CN111762774A - 一种采用生物胶原废弃物制备固相碳量子点的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种采用生物胶原废弃物制备固相碳量子点的方法及应用，该碳量子点的制备方法包括：(1)收集工厂产生的生物胶原废弃物作为碳源；(2)将所得到的生物胶原废弃物进一步酶解酸化处理、冷冻干燥并煅烧得到固相碳量子点粗产物；(3)将粗产物粉末收集，纯化后得到所述碳量子点材料。本发明制备方法简单易于操作，原料来源广泛、易得，实现了对于生物胶原废弃物的再利用，具有绿色无污染的优点，生物组织废弃物得到更高价值的回收利用，制得的碳量子点产率高，基本上实现碳源到碳量子点产品的全部转化，尤其适合大批量制备碳量子点，制备得到的碳量子点能够作为体内、体外成像剂使用，具有安全性高、毒副性低的优点。

Description

一种采用生物胶原废弃物制备固相碳量子点的方法及应用
技术领域
本发明涉及一种采用生物胶原废弃物制备固相碳量子点的方法及应用，属于纳米材料制备技术领域。
背景技术
荧光碳量子点尺寸在10nm以下，由于其低光漂白性、良好生物相容性、良好的水溶性、和极好的细胞膜通透性得到了极大的关注。这些性能使得碳量子点在生物体系中优于有机染料及无机重金属半导体量子点。
碳量子点的制备主要分为“自上而下”法和“自下而上”法。“自上而下”法是指通过化学氧化、水热、溶剂热、电化学剥离、激光消融等从大块石墨结构中切割或分解得到碳量子点。而“自下而上”法则是由合适的碳源分子前驱体通过聚合碳化得到的。尽管这些方法都可以制备出发荧光的碳量子点，但是经常包含复杂的制备过程、耗时较长、产率较低、前驱体昂贵等一系列反应条件限制了碳量子点的大批量制备的可能性，从而限制了碳量子点的实际应用前景。虽然有一些报道大批量制备碳量子点的方法，然而大量氧化性试剂以及昂贵、复杂前驱体的使用，使得制备方法不具备环境友好性；所得液相产品也存在提纯难、体积大、产率低、运输难等的诸多缺陷。因此，必须寻求新的方法实现固相高产率碳量子点的大批量制备。
生产胶原分子(如I型、III型、IV型、V型胶原蛋白等)的厂家在提纯胶原后产生的大量乙酸溶解的生物胶原废弃物。这些生物胶原废弃物主要为动物的皮、骨、尾、胎盘、肌腱等部位在提纯后产生的酸解物质。生物组织中丰富的氨基酸可作为优质碳源以制备碳量子点，提取胶原蛋白产品时大量添加的乙酸及蛋白酶可以作为分解剂切割碳结构，以便得到具有较小分子量的碳量子点前驱体。将这些生物胶原废弃物进一步酶解酸化处理，加深碳结构的切割解离，并在冷冻干燥处理过程后，将该生物胶原废弃物于惰性气体保护的管式炉中煅烧即可直接得到固相的碳量子点粗品。不同于其他煅烧方法只取碳化产品溶解后的溶液为产物，该法实现从碳源到固相碳量子点产品的直接转化，解决了以往碳量子点转化率低的问题。胶原结构中氨基酸分子间丰富的羧基、氨基、羟基等基团通过分子间相互作用固定官能团、并紧密堆积基团促进交联反应，达到碳量子点交联增强的发射性能。同时由于酸化处理过程中杂原子的掺杂提高了光稳定性，使得荧光碳量子点可用于生物成像。由于组装达到的官能团的堆叠，达到了对铁离子高度的亲和性。并且采取的碳源已经过初步酸解，有效促进了“自上而下”的制备进程，其产率高达85％，是目前报道的碳量子点产率的最高值。
因此，通过对生物胶原废弃物的再利用，以符合工业化“自上而下”的大规模生产需求、满足工艺简单且绿色环保的要求制备荧光碳量子点材料，有利于实现碳量子点的实际生产及生活应用前景。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提出了一种采用生物胶原废弃物实现大批量制备固相碳量子点的方法，并给出了碳量子点在成像剂和传感探针的应用。
本发明采用如下技术方案：一种采用生物胶原废弃物制备固相碳量子点的方法，包括如下步骤：
