JP2005189125A

JP2005189125A - Ｄｎａマイクロアレイの製造方法

Info

Publication number: JP2005189125A
Application number: JP2003431713A
Authority: JP
Inventors: Masayasu Sakane; 正恭坂根; Tatsuhiko Mori; 竜彦森; Haruki Shiraishi; 晴樹白石
Original assignee: Nissha Printing Co Ltd
Current assignee: Nissha Printing Co Ltd
Priority date: 2003-12-26
Filing date: 2003-12-26
Publication date: 2005-07-14

Abstract

【課題】安価な素材からなる基板に対して迅速に処理して製造することができ、検出部を複数形成する場合であっても容易に形成することができるＤＮＡマイクロアレイの製造方法を提供する。
【解決手段】絶縁性を有する基板２上に、リード部４と検出部３とをカーボンを主とする材料によって直列に形成し、次いで少なくとも検出部３にプラズマ照射を行い、次いで検出部３に核酸を付着させるように構成したので、安価な素材からなる基板に対して迅速に処理して製造することができ、検出部を複数形成する場合であっても容易に形成することができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、電気化学的検出方式に用いるＤＮＡマイクロアレイの製造方法に関する。

従来から、遺伝子構造を大量に効率的に解析するための解析ユニットとしてＤＮＡマイクロアレイがある（ＤＮＡチップともいう）。

ＤＮＡマイクロアレイとして、プローブＤＮＡを電極型センサに適用する方法がある（たとえば、特許文献１参照）。すなわち、出力端子を備えた電極であって、プローブＤＮＡが固定された電極と試料ＤＮＡとを反応させ、反応後の電極の電流を測定することにより、プローブＤＮＡと試料ＤＮＡとで形成されるハイブリッドＤＮＡの存在を検出あるいはハイブリッドＤＮＡの量を測定する方法である。すなわち、プローブＤＮＡが結合した電極を試料ＤＮＡを含む検体溶液に導入することにより、プローブＤＮＡと相補的な配列を有する試料ＤＮＡがハイブリダイズし、ハイブリッドＤＮＡが形成される。このハイブリダイゼーションは、インターカレーターの存在下で行なう。インターカレーターは、ハイブリッドＤＮＡの二本鎖間に侵入し、一種の電荷移動錯体を形成する。ハイブリッドを形成しない場合、つまり一本鎖のままであれば、インターカレーションは起こらない。インターカレーションにより、電極に流れる電流量が変化する。この電流は、ハイブリダイズにより形成された二本鎖ＤＮＡにインターカレートしたインターカレーターの酸化、還元によるものである。二本鎖ＤＮＡの形成の程度はインターカレートの程度として検出することができる。したがって、電極に流れる電流量を検出および／または測定することにより、ハイブリッドＤＮＡの存在が検出され、あるいはハイブリッドＤＮＡの量が測定される。このような電気化学的検出方式に用いるＤＮＡマイクロアレイは、ＥＣＡ（ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＣｈｅｍｉｃａｌＡｒｒａｙ）チップともいう。
特開平９−２８８０８０号公報

電気化学的検出方式に用いるＤＮＡマイクロアレイの電極としては、蒸着法で形成されたアレー状に配置された多数の微細な金電極上に、それぞれ異なる種類の合成オリゴＤＮＡを共有結合させたものがある（たとえば、特許文献２参照）。各金電極に異なる種類の合成オリゴＤＮＡを供給する手段としては、フォトリソグラフィー法を利用した方法や、ディスペンサーで反応性物質を滴下する方法がある。
特開２００１−５０９３１号公報

ＤＮＡマイクロアレイは、各種検査への応用が期待されているが、高価であるため、現在、研究用途以外には余り普及していない。そのため安価なＤＮＡマイクロアレイが望まれている。

そのため、基板表面に核酸分子を湿潤化学的処理を行わずに固定化することによってコスト低下を図る方法として、基板表面に原子状酸素プラズマで処理し、基板表面に核酸の結合部位を形成することによって固定化する方法がある（たとえば、特許文献３参照）。
特開２００２−２１８９７６号公報

しかし、上記の方法は、次のような問題点を有するものであった。

すなわち、基板として酸化ケイ素、ガラス、酸化アルミニウム、サファイア、ＳｒＴｉＯ_３、ＬａＡｌＯ_３、ＮｄＧａＯ_３およびＺｒＯ₂などの単結晶表面またはアモルファスであるものを用いるため、いずれの素材も比較的高価なものであった。

また、基板表面に酸化物を形成する必要があり、基板の種類がサファイアなど酸化物形成が困難な素材である場合は、長時間の処理が必要であった。

また、上記の核酸固定化法は、電気化学的検出方式に用いるＤＮＡマイクロアレイの電極に関するものではないため、検出部を複数形成しようとしても検出部間の絶縁が困難であった。

したがって、本発明は、上記のような問題点を解消し、安価な素材からなる基板に対して迅速に処理して製造することができ、検出部を複数形成する場合であっても容易に形成することができるＤＮＡマイクロアレイの製造方法を提供することを目的とする。

