CN1876632A - 固相时间分辨荧光免疫分析螯合剂及其制备方法 - Google Patents
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本发明的螯合剂为：2，2′，2″，2″′－{[4，4′－二异硫氰基－双(苯基－1－乙炔基)－4，4′－(2，2′－二吡啶)]－6，6′－(亚甲基次氮基)}－四乙酸。将两个4－异硫氰基－1－乙炔基－苯结合于2，2′－二吡啶的4，4′位上，可增强二吡啶发光效率并有利于螯合剂激发能向稀土离子转移，苯4位的异硫氰基无需联结剂在温和条件下与蛋白质游离氨基结合，确保蛋白质生物活性。吡啶4位与4－异硫氰基—苯之间是“硬性”键苯乙炔联结，可阻止螯合剂激发光能向蛋白质转移，减少蛋白分子对激发能的熄灭作用。二吡啶6，6′位上N，N′－四羧基八配位结构可牢固结合稀上离子，有效排除水分子的熄灭作用，提高螯合剂的水溶解性及在水溶液中的动力稳定性。
Description
技术领域
本发明属于固相时间分辨荧光免疫分析螯合剂及其制备方法。
背景技术
较完整介绍荧光免疫分析(以下简称FIA)技术始见于1979年Soini的报告[1]。由于荧光素标记物化学性质稳定，不受效期限制，不使用放射核素，使人们期望FIA能替代放射免疫分析(RIA)和酶联免疫分析(ELISA)。但实际测量FIA灵敏度比理论数值低100-1000倍[1]；其主要原因是常规使用的荧光素、若丹明等的发光波长和荧光寿命与荧光本底的波长及寿命接近或重叠，导致信号/噪声比降低[1，2]。
为解决这些问题，1974年Sundberg首次报告了用稀土Eu3+-螯合剂(氨基-苯基-EDTA)标记抗体进行时间分辨荧光免疫分析(以下简称TRFIA)的方法[3]。稀土离子作为荧光探针，它量子产率高，Stokes位移(＞200nm)大，荧光寿命(μs-ms)长，发射光谱窄(＜10nm)[4].
TRFIA的基本原理是用紫外光激发作为配体的螯合剂，螯合剂吸收能量后，跃迁到激发态后将部分能量传递给稀土离子，使稀土离子发射出较强的特征荧光，采用时间分辨技术，经过50-100μs的延迟测量，即可排除短寿命荧光本底干扰[5]，在适当条件下，Eu3+离子在水溶液中测量下限可达5×10-14mol/L。
Eu3+等稀土离子具有9配位的特性[1]，使其在水溶液中极易被共价结合的H2O分子包围，导致荧光熄灭[1，6]；这是TRFIA必须解决的问题。
1983年Soini，Skola等采用TRFIA解离增强体系(以下简称DELFIA)可排除水分子的干扰[7，8]，使TRFIA分析灵敏度提高100-1000倍[9]，对IgG分析灵敏度达0.025ng/ml。该方法是将Eu3+从免疫反应物上解离下来在荧光增强液(含表面活性剂TritonX-100，TOPO)中与β-二酮形成新的螯合物进行测定。现在，DELFIA体系已经被Wallac公司实现了商品化，在临床检测中得到应用[10]。
DELFIA属于间接检测方法。因为它需要将稀土离子从免疫反应物上解离下来，才能进行增强荧光的测量；由此失去了反应配基的空间结合信息，故不适用于原位杂交、免疫组化、均相免疫分析等[11]；从上世纪80年代后期，有关的研究重点转向直接TRFIA测量方法的研究。
1983年，Pettersson采用无须解离Eu3+离子的固相结合免疫配基，在固相上采用DELFIA相似的荧光增强液及多氨多羧基螯合剂(EDTA、DTPA等)，分析灵敏度比DELFIA低约10倍[12]。由此推论：要提高直接测量的TRFIA灵敏度，关键要制备发光效能更强的稀土离子双功能螯合剂。
稀土离子双功能螯合剂应满足下述基本要求：具有高的量子产率，在水溶液中的充分溶解性及动力稳定性，其蛋白质基团易于进行偶联反应，并经偶联蛋白质后不影响免疫反应性及特异性，稀土离子螯合基团在接近中性水溶液中与稀土离子形成牢固稳定的结合。螯合剂应尽可能避免含有高振动基团，如O-H，N-H和C-H键，以减少因键振动对荧光的熄灭[6]。
近卅年来，对发光体(parent)研究和应用以2，2′-二吡啶为最多，最初由Cook(1989)合成[13]。以2，2′-二吡啶为核心的螯合剂研究目前已见到有数百种[4，6，11]，按其结构特点可分为二类，一类是二吡啶联结4位芳香基，6，6′-多氨多羧基的螯合剂，这类螯合剂以Wallac实验室为代表的研究多集中于结构与光谱学关系的理论探讨，实际应用于TRFIA的报告不多；另一类为Alpha B(1987)首批以二吡啶为核心的穴状螯合剂(cryptates)。1993年，Mathis用穴状螯合剂作均相TRFIA检测泌乳素，灵敏度达到0.3μg/L[14].
