CN1863909A - 伸展单链核酸的方法、单链核酸伸展装置以及dna芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明验证了高频交流电场对水性溶液中的单链核酸的作用，该作用用于增强将所述单链核酸转变为其配对的互补链的杂交效率。本发明提供了，例如，伸展核酸的方法和核酸伸展装置，其中将高频交流电场施加于以游离形式存在于纯水或pH为5－11的水性溶液(R)中的单链核酸，或施加于固定在所提供的面向水性溶液(R)的对电极(E，E)之一或两者(E)的表面(f)之上的单链核酸，从而伸展所述单链核酸。

Description

伸展单链核酸的方法、单链核酸伸展装置以及DNA芯片
技术领域
本发明涉及在高频电场作用下伸展单链核酸的技术，所述单链核酸以无规卷曲或类似形式存在于水性溶液中。
背景技术
有一种技术，其涉及用微阵列技术将预定的DNA以微阵列形式支持在整合的生物测试板上，这种技术通常被称为“DNA芯片”或“DNA微阵列”(在下文中统称为“DNA芯片”)。由于在玻璃基片或硅基片上整合了多种或大量的DNA寡糖、cDNA(互补DNA)或类似物，这一DNA芯片技术具有可对分子间的反应(例如杂交)进行综合分析的特征。因此，DNA芯片用于基因突变分析、SNP(单碱基多态性)分析、基因表达频率分析等，并已开始被发现在广泛的领域内具有用途，例如药物开发、临床诊断、药物基因组学、法医学以及其它领域。
目前，上述DNA芯片技术已开始从致力于提高用于综合分析的DNA数量的技术开发，转变为以改善这种综合分析的精确度和反应效率为目的的技术开发。
更具体而言，从DNA芯片在临床诊断等的应用增加这一角度来说，对于更高灵敏度、定量和精确度、更短的反应时间等的要求更甚于对每片基片上所整合的DNA数量的要求。
日本专利公开公报Hei 6-038768号(参见权利要求1及其它部分)中揭示了一种用于在高粘度溶液中或在电场下消除热波动的技术，其前提是该技术应用于用酶促反应或化学反应处理DNA、RNA、其衍生物、其片段的方法或系统中。所描述的这一技术可使得对高分子DNA的处理(例如DAN链的合成反应)得以高效并精确进行。明确地说，这一技术的目的是使得高分子DNA在电场存在下经受酶促反应或化学反应。
此外，日本专利公开公报第Hei 8-322568号(参见权利要求1、第[0001]段及其它部分)揭示了一种DNA复制方法，该方法的特征在于：在使引物结合到单链模板DNA上的退火反应步骤和使DNA链从引物延伸的合成反应步骤中，对反应溶液施加电场，该反应溶液含有用于使模板DNA合成为直线形式的材料、合酶等。这一技术的目的是用于序列分析以确定DNA的碱基序列、或用于PCR法中以扩增DNA样品，因此该技术的前提是用于实现上述目的的所需成分包含在反应溶液中，而要施加的电场施加于该反应溶液。
然而，对于高频交流电场或任何其它电场对存在于纯水或类似水性溶液(绝对不含DNA合成所需的任何成分，例如核酸材料、酶和引物)中的单链核酸所可能产生的任何反应或作用仍是一无所知。此外，尚未验证水性溶液中杂交的效率与高频交流电场间任何可能的相关性，其中该水性溶液保留在整合板(例如生物分析用的DNA芯片)上小体积的反应孔中。
因此，本发明的主要目的在于证实高频交流电场对存在于水性溶液(绝对不含DNA合成所需的任何成分，例如核酸材料、酶和引物)中的单链核酸的作用；并利用上述作用来提高以单链核酸为互补链的杂交的效率。
发明内容
本发明首先提供了一种伸展下述单链核酸(1)或(2)的核酸伸展方法，该方法通过使高频交流电场作用于单链核酸(1)或(2)上：(1)以游离形式存在于纯水或pH为5-11的水性溶液中的单链核酸，或(2)以固定形式存在的单链核酸，该单链核酸固定在面向所述水性溶液排列的相对电极的一个或两个电极上；以及使用所述伸展设备的核酸伸展系统。
