CN1866016A - 检测雌二醇的胶体金免疫试纸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测雌二醇的胶体金免疫试纸及其制备方法，检测雌二醇的胶体金免疫试纸包括基板，在基板的中部设置有硝酸纤维膜，吸水纸的一端与基板的A端对齐设置，吸水纸的另一端搭盖在硝酸纤维膜的近A端的表面上，玻璃纤维膜的近B端覆盖在基板的近中部，玻璃纤维膜的近A端搭盖在硝酸纤维膜的近B端的表面上，加样纸的一端与基板的B端对齐设置，加样纸的另一端搭盖在玻璃纤维膜的近B端表面上，玻璃纤维膜浸泡于标记雌二醇抗体的胶体金探针中，取出，干燥；硝酸纤维素膜上设置有雌二醇与卵清蛋白的偶连物和兔抗鼠抗体，使用本发明的一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸，操作简便快速、成本低、携带方便、非专业人员也能操作及可进行现场检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测雌二醇的试纸及其制备方法。
背景技术
人类对动物内分泌干扰物所造成的环境污染和危害的普遍认知和系统研究还不到十年的历史，但越来越多的研究表明，具有内分泌干扰性的污染物不断富集所造成的污染正通过各种途径给人类和野生生物带来危害，且其已在世界范围内的自然水体，城市污水处理系统及供水系统中被广泛检出。雌二醇(17β-Estradiol)是天然雌激素的重要成分，它可以促进少女性早熟，因此，对食品中尤其是对畜禽产品进行雌二醇检测是很有必要的。目前，雌二醇的测定多采用放射免疫分析、酶联免疫分析或化学发光免疫分析法，但这些方法的操作过程繁琐、时间长，操作人员必须具有一定的专业技术知识才能操作，因此应用范围受限。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种操作简便快速、成本低、携带方便、非专业人员也能操作及可进行现场检测的检测雌二醇的胶体金免疫试纸。
本发明的第二个目的是提供一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸，包括基板，在所述基板的中部设置有硝酸纤维膜，吸水纸的一端与所述基板的A端对齐设置，所述吸水纸的另一端搭盖在所述硝酸纤维膜的近A端的表面上，玻璃纤维膜的近B端覆盖在基板的近中部，所述玻璃纤维膜的近A端搭盖在所述硝酸纤维膜的近B端的表面上，加样纸的一端与所述基板的B端对齐设置，所述加样纸的另一端搭盖在所述玻璃纤维膜的近B端表面上，所述玻璃纤维膜浸泡于标记雌二醇抗体的胶体金探针中，取出，干燥；所述硝酸纤维素膜上设置有雌二醇与卵清蛋白的偶连物和兔抗鼠抗体。
所述硝酸纤维素膜上设置的雌二醇与卵清蛋白的偶连物和兔抗鼠抗体为点膜机喷成的两条线。
所述吸水纸的长度为25-35mm，优选30mm，所述硝酸纤维膜的长度为20-30mm，优选25mm，所述玻璃纤维膜的长度为1-10mm，优选6mm，所述加样纸的长度为10-20mm，优选15mm。
所述基板的材料为聚氯乙烯。
一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸制备方法，包括如下步骤：
(1)胶体金的制备；
(2)胶体金探针的标记：①将雌二醇抗体0.005mol/LNaCl水溶液透析8-12小时离心除去蛋白沉淀，调至0.4-0.6mg/ml水溶液；②取胶体金100ml，用0.2mol/LK2CO3水溶液或0.2mol/L NaOH将胶体金溶液调至pH为8.2-9.0，磁力搅拌下加入2.4ml雌二醇抗体溶液，继续搅拌5-15min，加入牛血清白蛋白，使其最终质量百分浓度为1％，再搅拌5-15min，4000转/分离心20-25min，弃沉淀；③上清以10000转/分离心50-70min，弃上清，沉淀用0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液重新悬浮洗涤1-3次，所述磷酸盐缓冲溶液中含质量百分浓度为1％的牛血清白蛋白；④将沉淀用0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液悬浮，所述磷酸盐缓冲溶液中含质量百分浓度为1％的牛血清白蛋白，含质量百分浓度为0.02％的NaN3，制成标记雌二醇抗体的胶体金探针，4℃保存；