(1)碳源准备：将工厂提纯胶原蛋白后产生的生物胶原废弃物经进一步酶解酸化之后经去离子水充分洗涤，冷冻过夜；
(2)碳化：将上述生物胶原废弃物经真空冷冻干燥后在惰性气体保护下煅烧得到固相碳量子点粗品；
(3)纯化：将固相碳量子点粗品溶解后离心取上清液，然后将上清液在去离子水中透析后采用硅胶柱纯化，最后经冷冻干燥后得到碳量子点。
进一步的，所述步骤(1)中酶解、酸化是使用浓度为1-100g/L的胃蛋白酶的酸性溶液充分浸泡生物胶原废弃物1-5d。
进一步的，所述酸性溶液为0.001-14M的盐酸、乙酸、硝酸、硫酸、磷酸、硼酸、杂多酸或者混合酸，pH范围为0-5。
进一步的，所述步骤(2)中真空冷冻干燥时间为1～72h，在烘箱中的干燥条件为30～90℃，烘干1～36h。
进一步的，所述步骤(2)中在惰性气氛中煅烧，煅烧过程中升温速率1～5℃/min，煅烧温度为200-1000℃，煅烧时间为0.5-36h。
进一步的，所述步骤(3)中离心为3000～20000rad/min条件下离心1～30min，透析采用截留分子量1000～10000MW的透析袋，在去离子水中透析1～5d。柱层析选用100-200目硅胶为固定相，乙酸乙酯和甲醇1:1混合物为洗脱剂。
进一步的，所述碳量子点的得率为75-85％，制备得到的碳量子点的直径为2.2-6.7nm。
采用生物胶原废弃物制备碳量子点的方法制备得到的碳量子的应用，碳量子点能够在细胞培养中用于荧光成像。
采用生物胶原废弃物制备碳量子点的方法制备得到的碳量子的应用，碳量子点能够在紫外灯下用于指纹荧光成像。
采用生物胶原废弃物制备碳量子点的方法制备得到的碳量子的应用，碳量子点能够用于溶液中铁离子浓度的检测。
工厂在生产提纯胶原蛋白分子时会产生大量的生物胶原废弃物，这些生物胶原废弃物中富含多种氨基酸结构，是生产碳量子点的良好碳源。同时胶原中富含的氮原子以及酸性处理过程中添加的硫元素、磷元素等杂原子掺杂还可以提升碳量子点的光稳定性。胃蛋白酶的酸性溶液能够分解碳结构，并将碳结构切割为较小基团有利于碳化过程中碳量子点的合成，以此制备的碳量子点可作为良好的生物成像显色剂；在酸性条件下碳量子点对铁离子的亲和力明显优于其他金属离子，因此可作为高灵敏、高选择性检测环境中铁离子的荧光传感平台。
生物胶原废弃物其中蕴含的多层级等级结构可堆叠羧基、氨基等官能团从而促进结构交联，进而产生的碳量子点具有交联增强性的荧光发射。由于小尺寸导致的高细胞膜通透性能够便于碳量子点进出细胞。完全生物来源的前驱体从来源上就保障了碳量子点的安全性和低毒副性。碳量子点表面丰富的官能团使得其对于铁离子具有特异性的亲和力。铁离子与碳量子点结合并产生荧光共振能量转移，使得碳量子点的荧光淬灭。利用该原理，碳量子点可作为检测铁离子浓度的荧光探针。
本发明的有益效果：本发明中的原料来源广泛、易得，制备方法简单易于操作，实现了对于生物胶原废弃物的再利用，具有绿色无污染的优点，生物组织废弃物得到了更高价值的回收利用，制得的碳量子点产率高，基本上实现碳源到碳量子点产品的全部转化，尤其适合大批量制备碳量子点，制备得到的碳量子点具有较好的荧光性质和可修饰性，可作为体内、体外成像剂使用，具有安全性高、毒副性低的优点。
附图说明
图1为直接煅烧法制备出固相碳量子点粗品的照片；
图2为碳量子点粗品的TEM图像；
图3为纯化后碳量子点的TEM图像；
图4为碳量子点的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱图；
图5为碳量子点的红外光谱；
图6为碳量子点的表面光电子能谱；
图7为碳量子点的瞬态荧光光谱及拟合指数表；
图8为碳量子点的毒性试验研究CCK-8模式图；
图9为碳量子点用于胶原纤维的荧光成像图；
图10为碳量子点用于指纹成像荧光图；
图11为碳量子点用于HeLa细胞的荧光成像图；
