JP4412959B2

JP4412959B2 - 多層ｄｎａマイクロアレイ

Info

Publication number: JP4412959B2
Application number: JP2003338960A
Authority: JP
Inventors: 竜彦森; 了明面; 正恭坂根
Original assignee: Nissha Printing Co Ltd
Current assignee: Nissha Printing Co Ltd
Priority date: 2003-09-30
Filing date: 2003-09-30
Publication date: 2010-02-10
Anticipated expiration: 2023-09-30
Also published as: JP2005106559A

Description

本発明は、検出に必要とされる時間が短く、基板の表面改質が不要であり、基板材質の制約が少ない多層ＤＮＡマイクロアレイに関する。

従来から、遺伝子構造を大量に効率的に解析するための解析ユニットとしてＤＮＡマイクロアレイがある（ＤＮＡチップともいう）。

ＤＮＡマイクロアレイとして、プローブＤＮＡを電極型センサに適用する方法がある（たとえば、特許文献１参照）。すなわち、出力端子を備えた電極であって、プローブＤＮＡが固定された電極と試料ＤＮＡとを反応させ、反応後の電極の電流を測定することにより、プローブＤＮＡと試料ＤＮＡとで形成されるハイブリッドＤＮＡの存在を検出あるいはハイブリッドＤＮＡの量を測定する方法である。すなわち、プローブＤＮＡが結合した電極を試料ＤＮＡを含む検体溶液に導入することにより、プローブＤＮＡと相補的な配列を有する試料ＤＮＡがハイブリダイズし、ハイブリッドＤＮＡが形成される。このハイブリダイゼーションは、インターカレーターの存在下で行なう。インターカレーターは、ハイブリッドＤＮＡの二本鎖間に侵入し、一種の電荷移動錯体を形成する。ハイブリッドを形成しない場合、つまり一本鎖のままであれば、インターカレーションは起こらない。インターカレーションにより、電極に流れる電流量が変化する。この電流は、ハイブリダイズにより形成された二本鎖ＤＮＡにインターカレートしたインターカレーターの酸化、還元によるものである。二本鎖ＤＮＡの形成の程度はインターカレートの程度として検出することができる。したがって、電極に流れる電流量を検出および／または測定することにより、ハイブリッドＤＮＡの存在が検出され、あるいはハイブリッドＤＮＡの量が測定される。このような電気化学的検出方式に用いるＤＮＡマイクロアレイは、ＥＣＡ（ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＣｈｅｍｉｃａｌＡｒｒａｙ）チップともいう。

電気化学的検出方式に用いるＤＮＡマイクロアレイの電極としては、蒸着法で形成されたアレー状に配置された多数の微細な金電極上に、それぞれ異なる種類の合成オリゴＤＮＡを共有結合させたものがある（たとえば、特許文献２参照）。各金電極に異なる種類の合成オリゴＤＮＡを供給する手段としては、フォトリソグラフィー法を利用した方法や、ディスペンサーで反応性物質を滴下する方法がある。

これらのＤＮＡマイクロアレイでは、同一平面上に電極を構成するのが一般的である。基板に高集積度を要する核酸を固定化するには、核酸が固定化されるスポットの面積を小さくする方法が一般的に採られる。このような構成のＤＮＡマイクロアレイにおける信号の取り出し方法としては、基板の端に引き回し回路を形成したり、基板の背面にスルーホールで接続された接続部を形成するなどの方法が挙げられるが、集積度を高めると、引き回し回路の形成やスルーホールで接続された接続部の形成が困難になる。

