CN101221169A - 均相时间分辨荧光免疫分析螯合剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及均相时间分辨荧光免疫分析螯合剂及其制备方法。该螯合剂为：N，N，N’，N’－[[2，6－二(3’－氨甲基)－1－吡唑]－4－(4－异硫氰基(苯基乙炔)－吡啶)]－四乙酸。其发光基团为2，6－二(吡唑)吡啶；具有高三重态能量水平，结合稀土离子后激发波长为320nm，发射波长为520－620nm，发光寿命为2.99ms，量子产率0.58，符合均相TRFIA的要求在吡啶4－位结合苯乙炔，乙炔键可阻断联结蛋白大分子对发光能量的消耗。在吡啶4位苯基4－联结异硫氰基可无损伤的偶联蛋白质，有利于对螯合剂发光的高效测量。11配位的多氨多羧基结构，可排除水分子对稀土发光的淬灭作用，提高螯合剂在水中的溶解性和在水r溶液中的动力稳定性。
Description
技术领域
本发明属于均相时间分辨荧光免疫分析螯合剂及其制备方法。
背景技术
均相免疫分析(Homogeneous)是一种不需反复冲洗分离结合与游离标记物，在液相中即可直接测量的分析方法。此方法由于操作简便，快速，易于实现自动化操作，故长期以来成为免疫分析方法学研究追求的主要目标之一。
自1972年Rubenstein报告均相酶标记免疫分析方法之后的十余年有关均相和非均相酶标记分析多达10000份研究报告证明均相分析由于不能排除血浆中蛋白，血红素和多种酶的干扰使其灵敏度降低，因此最多用于体液中浓度较高的某些药物的分析。(参考文献Ngo.TTEnzyme-Mediated Immunoassay，edit Ngo.TT，plenum press.NewYork.1985，P1-28.)为解决上述酶作用底物显色易受血浆成分及外环境干扰，Boguslaski等(1980)用荧光染料代替酶标记发表了荧光均相免疫分析方法(FSIA)(参考文献Ngo.TT and woag，R.C.ibid P85)。荧光染料光学性质稳定，被广泛应用，但又遇到新的障碍，即荧光发射波在液相产生Raman散射以及其他大分子产生的波长为300-600nm的本底荧光，后者与测量荧光波长大部分相重叠，而且其发光寿命与荧光颜料都在1-50ns，(参考文献Hovinen.J and Hakala.H.OrganicLtters，2001，3(16)：2473-2476；Hemmil.I.Scaand.J.Clin.Lab.Invest，1988，48：389-400)降低了信号/噪声比，使分析的灵敏度降低。均相免疫分析的灵敏度还有一个限制因素是其测量信号依赖加入启动剂或淬灭剂产生的测量信号或清除费测量信号，这种机制难以提供足够强的测量信号(参考文献Knox.V.DLuminescence ImmunoassayandMolecularApplication.editKnoxV.D.New.YorkCRC-Press，1990.P66-7；Mathis.G.Clin.Chem.1993.39(q)：1953-1959)。
自上世纪80年代以来，一些研究者将共轭能量转移的理论和实践同时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)相结合，为解决上述两个问题提供了新的途径(参考文献 Morrison.L.E.，AnalyticalBiochemistry，1888，174：101-120；Wu，P.and BRAND.L.AnalyticalBiochemistry.1994，218：1-13)。其要点(1)在液相中能量转移的供体D与受体A之间的距离必须在有效(Fster)范围内(一般为10-100)，才能实现能量转移，应用于均相免疫分析时，只有当抗原D与抗体(包含D)结合时，D、A之间的距离使A的能量转移至D，使后者发射出可供测量的可见光信号。因此提高了测量信号的专一性；(2)由A到D的能量转移以及D接受能量的发光属化学发光，发光寿命为毫秒(ms)级，而A光致发光寿命毫微秒(ns)，经过时间分辨测量将后者删除，由此可显著提高信号/噪声比；当得乘积大于ΦEU(螯合剂中稀土离子发射产率)，即达到共轭能量转移，ΦA产率得到放大，高于螯合剂-稀土离子发射产率。例如文献[6]提供的数据，当ΦAΦB＝0.5大于ΦEU(0.3)时，ΦA＝0.68。
Wang等(2001)以一种多氨多羧螯合剂BPTA-Tb3+为供体，颜料Cy-3为受体，采用均相TRFIA检测BSM(一种药物)，其检测下限为2.1ng/ml(参考文Wang.G.etal.Helvetica Chimica Acta.1997，80：372-287)，此前Mathis用类似方法测量血清催乳素，达到较高的灵敏度0.3ng/ml，但仍未达到RIA的pg/ml水平。该著者认为有关均相免疫分析的研究多限于实验室阶段，离实验应用尚有一定的距离。