除2，2′-二吡啶外，其他类型的螯合剂如1，7-双(氯磺二苯基)-1，10-菲洛啉-2，9-二羧酸(BCPDA)和2，6-二(3′-氨甲基-1′-吡唑)-(4-苯基吡啶)-羧酸(BPTA)用于TRFIA尚未达到DELFIA那样实用程度[15]。
由于螯合剂分子结构的改变会对整个螯合剂的效能产生影响[4，6，11，16]。迄今，有关螯合剂研究与实际要求仍有一定差距，分子生物学、基团组学、蛋白组学分析仍然采用光学性能较差的有机染料[5]。因此，研究更高效能，具有实际应用价值的稀土螯合剂，对TRFIA现代分子生物学、基团组学、蛋白组学的发展具有重要意义。
发明内容
为了解决固相时间分辨荧光免疫分析螯合剂技术上的不足，例如2，6-二吡啶非直接结合导致发光效率降低；4，4′-二吡啶联结非“硬键”方式偶联蛋白致使发光体(二吡啶)的发光能量被偶联的蛋白质淬灭；苯非异硫氰基(以下简称NCS)基团与蛋白质偶联易使蛋白生物活性降低。本发明的目的是提供了一种新的固相时间分辨荧光免疫分析螯合剂及其制备方法。
本发明的螯合剂名称为：2，2′，2″，2-{[4，4′-二异硫氰基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亚甲基次氮基)}-四乙酸；其结构式如下所示。
(1)、螯合剂发光体为处于中心部位的2，2′-二吡啶。
为比较各种发光体的发光效率，文献[6]中研究了它们发光产额(logR)，最大激发波长(λexc)和代表共价结合于稀土离子的H2O分子数的发射衰减常数(Kchel)，摘要列于表1。
表1.发光体螯合Eu3+后的logR、λexc和Kchel参数比较
| 发光体 | logR | λexc | Kchel |
| 吡啶 | 4.83 | 265 | 2.48 |
| 异喹啉 | 4.44 | 324 | 2.63 |
| 2，2′-二吡啶 | 5.50 | 307 | 1.70 |
| 2，2′-嘧啶 | 5.17 | 250 | 1.96 |
| 1，10-菲洛啉 | 5.26 | 272 | 4.24 |
| 二氮杂萘 | 4.65 | 312 | 3.09 |
由表1可见，2，2′-二吡啶发光率5.50，共价结合H2O分子为1.70个，其性能是最好的，它的λexc＞300nm，可减少本底荧光的影响[16]，2，2′-二吡啶较高的三重点能量与稀土离子发射能量有足够的间隔，可防止受激发离子的能量向配体的反向传递[11]。
(2)、2，2′-二吡啶联结蛋白的位置对螯合剂发光效能有重要作用。文献[4]报告二吡啶4，4′位联结二甲基、甲氧苯基的logR分别为5.61和5.57：而3，3′联结相应的基团则logR分别为4.90和3.91。本发明采用4，4′位联接本乙炔应该是合理的。
(3)、在二吡啶4，4′位上结合吸电子基团的苯基有利于提高发光效率及螯合剂内部能量向Eu3+离子的转移[4，6]。
(4)、螯合剂偶联蛋白大分子后，其发光率(ε·Φ)及发光寿命明显降低。有关的研究以吡唑-2，5-二吡啶为发光体的螯合剂-Tb为对象，比较其发光性质，结果如表2[11]。
表2.偶联蛋白前后螯合剂-Tb激发波长λexc、
发光寿命τ及发光产率ε·Φ的比较
| λexc(nm) | τ(μs) | ε·Φ | |
| 未偶联蛋白 | 330 | 2811 | 8800 |
| 偶联蛋白 | 328 | 1350 | 3860 |
由表2可见，偶联蛋白后发光产率降低一倍多，发光寿命从2811μs降至1350μs，由此可见，螯合剂偶联蛋白基团及偶联反应对螯合剂发光效能具有重要影响。为此，本发明的的偶联蛋白基团用NCS-4-苯乙炔联结在吡啶4位。这种可有效降低蛋白大分子对螯合剂能量的消耗[17，18]；而NCS基团不需加任何偶联试剂，即可在较温和的条件下与蛋白质游离氨基结合，有利于保持蛋白质的生物活性不受偶联反应的影响。
(5)稀土离子螯合基团为二吡啶6，6′位分别结合二组次氮基二羧酸；四羧酸能牢固结合稀上离子，增加螯合剂的水溶解性及水相中动力稳定性[4，6，11，16]。四羧基和四个氮原子形成八配位结构，有效地排除水分子的熄灭作用。
本发明的螯合剂从上述五方面全面考虑发光效率、荧光寿命和最大吸收波长，对核心配体、蛋白质偶联基团和稀土离子螯合基团进行优化组合，体现了本发明的技术特点。目前尚未见报道。
本发明所设计的螯合剂合成路线如下：
本发明的制备方法的步骤和条件，结合具体实施方式说明如下：
(1).用2-氨基-6-甲基吡啶制备2-溴-6-甲基吡啶。
