CN1864852A - 一种大黄酸键合硅胶色谱固定相的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明采用功能偶联剂二次反应技术快速制备色谱固定相，该制备方法包括三步：第一步制备γ－氨基丙基键合硅胶前体。第二步将过量的氯化亚砜加入到大黄酸中，在回流状态下反应2小时，真空蒸除剩余的氯化亚砜，得到大黄酸酰氯。第三步以无水甲苯为溶剂，以三乙胺为催化剂，将前体硅胶与大黄酸酰氯在氮气保护和搅拌下回流反应10小时，固体经索氏抽提、溶剂洗涤、浮选和干燥，制备具有一定键合浓度的大黄酸键合硅胶固定相。本发明方法简便、制备成本较低和制备方法适用性广，所制备的大黄酸键合硅胶固定相表面配体键合浓度较高，由于大黄酸具有抗菌作用，长期放置时该固定相不易滋生细菌。大黄酸键合硅胶固定相适用于高效液相色谱、微柱液相色谱、电色谱分离分析及用作相关富集材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种硅胶色谱固定相的制备方法，特别是以天然产物为配体的硅胶色谱固定相的制备方法。
背景技术
高效液相色谱(HPLC)与经典液相色谱(LC)相比不仅分离效能高，而且选择性好，已成为无机、有机、生化、环境、食品和药物分析等领域的重要分离分析方法之一。色谱分析的基本要求是实现混合物各组分的分离，分离的实质是基于被分析溶质与流动相和固定相之间的相互作用的差异。其中，新型高效固定相的研制是色谱系统的核心，成为现代高效液相色谱最活跃的前沿研究领域。
以十八烷基硅烷化微粒硅胶(ODS)为代表的烃基键合硅胶固定相研制成功，因其柱效高、稳定性好、适用范围广、使用方便而迅速商品化，其应用在HPLC常规分离分析中占有重要地位，成为“广谱型”色谱固定相。由于硅胶机械强度好，物理性质如比表面积、孔结构、孔径和孔容等易控制，表面硅醇基具有高反应活性，通过化学修饰能获得多种功能固定相，仍是目前制备键合固定相的常用基质。
目前，以天然产物为配体的色谱固定相报道不多，主要涉及大环抗生素、蛋白质和生物酶。
1994年，Armstrong等人(Armstrong D W，Tang Y B，Chen S S，Zhou Y W，BagwillC，Chen J R.Macrocyclic antibiotics as a new class of chiral selectors forliquid chromatography，Anal Chem，1994，66：1473)首次制备了具有抗菌活性的万古霉素(Vancomycin)等3种大环抗生素键合硅胶固定相，利用其含有多种官能团和不对称中心，与被分离物质产生立体选择性作用，从而实现了70多对手性药物的分离。
2001年，Massolinin等人(Calleri E，Massolini G，Loiodice F，FracchiollaG，Felix G，Tortorella P，Caccialanza G.Evaluation of a penicillin Gacylase-based chiral stationary phase towards a series of 2-aryloxyalkanoicacids，isosteric analogs and 2-arylpropionic acids，J.Chromatogr.A，2002，958(1-2)：121)将青霉素酶键合到硅胶表面，分离了一系列苯氧烷基羧酸对映异构体，并用作表面催化剂，用于制备光学纯氨基青霉素，Calleri等对其分析应用进行了评述。
2002年，Pesek等制备了胆固醇键合固定相，评价了其色谱性能，在正相和反相模式下实现了联萘酚和萘乙胺的手性分离。
2000年，House等人(House David W.Chiral stationary phase based onyohimbine，United States Patent 6,132,606 2000)将萝芙木生物碱育亨宾(Yohimbine)及其同系物的羟基通过氨基甲酸乙酯键合到硅胶表面，制备含中草药配基的色谱固定相，研究发现该配基具有较高的手性辨识能力。
以上研究情况表明，天然化合物独特的结构使其固有作为色谱配体的潜能，人工合成配体常达不到这种境界，现有开发仅局限于手性识别能力，天然化合物的色谱分离功能有待系统地研究和开发利用。然而，目前直接利用中草药中活性成分天然的色谱分离功能研究甚少，深层次开发利用中草药资源具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种大黄酸键合硅胶固定相的制备方法。