(3)抗原的合成：①取卵清白蛋白10毫克，3毫升水，3毫升二氧六环，1N氢氧化钠0.3毫升配成卵清白蛋白溶液；②取雌二醇-6-肟43mg，加入三正丁胺50μL，二氧六环4毫升，冷却到0-10℃，加入氯甲酸乙酯15μL，4-10℃下反应30分钟，加入卵清白蛋白溶液，4℃冰浴搅拌，控制pH为8，反应5-7小时，③将反应液加入透析袋，透析45-50小时，将透析液调至pH4.5，冰箱4℃，放置4天，有黄色沉淀出现，离心收集沉淀，冷冻干燥，4℃冰箱保存，将卵清白蛋白溶于透析液内作参比，用紫外光谱法对雌二醇-6肟-卵清白蛋白进行定性检验，经紫外测定证明卵清蛋白已与雌二醇衍生物结合成雌二醇与卵清蛋白的偶连物；
(4)试纸制备：将玻璃纤维膜放入含1％牛血清白蛋白、1％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液中浸泡20-40min，浸泡于标记雌二醇抗体的胶体金探针中，真空干燥；在硝酸纤维膜上用点膜机将雌二醇与卵清蛋白的偶连物和兔抗鼠抗体喷成两条线，分别为检测线和对照线，经真空干燥后，用1％牛血清白蛋白、0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液封闭1.5-2.5小时，以0.01mo1/L磷酸盐缓冲溶液洗涤，真空干燥，将硝酸纤维膜粘于基板的中部，吸水纸的一端与所述基板的A端对齐粘接，所述吸水纸的另一端粘接在所述硝酸纤维膜的近A端的表面上，玻璃纤维膜的近B端粘接在基板的近中部，所述玻璃纤维膜的近A端粘接在所述硝酸纤维膜的近B端的表面上，加样纸的一端与所述基板的B端对齐粘接，所述加样纸的另一端粘接在所述玻璃纤维膜的近B端表面上制成一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸。
使用本发明的一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸，操作简便快速、成本低、携带方便、非专业人员也能操作及可进行现场检测。
附图说明
图1为本发明的结构示意图。
具体实施方式：
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明：
实施例1
一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸，包括基板1，在基板的中部设置有硝酸纤维膜2，吸水纸3的一端与基板的A端对齐设置，吸水纸的另一端搭盖在所述硝酸纤维膜的近A端的表面上，玻璃纤维膜4的近B端覆盖在基板的近中部，玻璃纤维膜的近A端搭盖在硝酸纤维膜的近B端的表面上，加样纸5的一端与基板的B端对齐设置，加样纸的另一端搭盖在玻璃纤维膜的近B端表面上，玻璃纤维膜浸泡于标记雌二醇抗体的胶体金探针中，取出，干燥；硝酸纤维素膜上设置有雌二醇与卵清蛋白的偶连物和兔抗鼠抗体。
硝酸纤维素膜上设置的雌二醇与卵清蛋白的偶连物和兔抗鼠抗体为点膜机喷成的两条线，检测线7和质控线6。
吸水纸的长度为25-35mm，优选30mm，所述硝酸纤维膜的长度为20-30mm，优选25mm，所述玻璃纤维膜的长度为1-10mm，优选6mm，所述加样纸的长度为10-20mm，优选15mm。
所述基板的材料为聚氯乙烯。
实施例2
一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸制备方法，包括如下步骤：
(1)胶体金的制备：用三蒸水溶解氯金酸，使其终浓度为0.1g/L，先进行沸水浴，待氯金酸溶液煮沸后，每100mL加入质量百分浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液2.5mL，再沸水浴下搅拌，直到氯金酸溶液的颜色稳定，继续沸水浴10min制成胶体金；
(2)胶体金探针的标记：①将雌二醇抗体用0.005mol/LNaCl水溶液透析10小时离心除去蛋白沉淀，调至0.5mg/ml水溶液②取胶体金100ml，用0.2mol/LK2CO3水溶液将胶体金溶液调至pH为9.0，磁力搅拌下加入2.4ml雌二醇抗体溶液，继续搅拌10min，加入牛血清白蛋白，使其最终质量百分浓度为1％，再搅拌10min，4000转/分离心20min，弃沉淀；③上清以10000转/分离心60min，弃上清，沉淀用0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液重新悬浮洗涤21-3次，所述磷酸盐缓冲溶液中含质量百分浓度为1％的牛血清白蛋白；④将沉淀用0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液悬浮，所述磷酸盐缓冲溶液中含质量百分浓度为1％的牛血清白蛋白，含质量百分浓度为0.02％的NaN3，制成标记雌二醇抗体的胶体金探针，4℃保存；