把2-氨基-6-甲基吡啶72g(0.67mol)溶于330ml质量浓度为40％HBr溶液中，保持在-15～0℃，缓慢滴加100ml含量为2mol的Br2，再滴加含有亚硝酸钠116g的水溶液，该亚硝酸钠的水溶液是把1.68mol溶于175ml H2O中得到的，搅拌30min，继续滴加含有NaOH 253g的水溶液，该NaOH水溶液是把6.33mol溶于265mlH2O中得到的，再搅拌30min，用二氯甲烷提取，用MgSO4吸水干燥，减压浓缩，减压蒸馏在4mmHg下收集62-65℃油状物，得到结晶产物2-溴-6-甲基吡啶。
(2).向反应瓶内加入2-溴-6-甲基吡啶90g(0.53mol)，二水合甲酸钠82.6g(0.79mol)，含钯5％的碳3.2g，苄基三乙基氯化铵21.2g(0.08mol)，质量浓度为32％的NaOH溶液53ml，H2O 130ml，搅拌，加热至回流，反应48h，每隔4-8h加入3.8～11.5g二水合甲酸钠、0.8～1.5g含钯5％的碳、0.6～3.8g苄基三乙基氯化铵和6.7～13.5ml质量浓度为32％的NaOH溶液，用步骤①的方法提取、浓缩、干燥、减压蒸馏在2mmHg下收集105-106℃的馏分，得产物6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶。
(3)产物6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶10g(54.35mmol)加冰醋酸63.7ml，滴加22.3ml质量浓度为30％的H2O2溶液，于80℃搅拌条件下，持续加温7h，冷却至室温，用质量浓度为25％的NaOH溶液中和至中性，用氯仿萃取、干燥、浓缩，所得固体用大量乙醚洗，干燥，得产物6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物。
(4).将浓硫酸7.7ml与浓硝酸5.8ml混合后用冰水冷却，保持温度在-10～0℃，加入产物6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物1.92g(8.89mmol)，在100℃反应6h，滤出生成的沉淀，干燥，得黄色结晶4，4′-二硝基-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物。
(5).产物4，4′-二硝基-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物1.5g(4.9mmol)溶于20ml冰醋酸中，在60℃，滴加乙酰溴11.5ml，开口，控制反应温度在80℃，反应2.5h，冷却至室温，倒入100g碎冰中，用质量浓度为25％的NaHCO3溶液中和，用二氯甲烷萃取、干燥、浓缩，倒入适量乙醚，所得固体干燥，得产物4，4′-二溴-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物。
(6).产物4，4′-二溴-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物0.64g(1.71mmol)溶于16ml二氯甲烷，加入3.2ml三溴化磷，搅拌加热，回流反应2h，冷却后倒入少量碎冰中，分离二氯甲烷层，用质量浓度为25％的NaOH溶液碱化，得白色沉淀，得产物4，4′-二溴-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶。
(7).在氮气气氛下，产物4，4′-二溴-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶403.1mg(1.179mmol)溶于13ml甲苯，加入362.3mg(2.46mmol)的对硝基苯乙炔，68.62mg(0.059mmol)的Pd(PPh3)4和24.52mg(0.13mmcl)的CuI，回流反应4h，过滤除去无机成分，滤液倾入过量甲醇中，收集沉淀，溶于20ml四氢呋喃(以下简称THF)中，甲醇重结晶，再溶于THF经硅胶G柱层析纯化，洗脱液为正己烷和THF，正己烷和THF的体积比＝3∶1，得产物4，4′-对硝基苯乙炔-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶。
(8)产物4，4′-对硝基苯乙炔-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶48.92mg(0.103mmol)溶于150ml的CCl4，加入N-溴代琥珀酰亚胺45.94mg(0.26mmol)，回流反应30分钟，加入过氧化苯甲酰2.85mg，反应6h，先滤出固体成分，再冷却至0℃，所生成的沉淀用甲醇冲洗，滤液过硅胶柱，洗脱液为MeOH和CCl4，MeOH和CCl4体积比为1∶9，得(4，4′-二硝基苯乙炔)-2，2′-二吡啶-6，6′-双(溴亚甲基)。