掌叶大黄、唐古拉特大黄或药用大黄属蓼科植物，其药用成分主要是蒽醌衍生物，其中包括：大黄素(emodin)、大黄酸(rhein)、大黄酚(chrysophanol)、大黄素甲醚(physcion)、芦荟大黄素(aloe-emodin)及其结合态的糖甙，它们对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、霍乱弧菌、肺炎球菌、脑膜炎双球菌和淋病双球菌有杀灭作用。这类化合物结构含有蒽醌环，有较大的平面π电子系统和良好的疏水性，蒽醌环上的羰基与邻近的羟基为被分离溶质提供络合、氢键和极性偶极等作用位点，且有较强的平面空间识别能力，大黄酸侧位上的羧基为蒽醌环嫁接到硅胶表面创造了条件。以功能偶联剂为桥粱，通过短链间隔臂锚定蒽醌，有利于保持硅胶表面配体的药物活性和色谱选择功能。
本发明所述的制备方法，是通过以下技术方案实现的。
(1)在氮气氛下，按活化硅胶(g)：含氨基丙基的硅氧烷偶联剂(mmoL)∶无水甲苯(mL)为1∶2.7～3.3∶9～11的比例，将氨基丙基的硅氧烷加入无水甲苯中，油浴迅速升温至110～120℃，搅拌，在回流状态下反应8～10小时，继续通氮气直至室温；过滤，固体用甲苯和甲醇洗涤，80℃下真空干燥，制得含氨基的硅胶前体；
(2)按步骤(1)中活化硅胶(g)的单位用量计算大黄酸和氯化亚砜用量，按大黄酸(mmoL)为2.3～2.7，氯化亚砜(mL)为1.8～2.2的比例，将氯化亚砜加入到大黄酸中，在回流状态下反应2～2.5小时，真空蒸除剩余的氯化亚砜，得到大黄酸酰氯；
(3)按步骤(1)中活化硅胶(g)的单位用量计算三乙胺的无水甲苯用量，按三乙胺(mL)为0.36～0.44，无水甲苯(mL)为9～11的比例，以无水甲苯为溶剂，在催化剂三乙胺的存在下，将硅胶前体与大黄酸酰氯在氮气保护和搅拌下回流反应10～12小时，用甲苯作溶剂抽提10小时，再依次用甲苯、氯仿、丙酮、甲醇和丙酮洗涤滤液清亮，抽干，真空干燥，制得大黄酸键合硅胶色谱固定相。
本发明所述的含氨基丙基的硅氧烷偶联剂，是指γ-氨基丙基三乙氧基硅烷、γ-氨基丙基三甲氧基硅烷。
本发明所述的活化硅胶(g)∶含氨基丙基的硅氧烷偶联剂(mmoL)∶无水甲苯(mL)的最佳配比为1∶3∶10。
本发明所述的硅活化硅胶(g)∶大黄酸(mmoL)∶氯化亚砜(mL)的最佳配比为1∶3∶2.5。
本发明所述的硅活化硅胶(g)∶三乙胺(mL)∶无水甲苯(mL)的最佳配比为1∶0.4∶10。
本发明采用γ-氨基丙基三乙基硅烷为偶联剂，在催化剂存在的条件下，合成了大黄酸键合硅胶固定相。所得固定相经漫反射红外光谱、元素分析、热分析和化学分析表征了其结构，以甲醇-水(65∶35，体积比)为流动相，流速为1.0mL/min，以联苯为溶质，室温下测得柱效为85,000板/米。
本发明以不同种类溶质为探针，包括烷基苯、多环芳烃、取代苯酚和苯胺、N-取代苯胺、取代苯甲酸、碳簇、核苷酸、碱基、磺胺药物和中草药提取物等，较系统地研究了固定相的色谱性能。研究发现，大黄酸配体由于含羟基蒽醌类结构，该键合硅胶固定相不仅具有传统的ODS反相色谱性能，同时能为溶质提供络合、偶极、氢键、π-π电荷转移作用及静电作用等多种作用位点。一定程度该固定相能克服传统ODS单一的疏水性对极性化合物分离选择性用限的不足，为极性芳香性化合物难分离物质提供分离可能性。实验结果表明，采用本发明所合成的大黄酸键合硅胶固定相具有键合量较高、键合层稳定、方法简便、制备成本较低和制备方法适用面广等特点，由于大黄酸具有抗菌作用，长期放置时该固定相不易滋生细菌，采用该固定相填装的色谱柱使用寿命较长。
本发明硅胶比表面积为(250～400m2/g)时，固定相表面大黄酸的浓度α可高达为0.39～0.45mmol/g。
α＝W/M(mmol/g)，其中：W为固定相表面大黄酸的重量(g)，M为大黄酸的摩尔质量(g/mol)。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例作进一步的说明。
实施例1。
取YQG 5μm(320m2/g)球形活化硅胶100g为基质。
(1)在氮气氛下，按活化硅胶(g)∶γ-氨基丙基三乙氧基硅烷偶联剂(mmoL)∶无水甲苯(mL)为1∶2.7∶10的比例，将γ-氨基丙基三乙氧基硅烷加入无水甲苯中，油浴迅速升温至110℃，搅拌，在回流状态下反应8小时，继续通氮气直至室温；过滤，固体用甲苯和甲醇洗涤，80℃下真空干燥，制得含氨基的硅胶前体；