本发明还提供了一种DNA芯片，该芯片采用了在高频交流电场或介电电泳的作用下伸展以游离或固定形式存在于pH为5-11水性溶液中的单链核酸的方法，所述高频电场施加于保留有纯水或pH为5-11的所述水性溶液的反应孔。
需要注意的是，本文所用的术语“水性溶液”是指纯水或绝对不含用于DNA合成的核酸材料、酶和任何其它高分子成分(例如引物)的pH为6-11的水性溶液。该水性溶液作为水相发挥功能，它能为含有互补链的核酸提供杂交的场所。
附图概述
图1为状态示意图，在该状态中具有以无规卷曲形式缠绕成高级结构的单链核酸(1)(如DNA)以游离形式存在于水性溶液(R)中。
图2为状态示意图，在该状态中单链核酸(1)在高频交流电场的作用下已沿电场以单一方向伸直。
图3为状态示意图，在该状态中单链核酸(3)的末端固定于电极(E)的表面(f)上，在外加电压为0的状态下该单链核酸具有卷曲成无规卷曲形式的高级结构。
图4为状态示意图，在该状态中固定在电极(E)上的单链核酸(4)已在高频交流电场的作用下被伸展。
图5为位于电极(E)对侧的另一电极(e)以较小面积成形的构造示意图。
图6描绘了反应检测部分的一个实施方式，其配备有可使反应检测部分排列于平板(例如DNA芯片)上的结构。
图7是DNA芯片(10)的一个实施方式的外部透视图，在该芯片上排列有相同的反应检测部分(6)。
图8是获自试验中观察的显微照片(以照片代替图)，这是一张施加电场前，溶液中无规卷曲形式的单链DNA的照片。
图9是获自试验中另一次观察的显微照片(以照片代替图)，这是一张单链DNA通过电场的施加被伸展的照片。
本发明的最佳实施模式
在附图的基础上对实施方式进行描述，这些实施方式可适当地实现本发明的用于伸展单链核酸的技术。
图1示意了一种状态，在该状态中单链核酸(1)以游离形式存在于用记号R来表示的水性溶液中，该单链核酸具有高级结构、卷曲成无规卷曲形式，例如DNA。在图1所示的状态中，施加的电压为0。需要注意的是，在图1和其它图中，记号A代表能够保留水性溶液R的反应孔，而记号E，E则代表由铝或其它材料形成并彼此相对排列的电极，保留在反应孔A中的水性溶液R夹在两个电极之间。此外，记号V、记号S1和记号S2分别表示与电极E，E连接的交流电源、处于关(OFF)位置的开关和处于开(ON)位置的开关。
要求将电极E-E间的距离设计为40μm或更短，这是由于电极E-E间的距离大于40μm被认为易于在水性溶液R中产生对流，这一对流是由施加电压所导致的热能引起。由于这一对流被认为会干扰高频交流电场伸展单链核酸1的作用，因此要尽量避免在水性溶液R中发生此类对流。
如图2所示，高频交流电场(在图中以虚线表示)是在水性溶液R中通过电极E，E形成的，穿过电极的电压是由电源V提供的。通过这一高频交流电场的作用，可以使单链核酸1在不被电解的状态下沿电场单向定向。因此，作为高频交流电场构造的结果，该单链核酸显示为伸展的形式。需要注意的是，记号2表示已变成伸展形式的单链核酸。
图3显示的状态是：单链核酸(3)的末端固定于电极(E，E)之一的表面(f)上，在外加电压为0的状态下它具有卷曲成无规卷曲形式的高级结构。需要注意的是，电极表面f事先已经表面处理，以使得单链核酸3的末端可通过化学结合(例如偶联)固定于其上。例如，在经链亲和素表面处理的表面f上可固定经生物素化的单链核酸末端。
图4显示了固定的单链核酸4已在高频交流电场的作用下被伸展的状态。经固定的单链核酸4在被固定的同时被促使在单一方向伸直，且由此该单链核酸4沿电场方向伸展。需要注意的是，即便单链核酸曾经伸展过，一旦当高频交流电场的供给电压低至0时，该单链核酸仍会回复到原来的无规卷曲形式。
在图5所示的构造中，位于电极E对侧有较小面积的另一电极e，从而形成集中于电极e上的非均匀电场(如图5中交替的长-短划线所示)。需要注意的是，由于电力线聚集在电极的凸处和尖端边缘部分，为了形成不均匀的电场，可通过诸如溅射表面处理和蚀刻等在电极表面形成具有凹凸的粗糙表面的构造或类似的构造。