そこで、高精度な設備を必要とせずに集積度を高めることが可能な方式として、印刷法を利用して得ることができる多層ＤＮＡマイクロアレイがある。印刷法を利用した多層ＤＮＡマイクロアレイとは、ターゲットＤＮＡを検出するためのＤＮＡプローブが固定化された電極を絶縁性を有する基板上に印刷法を利用して形成してＤＮＡマイクロアレイユニットとし、複数のＤＮＡマイクロアレイユニットを接着層を介して複数積層して多層化したものである。各ＤＮＡマイクロアレイユニット上には１組または複数組の検出部とリード部とが直列に形成されている。すなわち、図４に示すように、ＤＮＡを測定する検出部と、検出部からの信号を外部に伝えるためのリード部とが対をなして形成されている。たとえば、各ＤＮＡマイクロアレイユニットに複数の検出部が形成されていた場合、１つの多層ＤＮＡマイクロアレイ中には、各ＤＮＡマイクロアレイユニット上の検出部の数にＤＮＡマイクロアレイユニットの積層数を掛け合わせた数のリード部が存在することになる。
特開平９−２８８０８０号公報特開２００１−５０９３１号公報

しかし、図６に示すように、従来の多層ＤＮＡマイクロアレイは、複数のＤＮＡマイクロアレイユニットを、各検出部が他のＤＮＡマイクロアレイユニットの基板とわずかな隙間が生じるように積層し、検体溶液が毛管現象を利用して各検出部の表面に行き渡るように構成されているため、検体が検出されるまでの時間が長いという問題点があった。

また、検体として血液などの粘性が高いものを用いる場合は、基板に親水性処理や疎水性処理等の表面改質を行い、確実に検体が検出部に行き渡るようにする必要があった。

また、検体の種類によっては、基板間の隙間を大きくしてより確実に検体が検出部に行き渡るようにする必要があり、この場合には基板間の間隔を一定に保つため、基板として剛性が高く撓みにくいものを用いなければならないという制約があった。

したがって、本発明は、上記のような問題点を解消し、検出に必要とされる時間が短く、基板の表面改質が不要であり、基板材質の制約が少ない多層ＤＮＡマイクロアレイを提供することを目的とする。

本発明の多層ＤＮＡマイクロアレイは、以上の目的を達成するために、以下のように構成している。

本発明の第１態様によれば、絶縁性を有する基板上に導電性を有するリード部と、導電性を有し、かつ核酸が固定化された導電性微粉末を有する検出部とが直列に形成された複数のＤＮＡマイクロアレイユニットが、各検出部の上に他のＤＮＡマイクロアレイユニットの基板が重複せず検出部の表面が露出するよう階段状に積層された多層ＤＮＡマイクロアレイを提供する。

本発明の第２態様によれば、各リード部の抵抗値が一定である第１の態様に記載の多層ＤＮＡマイクロアレイを提供する。

本発明の第３態様によれば、各リード部の長さが一定である第１の態様に記載の多層ＤＮＡマイクロアレイを提供する。

本発明の多層ＤＮＡマイクロアレイは、第１態様によれば、絶縁性を有する基板上に導電性を有するリード部と、導電性を有し、かつ核酸が固定化された導電性微粉末を有する検出部とが直列に形成された複数のＤＮＡマイクロアレイユニットが、各検出部の上に他のＤＮＡマイクロアレイユニットの基板が重複せず検出部の表面が露出するよう階段状に積層されるように構成したので、検出部は検体溶液に瞬時に接触するため、測定時間を短縮できるものである。また、検出部に検体溶液を接触させるために毛管現象を利用しないので基板の表面改質が不要である。また、基板間に間隙を形成する必要がないので基板材質の制約が少ないものである。

図面を参照しながら本発明の実施の形態について詳しく説明する。

図１〜３は、本発明の多層ＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す断面図である。図４は、本発明の多層ＤＮＡマイクロアレイを構成するＤＮＡマイクロアレイユニットの一実施例を示す平面図である。図５は、は本発明の多層ＤＮＡマイクロアレイを構成するＤＮＡマイクロアレイユニットと接着層のパターンの一実施例を示す平面図である。１は多層ＤＮＡマイクロアレイ、２はＤＮＡマイクロアレイユニット、３は基板、４は検出部、５はリード部、６は接着層である。