符合实际要求的均相TRFIA应具备所有的分析类型，高灵敏性及高度稳定性。要达到这些要求的关键是“理想”的螯合剂。这样的螯合剂其三重态能量水平要高，激发光峰值波长应大于300nm，以减少本底的影响，其发射波长要与受体激发波峰相重叠，此外也要具备通常稀土螯合剂的标准，如高发光效率，动力稳定性，与稀土离子高强度结合能力，通过多配位结合排除水分子和淬灭的能力以及以生物大分子偶联后尽可能保持其生物活性(参考文献Takalo H.HelveticaChimica.Acta，1993，76：877-883；Egbe.DAM，Macromol.Chem.Phys.，1998，199：2683-2688；Takalo H.Acta.Chem.Scand，1998.42：373-377；Mitrunen.K.Clin.Chem.1995，41(8)：1215-1120；Vermonden.Tetrahedron，2003，59(27)：5039-5045；Hakala.H.J.Luminescence.2005.113：17-2617；Carlos.J.Helvetic.Chmical.Acta.1997，80：86-96)。
发明内容
本发明是提供均相时间分辨荧光免疫分析螯合剂及其制备方法。
提供的螯合剂是以2，6-二(N-吡唑)吡啶为核心的多氨基多羧基结构。
本发明提供的螯合剂为：N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-异硫氰基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸；其结构式如下：
本发明的螯合剂合成路线如下：
本发明提供的螯合剂的制备方法的步骤和条件如下：
(1)N-氧化-2，6-二溴吡啶的合成
向三口反应器中加入2，6-二溴吡啶和质量浓度为30％的过氧化氢，2，6-二溴吡啶与过氧化氢摩尔比为1∶3，再加入与2，6-二溴吡啶摩尔比为(14∶1)～(15∶1)的三氟乙酸，35～42℃搅拌反应1～5h，冷却至室温，倒入蒸馏水中，冷却至-5～0℃，抽滤，滤液用无水Na2CO3中和pH值至9～11之间，用氯仿萃取，合并有机相，蒸除溶剂，得到白色固体产物N-氧化-2，6-二溴吡啶；
(2)N-氧化-2，6-二溴-4-硝基吡啶的合成
将摩尔比为1∶16的N-氧化-2，6-二溴吡啶和质量浓度为98％的浓H2SO4互溶，搅拌下加入体积比为2∶1的上述浓H2SO4和发烟硝酸的混合酸，升温至80～100℃，搅拌1～3h，冷却后倒入碎冰中，抽滤，真空干燥，得浅黄色固体产物N-氧化-2，6-二溴-4-硝基吡啶；
(3)2，6-二溴-4-氨基吡啶的合成
室温搅拌下向N-氧化-2，6-二溴吡啶中加入冰醋酸，冰醋酸与N-氧化-2，6-二溴吡啶摩尔比为(82∶1)～(88∶1)，再加入与N-氧化-2，6-二溴吡啶摩尔比为7∶1的还原铁粉，80～110℃反应0.5～2h，得到的灰白色稠状物，用饱和NaOH溶液调节pH值为9～11，冷却，用乙醚萃取，合并有机相，回收乙醚，得到白色固体产物2，6-二溴-4-氨基吡啶；
(4)2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-氨基吡啶的合成
将3-甲基吡唑溶于二甘醇二甲基醚中，3-甲基吡唑与二甘醇二甲基醚的摩尔比为1∶4，搅拌下加入金属钾，升温至60～80℃继续反应，待钾全部溶解后加入2，6-二溴-4-氨基吡啶，其中3--甲基吡唑、金属钾和2，6-二溴-4-氨基吡啶的摩尔比为4∶4∶1，在160～170℃下反应80～100小时，冷却，抽滤，减压蒸除滤液中溶剂，搅拌下加入蒸馏水，抽滤得浅黄色粉末，用体积比为2∶1的氯仿∶正己烷溶液提取，合并提取液，过滤，浓缩后冰盐浴冷却下重结晶，得到白色针状晶体2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-氨基吡啶；
(5)2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶的合成
向反应器中加入NaNO2、H2SO4和2，6-二(3-甲基-1-H-吡唑)-4-氨基吡啶，三者的摩尔比为1∶40∶1，其中2，6-二(3-甲基-1-H-吡唑)-4-氨基吡啶用醋酸溶解，并滴入反应器中，35～40℃下反应一小时，降温至-10～-5℃，将CuBr用HBr溶解，加入到反应器中，CuBr与2，6-二(3-甲基-1-H-吡唑)-4-氨基吡啶摩尔比为2∶5，在-10～-5℃反应半小时，再升温至40～60℃，反应一小时，然后降温至0～-7℃，用质量浓度为50％的NaOH溶液中和pH值为9～11，用氯仿萃取，蒸干溶剂，产物用氯仿∶甲醇体积比为2∶1的混合溶液重结晶，得黄色结晶2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶。
(6)2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶的合成
向三口反应器中加入2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶和N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶和N-溴代琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶2，其中2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶用CCl4溶解，再加入与2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶摩尔比为1∶109的过氧化苯甲酰，光照，回流反应0.5～2h，抽滤，对滤液进行蒸馏，得到的固体用氯仿为淋洗剂进行柱分离，得白色固体产物2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶；