(9).产物(4，4′-二硝基苯乙炔)-2，2′-二吡啶-6，6′-双(溴亚甲基)252.8mg(0.4mmol)，166.3mg(0.88mmol)的亚氨基二乙酸乙酯，0.21g(2.0mmol)的Na2CO3溶于10ml甲腈，回流反应过夜，沉淀滤出，滤液浓缩，硅胶纯化，洗脱液为MeOH和CHCl3，MeOH和CHCl3体积比为1∶9，得2，2′，2″，2-{[4，4′-二硝基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亚甲基次氮基)}-四乙酸酯。
(10).将蒸馏水16.4ml，浓氨水30ml，产物2，2′，2″，2-{[4，4′-二硝基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亚甲基次氮基)}-四乙酸酯13.91g(0.0164mol)先后加到250ml三颈瓶内，搅拌，冷却到0℃.锌粉16g(0.246mol)分次加入到反应瓶内，密封反应瓶，搅拌反应2.5h.随后室温继续搅拌20h.反应混合物用50ml水稀释，再用二氯甲烷萃取、洗涤、干燥，挥尽溶剂，剩余物在氩气保护下用石油醚-苯混合溶剂重结晶，得产物2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亚甲基次氮基)}-四乙酸酯。
(11).产物2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亚甲基次氮基)}-四乙酸酯236.4mg(0.3mmol)溶于三氟乙酸5ml，室温搅拌2h，减压蒸发除去三氟乙酸，再经乙酸酐处理，滤出沉淀，得2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)得产物2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亚甲基次氮基)}-四乙酸。
(12)产物2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亚甲基次氮基)}-四乙酸223.1mg(0.33mmol)溶于10ml的H2O中，用固体NaHCO3调pH至8.5，取二氯硫化碳42mg(0.305mmol)溶于10ml的CHCl3中，缓慢滴加，室温搅拌，当游离氨检测为阴性时，中止反应。分离出水相，蒸发浓缩，Florisil柱层析纯化，乙腈/水洗脱，得最终产物2，2′，2″，2-{[4，4′-二异硫氰基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亚甲基次氮基)}-四乙酸。
本发明的技术创新特点及有益效果如下：
本发明的螯合剂技术创新点：在2，2′-二吡啶两个4位中联结4-NCS-苯乙炔作为偶联蛋白基团。
常用的蛋白偶联基团有-NH2，-COOH，-HS，-SCl等，前三者需加偶联剂(戊二醛，碳二亚胺等)，反应过程较复杂，容易引起蛋白质自身偶联，甚至变性，第四种方法需在酸性条件偶联，而且该基团极不稳定，也不利于保持蛋白质的活性。本发明采用的偶联基团具有如下优点：
·不需要任何偶联剂，在非常温和的条件下-NCS基即可与蛋白质自行偶联，充分保证蛋白质的生物活性。
·-NCS和苯乙炔皆采用4位结合，可减少激发光能的损失。
·吡啶4位联结苯基可提高螯合剂发光效率及分子内能量的传递。
·苯基上的乙炔属“硬”性键(rigid backbone)[18]，可阻断蛋白大分子对螯合剂发光能量的消耗。
技术难点是在联结上述基团的反应过程如何保护相关基团不被破坏。其中-NCS在酸处理及氧化、溴化反应易分解，乙炔键在氧化、溴化中容易丢失。为此，采取如下措施：
·将联结苯乙炔基团安排在第6步反应后进行，可避免浓H2SO4、HNO3、乙酰溴、及三溴化磷的作用。
·联结苯乙炔后的反应9为保护炔键，6，6′-二甲基的溴化采用较温和的溴化剂-溴代琥珀酰亚胺。
·为保护-NCS，将该反应安排在最后一步，氨基在二氯硫化碳作用下转化成-NCS，使其不受前面一系列反应的影响。
本发明的螯合剂的技术指标及优点
·具有高发光效率及优越的光学性能。2，2′-二吡啶的发光效率logR为5.50，λexc为307nm，λem为660nm，发光衰减常数为1.70。
·四羧基和四氨基螯合基团以8配位牢固结合稀土离子，减少水分子的熄灭作用。
·吡啶4位上的苯基既可提高发光体发光效率，又提供了蛋白结合基团。
·吡啶4位的乙炔键保证了螯合剂发光能量高效率地传递给稀土离子。
