提高了补肾养血软胶囊的质量标准，更好的控制了产品质量，并且能简便快捷的进行产品质量控制。

                        附图说明

附图1：二苯乙烯苷对照品的紫外吸收图；

附图2：二苯乙烯苷对照品的液相色谱图

附图3：供试品溶液的液相色谱图

附图4：缺制何首乌的阴性制剂的液相色谱图；

附图5：鉴别制何首乌薄层色谱图(供试品1、供试品2、供试品3、缺制何首乌的阴性样品、何首乌对照药材)；

附图6：鉴别当归和补骨脂薄层色谱图(供试品1、供试品2、供试品3、当归对照药材、补骨脂对照药材、缺当归和补骨脂的阴性样品)。

                    具体实施方式

用下文的实施例来进一步说明本发明，所用实施例不应当构成对本发明的限制。

实施例1：补肾养血软胶囊的质量控制方法

按处方称取药材制何首乌480g、当归120g、黑豆240g、牛膝(盐制)120g、茯苓120g、菟丝子120g、补骨脂(盐制)60g、枸杞子120g，以上八味药材加8倍量70％乙醇提取三次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液回收乙醇得清膏后备用；药渣加10倍量水煎煮两次，每次1小时，滤过，滤液回收备用。合并上述两种清膏，继续浓缩至相对密度1.25(50℃)的清膏，喷雾干燥，收集干燥粉，过120目筛，加入植物油、卵磷脂、蜂蜡等辅料，搅匀，压制软胶囊1000粒，即得。

取不同产地，不同批次的药材同上述制备方法制备10批样品。

1、按以下高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈—水体积比为18∶82；检测波长为320nm。

对照品溶液的制备：精密称取二苯乙烯苷对照品，用50％乙醇配置成浓度为30μg/ml的溶液。

供试品溶液的制备：取本品内容物，混匀，取约0.15g，精密称定，置50ml量瓶中，加50％乙醇适量，超声处理15min，放冷至室温，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，按外标法以峰面积计算，10批样品中二苯乙烯苷的含量结果如下：

               表9 样品二苯乙烯苷的测定结果

样品批号	测得结果(mg/0.65g)	平均含量(mg/粒)
			041001041002041003041004041005041006041007041008041009041010	4.84.74.54.64.74.62.22.35.25.25.15.15.25.34.74.63.83.73.23.0	4.3

根据中国药典2005版一部规定制何首乌的含量限度(0.8％)、本品制何首乌中二苯乙烯苷的转移率为55.6％和每粒中含制何首乌的生药量(0.48g)计算得每粒中二苯乙烯苷的量为：0.48g×1000×0.8％×55.6％＝2.13mg，由于不同产地、不同批次的药材的含量差异很大，并且在提取过程中损耗误差，因此暂定本品补肾养血软胶囊的含量限度为：本品每粒含制何首乌以二苯乙烯苷(C₁₀H₁₂N₅O₄)计，不得少于2.1mg。

以上结果表明本产品测定的10批样品含量都大于2.1mg。

2、薄层色谱法鉴别

制何首乌的薄层鉴别：

(1)供试品溶液的制备  取本品内容物约1.0g，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至约1ml作为供试品溶液。

(2)对照品溶液的制备  取何首乌对照药材1.0g，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至约1ml作为供对照药材溶液。

(3)测定方法  吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇体积比8∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置波长为365nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。

当归和补骨脂的薄层鉴别：

(1)供试品溶液的制备  取本品内容物约2.0g，加乙酸乙酯30ml，搅拌，超声处理25分钟，滤过，滤液蒸至无乙酸乙酯，用甲醇20ml，溶解残留物，取上清液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。

(2)对照品溶液的制备  取当归对照药材1.0g，加乙醚10ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为当归对照药材溶液。

取补骨脂对照药材1.0g，加乙酸乙酯30ml，超声处理25分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为对照药材溶液

(3)测定方法  吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯体积比8∶2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％的氢氧化钾溶液，晾干，置波长为365nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