(7)N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)的合成
向反应器中加入碳酸钠、亚氨基二乙酸二乙酯和2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶，三者的摩尔比为10∶2∶1，再加入与2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶摩尔比为(77∶1)～(192∶1)的无水乙腈，搅拌，回流20～24h，抽滤，回收滤液中溶剂，剩余部分溶于氯仿中，水洗氯仿溶液，有机相用无水硫酸钠干燥后蒸除溶剂，剩余油状物柱分离，柱分离的淋洗剂为体积比为3∶1的乙酸乙酯∶正己烷混合溶液，得产物N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)；
(8)N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)的合成
在氮气气氛下，向反应器中加入N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)、对氨基苯乙炔、四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)和CuI，四者的摩尔比为20∶40∶1∶20，其中N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)用甲苯溶解，回流反应2～5h，过滤除去无机成分，滤液倒入甲醇中，收集沉淀，溶于四氢呋喃中，用甲醇重结晶，经硅胶G柱层析纯化，淋洗剂为体积比为3∶1的正己烷和四氢呋喃混合溶液，得产物N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基)-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)；
(9)N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸的合成
N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基)-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)溶于与其摩尔比为225∶1的三氟乙酸中，室温搅拌1～3h，减压蒸发除去三氟乙酸，再经乙酸酐处理，滤出沉淀，得N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸；
(10)N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-异硫氰基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸的合成
N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸溶于H2O中，用固体NaHCO3调pH至7～9，取二氯硫化碳溶于CHCl3中，二氯硫化碳与CHCl3的摩尔比为1∶354，其中N，N，N’，N’-[[2，6-二二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸与二氯硫化碳的摩尔比为1∶1，滴加，室温搅拌，当游离氨检测为阴性时，中止反应，分离出水相，蒸发浓缩，Florisil柱层析纯化，乙腈/水洗脱，得最终产物N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸。
本发明的螯合剂设计及结构具有如下优点：
同一些三元结构比，发光核心体2，6-二(吡唑)吡啶的三重态能量水平E(cm-1)为25150是最高的，而三联吡啶为22400。该结构与稀土离子Tb3+结合后，激发波长为320nm，发光寿命2990μs，量子产率0.58，适合均相能量转移TRFIA应用。
四羧酸结构可增加螯合剂的水溶解性及动力稳定性。
七个氮原子加上四羧酸形成11配位结合稀土离子，提高结合强度又可有效地排除由水分子对稀土离子发光的淬灭作用。
在吡啶4-位结合苯乙炔，乙炔为硬性键，可阻断联结蛋白大分子对发光能量的消耗。
在吡啶4位苯基4-联结异硫氰基可以最简便的方式无损伤的偶联蛋白质，4-位偶联蛋白质，有利于对螯合剂发光的高效测量。
具体实施方式
实施例1
(1)N-氧化-2，6-二溴吡啶合成
向反应瓶中加入30.0g 2，6-二溴吡啶，180ml三氟乙酸，40ml质量浓度为30％的过氧化氢，35℃搅拌反应1h，冷却至室温，倒入蒸馏水中，冷却至-5℃，抽滤，滤液用无水Na2CO3中和至pH值为9，用氯仿萃取，合并有机相，蒸除溶剂，得到白色固体产物N-氧化-2，6-二溴吡啶。
(2)N-氧化-2，6-二溴-4-硝基吡啶合成