本発明の多層ＤＮＡマイクロアレイ１は、絶縁性を有する基板３上に導電性を有するリード部５と核酸が固定化された検出部４とが直列に形成された複数のＤＮＡマイクロアレイユニット２が、各検出部４の上に他のＤＮＡマイクロアレイユニット２の基板３が重複せず検出部４の表面が露出するよう階段状に積層されたものである（図１参照）。なお、本発明でいう多層ＤＮＡマイクロアレイ１とは、ＤＮＡの検出だけでなく、ＲＮＡ、プロテインの検出を行うものも含む。

ＤＮＡマイクロアレイユニット２は、絶縁性を有する基板３上に、導電性を有するリード部５と核酸が固定化された検出部４とが直列に形成されたものである（図４参照）。

このような構成のＤＮＡマイクロアレイユニット２を得るには、たとえば、絶縁性を有する基板３上に、リード部５および検出部４が直列になるように導電性インキを用いて連続的に印刷し、次いで核酸が固定化された導電性微粉末を未乾燥の検出部４に付着させ、次いでリード部５および検出部４を乾燥させるようにするとよい。

基板３としては、絶縁性を有し、導電性インキが印刷可能なものであればよく、たとえば、紙類、ポリエチレン系樹脂、エチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリイソブチレン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート系樹脂、不飽和ポリエステル系樹脂、含フッ素系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリ塩化ビニリデン系樹脂、ポリ酢酸ビニル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、ポリビニルアセタール系樹脂、アクリル系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、ポリスチレン系樹脂、アセタール系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアミド系樹脂、フェノール系樹脂、ユリア系樹脂、エポキシ系樹脂、メラミン系樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体系樹脂、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体系樹脂、シリコーン系樹脂、ポリフェニレンオキサイド系樹脂、ポリスルホン系樹脂などの有機材料や、ガラス、アルミナなどの無機材料などを使用することができる。また、各基板３の厚さが数十μｍ程度と薄いものであると、多層ＤＮＡマイクロアレイ１をより小型化することができ、多層ＤＮＡマイクロアレイ１に接触させるべき検体溶液の量が少なくなるので好適である。

リード部５および検出部４は、絶縁性を有する基板３上に直列になるように導電性インキなどを用いて連続的に形成することができる（図４参照）。

導電性インキは、導電性フィラー、バインダー、溶剤から少なくとも構成される。導電性フィラーとしては、導電性に優れた物質である銅粉、金粉、黒鉛、カーボンブラック、炭素繊維、ニッケル粉などを用いることができる。なお、銀粉は検体溶液中に溶出するなどマイグレーションが生じるおそれがあるため、他の物質をフィラーとして用いるのが好ましい。バインダーとしては、エポキシ系樹脂、アルキド系樹脂、アクリル系樹脂、ポリウレタン系樹脂、メラミン系樹脂、フェノール系樹脂、塩化ビニル−酢酸ビニル共重合体系樹脂などを用いることができる。溶剤としては、バインダーとして用いる樹脂を溶解するものを用いるとよい。また、必要に応じて、分散剤、滑剤、カップリング剤などの添加剤を加えてもよい。

導電性インキに要求される特性としては、導電性、印刷適正、乾燥性が挙げられる。導電性が小さいと検出信号が小さくなり、ノイズの影響が大きくなるので正しい検出結果を得るのが困難になる。本発明においては、導電性は、リード部５の長さなどにより適宜精度よく検出できる範囲であればよく、ばらつきの少ない安定した検出信号を取り出すには１５００Ω／ｃｍ^２以下であるのが好ましい。

導電性インキの印刷方法としては、たとえば、スクリーン印刷法、グラビア印刷法、オフセット印刷法、インクジェット印刷法など、通常の印刷法を用いることができる。印刷方法は、導電性インキの種類や、リード部５および検出部４のパターン形状などに応じて適宜選択すればよい。また、リード部５および検出部４は、めっき法などで形成することもできる。

検出部４は、導電性インキの印刷によって、リード部５および検出部４が直列になるように連続したパターンとして１回の印刷工程で連続して印刷して形成することができる。検出部４としては、所望の抵抗値を有するとともに、核酸が固定化された導電性微粉末を固着させるようにする。すなわち、核酸が固定化された導電性微粉末が確実に検出部４の表面に固着できるようにするため、印刷された検出部４の導電性インキ膜厚と、付着される導電性微粉末の粒径を、適宜選択するとよい。