图12中a为碳量子点用于铁离子检测的荧光图谱；b为荧光强度与铁离子浓度的线性关系图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明做进一步的解释和说明。
TEM测试条件：型号为日立JEM-2100F，加速电压为200kV，称取5mg碳量子点粗产物直接溶于水中配成1mg/mL的溶液。取一定体积的碳量子点母液稀释为0.5mg/mL，并取10uL滴加在碳支持膜的铜网上，并与室温下干燥可得透射电镜样品。
紫外-可见光谱测试条件：型号为岛津UV-1800紫外可见分光光度计。取一定体积的碳量子点母液稀释为0.5mg/mL，取3mL置于石英比色皿中进行测试。
荧光光谱测试条件：型号为岛津RF-5301PC荧光分度计。取一定体积的碳量子点母液稀释为0.1mg/mL，取3mL置于石英比色皿中进行测试。
红外光谱测试条件：型号为布鲁克IFS66V/S红外光谱仪，在400-4000cm-1波数范围内采集数据。按1:100质量比将碳量子点粗产物与溴化钾混合研磨后压片即可得测试样品。
表面能谱测试条件：型号为ESCALAB MK II X-射线光电子能谱，以Mg为激发源。
实施例一：
(1)准备碳源：将100g工厂提取胶原蛋白后剩余的牛肌腱废弃物加入5L的0.5M的乙酸溶液，并添加10g的胃蛋白酶，在4℃下搅拌2d。将浸泡后胶原废弃物用纱布过滤，用去离子水进行充分洗涤。清洗后于-20℃冰柜中冷冻过夜，然后经冻干机冷冻干燥36h，烘箱温度设置40℃下干燥8h，最后得到白色纱翼状固体即为碳源前驱体；
(2)碳化碳源：称取20g步骤(1)中所得到的碳源置于瓷舟中，并放置于管式炉中，在氮气保护下以1℃/min的程序从室温升温至300℃并保温6h；待温度降至室温，将瓷舟取出即可得到棕黄色碳量子点产品；
(3)纯化：将步骤(2)中所得碳量子点产品全部溶于水中，20000rad/min条件下离心10min去除沉淀，上清液用超纯水透析1d，经硅胶柱层析纯化，将得到的溶液进行冷冻干燥，获得纯化的碳量子点产品，产率为75％。
实施例二：
(1)准备碳源：将100g工厂提取胶原蛋白后剩余的鼠尾废弃物加入5L的0.1M的盐酸-硝酸混合物(体积比1:1)，并添加10g的胃蛋白酶，在4℃下搅拌3d。将浸泡后胶原废弃物用纱布过滤，用去离子水进行充分洗涤。清洗后于-20℃冰柜中冷冻过夜，然后经冻干机冷冻干燥36h，烘箱温度设置50℃下干燥6h，最后得到白色纱翼状固体即为碳源前驱体；
(2)碳化碳源：称取20g步骤(1)中所得到的碳源置于瓷舟中，并放置于管式炉中，在氩气保护下以5℃/min的程序从室温升温至400℃并保温4h；待温度降至室温，将瓷舟取出即可得到棕黄色碳量子点产品；
(3)纯化：将步骤(2)中所得碳量子点产品全部溶于水中，8000rad/min条件下离心30min去除沉淀，上清液用超纯水透析2d，经硅胶柱层析纯化，将得到的溶液进行冷冻干燥，获得纯化的碳量子点产品，产率为85％。
实施例三：
(1)准备碳源：将100g工厂提取胶原蛋白后剩余的牛肌腱、鼠尾、鱼皮混合废弃物中加入5L的0.3M的硝酸-硅钨酸混合物(体积比3:1)，并添加10g的胃蛋白酶，在4℃下搅拌5d。去除残存的大块组织然后用纱布过滤得到酶解酸化产物，用去离子水进行充分洗涤。清洗后于-20℃冰柜中冷冻过夜，然后经冻干机冷冻干燥48h，烘箱温度设置60℃下干燥4h，最后得到白色纱翼状固体即为碳源前驱体；
(2)碳化碳源：称取20g步骤(1)中所得到的碳源置于瓷舟中，并放置于管式炉中，在氩气保护下以10℃/min的程序升温至600℃并保温2h；待温度降至室温，将瓷舟取出即可得到棕黄色碳量子点产品；
(3)纯化：将步骤(2)中所得碳量子点产品全部溶于水中，10000rad/min条件下离心15min去除沉淀，上清液用超纯水透析3d，经硅胶柱层析纯化，将得到的溶液进行冷冻干燥，获得纯化的碳量子点产品，产率为80％。