将19.8g N-氧化-2，6-二溴吡啶溶于67.8ml浓H2SO4中，搅拌下加入67.8ml浓H2SO4和34.2mL发烟硝酸的混合酸，升温至80℃，搅拌1h。冷却后倒入碎冰中，抽滤，真空干燥得浅黄色固体产物N-氧化-2，6-二溴-4-硝基吡啶。
(3)2，6-二溴-4-氨基吡啶合成
室温搅拌下向17.4g N-氧化-2，6-二溴吡啶中加入280mL冰醋酸，缓慢升温，加入23.2g还原铁粉，80℃反应1h，得到的灰白色稠状物，用饱和NaOH溶液调节pH值为9，冷却，用乙醚萃取，合并有机相回收乙醚，得到白色固体产物2，6-二溴-4-氨基吡啶。
(4)2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-氨基吡啶合成
将10.1mL3-甲基吡唑溶于73.5ml二甘醇二甲基醚中，搅拌下加入4.7g金属钾，升温至60℃继续反应，待钾全部溶解后加入7.56g2，6-二溴-4-氨基吡啶，160℃下反应80小时。冷却，抽滤，减压蒸除滤液中溶剂，搅拌下向残余液中加入蒸馏水，抽滤得浅黄色粉末，用体积比为2∶1的氯仿∶正己烷混合溶液提取，合并提取液，过滤，浓缩后冰盐浴冷却下重结晶得白色针状晶体2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-氨基吡啶。
(5)2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶合成
向反应瓶中加入0.02762g NaNO2，1ml H2SO4，将0.1002g 2，6-二(3-甲基-1-H-吡唑)-4-氨基吡啶用醋酸溶解，将此溶液滴入反应瓶中，35℃下反应一小时后，降温至-10℃。将0.14g CuBr用2ml HBr溶解，加入反应瓶中，-10℃反应半小时，再升温至40℃反应一小时，然后降温至0℃，用质量浓度为50％的NaOH溶液中和pH值为9，用氯仿萃取，蒸干溶剂，产物用氯仿∶甲醇体积比为2∶1的混合溶液重结晶，得黄色结晶2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶。
(6)2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶的合成
向反应瓶中加入g 2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶，30mLCCl4，7mg过氧化苯甲酰，加入1.19g N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，光照，回流反应0.5h。抽滤，对滤液进行蒸馏，得到的固体用氯仿为淋洗剂进行柱分离，得白色固体产物2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶。
(7)N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)的合成
向三口瓶中加入5.3g碳酸钠、1.94g亚氨基二乙酸二乙酯2.38g2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶，20mL无水乙腈，搅拌，回流20h。抽滤，回收滤液中溶剂，剩余部分溶于氯仿中，水洗氯仿溶液，有机相用无水硫酸钠干燥后蒸除溶剂，剩余油状物柱分离，淋洗剂为乙酸乙酯∶正己烷体积比为3∶1的混合溶液，得产物N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)。
(8)N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)的合成
在氮气气氛下，将815.9mg N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)溶于甲苯，加入362.3mg对氨基苯乙炔，68.62mg四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)和24.52mg CuI，回流反应2h，过滤除去无机成分，滤液溶于甲醇中，收集沉淀，溶于四氢呋喃中，用甲醇重结晶，经硅胶G柱层析纯化，淋洗剂为正己烷∶四氢呋喃体积比为3∶1的混合溶液，得产物N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)
(9)N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸的合成
将218.4mgN，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)溶于5ml三氟乙酸，室温搅拌1h，减压蒸发除去三氟乙酸，再经乙酸酐处理，滤出沉淀，得N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸；
(10)N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-异硫氰基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸的合成