核酸が固定化された導電性微粉末を、未乾燥の検出部４に付着させる。導電性微粉末としては、導電性を有し、核酸を固定化することができるものを用いる。たとえば、金、グラシーカーボン、炭素などからなる微粉末を用いることができる。導電性微粉末の形状や大きさとしては、検出能力や再現性の点から印刷された導電性インキ上に一面に形成されるものであればよく、たとえば、球状、板状、針状など種々の形状のものを用いることができる。特に、形状が球状であると、検出部４に均一に付着させることができるので好ましい。

導電性微粉末に対して核酸を固定化する方法としては、たとえば、グラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することにより電極表面にカルボン酸を導入し、核酸のアミノ基とアミド結合形成させて固定化する方法がある。グラシーカーボンへの固定化は、ＫｅｌｌｙＭ．ＭｉｌｌａｎａｎｄＳｕｓａｎＲ．Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，ＡｎａｌｉｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ６５，２３１７−２３２３（１９９３）に記載されている。なお、本発明でいう核酸とは、ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片をいう。

リード部５および検出部４を構成する導電性インキを、加熱などの手段で乾燥させ、導電性微粉末を検出部４に完全に固着させ剥離しないようにする。乾燥条件としては、核酸を破壊しない１００℃以下とするのが好ましい。導電性インキを乾燥させることにより、リード部５および検出部４を実用的な抵抗値にするとともに、導電性微粉末との密着をより強固にすることができる。

また、リード部５および検出部４は、１つのＤＮＡマイクロアレイユニット２上に１組だけでなく、複数組を並行するように形成してもよい。検出部４の幅を小さくするほど多層ＤＮＡマイクロアレイ１を小型化することができ、必要とする検体の量を少なくできるので好ましいが、逆に検出感度も小さくなるので、リード部５および検出部４の数はこれらの要素を総合的に勘案して決定するとよい。

以上のようにしてＤＮＡマイクロアレイユニット２を得ることができる。なお、以上に述べたＤＮＡマイクロアレイユニット２の構成および製造方法は一例であり、本発明の請求項に記載した範囲において、他のＤＮＡマイクロアレイユニット２の構成および製造方法であっても用いることができる。

ＤＮＡマイクロアレイユニット２は、各検出部４の上に他のＤＮＡマイクロアレイユニット２の基板３が重複せず検出部４の表面が露出するよう階段状に複数積層される。

ＤＮＡマイクロアレイユニット２は、接着層６を介して積層するとよい。接着層６は確実にＤＮＡマイクロアレイユニット２を固定し、検出時に不純物などの影響で検出感度を損なわないものであればよい。またＤＮＡマイクロアレイユニット２上のＤＮＡを壊さない温度、すなわち約１００℃以下の温度で乾燥または固化するものが好ましい。接着層６としては、ポリエステル系樹脂、アクリル系樹脂、スチレンブタジエンゴムなどからなるものを用いるとよい。図１〜３に示すように、各ＤＮＡマイクロアレイユニット２の貼り合わせは、各検出部４の上に他のＤＮＡマイクロアレイユニット２の基板３が重複せず検出部４の表面が露出するよう階段状になるようにする。各ＤＮＡマイクロアレイユニット２の基板３の長さは、それぞれ同一であっても、異なるものであってもよい。また、各ＤＮＡマイクロアレイユニット２のリード部５の長さは、それぞれ同一であっても（図２参照）、異なるものであっても（図１、３参照）よい。各リード部５の長さが同一であると、各リード部５の抵抗値を一定とすることが容易となる。リード部５の長さを変える場合には、リード部５が長いものほど検出感度が低下するので、必要に応じて抵抗値を考慮してこれを補正するとよい。

多層ＤＮＡマイクロアレイ１は消耗品であるため、測定を行うごとに多層ＤＮＡマイクロアレイ１を交換する。多層ＤＮＡマイクロアレイ１を測定装置に接続するには、多層ＤＮＡマイクロアレイ１からの信号を受信するため、多層ＤＮＡマイクロアレイ１と同数の端子部を、多層ＤＮＡマイクロアレイ１と同様のピッチで有するコネクタ（図示せず）を用いるとよい。