(2)按步骤(1)中活化硅胶(g)的单位用量计算大黄酸和氯化亚砜用量，按大黄酸(mmoL)为2.3，氯化亚砜(mL)为1.9的比例，将氯化亚砜加入到大黄酸中，在回流状态下反应2小时，真空蒸除剩余的氯化亚砜，得到大黄酸酰氯；
(3)按步骤(1)中活化硅胶(g)的单位用量计算三乙胺的无水甲苯用量，按三乙胺(mL)为0.36，无水甲苯(mL)为10的比例，以无水甲苯为溶剂，在催化剂三乙胺的存在下，将硅胶前体与大黄酸酰氯在氮气保护和搅拌下回流反应11小时，用甲苯作溶剂抽提10小时，再依次用甲苯、氯仿、丙酮、甲醇和丙酮洗涤滤液清亮，抽干，真空干燥，制得大黄酸键合硅胶色谱固定相。
本实施例所得的大黄酸键合硅胶色谱固定相，其大黄酸键合硅胶固定相表面配体键合浓度实测数据如下表：
大黄酸键合硅胶固定相表面配体键合浓度
| 键合相 | C(％) | H(％) | 键合浓度α(mmol/g) |
| 大黄酸键合相前体硅胶 | 11.684.33 | 1.461.12 | 0.411.20 |
实施例2。
取Kromasil 5μm(340m2/g)球形活化硅胶50g为基质。
(1)在氮气氛下，按活化硅胶(g)∶γ-氨基丙基三甲氧基硅烷偶联剂(mmoL)∶无水甲苯(mL)为1∶3.3∶9的比例，将γ-氨基丙基三甲氧基硅烷加入无水甲苯中，油浴迅速升温至120℃，搅拌，在回流状态下反应10小时，继续通氮气直至室温；过滤，固体用甲苯和甲醇洗涤，80℃下真空干燥，制得含氨基的硅胶前体；
(2)按步骤(1)中活化硅胶(g)的单位用量计算大黄酸和氯化亚砜用量，按大黄酸(mmoL)为2.7，氯化亚砜(mL)为2.2的比例，将氯化亚砜加入到大黄酸中，在回流状态下反应2.5小时，真空蒸除剩余的氯化亚砜，得到大黄酸酰氯；
(3)按步骤(1)中活化硅胶(g)的单位用量计算三乙胺的无水甲苯用量，按三乙胺(mL)为0.44，无水甲苯(mL)为11的比例，以无水甲苯为溶剂，在催化剂三乙胺的存在下，将前体硅胶与大黄酸酰氯在氮气保护和搅拌下回流反应12小时，用甲苯作溶剂抽提10小时，再依次用甲苯、氯仿、丙酮、甲醇和丙酮洗涤滤液清亮，抽干，真空干燥，制得大黄酸键合硅胶色谱固定相。
本实施例所得的大黄酸键合硅胶色谱固定相，其大黄酸键合硅胶固定相表面配体键合浓度实测数据如下表：
大黄酸键合硅胶固定相表面配体键合浓度
| 键合相 | C(％) | H(％) | 键合浓度α(mmol/g) |
| 大黄酸键合相前体硅胶 | 11.764.24 | 1.351.08 | 0.421.18 |
Claims (6)
1、一种大黄酸键合硅胶色谱固定相的制备方法，以活化硅胶为键合固定相基质，其特征是：
(1)在氮气氛下，按活化硅胶(g)∶含氨基丙基的硅氧烷偶联剂(mmoL)∶无水甲苯(mL)为1∶2.7～3.3∶9～11的比例，将氨基丙基的硅氧烷加入无水甲苯中，油浴迅速升温至110～120℃，搅拌，在回流状态下反应8～10小时，继续通氮气直至室温；过滤，固体用甲苯和甲醇洗涤，80℃下真空干燥，制得含氨基的硅胶前体；
(2)按步骤(1)中活化硅胶(g)的单位用量计算大黄酸和氯化亚砜用量，按大黄酸(mmoL)为2.3～2.7，氯化亚砜(mL)为1.8～2.2的比例，将氯化亚砜加入到大黄酸中，在回流状态下反应2～2.5小时，真空蒸除剩余的氯化亚砜，得到大黄酸酰氯；
(3)按步骤(1)中活化硅胶(g)的单位用量计算三乙胺和无水甲苯用量，按三乙胺(mL)为0.36～0.44，无水甲苯(mL)为9～11的比例，以无水甲苯为溶剂，在催化剂三乙胺的存在下，将硅胶前体与大黄酸酰氯在氮气保护和搅拌下回流反应10～12小时，用甲苯作溶剂抽提10小时，再依次用甲苯、氯仿、丙酮、甲醇和丙酮洗涤滤液清亮，抽干，真空干燥。
2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征是活化硅胶(g)∶含氨基丙基的硅氧烷偶联剂(mmoL)∶无水甲苯(mL)的比例为1∶3∶10。
3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征是活化硅胶(g)∶大黄酸(mmoL)∶氯化亚砜(mL)的比例为1∶3∶2.5。
4、根据权利要求1所述的制备方法，其特征是活化硅胶(g)∶三乙胺(mL)∶无水甲苯(mL)的比例为1∶0.4∶10。
5、根据权利要求1所述的制备方法，其特征是含氨基丙基的硅氧烷偶联剂，为γ-氨基丙基三乙氧基硅烷。
6、根据权利要求1所述的制备方法，其特征是含氨基丙基的硅氧烷偶联剂，为γ-氨基丙基三甲氧基硅烷。
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