将203.3mg N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸溶于H2O中，用固体NaHCO3调pH至7，取二氯硫化碳42mg溶于10ml CHCl3中，滴加，室温搅拌，当游离氨检测为阴性时，中止反应。分离出水相，蒸发浓缩，Florisil柱层析纯化，乙腈/水洗脱得最终产物N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸；
实施例2
(1)N-氧化-2，6-二溴吡啶的合成
向反应瓶中加入30.0g2，6-二溴吡啶，190ml三氟乙酸，40ml质量浓度为30％的过氧化氢，38℃搅拌反应2h，冷却至室温，倒入蒸馏水中，冷却至-5℃，抽滤，滤液用无水Na2CO3中和至pH值为10，用氯仿萃取，合并有机相，蒸除溶剂，得到白色固体产物N-氧化-2，6-二溴吡啶。
(2)N-氧化-2，6-二溴-4-硝基吡啶合成
将19.8g N-氧化-2，6-二溴吡啶溶于67.8ml浓H2SO4中，搅拌下加入67.8ml浓H2SO4和34.2mL发烟硝酸的混合酸，升温至90℃，搅拌2h。冷却后倒入碎冰中，抽滤，真空干燥得浅黄色固体产物N-氧化-2，6-二溴-4-硝基吡啶。
(3)2，6-二溴-4-氨基吡啶合成
室温搅拌下向17.4g N-氧化-2，6-二溴吡啶中加入290mL冰醋酸，缓慢升温，加入23.2g还原铁粉，100℃反应1h，得到的灰白色稠状物，用饱和NaOH溶液调节pH值为10，冷却，用乙醚萃取，合并有机相回收乙醚，得到白色固体产物2，6-二溴-4-氨基吡啶。
(4)2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-氨基吡啶合成
将10.1mL 3-甲基吡唑溶于73.5ml二甘醇二甲基醚中，搅拌下加入4.7g金属钾，升温至70℃继续反应，待钾全部溶解后加入7.56g2，6-二溴-4-氨基吡啶，163℃下反应96小时。冷却，抽滤，减压蒸除滤液中溶剂，搅拌下向残余液中加入蒸馏水，抽滤得浅黄色粉末，用氯仿∶正己烷体积比为2∶1的混合溶液提取，合并提取液，过滤，浓缩后冰盐浴冷却下重结晶得白色针状晶体2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-氨基吡啶。
(5)2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶合成
向反应瓶中加入0.02762g NaNO2，1ml H2SO4，将0.1002g 2，6-二(3-甲基-1-H-吡唑)-4-氨基吡啶用醋酸溶解，将此溶液滴入反应瓶中，37℃下反应一小时后，降温至-7℃。将0.14g CuBr用2ml HBr溶解，加入反应瓶中，-7℃反应半小时，再升温至50℃，反应一小时，然后降温至0℃，用质量浓度为50％的NaOH溶液中和至pH值为10，用氯仿萃取，蒸干溶剂，产物用氯仿∶甲醇体积比为2∶1的混合溶液重结晶，得黄色结晶2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶。
(6)2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶的合成
向反应瓶中加入1g 2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶，30mL CCl4，7mg过氧化苯甲酰，加入1.19g N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，光照，回流反应1h，抽滤，对滤液进行蒸馏，得到的固体用氯仿为淋洗剂进行柱分离，得白色固体产物2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶。
(7)N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)的合成
向反应瓶中加入5.3g碳酸钠，1.94g亚氨基二乙酸二乙酯，2.38g2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶，30mL无水乙腈，搅拌，回流22h。抽滤，回收滤液中溶剂，剩余部分溶于氯仿中，水洗氯仿溶液，有机相用无水硫酸钠干燥后蒸除溶剂，剩余油状物柱分离，淋洗剂为体积比为3∶1的乙酸乙酯∶正己烷混合溶液，得产物N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)。
(8)N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)的合成
在氮气气氛下，将815.9mg N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)溶于甲苯，加入362.3mg对氨基苯乙炔，68.62mg四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4)和24.52mg CuI，回流反应4h，过滤除去无机成分，滤液溶于甲醇中，收集沉淀，溶于四氢呋喃中，用甲醇重结晶，经硅胶G柱层析纯化，淋洗剂为正己烷∶四氢呋喃体积比为3∶1的混合溶液，得产物N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)。