当人为地在电极e的附近形成非均匀电场从而使电力线集中在一个位置上时，以游离形式存在于水性溶液R中的单链核酸1(参见图1)可由此通过介电电泳向电力线集中的单一位置(电极e)迁移，从而使该单链核酸得以伸展。由此，单链核酸的末端可固定于电极e上。需要注意的是，图5中的记号5表示单链核酸的末端固定于电极e上。
现在来参考以下图6，该图显示了反应检测部分的一个实施方式，其配备有可使反应检测部分排列于平板(例如DNA芯片)上的结构。这一反应检测部分6配备有反应孔A和相对的电极E，E，反应孔A是能够保留水性溶液R的极小的凹陷区域，而相对的电极E，E则面向反应孔A排列。图6中记号7所示的是一组单链DNA探针，它们各自被事先以伸展形式固定在电极E的表面f上。
图6中的记号8所示为从微喷嘴N逐滴加入反应孔A中的单链靶核酸。逐滴加入后，这一单链靶核酸8立即形成无规卷曲形式的高级结构。当对电极E-E间的缠绕的靶单链核酸8施加高频交流电场时，该单链核酸可发生结构变化以形成如记号9所示的伸展形式，并且可使得该伸展的单链核酸沿电场(电力线)向DNA探针7侧迁移。
在靶单链核酸8已完全移动到邻接DNA探针7的区域后，通过停止施加电场的一段时间，可使得杂交在短时间内通过天然的布朗运动、在施予的pH、温度等条件下高效地进行。更为详细的描述为，在各自均为伸展形式的DNA探针7和靶单链核酸8之间，当它们包含互补的碱基序列时，能够进行高精度的杂交，该杂交具有降低的误杂交，且不受空间位阻或水性溶液R对流的影响。
可提供包含多个排列于基片上的如图7所示的此类反应检测部分6的DNA芯片。例如，多个如上文所述的反应检测部分6在如图7所示的盘状板10上呈辐射状排列或以圆周方向排列，而所需的DNA探针7可固定在分组的反应检测部分6中。
(实施例)
进行了根据本发明的高频交流电场对单链核酸的伸展作用的验证试验。
通过PCR法扩增了λ噬菌体DNA(Takara Shuzo)的部分序列(5kbp)(参见NAKAYAMA的《生物试验图解》″Bioexperiments Illustrated″，第三卷，第二章，出版于日本，Shujunsha Co.，Ltd，1998年)。在进行扩增时，以1∶1的比例加入dTTP和dUTP-FITC以对PCR产物进行荧光标记。在PCR扩增进行时，采用了5′端经生物素化的引物(TOYOBO，LTD.)作为一侧的引物。
对该PCR产物进行凝胶电泳，将5kb处的条带切割分离，并从凝胶中提取双链DNA片段。采用了“QIAquick Gel Extraction KIT”(QIAGEN K.K)提取所述DNA片段。
单链DNA制备的概要。在一系列步骤中，使用了“DINABEADS KilobaseBinder Kit”(Dynal Inc.)。将所得的双链DNA与施加于珠上的抗生物素蛋白结合，然后用碱使其变性以释放液相中的双链DNA中未经生物素修饰的的单链DNA，从而获得用于下一步试验的单链DNA。
更具体的描述为，将试剂盒中的珠(“DYNABEAD M-280 streptavidin”，5μL)用结合溶液(20μL)洗涤，然后将其悬浮在结合溶液中(20μL)。然后进行抗生物素蛋白-生物素反应。将通过PCR用生物素化的引物扩增的样品DNA(20μL)和上述的珠悬浮液在室温下孵育3小时。用磁铁收集珠，然后去除上清液，并用洗涤缓冲液洗涤2次(40μL每次)以去除未反应的DNA。
加入200mM的氢氧化钠(20μL)，然后在0℃下孵育10分钟以促进DNA的碱变性。收集含有释放出的单链DNA的上清液。用“MICROCON”(MilliporeCorporation)浓缩上清液，并用超纯水替换液相以降低氢氧化钠的浓度。
将由此获得的水性DNA溶液(5μL)置于一对间距设定为25μm的相对的铝电极之间，然后施加电压为1MHz和1.5V/μm的高频交流电场。由此使单链DNA在该水性溶液中的伸展成为可能。在衰减显微镜(evanescent microscope，由Olympus Corporation制造)下观察证实该伸展状态。图8和图9所示为通过那些观察得到的显微照片。