采用实施例二制备得到的碳量子点进行纯化后采用上述测试条件，对碳量子点进行测试。
1、TEM检测。
直接制备的固相碳量子点呈棕黄色如图1所示。由图2可看出，在电子显微镜下碳量子点粗产物的粒径大小为4.5±2.2nm，纯化后碳量子点的粒径大小为3.2±1.0nm，粒径区间明显变窄，如图3所示。图4显示碳量子点在紫外光区有很强的吸收。其中，在270nm和320nm处有两个微弱的宽峰。前者可能归属于碳核的芳基sp2域的π-π*转移，而后者可能是由于胶原本身存在的杂原子在煅烧之后，掺杂在碳量子点表面，由缺陷激发而引起。吸收峰的尾部从350nm延伸至500nm，可以归因于C＝O的n-π*转移或碳量子点上的胺基。在紫外光的照射下碳量子点的水溶液可以发出明亮的蓝色荧光。荧光光谱显示碳量子点具有激发波长依赖的荧光特性，在300nm到400nm的紫外光激发下，碳量子点的荧光发射峰位置从398nm移动到了460nm处。这是由于碳量子点粒径不均或不同的表面化学导致的发射诱捕态造成的。经测量，碳量子点粗产物的量子产率为9％，而纯化后量子产率提高为16％，均满足作为高灵敏的荧光传感平台的要求。
2、碳量子点的光谱研究
胶原内富含氨基酸结构便于形成功能团的堆叠，有利于碳量子点内部共价键的形成并达到交联增强发射的效果。图5为碳量子点的红外光谱图显示具备多种官能团，图6的表面光电子能谱分析显示碳量子点具有N元素掺杂，且具备较高含量的官能团。图7的荧光衰减曲线显示，该碳量子点适用于三指数模型，包含一个约1ns的快组分和两个分别在4ns和11ns的慢组分。快组分为固有态发射，慢组分为缺陷态发射。图7中的插图显示碳量子点具有更高的慢组分百分比，说明其发光机理可能主要为缺陷态发光。
3、碳量子点的细胞毒性研究
如图8所示，用CCK-8试验检验碳量子点对细胞的毒性，HeLa细胞以每孔5×103个的密度培养24小时。接下来用不同浓度的碳量子点与HeLa细胞共同于添加5％二氧化碳的37℃的湿润孵化器中孵育24小时。碳量子点的浓度依次增加，分别为0，0.001，0.01，0.05，0.1，0.5，1.0mg/mL。在每孔中加入10μL的CCK-8溶液，并再次孵育1小时。之后用孔板光度计读出490nm处的吸收值。碳量子点的毒性可以通过与空白样品的吸收值对比得到。空白样品为在不添加碳量子点下，同等情况下培养HeLa细胞。在不同浓度碳量子点存在下，细胞成活率在80％以上。
4、基于碳量子点的荧光成像显色剂
图9表示碳量子点可以清晰判定直径约为200nm～500nm的胶原纤维。由于碳量子点具有良好的固态光致发光性能和亲脂性，因此有望实现固相碳量子点对于指纹的可视化观察。图10为在365nm紫外灯激发下碳量子点标记的指纹荧光图像。通过观察，指纹的细节部分清晰可辨，并且显示了指纹中乳头状脊线形貌，而通常这些二级信息包括分支和交叉，是区分在和识别个体的有效信息。此外，碳量子点的低毒性和生物相容性使得其可以作为生物成像剂满足生物系统的可视化实验要求。在细胞培养液中加入碳量子点，使其浓度为0.1mg/ml，与HeLa细胞在37℃下共同孵育2小时。之后用培养液冲洗细胞三次以洗掉多余的碳量子点。之后，用3.7％甲醛PBS溶液固色10分钟后用PBS溶液冲洗细胞三次。用蔡司LSM-710共聚焦显微镜进行观察和计数。图11显示细胞质的网状结构可以很清晰的借由碳量子点的蓝色荧光进行观察。碳量子点可以通过内吞作用被细胞摄取于细胞质，这也充分展示了碳量子点的低毒性和高效率。与传统的有机染料和半导体量子点相比，碳量子点明显具有更高的水溶性和生物适应性，更能应用于细胞内成像追踪、细胞免疫等方面的应用。
5、基于碳量子点的铁离子荧光检测平台