(3)抗原的合成：①取卵清白蛋白10毫克，3毫升水，3毫升二氧六环，1N氢氧化钠0.3毫升配成卵清白蛋白溶液；②取雌二醇-6-肟43mg，加入三正丁胺50μL，二氧六环4毫升，冷却到0℃，加入氯甲酸乙酯15μL，4℃下反应30分钟，加入卵清白蛋白溶液，4℃冰浴搅拌，控制pH为8，反应6小时，③将反应液加入透析袋，透析48小时，将透析液调至pH4.5，冰箱4℃，放置4天，有黄色沉淀出现，离心收集沉淀，冷冻干燥，4℃冰箱保存，将卵清白蛋白溶于透析液内作参比，用紫外光谱法对雌二醇-6肟-卵清白蛋白进行定性检验，经紫外测定证明卵清蛋白已与雌二醇衍生物结合成雌二醇与卵清蛋白的偶连物；
(4)试纸制备：将玻璃纤维膜放入含1％牛血清白蛋白、1％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液中浸泡30min，浸泡于标记雌二醇抗体的胶体金探针中，真空干燥；在硝酸纤维膜上用点膜机将雌二醇与卵清蛋白的偶连物和兔抗鼠抗体喷成两条线，分别为检测线和对照线，经真空干燥后，用1％牛血清白蛋白、0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液封闭1.5小时，以0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤，真空干燥，将硝酸纤维膜粘于基板的中部，吸水纸的一端与所述基板的A端对齐粘接，所述吸水纸的另一端粘接在所述硝酸纤维膜的近A端的表面上，玻璃纤维膜的近B端粘接在基板的近中部，所述玻璃纤维膜的近A端粘接在所述硝酸纤维膜的近B端的表面上，加样纸的一端与所述基板的B端对齐粘接，所述加样纸的另一端粘接在所述玻璃纤维膜的近B端表面上制成一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸。
实施例3
一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸制备方法，包括如下步骤：
(1)胶体金的制备：用三蒸水溶解氯金酸，使其终浓度为0.1g/L，先进行沸水浴，待氯金酸溶液煮沸后，每100mL加入质量百分浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液2.5mL，再沸水浴下搅拌，直到氯金酸溶液的颜色稳定，继续沸水浴10min制成胶体金；
(2)胶体金探针的标记：①将雌二醇抗体用0.005mol/LNaCl水溶液透析8-12小时离心除去蛋白沉淀，调至0.4mg/ml；②取胶体金100ml，用0.2mol/L NaOH将胶体金溶液调至pH为8.2，磁力搅拌下加入2.4ml雌二醇抗体溶液，继续搅拌5-15min，加入牛血清白蛋白，使其最终质量百分浓度为1％，再搅拌5-15min，4000转/分离心25min，弃沉淀；③上清以10000转/分离心50-70min，弃上清，沉淀用0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液重新悬浮洗涤1-3次，所述磷酸盐缓冲溶液中含质量百分浓度为1％的牛血清白蛋白；④将沉淀用0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液悬浮，所述磷酸盐缓冲溶液中含质量百分浓度为1％的牛血清白蛋白，含质量百分浓度为0.02％的NaN3，制成标记雌二醇抗体的胶体金探针，4℃保存；
(3)抗原的合成：①取卵清白蛋白10毫克，3毫升水，3毫升二氧六环，1N氢氧化钠0.3毫升配成卵清白蛋白溶液；②取雌二醇-6-肟43mg，加入三正丁胺50μL，二氧六环4毫升，冷却到10℃，加入氯甲酸乙酯15μL，10℃下反应30分钟，加入卵清白蛋白溶液，4℃冰浴搅拌，控制pH为8，反应5-7小时，③将反应液加入透析袋，透析45-50小时，将透析液调至pH4.5，冰箱4℃，放置4天，有黄色沉淀出现，离心收集沉淀，冷冻干燥，4℃冰箱保存，将卵清白蛋白溶于透析液内作参比，用紫外光谱法对雌二醇-6肟-卵清白蛋白进行定性检验，经紫外测定证明卵清蛋白已与雌二醇衍生物结合成雌二醇与卵清蛋白的偶连物；