图8是施加电场前，水性溶液中无规卷曲形式的单链DNA的照片，而图9则是通过电场的施加被伸展的单链DNA的照片。
工业适用性
本发明可用于以下技术，例如：在形成DNA芯片的基片的预定位置上固定一种或多种处于伸展形式的检测核酸(如DNA检测探针)；或在伸展一种或多种固定的检测核酸和一种或多种具有互补链的靶核酸时进行杂交。
当将高频交流电场施加于以游离形式或以其末端固定形式存在于纯水或pH5-11的水性溶液中的单链核酸时，由于热运动而以无规卷曲形式存在的单链核酸能得以伸展而不被电解。具体而言，认为由形成单链核酸骨架的含磷离子(带负电)和它们周围来自水中的氢原子(带正电)形成电子云。因此，在高频交流电场的施加下，由这些负电荷和正电荷产生的极化向量(偶极)整体呈单一方向取向，并由此使得单链核酸得以伸展。
此外，当水性溶液中形成非均匀电场而使电力线集中在某一具体位置时，可使得以游离形式存在于水性溶液中的单链核酸向电力线集中的位置移动。这一现象被称为“介电电泳”。当水性溶液被置于间距为25μL或更短的相对电极之间以减小由施加电压的提高而引起的对流的影响，并将具有500kHz或更高的高频和足以提供1.2V/μm或更高电场强度的施加电压的高频交流电场施加于该水性溶液时，可确定地对以无规卷曲形式存在的单链核酸进行介电极化。因此，该单链核酸可平行于电场被线性伸展。
通过上述被称为“介电电泳”的电动力学效应，就有可能自然地将极性的单链核酸移动到电极的一个边缘，并将该单链核酸用以其一端接触于相对电极的形式固定。可将此用于在DNA芯片等的反应孔中排列和固定检测DNA探针等。当关闭电场时，以其一端(末端)固定的形式存在的单链核酸回复到原来的无规卷曲状态。
处于伸展状态的核酸，其碱基序列是暴露的，从而消除了由位阻或热波动引起的不利影响。因此，其与另一具有互补链的核酸的杂交得以在短时间内高效而高精度地进行。

Claims (10)

1.一种核酸伸展方法，所述方法通过以高频交流电场作用于以下单链核酸(1)或(2)来伸展所述单链核酸(1)或(2)：
(1)以游离形式存在于纯水或pH为5-11的水性溶液中的单链核酸，或
(2)以固定形式存在的单链核酸，所述单链核酸固定于面向所述水性溶液排列的相对电极之一或两者上。
2.如权利要求1所述的核酸伸展方法，其特征在于，所述高频为500kHz或更高的频率，且施加电压给出1.2V/μm或更高的电场强度。
3.如权利要求1所述的核酸伸展方法，其特征在于，将所述相对电极间的距离设定为40μm或更短。
4.如权利要求1所述的核酸伸展方法，其特征在于，所述单链核酸的所述伸展受介电电泳的影响。
5.一种核酸伸展系统，其特征在于，以采用权利要求1所述的方法伸展的单链核酸作为互补链之一来进行杂交。
6.一种核酸伸展系统，该系统至少提供了能在其中储存水性溶液的反应孔、和在所述反应孔中形成高频交流电场的装置，其特征在于，在所述高频交流电场的作用下，存在于所述反应孔中的单链核酸是伸展的。
7.如权利要求6所述的核酸伸展系统，其特征在于，所述反应孔至少具有一对相对的电极，且所述单链核酸以其一端固定在所述相对电极中的一个或两个的表面上。
8.如权利要求7所述的核酸伸展系统，其特征在于，所述相对电极间的距离为40μm或更短。
9.一种核酸伸展系统，其特征在于，以伸展的单链核酸作为互补链之一，在所述反应孔中进行权利要求6所述的杂交。
10.一种DNA芯片，其特征在于，使用一种装置用于在施加于保留有纯水或水性溶液的反应孔的高频交流电场的作用下伸展单链核酸，所述单链核酸以游离或固定形式存在于pH5-11的所述水性溶液中。
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