本発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法は、以上の目的を達成するために、以下のように構成している。

本発明の第１態様によれば、絶縁性を有する基板上に、リード部と検出部とをカーボンを主とする材料によって直列に形成し、次いで少なくとも検出部にプラズマ照射を行い、次いで検出部に核酸を付着させるＤＮＡマイクロアレイの製造方法を提供する。

本発明の第２態様によれば、プラズマ照射を、大気プラズマ処理法または酸素プラズマ処理法で行う第１の態様に記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法を提供する。

本発明の第３態様によれば、リード部と検出部の形成を、カーボンインキを用いスクリーン印刷法で行う第１〜２の態様のいずれかに記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法を提供する。

本発明の第４態様によれば、核酸の固定を、核酸が分散した水溶液に検出部を浸漬して行う第１〜３の態様のいずれかに記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法を提供する。

本発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法は、絶縁性を有する基板上に、リード部と検出部とをカーボンを主とする材料によって直列に形成し、次いで少なくとも検出部にプラズマ照射を行い、次いで検出部に核酸を付着させるように構成したので、安価な素材からなる基板に対して迅速に処理して製造することができ、検出部を複数形成する場合であっても容易に形成することができる。

図面を参照しながら本発明の実施の形態について詳しく説明する。

図１は、本発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法によって得ることができるＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す平面図である。図中、１はＤＮＡマイクロアレイ、２は基板、３は検出部、４はリード部である。

本発明のＤＮＡマイクロアレイ１の製造方法は、絶縁性を有する基板２上に、リード部４と検出部３とをカーボンを主とする材料によって直列に形成し、次いで少なくとも検出部３にプラズマ照射を行い、次いで検出部３に核酸を付着させる方法である（図１参照）。なお、本発明でいうＤＮＡマイクロアレイ１とは、ＤＮＡの検出だけでなく、ＲＮＡ、プロテインの検出を行うものも含む。

まず、絶縁性を有する基板２上に、リード部４と検出部３とをカーボンを主とする材料によって直列に形成する。

基板２としては、絶縁性を有し、リード部４と検出部３とを形成可能なものであればよい。たとえば、紙類、ポリエチレン系樹脂、エチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリイソブチレン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート系樹脂、不飽和ポリエステル系樹脂、含フッ素系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリ塩化ビニリデン系樹脂、ポリ酢酸ビニル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、ポリビニルアセタール系樹脂、アクリル系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、ポリスチレン系樹脂、アセタール系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアミド系樹脂、フェノール系樹脂、ユリア系樹脂、エポキシ系樹脂、メラミン系樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体系樹脂、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体系樹脂、シリコーン系樹脂、ポリフェニレンオキサイド系樹脂、ポリスルホン系樹脂などの有機材料や、ガラス、アルミナなどの無機材料などを使用することができる。

リード部４および検出部３は、カーボンを主とする材料によって直列に接続されるように形成する。

カーボンを主とする材料としては、たとえば、導電性に優れた物質である黒鉛、カーボンブラック、炭素繊維などを導電性フィラーとし、エポキシ系樹脂、アルキド系樹脂、アクリル系樹脂、ポリウレタン系樹脂、メラミン系樹脂、フェノール系樹脂、塩化ビニル−酢酸ビニル共重合体系樹脂などからなるバインダーと、バインダーとして用いる樹脂を溶解する溶剤とからなる導電性インキを用いるとよい。また、必要に応じて、分散剤、滑剤、カップリング剤などの添加剤を加えてもよい。

導電性インキの印刷方法としては、容易に厚膜、パターン化可能なスクリーン印刷法が好ましい。乾燥方法や膜厚は、所望の抵抗値になるよう適宜選択するとよい。

導電性インキを、加熱などの手段で乾燥させる。導電性インキを乾燥させることにより、リード部４および検出部３を実用的な抵抗値にすることができる。

また、リード部４および検出部３は、１つの基板２上に１組だけでなく、複数組を並行するように形成してもよい。検出部３の幅を小さくするほどＤＮＡマイクロアレイ１を小型化することができ、必要とする検体の量を少なくできるので好ましいが、逆に検出感度も小さくなるので、リード部４および検出部３の数はこれらの要素を総合的に勘案して決定するとよい。

なお、リード部４および検出部３は上記した手段以外で形成してもよく、たとえば、カーボンエッチング法などを用いてもよい。

リード部４において、導電性が小さいと検出信号が小さくなり、ノイズの影響が大きくなるので正しい検出結果を得るのが困難になる。本発明においては、導電性は、リード部４の長さなどにより適宜精度よく検出できる範囲であればよく、ばらつきの少ない安定した検出信号を取り出すには１５００Ω／ｃｍ^２以下であるのが好ましい。

また、基板２上に複数の検出部３およびリード部４を形成する場合、各リード部４の長さは、それぞれ同一であっても、異なるものであってもよい。各リード部４の長さが同一であると、各リード部４の抵抗値を一定とすることが容易となる。リード部４の長さを変える場合には、リード部４が長いものほど検出感度が低下するので、必要に応じて抵抗値を考慮してこれを補正するとよい。