(4)试纸制备：将玻璃纤维膜放入含1％牛血清白蛋白、1％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液中浸泡20-40min，浸泡于标记雌二醇抗体的胶体金探针中，真空干燥；在硝酸纤维膜上用点膜机将雌二醇与卵清蛋白的偶连物和兔抗鼠抗体喷成两条线，分别为检测线和对照线，经真空干燥后，用1％牛血清白蛋白、0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液封闭2.5小时，以0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤，真空干燥，将硝酸纤维膜粘于基板的中部，吸水纸的一端与所述基板的A端对齐粘接，所述吸水纸的另一端粘接在所述硝酸纤维膜的近A端的表面上，玻璃纤维膜的近B端粘接在基板的近中部，所述玻璃纤维膜的近A端粘接在所述硝酸纤维膜的近B端的表面上，加样纸的一端与所述基板的B端对齐粘接，所述加样纸的另一端粘接在所述玻璃纤维膜的近B端表面上制成一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸。
实施例4
一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸制备方法，包括如下步骤：
(1)胶体金的制备：用三蒸水溶解氯金酸，使其终浓度为0.1g/L，先进行沸水浴，待氯金酸溶液煮沸后，每100mL加入质量百分浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液2.5mL，再沸水浴下搅拌，直到氯金酸溶液的颜色稳定，继续沸水浴10min制成胶体金；
(2)胶体金探针的标记：①将雌二醇抗体用0.005mol/L水溶液透析12小时离心除去蛋白沉淀，调至0.6mg/ml的水溶液；②取胶体金100ml，用0.2mol/L NaOH将胶体金溶液调至pH为8.2，磁力搅拌下加入2.4ml雌二醇抗体溶液，继续搅拌15min，加入牛血清白蛋白，使其最终质量百分浓度为1％，再搅拌15min，4000转/分离心25min，弃沉淀；③上清以10000转/分离心70min，弃上清，沉淀用0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液重新悬浮洗涤1次，所述磷酸盐缓冲溶液中含质量百分浓度为1％的牛血清白蛋白；④将沉淀用0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液悬浮，所述磷酸盐缓冲溶液中含质量百分浓度为1％的牛血清白蛋白，含质量百分浓度为0.02％的NaN3，制成标记雌二醇抗体的胶体金探针，4℃保存；
(3)抗原的合成：①取卵清白蛋白10毫克，3毫升水，3毫升二氧六环，1N氢氧化钠0.3毫升配成卵清白蛋白溶液；②取雌二醇-6-肟43mg，加入三正丁胺50μL，二氧六环4毫升，冷却到5℃，加入氯甲酸乙酯15μL，10℃下反应30分钟，加入卵清白蛋白溶液，4℃冰浴搅拌，控制pH为8，反应7小时，③将反应液加入透析袋，透析50小时，将透析液调至pH4.5，冰箱4℃，放置4天，有黄色沉淀出现，离心收集沉淀，冷冻干燥，4℃冰箱保存，将卵清白蛋白溶于透析液内作参比，用紫外光谱法对雌二醇-6肟-卵清白蛋白进行定性检验，经紫外测定证明卵清蛋白已与雌二醇衍生物结合成雌二醇与卵清蛋白的偶连物；
(4)试纸制备：将玻璃纤维膜放入含1％牛血清白蛋白、1％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液中浸泡40min，浸泡于标记雌二醇抗体的胶体金探针中，真空干燥；在硝酸纤维膜上用点膜机将雌二醇与卵清蛋白的偶连物和兔抗鼠抗体喷成两条线，分别为检测线和对照线，经真空干燥后，用1％牛血清白蛋白、0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液封闭2.5小时，以0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤，真空干燥，将硝酸纤维膜粘于基板的中部，吸水纸的一端与所述基板的A端对齐粘接，所述吸水纸的另一端粘接在所述硝酸纤维膜的近A端的表面上，玻璃纤维膜的近B端粘接在基板的近中部，所述玻璃纤维膜的近A端粘接在所述硝酸纤维膜的近B端的表面上，加样纸的一端与所述基板的B端对齐粘接，所述加样纸的另一端粘接在所述玻璃纤维膜的近B端表面上制成一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸。
Claims (6)
1.一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸，包括基板，其特征在所述基板的中部设置有硝酸纤维膜，吸水纸的一端与所述基板的A端对齐设置，所述吸水纸的另一端搭盖在所述硝酸纤维膜的近A端的表面上，玻璃纤维膜的近B端覆盖在基板的近中部，所述玻璃纤维膜的近A端搭盖在所述硝酸纤维膜的近B端的表面上，加样纸的一端与所述基板的B端对齐设置，所述加样纸的另一端搭盖在所述玻璃纤维膜的近B端表面上，所述玻璃纤维膜浸泡于标记雌二醇抗体的胶体金探针中，取出，干燥；所述硝酸纤维素膜上设置有雌二醇与卵清蛋白的偶连物和兔抗鼠抗体。