·-NCS偶联蛋白后，保证蛋白生物活性不受影响。
·本螯合剂的高发光效率，在水溶液中的高溶解性及稳定性，高度离子结合能力和结合蛋白大分子的高生物活性，使其能用于固相TRFIA直接测量。
技术参考文献如下：
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Claims (2)
1、固相时间分辨荧光免疫分析螯合剂，其特征在于，该螯合剂名称为：2，2′，2″，2-{[4，4′-二异硫氰基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亚甲基次氮基)}-四乙酸；其结构式如下所示。
2、如权利要求1所述的固相时间分辨荧光免疫分析螯合剂的制备方法，其特征在于，步骤和条件如下：
(1).用2-氨基-6-甲基吡啶制备2-溴-6-甲基吡啶。
把2-氨基-6-甲基吡啶72g(0.67mol)溶于330ml质量浓度为40％HBr溶液中，保持在-15～0℃，缓慢滴加100ml含量为2mol的Br2，再滴加含有亚硝酸钠116g的水溶液，该亚硝酸钠的水溶液是把1.68mol溶于175ml H2O中得到的，搅拌30min，继续滴加含有NaOH 253g的水溶液，该NaOH水溶液是把6.33mol溶于265mlH2O中得到的，再搅拌30min，用二氯甲烷提取，用MgSO4吸水干燥，减压浓缩，减压蒸馏在4mmHg下收集62-65℃油状物，得到结晶产物2-溴-6-甲基吡啶。
(2).向反应瓶内加入2-溴-6-甲基吡啶90g(0.53mol)，二水合甲酸钠82.6g(0.79mol)，含钯5％的碳3.2g，苄基三乙基氯化铵21.2g(0.08mol)，质量浓度为32％的NaOH溶液53ml，H2O 130ml，搅拌，加热至回流，反应48h，每隔4-8h加入3.8～11.5g二水合甲酸钠、0.8～1.5g含钯5％的碳、0.6～3.8g苄基三乙基氯化铵和6.7～13.5ml质量浓度为32％的NaOH溶液，用步骤①的方法提取、浓缩、干燥、减压蒸馏在2mmHg下收集105-106℃的馏分，得产物6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶。
(3)产物6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶10g(54.35mmol)加冰醋酸63.7ml，滴加22.3ml质量浓度为30％的H2O2溶液，于80℃搅拌条件下，持续加温7h，冷却至室温，用质量浓度为25％的NaOH溶液中和至中性，用氯仿萃取、干燥、浓缩，所得固体用大量乙醚洗，干燥，得产物6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物。
(4).将浓硫酸7.7ml与浓硝酸5.8ml混合后用冰水冷却，保持温度在-10～0℃，加入产物6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物1.92g(8.89mmol)，在100℃反应6h，滤出生成的沉淀，干燥，得黄色结晶4，4′-二硝基-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物。
(5).产物4，4′-二硝基-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物1.5g(4.9mmol)溶于20ml冰醋酸中，在60℃，滴加乙酰溴11.5ml，开口，控制反应温度在80℃，反应2.5h，冷却至室温，倒入100g碎冰中，用质量浓度为25％的NaHCO3溶液中和，用二氯甲烷萃取、干燥、浓缩，倒入适量乙醚，所得固体干燥，得产物4，4′-二溴-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物。
(6).产物4，4′-二溴-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物0.64g(1.71mmol)溶于16ml二氯甲烷，加入3.2ml三溴化磷，搅拌加热，回流反应2h，冷却后倒入少量碎冰中，分离二氯甲烷层，用质量浓度为25％的NaOH溶液碱化，得白色沉淀，得产物4，4′-二溴-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶。