厚さ１２５μｍ、幅７ｍｍ、長さ７０ｍｍのポリエチレンテレフタレートフィルムを基板とし、その上にカーボンインキを用いてスクリーン印刷法でリード部および検出部を形成し、次いで検出部にＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製ポリグアニル酸カリウム塩（ＰＯＬＹＧＵＡＮＹＬＩＣＡＣＩＤｐｏｔａｓｓｉｕｍｓａｌｔ）が固定化されたグラシーカーボン粉を散布して固定し、同一基板上に４個の検出部を有する単層のＤＮＡマイクロアレイユニットを得た（図４参照）。

また、基板の長さを６５ｍｍ、６０ｍｍ、５５ｍｍ、５０ｍｍとしたこと以外は上記と同様にして、それぞれ長さが異なる単層のＤＮＡマイクロアレイユニットを得た。

次いで、各ＤＮＡマイクロアレイユニットを、基板のリード部側の端面で位置合わせし、各検出部の上に他のＤＮＡマイクロアレイユニットの基板が重複せず検出部の表面が階段状に露出するように接着層を介して貼り合わせ、合計５層の多層ＤＮＡマイクロアレイを得た（図１参照）。

このようにして得た多層ＤＮＡマイクロアレイを用い、ハイブリダイゼーションおよびインターカレーションを行ったところ、それぞれの処理において安定化した値が得られるまでの時間は５秒程度と短いものであった。

比較例

比較例として、厚さ１２５μｍ、幅７ｍｍ、長さ７０ｍｍのポリエチレンテレフタレートフィルムを基板とし、その上にカーボンインキを用いてスクリーン印刷法でリード部および検出部を形成し、次いで検出部にＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製ポリグアニル酸カリウム塩（ＰＯＬＹＧＵＡＮＹＬＩＣＡＣＩＤｐｏｔａｓｓｉｕｍｓａｌｔ）が固定化されたグラシーカーボン粉を散布して固定し、同一基板上に４個の検出部を有する単層のＤＮＡマイクロアレイユニットを複数得た（図４参照）。

次いで、各検出部の表面が他のＤＮＡマイクロアレイユニットの基板と０．５ｍｍの間隔を有するように接着層を介して貼り合わせ、合計５層の多層ＤＮＡマイクロアレイを得た（図６参照）。

このようにして得た多層ＤＮＡマイクロアレイを用い、ハイブリダイゼーションおよびインターカレーションを行ったところ、それぞれの処理において安定化した値が得られるまでに３０秒程度要するものであった。

本発明は、電気化学的にＤＮＡやＲＮＡを検出する方法において好適に用いることができ、産業上有用なものである。

本発明の多層ＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す断面図である。本発明の多層ＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す断面図である。本発明の多層ＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す断面図である。本発明の多層ＤＮＡマイクロアレイを構成するＤＮＡマイクロアレイユニットの一実施例を示す平面図である。本発明の多層ＤＮＡマイクロアレイを構成するＤＮＡマイクロアレイユニットと接着層のパターンの一実施例を示す平面図である。従来の多層ＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す断面図である。

符号の説明

１多層ＤＮＡマイクロアレイ
２ＤＮＡマイクロアレイユニット
３基板
４検出部
５リード部
６接着層

Claims

絶縁性を有する基板上に導電性を有するリード部と、導電性を有し、かつ核酸が固定化された導電性微粉末を有する検出部とが直列に形成された複数のＤＮＡマイクロアレイユニットが、各検出部の上に他のＤＮＡマイクロアレイユニットの基板が重複せず検出部の表面が露出するよう階段状に積層されていることを特徴とする多層ＤＮＡマイクロアレイ。
各リード部の抵抗値が一定である請求項１記載の多層ＤＮＡマイクロアレイ。
各リード部の長さが一定である請求項１記載の多層ＤＮＡマイクロアレイ。