2.根据权利要求1所述的一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸，其特征是所述硝酸纤维素膜上设置的雌二醇与卵清蛋白的偶连物和兔抗鼠抗体为点膜机喷成的两条线。
3.根据权利要求1所述的一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸，其特征是所述吸水纸的长度为25-35mm，所述硝酸纤维膜的长度为20-30mm，所述玻璃纤维膜的长度为1-10mm，所述加样纸的长度为10-20mm。
4.根据权利要求1所述的一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸，其特征是所述基板的材料为聚氯乙烯。
5.根据权利要求3所述的一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸，其特征是所述吸水纸的长度为30mm，所述硝酸纤维膜的长度为25mm，所述玻璃纤维膜的长度为6mm，所述加样纸的长度为15mm。
6.一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸制备方法，包括如下步骤：
(1)胶体金的制备；
(2)胶体金探针的标记：①将雌二醇抗体用0.005mol/LNaCl水溶液透析8-12小时，离心除去蛋白沉淀，调至0.4-0.6mg/ml水溶液；②取胶体金100ml，调pH为8.2-9.0，磁力搅拌下加入2.4ml雌二醇抗体溶液，继续搅拌5-15min，加入牛血清白蛋白，使其最终质量百分浓度为1％，再搅拌5-15min，4000转/分离心20-25min，弃沉淀；③上清以10000转/分离心50-70min，弃上清，沉淀用0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液重新悬浮洗涤1-3次，所述磷酸盐缓冲溶液中含质量百分浓度为1％的牛血清白蛋白；④将沉淀用0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液悬浮，所述磷酸盐缓冲溶液中含质量百分浓度为1％的牛血清白蛋白，含质量百分浓度为0.02％的NaN3，制成标记雌二醇抗体的胶体金探针，4℃保存；
(3)抗原的合成：①取卵清白蛋白10毫克，3毫升水，3毫升二氧六环，1N氢氧化钠0.3毫升配成卵清白蛋白溶液；②取雌二醇-6-肟43mg，加入三正丁胺50μL，二氧六环4毫升，冷却到0-10℃，加入氯甲酸乙酯15μL，4-10℃下反应30分钟，加入卵清白蛋白溶液，4℃冰浴搅拌，控制pH为8，反应5-7小时，③将反应液加入透析袋，透析45-50小时，将透析液调至pH4.5，冰箱4℃，放置4天，有黄色沉淀出现，离心收集沉淀，冷冻干燥，4℃冰箱保存，将卵清白蛋白溶于透析液内作参比，用紫外光谱法对雌二醇-6肟-卵清白蛋白进行定性检验，经紫外测定证明卵清蛋白已与雌二醇衍生物结合成雌二醇与卵清蛋白的偶连物；
(4)试纸制备：将玻璃纤维膜放入含1％牛血清白蛋白、1％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液中浸泡20-40min，浸泡于标记雌二醇抗体的胶体金探针中，真空干燥；在硝酸纤维膜上用点膜机将雌二醇与卵清蛋白的偶连物和兔抗鼠抗体喷成两条线，分别为检测线和对照线，经真空干燥后，用1％牛血清白蛋白、0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液封闭1.5-2.5小时，以0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤，真空干燥，将硝酸纤维膜粘于基板的中部，吸水纸的一端与所述基板的A端对齐粘接，所述吸水纸的另一端粘接在所述硝酸纤维膜的近A端的表面上，玻璃纤维膜的近B端粘接在基板的近中部，所述玻璃纤维膜的近A端粘接在所述硝酸纤维膜的近B端的表面上，加样纸的一端与所述基板的B端对齐粘接，所述加样纸的另一端粘接在所述玻璃纤维膜的近B端表面上制成一种检测雌二醇的胶体金免疫试纸。
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