实施例2：补肾养血软胶囊的质量控制方法

同实施例1制备方法制备补肾养血软胶囊。

1、照以下高效液相色谱法测定：

色谱条件：流动相乙腈—水体积比为20∶80；检测波长为320nm。

对照品溶液的制备：同实施例1配置成浓度为60μg/ml的溶液。

供试品溶液的制备：取本品内容物，混匀，取约0.50g，精密称定，其余同实施例1。

测定法：同实施例1，计算结果二苯乙烯苷含量3.2mg/0.65g。

2、薄层色谱法鉴别

制何首乌的薄层鉴别

(1)供试品溶液的制备  取本品内容物约2.0g，其它同实施例1。

(2)对照品溶液的制备  取何首乌对照药材2.0g，其它同实施例1。

(3)测定方法  以氯仿-甲醇体积比7∶3为展开剂，其它同实施例1

当归和补骨脂的薄层鉴别：

(1)供试品溶液的制备  取本品内容物约4.0g，其它同实施例1。

(2)对照品溶液的制备  取当归对照药材2.0g，其它同实施例1。取补骨脂对照药材2.0g，其它同实施例1。

(3)测定方法  以正己烷-乙酸乙酯体积比7∶3为展开剂，其它同实施例1。

实施例3：补肾养血软胶囊的质量控制方法

同实施例1制备方法制备补肾养血软胶囊。

1、照以下高效液相色谱法测定

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈—水体积比22∶78；检测波长为322nm。

对照品溶液的制备：同实施例1，配置成浓度为10μg/ml的溶液。

供试品溶液的制备：取本品内容物0.05g，同实施例1。

测定法：同实施例1，计算二苯乙烯苷含量为4.1mg/0.65g。

2、薄层色谱法鉴别

制何首乌的薄层鉴别：

(1)供试品溶液的制备  取本品内容物约0.5g，同实施例1。

(2)对照品溶液的制备  取何首乌对照药材0.5g，同实施例1。

(3)测定方法  以氯仿-甲醇体积比9∶1为展开剂，其它同实施例1。

当归和补骨脂的薄层鉴别：

(1)供试品溶液的制备  取本品内容物约1.0g，同实施例1。

(2)对照品溶液的制备  取当归对照药材0.5g，同实施例1。取补骨脂对照药材0.50g，同实施例1。

(3)测定方法  以正己烷-乙酸乙酯体积比8∶2为展开剂，同实施例1。

实施例4：补肾养血软胶囊的质量控制方法

按处方称取药材制何首乌480g、当归120g、黑豆240g、牛膝(盐制)120g、茯苓120g、菟丝子120g、补骨脂(盐制)60g、枸杞子120g，以上八味药材加10倍量70％乙醇提取三次，每次1.0小时，合并煎液，滤过，滤液回收乙醇得清膏后备用；药渣加12倍量水煎煮两次，每次1小时，滤过，滤液回收备用。合并上述两种清膏，继续浓缩至相对密度1.25(50℃)的清膏，喷雾干燥，收集干燥粉，过120目筛，加入植物油、卵磷脂、蜂蜡等辅料，搅匀，压制软胶囊1000粒，即得。

1、照以下高效液相色谱法测定

色谱条件：流动相乙腈—水体积比为15∶85；检测波长为319nm。

对照品溶液的制备：同实施例1，配置成浓度为20μg/ml的溶液。

供试品溶液的制备：取本品内容物0.10g，同实施例1处理。

测定法：同实施例1，计算二苯乙烯苷含量为4.1mg/0.65g。

2、薄层色谱法鉴别

制何首乌的薄层鉴别

(1)供试品溶液的制备  取本品内容物约1.0g，同实施例1。

(2)对照品溶液的制备  取何首乌对照药材1.0g，同实施例1。

(3)测定方法  以氯仿-甲醇体积比6∶4为展开剂，同实施例1，结果为供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

当归和补骨脂的薄层鉴别：

(1)供试品溶液的制备  取本品内容物约2.0g，同实施例1。

(2)对照品溶液的制备  取当归对照药材1.0g，同实施例1取补骨脂对照药材1.0g，同实施例1。

(3)测定方法  以正己烷-乙酸乙酯体积比6∶4为展开剂，同实施例1处理，结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

实施例5：补肾养血软胶囊的质量控制方法

同实施例4制备方法制备补肾养血软胶囊。

1、照以下高效液相色谱法测定

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈—水体积比23∶77；检测波长为319nm。

对照品溶液的制备：同实施例1配置成浓度为40μg/ml的溶液。

供试品溶液的制备：取本品内容物0.30g，同实施例1处理。

测定法：同实施例1，计算二苯乙烯苷的含量为2.8mg/0.65g。

2、薄层色谱法鉴别

制何首乌的薄层鉴别：

(1)供试品溶液的制备  取本品内容物约1.0g，同实施例1。

(2)对照品溶液的制备  取何首乌对照药材1.0g，同实施例1。

(3)测定方法  以氯仿-甲醇体积比8∶2为展开剂，其它同实施例1，结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