(9)N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸的合成
将218.4mgN，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)溶于5ml三氟乙酸，室温搅拌2h，减压蒸发除去三氟乙酸，再经乙酸酐处理，滤出沉淀，得N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸。
(10)N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-异硫氰基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸的合成
将203.3mg N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸溶于H2O中，用固体NaHCO3调pH至8.5，取二氯硫化碳42mg溶于10ml CHCl3中，滴加，室温搅拌，当游离氨检测为阴性时，中止反应。分离出水相，蒸发浓缩，Florisil柱层析纯化，乙腈/水洗脱得最终产物N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸。
实施例3
(1)N-氧化-2，6-二溴吡啶合成
向反应瓶中加入30.0g 2，6-二溴吡啶，200ml三氟乙酸，40ml质量浓度为30％的过氧化氢，42℃搅拌反应5h，冷却至室温，倒入蒸馏水中，冷却至-5℃，抽滤，滤液用无水Na2CO3中和至PH值为11，用氯仿萃取，合并有机相，蒸除溶剂，得到白色固体产物N-氧化-2，6-二溴吡啶。
(2)N-氧化-2，6-二溴-4-硝基吡啶合成
将19.8g N-氧化-2，6-二溴吡啶溶于67.8ml浓H2SO4中，搅拌下加入67.8ml浓H2SO4和34.2mL发烟硝酸的混合酸，升温至100℃，搅拌3h。冷却后倒入碎冰中，抽滤，真空干燥得浅黄色固体产物N-氧化-2，6-二溴-4-硝基吡啶。
(3)2，6-二溴-4-氨基吡啶合成
室温搅拌下向17.4g N-氧化-2，6-二溴吡啶中加入300mL冰醋酸，缓慢升温，加入23.2g还原铁粉，110℃反应2h，得到的灰白色稠状物，用饱和NaOH溶液调节pH值为11，冷却，用乙醚萃取，合并有机相回收乙醚，得到白色固体产物2，6-二溴-4-氨基吡啶。
(4)2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-氨基吡啶合成
将10.1mL3-甲基吡唑溶于73.5ml二甘醇二甲基醚中，搅拌下加入4.7g金属钾，升温至80℃继续反应，待钾全部溶解后加入7.56g2，6-二溴-4-氨基吡啶，170℃下反应100小时。冷却，抽滤，减压蒸除滤液中溶剂，搅拌下向残余液中加入蒸馏水，抽滤得浅黄色粉末，用氯仿∶正己烷体积比为2∶1的混合溶液提取，合并提取液，过滤，浓缩后冰盐浴冷却下重结晶得白色针状晶体2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-氨基吡啶。
(5)2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶合成
向三口反应瓶中加入0.02762g NaNO2，1ml H2SO4。将0.1002g2，6-二(3-甲基-1-H-吡唑)-4-氨基吡啶用醋酸溶解，将此溶液滴入反应瓶中，35℃下反应一小时后，降温至-5℃。将0.14g CuBr用2ml HBr溶解，加入到反应瓶中，-5℃反应半小时，再升温至60℃，反应一小时，然后降温至0℃，用质量浓度为50％的NaOH溶液中和至pH值为11，用氯仿萃取，蒸干溶剂，产物用氯仿∶甲醇体积比为2∶1的混合溶液重结晶，得黄色结晶2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶。
(6)2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶的合成
向反应瓶中加入1g 2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶，30mL CCl4，7mg过氧化苯甲酰，加入1.19g N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，光照，回流反应2h。抽滤，对滤液进行蒸馏，得到的固体用氯仿为淋洗剂进行柱分离，得白色固体产物2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶。
(7)N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)的合成
向反应瓶中加入5.3g碳酸钠，1.94g亚氨基二乙酸二乙酯，2.38g2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶，50mL无水乙腈，搅拌，回流24h。抽滤，回收滤液中溶剂，剩余部分溶于氯仿中，水洗氯仿溶液，有机相用无水硫酸钠干燥后蒸除溶剂，剩余油状物柱分离，淋洗剂为乙酸乙酯∶正己烷体积比为3∶1的混合溶液，得产物N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)。