铁离子在新陈代谢、氧的输送、酶催化、血红蛋白的合成等一系列生理活动中都扮演了相当重要的角色，因此实现对铁离子的检测具有十分重要的意义。铁离子能与带有负电荷的碳量子点表面的羧基、羟基官能团通过静电及络合作用结合在一起。铁离子与结合位点之间的相互作用能够促使从碳量子点的激发态到铁离子d轨道的非辐射电子转移。为掩蔽其他过渡金属离子的干扰，在酸性体系下通过调节各种金属离子与碳量子点表面羟基官能团的Ksp值，使得碳量子点对铁离子具有最强的络合能力。在该实施例中，配置碳量子点的5μg/mL的水溶液100mL，调节溶液pH为3～4。分别取3mL碳量子点溶液加入不同体积铁离子的80mM溶液在室温下混合，并于黑暗中静置20分钟，其中铁离子的浓度依次为10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μM。依次测量混合溶液的荧光光谱，可得铁离子浓度线性曲线。该实施例的荧光强度变化图谱如图12a所示，随着铁离子浓度的增大，碳量子点的荧光强度也逐渐降低。铁离子浓度在0到100μM的范围内与碳量子点的荧光强度呈线性关系，反映出碳点的荧光淬灭应该是静态过程而非动态。图12b的Stern–Volmer曲线显示了这一线性关系。静态淬灭过程来源于基态荧光物质与淬灭离子间产生的非荧光复合物。荧光碳量子点呈现了良好的线性关系，铁离子的检出限为0.18μM(信噪比为3)。氨基酸组装堆叠起来的官能团使得碳量子点具有较高的量子产率和荧光强度，进而具备对于铁离子的高灵敏度。

Claims (10)

1.一种采用生物胶原废弃物制备固相碳量子点的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)碳源准备：将工厂提纯胶原蛋白后产生的生物胶原废弃物经进一步酶解酸化之后采用去离子水充分洗涤，冷冻过夜；
(2)碳化：将上述生物胶原废弃物经真空冷冻干燥后在惰性气体保护下煅烧得到固相碳量子点粗品；
(3)纯化：将固相碳量子点粗品溶解后离心取上清液，然后将上清液在去离子水中透析后采用硅胶柱纯化，最后经冷冻干燥后得到碳量子点。
2.如权利要求1所述的采用生物胶原废弃物制备固相碳量子点的方法，其特征在于：所述步骤(1)中酶解酸化是使用浓度为1-100g/L的胃蛋白酶的酸性溶液充分浸泡生物胶原废弃物1-5d。
3.如权利要求2所述的采用生物胶原废弃物制备固相碳量子点的方法，其特征在于：所述酸性溶液为0.001-14M的盐酸、乙酸、硝酸、硫酸、磷酸、硼酸、杂多酸或者混合酸，酸性溶液的pH范围为0-5。
4.如权利要求1所述的采用生物胶原废弃物制备固相碳量子点的方法，其特征在于：所述步骤(2)中真空冷冻干燥时间为1-2d，在烘箱中的干燥条件为30-90℃，烘干1-2d。
5.如权利要求1所述的采用生物胶原废弃物制备固相碳量子点的方法，其特征在于：所述步骤(2)中在惰性气氛中煅烧，煅烧过程中升温速率1～5℃/min，煅烧温度为200-1000℃，煅烧时间为0.5-36h。
6.如权利要求1所述的采用生物胶原废弃物制备固相碳量子点的方法，其特征在于：所述步骤(3)中离心为3000-20000rad/min条件下离心1-30min，透析采用截留分子量1000-10000MW的透析袋，在去离子水中透析1-5d，柱层析选用100-200目硅胶为固定相，乙酸乙酯和甲醇1:1混合物为洗脱剂。
7.如权利要求1所述的采用生物胶原废弃物制备固相碳量子点的方法，其特征在于：所述碳量子点的得率为75-85％，制备得到的碳量子点的直径为2.2-6.7nm。
8.根据权利要求1-7任意一项采用生物胶原废弃物制备固相碳量子点的方法制备得到的碳量子的应用，碳量子点能够在细胞培养中用于荧光成像。
9.根据权利要求1-7任意一项采用生物胶原废弃物制备固相碳量子点的方法制备得到的碳量子的应用，碳量子点能够在紫外灯下用于指纹荧光成像。
10.根据权利要求1-7任意一项采用生物胶原废弃物制备固相碳量子点的方法制备得到的碳量子的应用，碳量子点能够用于溶液中铁离子浓度的检测。
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