当归和何首乌的薄层鉴别：

(1)供试品溶液的制备  取本品内容物约2.0g，同实施例1。

(2)对照品溶液的制备  取当归对照药材1.0g，同实施例1。取补骨脂对照药材1.0g，同实施例1。

(3)测定方法  以正己烷-乙酸乙酯体积比8∶2为展开剂，同实施例1，结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

Claims (16)

1、一种补肾养血软胶囊的质量控制方法，其特征是利用高效液相色谱法测定补肾养血软胶囊中制何首乌中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量，它包括：

(1)、色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈-水体积比13-23∶87-77，检测波长为320±2nm；

(2)、对照品溶液的制备：精密称取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品，用50％乙醇配置成浓度为10-50μg/ml的溶液；

(3)、供试品溶液的制备：取补肾养血软胶囊内容物，混匀，取约0.05-0.50g，精密称定，置50ml量瓶中，加50％乙醇适量，超声处理10-30min，放冷至室温，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；

(4)、测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-20μl，注入液相色谱仪，测定，按外标法以峰面积计算，得出结果。

2、根据权利要求1所述的补肾养血软胶囊的质量控制方法，其特征是流动相乙腈-水较好的体积比为15-21∶85-79。

3、根据权利要求2所述的补肾养血软胶囊的质量控制方法，其特征是流动相乙腈-水更好的体积比为18∶82。

4、根据权利要求1所述的补肾养血软胶囊的质量控制方法，其特征是对照品溶液浓度较好为20-40μg/ml。

5、根据权利要求4所述的补肾养血软胶囊的质量控制方法，其特征是对照品溶液浓度更好为30μg/ml。

6、根据权利要求1所述的补肾养血软胶囊的质量控制方法，其特征是取补肾养血软胶囊内容物较好为0.10-0.30g。

7、根据权利要求6所述的补肾养血软胶囊的质量控制方法，其特征是取补肾养血软胶囊内容物更好为0.15g。

8、根据权利要求1所述的补肾养血软胶囊的质量控制方法，其特征是分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl更好。

9、一种补肾养血软胶囊的质量控制方法，其特征是利用薄层色谱法鉴别补肾养血软胶囊中药材制何首乌，它包括：

(1)、供试品溶液的制备取补肾养血软胶囊内容物约0.5-2.0g，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至约1ml作为供试品溶液；

(2)、对照品溶液的制备取何首乌对照药材0.5-2.0g，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至约1ml作为供对照药材溶液；

(3)、测定方法吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇体积比9-6∶1-4为展开剂，展开，取出，晾干，置波长为365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

10、根据权利要求9所述的补肾养血软胶囊的质量控制方法，其特征是取补肾养血软胶囊内容物更好为1.0g。

11、根据权利要求9所述的补肾养血软胶囊的质量控制方法，其特征是取何首乌对照药材更好为1.0g。

12、根据权利要求9所述的补肾养血软胶囊的质量控制方法，其特征是展开剂氯仿-甲醇更好体积比为8∶2。

13、一种补肾养血软胶囊的质量控制方法，其特征是利用薄层色谱法鉴别补肾养血软胶囊中药材当归和补骨脂，它包括：

(1)、供试品溶液的制备取补肾养血软胶囊内容物约1.0-4.0g，加乙酸乙酯30ml，搅拌，超声处理25分钟，滤过，滤液蒸至无乙酸乙酯，用甲醇20ml，溶解残留物，取上清液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；

(2)、对照品溶液的制备取当归对照药材0.5-2.0g，加乙醚10ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为当归对照药材溶液；取补骨脂对照药材0.5-2.0g，加乙酸乙酯30ml，超声处理25分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为对照药材溶液；

(3)、测定方法吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正已烷-乙酸乙酯体积比9-6∶1-4为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％的氢氧化钾溶液，晾干，置波长为365nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

14、根据权利要求13所述的补肾养血软胶囊的质量控制方法，其特征是取补肾养血软胶囊内容物更好为2.0g。

15、根据权利要求13所述的补肾养血软胶囊的质量控制方法，其特征是取当归对照药材更好为1.0g；取补骨脂对照药材更好为1.0g。

16、根据权利要求13所述的补肾养血软胶囊的质量控制方法，其特征是展开剂正已烷-乙酸乙酯更好体积比为8∶2。

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