(7).在氮气气氛下，产物4，4′-二溴-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶403.1mg(1.179mmol)溶于13ml甲苯，加入362.3mg(2.46mmol)的对硝基苯乙炔，68.62mg(0.059mmol)的Pd(PPh3)4和24.52mg(0.13mmol)的CuI，回流反应4h，过滤除去无机成分，滤液倾入过量甲醇中，收集沉淀，溶于20ml THF中，甲醇重结晶，再溶于THF经硅胶G柱层析纯化，洗脱液为正己烷和THF，正己烷和THF的体积比＝3∶1，得产物4，4′-对硝基苯乙炔-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶。
(8).产物4，4′-对硝基苯乙炔-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶48.92mg(0.103mmol)溶于150ml的CCl4，加入N-溴代琥珀酰亚胺45.94mg(0.26mmol)，回流反应30分钟，加入过氧化苯甲酰2.85mg，反应6h，先滤出固体成分，再冷却至0℃，所生成的沉淀用甲醇冲洗，滤液过硅胶柱，洗脱液为MeOH和CCl4，MeOH和CCl4体积比为1∶9，得(4，4′-二硝基苯乙炔)-2，2′-二吡啶-6，6′-双(溴亚甲基)。
(9).产物(4，4′-二硝基苯乙炔)-2，2′-二吡啶-6，6′-双(溴亚甲基)252.8mg(0.4mmol)，166.3mg(0.88mmol)的亚氨基二乙酸乙酯，0.21g(2.0mmol)的Na2CO3溶于10ml甲腈，回流反应过夜，沉淀滤出，滤液浓缩，硅胶纯化，洗脱液为MeOH和CHCl3，MeOH和CHCl3体积比为1∶9，得2，2′，2″，2-{[4，4′-二硝基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亚甲基次氮基)}-四乙酸酯。
(10).将蒸馏水16.4ml，浓氨水30ml，产物2，2′，2″，2-{[4，4′-二硝基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亚甲基次氮基)}-四乙酸酯13.91g(0.0164mol)先后加到250ml三颈瓶内，搅拌，冷却到0℃.锌粉16g(0.246mol)分次加入到反应瓶内，密封反应瓶，搅拌反应2.5h.随后室温继续搅拌20h.反应混合物用50ml水稀释，再用二氯甲烷萃取、洗涤、干燥，挥尽溶剂，剩余物在氩气保护下用石油醚-苯混合溶剂重结晶，得产物2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亚甲基次氮基)}-四乙酸酯。
(11).产物2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亚甲基次氮基)}-四乙酸酯236.4mg(0.3mmol)溶于三氟乙酸5ml，室温搅拌2h，减压蒸发除去三氟乙酸，再经乙酸酐处理，滤出沉淀，得2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)得产物2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亚甲基次氮基)}-四乙酸。
(12).产物2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亚甲基次氮基)}-四乙酸223.1mg(0.33mmol)溶于10ml的H2O中，用固体NaHCO3调pH至8.5，取二氯硫化碳42mg(0.305mmol)溶于10ml的CHCl3中，缓慢滴加，室温搅拌，当游离氨检测为阴性时，中止反应。分离出水相，蒸发浓缩，Florisil柱层析纯化，乙腈/水洗脱，得最终产物2，2′，2″，2-{4，4′-二异硫氰基-双(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亚甲基次氮基)}-四乙酸。
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| CN103121967A (zh) * | 2011-11-18 | 2013-05-29 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种固相时间分辨荧光免疫分析螯合剂的中间体及其制备方法 |
| CN103980317A (zh) * | 2014-05-28 | 2014-08-13 | 南开大学 | 联吡啶四齿配体钌络合物及其制备方法和应用 |
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