検出部３は、導電性インキの印刷によって、リード部４および検出部３が直列になるように連続したパターンとして１回の印刷工程で連続して印刷して形成することができる。検出部３としては、所望の抵抗値を有するようにするとよい。

次いで、少なくとも検出部３にプラズマ照射を行う。プラズマ照射としては、大気プラズマ処理法や酸素プラズマ処理法を用いるのが好ましい。これらのプラズマ処理法を用いると、カーボンを主とする材料から構成される検出部３の表面に、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯなどの所望の官能基を容易に導入することが可能である。なお、減圧プラズマ処理法によっても所望の官能基を導入することができるが、処理時間、作業性、核酸固定化の効果などを総合的に勘案すると、大気プラズマ処理法および酸素プラズマ処理法の方がより良好な結果を得ることができる。

プラズマ照射の条件については、基板２や検出部３が大きく損傷しない程度であればよい。たとえば、照射時間については、通常、数分以内程度の範囲で行うとよい。また、照射距離についてもプラズマ照射装置の性能や、基板２や検出部３の損傷程度に応じて適宜選択するとよい。

次いで、検出部３に核酸を付着させる。

検出部３に核酸を付着させるには、プラズマ処理した検出部３を、速やかに核酸が分散したリン酸バッファーなどの溶液に浸漬して照射部への固定化を行ない、オーブンなどで乾燥するとよい。ここで使用するプローブＤＮＡは、鎖長数ｍｅｒ〜５０ｍｅｒ程度が好ましい。これは鎖長が長くなるとハイブリダイズが困難になったり、クロスハイブリダイゼーションなどの影響により安定した電極信号が得られなくなるからである。

さらに、図１に示すように、複数の検出部３を設け、個々に異なる核酸を固定化する場合は、プラズマ照射を、核酸固定を行わない検出部３をマスキングして行い、直ちに所望の核酸の入った処理液に浸漬する。次いで、他の検出部３についても同様の手順で核酸の固定化を行い、順次異なった核酸を検出部３に固定化する。

本発明においてプラズマ照射により核酸が固定化されるのは、プラズマ照射により検出部３の表面に生ずる−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯなどの官能基を利用するものと考えられる。

このようにして得たＤＮＡマイクロアレイ１は、水で洗浄しても電気信号に変化が見られないことから核酸が検出部３の表面に強く結合していることが分かる。

以上のようにしてＤＮＡマイクロアレイ１を得ることができる。なお、以上に述べたＤＮＡマイクロアレイ１の製造方法は一例であり、本発明の請求項に記載した範囲において、他のＤＮＡマイクロアレイ１の製造方法であっても用いることができる。

厚さ２５０μｍ、幅４５ｍｍ、長さ６０ｍｍのポリエチレンテレフタレートフィルムを基板２とし、その上にカーボンを主とする導電性インキ（十条ケミカル株式会社製ＣＨ−１）をスクリーン印刷にて、図１に示すように、５ｍｍ角の検出部３と、幅２ｍｍ、長さ５０ｍｍのリード部４とがそれぞれ直列になるよう印刷した後、オーブンで７０℃２時間の乾燥処理を行った。

次いで、検出部３のみプラズマ照射されるようにマスキングプレートを基板２上にセットし、プラズマ照射装置（株式会社キーエンス製ＰｌａｓｍａＳｕｆａｃｅＴｒｅａｔｅｒＳＴ−７０１０）にて大気プラズマ処理を行った。処理条件は、照射距離３０ｍｍ、照射時間３秒とした。

次いで、速やかにＳＩＧＭＡ社製ＰＯＬＹＧＵＡＮＹＬＩＣＡＣＩＤｐｏｔａｓｓｉｕｍｓａｌｔを０．０１Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）で３０ｐｐｍになるよう調整した液中に上記作製した基板２の検出部３を挿入し、５分間浸漬し水洗、４０℃３０分のオーブン乾燥を経てＤＮＡマイクロアレイ１を得た。

このようにして得たＤＮＡマイクロアレイ１を０．２Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）液中に挿入し、扶桑製作所社製ポテンショスタットＭＯＤＥＬ３３１Ａにて電位を＋０．１Ｖより＋１．３Ｖまで走査し酸化還元電位を測定したところ０．９Ｖ付近にグアニンのピークが確認され、実用上問題がないものであった。

本発明は、電気化学的にＤＮＡやＲＮＡを検出する方法において好適に用いることができ、産業上有用なものである。

本発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法によって得ることができるＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す平面図である。

符号の説明

１ＤＮＡマイクロアレイ
２基板
３検出部
４リード部

Claims

絶縁性を有する基板上に、リード部と検出部とをカーボンを主とする材料によって直列に形成し、次いで少なくとも検出部にプラズマ照射を行い、次いで検出部に核酸を付着させることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
プラズマ照射を、大気プラズマ処理法または酸素プラズマ処理法で行う請求項１記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
リード部と検出部の形成を、カーボンインキを用いスクリーン印刷法で行う請求項１〜２のいずれかに記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
核酸の固定を、核酸が分散した水溶液に検出部を浸漬して行う請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法。