(8)N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)的合成
在氮气气氛下，将815.9mg N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)溶于甲苯，加入362.3mg对氨基苯乙炔，68.62mg Pd(PPh3)4和24.52mg CuI，回流反应5h，过滤除去无机成分，滤液溶于甲醇中，收集沉淀，溶于四氢呋喃中，用甲醇重结晶，经硅胶G柱层析纯化，淋洗剂为正己烷∶四氢呋喃体积比为3∶1的混合溶液，得产物N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)。
(9)N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸的合成
将218.4mg N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)溶于5ml三氟乙酸，室温搅拌3h，减压蒸发除去三氟乙酸，再经乙酸酐处理，滤出沉淀，得N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸。
(10)N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-异硫氰基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸的合成
将203.3mg N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸溶于H2O中，用固体NaHCO3调pH至9，取二氯硫化碳42mg溶于10ml CHCl3中，滴加，室温搅拌，当游离氨检测为阴性时，中止反应。分离出水相，蒸发浓缩，Florisil柱层析纯化，乙腈/水洗脱得最终产物N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸。
Claims (2)
1.均相时间分辨荧光免疫分析螯合剂为：N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-异硫氰基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸；其结构式如下：
2.如权利要求1所述的均相时间分辨荧光免疫分析螯合剂的制备方法，其步骤和条件如下：
(1)N-氧化-2，6-二溴吡啶的合成
向三口反应器中加入2，6-二溴吡啶和质量浓度为30％的过氧化氢，2，6-二溴吡啶与过氧化氢摩尔比为1∶3，再加入与2，6-二溴吡啶摩尔比为(14∶1)～(15∶1)的三氟乙酸，35～42℃搅拌反应1～5h，冷却至室温，倒入蒸馏水中，冷却至-5～0℃，抽滤，滤液用无水Na2CO3中和pH值至9～11之间，用氯仿萃取，合并有机相，蒸除溶剂，得到白色固体产物N-氧化-2，6-二溴吡啶；
(2)N-氧化-2，6-二溴-4-硝基吡啶的合成
将摩尔比为1∶16的N-氧化-2，6-二溴吡啶和质量浓度为98％的浓H2SO4互溶，搅拌下加入体积比为2∶1的上述浓H2SO4和发烟硝酸的混合酸，升温至80～100℃，搅拌1～3h，冷却后倒入碎冰中，抽滤，真空干燥，得浅黄色固体产物N-氧化-2，6-二溴-4-硝基吡啶；
(3)2，6-二溴-4-氨基吡啶的合成
室温搅拌下向N-氧化-2，6-二溴吡啶中加入冰醋酸，冰醋酸与N-氧化-2，6-二溴吡啶摩尔比为(82∶1)～(88∶1)，再加入与N-氧化-2，6-二溴吡啶摩尔比为7∶1的还原铁粉，80～110℃反应0.5～2h，得到的灰白色稠状物，用饱和NaOH溶液调节pH值为9～11，冷却，用乙醚萃取，合并有机相，回收乙醚，得到白色固体产物2，6-二溴-4-氨基吡啶；
(4)2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-氨基吡啶的合成
将3-甲基吡唑溶于二甘醇二甲基醚中，3-甲基吡唑与二甘醇二甲基醚的摩尔比为1∶4，搅拌下加入金属钾，升温至60～80℃继续反应，待钾全部溶解后加入2，6-二溴-4-氨基吡啶，其中3-甲基吡唑、金属钾和2，6-二溴-4-氨基吡啶的摩尔比为4∶4∶1，在160～170℃下反应80～100小时，冷却，抽滤，减压蒸除滤液中溶剂，搅拌下加入蒸馏水，抽滤得浅黄色粉末，用体积比为2∶1的氯仿∶正己烷溶液提取，合并提取液，过滤，浓缩后冰盐浴冷却下重结晶，得到白色针状晶体2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-氨基吡啶；
(5)2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶的合成
向反应器中加入NaNO2、H2SO4和2，6-二(3-甲基-1-H-吡唑)-4-氨基吡啶，三者的摩尔比为1∶40∶1，其中2，6-二(3-甲基-1-H-吡唑)-4-氨基吡啶用醋酸溶解，并滴入反应器中，35～40℃下反应-小时，降温至-10～-5℃，将CuBr用HBr溶解，加入到反应器中，CuBr与2，6-二(3-甲基-1-H-吡唑)-4-氨基吡啶摩尔比为2∶5，在-10～-5℃反应半小时，再升温至40～60℃，反应-小时，然后降温至0～-7℃，用质量浓度为50％的NaOH溶液中和pH值为9～11，用氯仿萃取，蒸干溶剂，产物用氯仿∶甲醇体积比为2∶1的混合溶液重结晶，得黄色结晶2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶；
(6)2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶的合成向三口反应器中加入2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶和N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶和N-溴代琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶2，其中2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶用CCl4溶解，再加入与2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶摩尔比为1∶109的过氧化苯甲酰，光照，回流反应0.5～2h，抽滤，对滤液进行蒸馏，得到的固体用氯仿为淋洗剂进行柱分离，得白色固体产物2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶；
(7)N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)的合成
向反应器中加入碳酸钠、亚氨基二乙酸二乙酯和2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶，三者的摩尔比为10∶2∶1，再加入与2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶摩尔比为(77∶1)～(192∶1)的无水乙腈，搅拌，回流20～24h，抽滤，回收滤液中溶剂，剩余部分溶于氯仿中，水洗氯仿溶液，有机相用无水硫酸钠干燥后蒸除溶剂，剩余油状物柱分离，柱分离的淋洗剂为体积比为3∶1的乙酸乙酯∶正己烷混合溶液，得产物N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)；
(8)N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)的合成
在氮气气氛下，向反应器中加入N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)、对氨基苯乙炔、四(三苯基膦)钯(0)和CuI，四者的摩尔比为20∶40∶1∶20，其中N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)用甲苯溶解，回流反应2～5h，过滤除去无机成分，滤液倒入甲醇中，收集沉淀，溶于四氢呋喃中，用甲醇重结晶，经硅胶G柱层析纯化，淋洗剂为体积比为3∶1的正己烷和四氢呋喃混合溶液，得产物N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基)-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)；
(9)N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸的合成
N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基)-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)溶于与其摩尔比为225∶1的三氟乙酸中，室温搅拌1～3h，减压蒸发除去三氟乙酸，再经乙酸酐处理，滤出沉淀，得N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸；
(10)N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-异硫氰基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸的合成
N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸溶于H2O中，用固体NaHCO3调pH至7～9，取二氯硫化碳溶于CHCl3中，二氯硫化碳与CHCl3的摩尔比为1∶354，其中N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸与二氯硫化碳的摩尔比为1∶1，滴加，室温搅拌，当游离氨检测为阴性时，中止反应，分离出水相，蒸发浓缩，Florisil柱层析纯化，乙腈/水洗脱，得最终产物N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080716 |